KR101190571B1

KR101190571B1 - ３?플루오로?ｎ〔４?메톡시펜에틸〕?ｎ?〔１?〔４?메톡시페닐〕?２，５?디옥소피롤리딘?３?일〕벤즈아마이드를 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101190571B1
Application number: KR1020120071692A
Authority: KR
Inventors: 박상익; 김현영; 이숙경
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2012-07-02
Publication date: 2012-10-17

Abstract

본 발명은 3-플루오로-N-(4-메톡시펜에틸)-N-(1-(4-메톡시페닐)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일)벤즈아마이드(3-fluoro-N-(4-methoxyphenethyl)-N-(1-(4-methoxyphenyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)benzamide) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명에 따른 화합물은 GCPⅡ의 S1 포켓을 특이적으로 억제하여 Aβ의 분해를 억제함으로써, 시냅스 강화가 일어나며, 질환의 진행 단계에 따라 Aβ의 항상성 유지에 중요한 역할을 할 수 있어 알츠하이머 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

３?플루오로?Ｎ〔４?메톡시펜에틸〕?Ｎ?〔１?〔４?메톡시페닐〕?２，５?디옥소피롤리딘?３?일〕벤즈아마이드를 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition comprising 3-fluoro-N-(4-methoxyphenethyl)-N-(1-(4-methoxyphenyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)benzamide for preventing and treating of neurodegenerative disease}

본 발명은 3-플루오로-N-(4-메톡시펜에틸)-N-(1-(4-메톡시페닐)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일)벤즈아마이드(3-fluoro-N-(4-methoxyphenethyl)-N-(1-(4-methoxyphenyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)benzamide) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

GCPⅡ(glutamate carboxypeptidaseⅡ)는 뇌에 존재하는 94 내지 100 kDa의 분명한 분자량을 가진 유형 Ⅱ 내재성 막 단백질(integral membrane protein)이고, 주로 신경교(glia) 내에 있으며, NAAG(N-acetylaspartylglutamate)를 NAA(N-acetylaspartate) 및 글루타메이트(glutamate)로 가수분해함에 따라, 흥분성 신호전달(glutamatergic transmission)에 영향을 미친다. NAAG 가수분해로 인해 생성된 글루타메이트는 중추신경계에서 주요한 흥분성 신경전달물질로서 신경계에 필수적인 요소로 작용하지만 뇌 속의 과다한 축적은 뇌세포의 사멸과 변성을 초래하여 알츠하이머, 뇌졸중, 중풍, 치매, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeid-Jakob)병와 같은 퇴행성 뇌질환을 야기하는 것으로 알려져 있다(Choi, W. H., Oh, Y. S., Ahn, J. Y., Kim, S. R. and Ha, T. Y.(2005) Antioxidative and protective effects of Ulmus davidiana var . japonica extracts on glutamate-induced cytotoxicity in PC12 cells. Korean J. Food Sci . Technol. 37, 479-483; Jeon, H. J., Park, S. W. and Mun, B. S. (2004) Effects of Gwibitang on glutamate-induced death in rat neonatal astrocytes. J Korean Oriental Med . 25, 184-193; Lee, J., Kim, M. S., Lee, C., Kim, H. Y., Choi, D. H., Kim, T. Y., Son, Y. and Park, R. (2003) Role of morphine in the glutamate-induced oxidative damage of C6 glial cells. Korean J Anesthesiol . 45, 271-277).

GCPⅡ는 효소 활성 및 발현 부위에 따라 다양한 이름이 있다. 전립선에서 GCPⅡ의 강한 발현(GCPⅡ의 기능 장소는 알려지지 않음) 때문에 PSMA라 명명하며, 중추신경계에서 뇌 신경전달물질(brain neurotransmitter), NAAG를 대사작용시키므로, GCPⅡ를 NAALADase라 명명하며, 전반부 소장(proximal small intestine)에서 폴리-지-글루타메이트 엽산(poly-g-glutamated folate), 엽산 가수분해효소(folate hydrolase) FOLH1 및 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase)로서 글루타메이트 카르복시펩티다아제Ⅱ(glutamate carboxypeptidaseⅡ, GCPⅡ)로부터 감마에 연결된 글루타메이트(gamma-linked glutamate)를 제거하는 역할을 한다.

또한, GCPⅡ의 구조는 GCPⅡ의 촉매 기전 및 기질 특이성에 대한 통찰을 제공한다. GCPⅡ는 활성 부위에 이핵성 Zn² ⁺중심(binuclear Zn² ⁺ centre)이 있고, 이 활성부위에서 두 개의 아연 원자는 결합 카르복시산염 리간드(bridging carboxylate ligand)를 공유한다. α-NAAG는 GCPⅡ의 아르기닌(arginine) 부분과 상호작용하는 글루타메이트 곁가지(glutamate side chain) 종류와 결합하고, 카르보닐(carbonyl)이 공격받는 것으로부터 산소, 및 C-말단은 아연 이온과 결합한다. 기질(예를 들어, α-NAAG에서의 NAA)의 나머지는 Arg-210과 특이적 상호작용하는 기질-결합 공간으로부터 수용된다. 좀 더 큰 기질(예를 들어, 네 개의 γ와 연결된 글루타메이트까지 함께 있는 폴리-γ-글루타메이트 엽산(poly- γ-glutamated folates with up to four γ-linked glutamates) (9))은 포켓과의 입체 충돌을 피하기 위해 약간의 구조적 재배열을 요구하고 결합의 교대 방법을 가질 수 있다. 또한, GCPⅡ는 두 개의 활성 부위인 S1' 포켓 및 S1 포켓이 있다(Mlcochova P., Plechanovova A., Barinka C., Mahadevan D., Saldanha J. W., Rjlisek L., Konvalinka J.(2007) Mapping of the active site of glutamate carboxypeptidase II by site-directed mutagenesis. FEBS J. 274(18) : 4731-41). 상기 S1 포켓이 GCPⅡ 기질 특이성의 '미세-조정(fine-tuning)'으로서 작용한다면, 상기 S1' 포켓은 NAAG 및 GCPⅡ 억제제의 주요한 높은 친화성 결합(affinity binding)에 기여하게 된다.

지금까지, GCPⅡ의 주요 기능은 NAAG 가수분해 작용이 있는 것으로 보고되었다. 따라서, 강력하고 선택적인 GCPⅡ 억제제, 즉 2-PMPA(2-(Phosphonomethyl) pentanedioic acid)는 뇌졸중(stroke), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis) 및 신경성 통증(neuropathic pain)의 임상 전의 모델에서 뇌 글루타메이트를 감소시키고 신경보호효과를 제공한다고 보고된 바 있다. 그러나 지금까지, GCPⅡ의 S1 포켓에 특이적인 억제 활성을 가지는 화합물은 없었다.

이에 본 발명자들은 GCPⅡ의 S1 포켓에 특이적인 억제 화합물을 동정하기 위해 가상 스크리닝을 이용하여 S1' 포켓은 억제하지 않으면서 S1 포켓을 특이적으로 억제하는 화합물을 발견하였고, S1 포켓을 특이적으로 억제하는 화합물은 신경퇴행성 질환에 있어서, Aβ의 항상성 유지에 중요한 역할을 하며, 시냅스 강화를 일으키는 효과가 있어 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 목적은 3-플루오로-N-(4-메톡시펜에틸)-N-(1-(4-메톡시페닐)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일)벤즈아마이드(3-fluoro-N-(4-methoxyphenethyl)-N-(1-(4-methoxyphenyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)benzamide) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 1) 시험관내(in vitro)에서 GCPⅡ발현 세포주에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 피검물질을 동시에 또는 순차적으로 처리하는 단계; 2) 단계 1)의 세포주에서 GCPⅡ의 S1 또는 S1' 포켓의 활성수준을 측정하는 단계; 및 3) 단계 2)의 GCPⅡ의 S1 또는 S1' 포켓의 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가하거나 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 1) 시험관내(in vitro)에서 GCPⅡ에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 피검물질을 동시에 또는 순차적으로 처리하는 단계; 2) 단계 1)의 GCPⅡ의 S1 또는 S1' 포켓의 활성수준을 측정하는 단계; 및 3) 단계 2)의 GCPⅡ의 S1 또는 S1' 포켓의 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가하거나 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 GCPⅡ의 S1 포켓을 특이적으로 억제하는 하기 화학식 1로 표시되는 3-플루오로-N-(4-메톡시펜에틸)-N-(1-(4-메톡시페닐)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일)벤즈아마이드(3-fluoro-N-(4-methoxyphenethyl)-N-(1-(4-methoxyphenyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)benzamide) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

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또한 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 1) 시험관내(in vitro)에서 GCPⅡ 발현 세포주에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 피검물질을 동시에 또는 순차적으로 처리하는 단계; 2) 단계 1)의 세포주에서 GCPⅡ의 S1 또는 S1' 포켓의 활성수준을 측정하는 단계; 및 3) 단계 2)의 GCPⅡ의 S1 또는 S1' 포켓의 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가하거나 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 1) 시험관내(in vitro)에서 GCPⅡ에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 피검물질을 동시에 또는 순차적으로 처리하는 단계; 2) 단계 1)의 GCPⅡ의 S1 또는 S1' 포켓의 활성수준을 측정하는 단계; 및 3) 단계 2)의 GCPⅡ의 S1 또는 S1' 포켓의 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가하거나 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 신경퇴행성 질환에 있어서, GCPⅡ의 S1 포켓을 특이적으로 억제하여 Aβ의 분해를 억제함으로써, 시냅스 강화가 일어나며, Aβ의 항상성 유지에 중요한 역할을 할 수 있어 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 2-PMPA가 Aβ 및 NAAG 분해에 미치는 영향을 나타낸 그림이다:
(a, b) rhGCPⅡ를 2-PMPA 또는 EDTA가 있거나 또는 없이 Aβ₄₀또는 NAAG와 함께 배양시켰고, Aβ₄₀또는 NAAG 수준을 ELISA 또는 NAAG 분해 분석(cleavage assay)으로 검출하였다; (c) 렌티바이러스 GCPⅡ(lentiviral GCPⅡ)를 마우스 일차 성상세포 내에 감염시킨 후, 단량체의 Aβ₄₀을 세포 내에 처리하였고 2-PMPA를 다양한 투여량으로 처리하여 세포 성장 배지에서 상기 Aβ₄₀의농도를 ELISA 분석으로 측정하였다; (d,e) 8달 된 APP Swedish/PS1E9 형질전환 마우스의 복강내에 1달 동안 2-PMPA의 10 mg/kg 또는 PBS 2/wk을 주입하였고(9 번), 막 단편(membrane fraction)을 NAAG 및 ELISA 분석으로 분석하였다.
도 2는 GCPⅡ의 위치선택적 돌연변이를 나타낸 그림이다:
(a) 프라이머(primer)의 서열을 위치선택적 돌연변이 실험에 사용하였다; (b) 형질도입된 HEK293 세포에서 다양한 돌연변이 단백질의 발현을 나타냈다.
도 3은 GCPⅡ의 S1' 포켓 돌연변이에서 NAAG 분해 활성을 나타낸 그림이다:
(a) S1' 포켓(R210A, K699S)에서 치환이 있는 돌연변이 단백질은 NAAG(N-acetyl-aspartyl-glutamate)를 분해하지 않았으나, S1 포켓(R536L, R548P)에서 돌연변이가 있는 다른 단백질은 약 40% 정도 NAAG 분해 활성을 갖는다; (b) GCPⅡ의 NAAG 분해 활성은 Aβ 펩타이드에 영향을 받지 않았다.
도 4는 GCPⅡ 돌연변이의 Aβ 분해에 미치는 영향을 나타낸 그림이다:
(a, b) H4 세포에서, 과발현된 S1' 돌연변이(K699S)는 아밀로이드-β₄₀(amyloid-β₄₀)을 분해하였지만, S1 돌연변이(G548P)는 분해하지 않았다; (c) 남은 Aβ은 G548P를 제외하고 K699S에 의해 감소하였다.
도 5는 GCPⅡ 억제제 결합모드를 나타내는 그림이다: (a)는 S1 자리에 특이적으로 결합한 경우이고(선별), (b)는 S1' 자리에 특이적으로 결합한 경우이다(비선별).
도 6은 GCPⅡ의 Aβ 분해를 저해하는 것으로 보이는 7개의 화합물을 웨스턴 블랏을 통하여 확인한 그림이다.
도 7은 화학식 1의 화합물이 NAAG 분해에 미치는 영향을 확인한 그림이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 GCPⅡ의 S1 포켓을 특이적으로 억제하는 하기 화학식 1로 표시되는 3-플루오로-N-(4-메톡시펜에틸)-N-(1-(4-메톡시페닐)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일)벤즈아마이드(3-fluoro-N-(4-methoxyphenethyl)-N-(1-(4-methoxyphenyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)benzamide) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

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본 발명에 따른 상기 화합물은 유기합성 분야에서 당업자에게 알려진 방법을 통해 제조하거나, 상업적으로 판매되는 것을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기의 신경퇴행성 질병은 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 루게릭병 및 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 알츠하이머 질환이다.

또한 본 발명은 GCPⅡ의 S1 포켓(pocket)을 특이적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 시냅스 강화를 일으키는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 세포 내 Aβ의 항상성을 유지하는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 화합물은 GCPⅡ의 S1 포켓을 특이적으로 억제할 수 있어, 이를 이용한 S1' 포켓에 특이적인 기질 분해능을 측정하는데 사용할 수 있다.

본 발명자들은 GCPⅡ의 특이적 억제제인 2-PMPA의 Aβ 펩타이드에 대한 효과를 확인하기 위하여, 재조합 인간 GCPⅡ(rhGCPⅡ)를 Aβ_1-40과 함께 인큐베이트시켰고 다양한 투여량으로 2-PMPA를 첨가했으며 ELISA로 분석하였다. 그 결과, rhGCPⅡ는 대조군과 비교하여 80% 정도 Aβ_1-40펩타이드를 분해시켰지만, 2-PMPA는 GCPⅡ의 Aβ_1-40분해에 아무런 효과가 없었다는 것을 확인하였고(도 1a 참조). 2-PMPA는 1차 마우스 성상세포에서 렌티바이러스 GCPⅡ의 Aβ_1-40분해를 차단하지 않았다는 것을 확인하였고(도 1c 참조), GCPⅡ에 의한 NAAG의 가수분해는 2-PMPA에 의해 완전히 차단되었다는 것을 확인하였다(도 1b 참조). 또한, 마우스 뇌에서 2-PMPA의 효과를 알아보기 위하여, 2-PMPA를 형질전환 AD 모델 마우스 내에 처리하였다. 본 발명자들은 2-PMPA(10 mg/kg, 복강 내로, 1달 동안 2X/wk)를 8달 된 APP Swedish/PS1Δ9 형질전환 마우스에 처리하였다. 피질 막 단편(cortical membrane fraction)에서 Aβ_1-40및Aβ_1-42의 수준을 ELISA로 분석하였고 GCPⅡ의 NAAG 분해 활성을 NAAG 분석으로 측정하였다. 그 결과, NAAG 분해는 PBS 대조군과 비교하여 2-PMPA를 처리한 마우스에서 약 90% 감소하였지만(도 1d 참조), Aβ_1-40및Aβ_1-42의 총 수준은 2-PMPA의 처리에 의해 변화되지 않았다는 것을 확인하였다(도 1e 참조). 따라서, GCPⅡ에서 NAAG 또는 Aβ 분해 부위가 다르다는 것을 확인하였다.

본 발명자들은 GCPⅡ가 S1 및 S1' 포켓이라 명명된 두 개의 활성 부위로 구성되어 있다는 것을 바탕으로 GCPⅡ[ref]의 다양한 돌연변이인, GCPⅡ의 7개의 돌연변이(R210A, D387N, P388A, R536L, G548P, Y552I, K699S)를 제작하였다(도 2a 참조). 각 돌연변이가 있는, 두 개의 상보적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여, 아미노산을 위치선택적 돌연변이로 변화시켰다. 돌연변이가 있는 다양한 GCPⅡ의 발현을 확인하기 위하여, 돌연변이 플라스미드를 HEK293T 세포 이내에 형질도입시킨 후 웨스턴 블롯팅(wetern blotting)으로 단백질의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, 밴드의 패턴은 rhGCPⅡ와 유사했고 하나의 밴드는 GCPⅡ의 예측된 크기인 98 kDa에서 두드러지게 보였다는 것을 확인하였다(도 2b 참조).

본 발명자들은 GCPⅡ 돌연변이의 효소 활성의 변화를 관찰하였다. 다양한 돌연변이의 효소 활성을 분석하기 위하여, S1' 포켓(R210A, K699S) 및 S1 포켓(R536L, G548P)에 치환이 있는 돌연변이 단백질을 H4 세포에 형질도입시켰다. NAAG의 가수분해를 측정하기 위하여, 세포 용해물을 [H]³이 라벨된 NAAG(20 μM) 및 GCPⅡ의 특이적 기질과 함께 배양시켰다. 그 결과, 상기 S1' 포켓 돌연변이(R210A, K699S)는 NAAG를 가수분해하는 활성을 완전히 잃어버렸으나, 상기 S1 포켓 돌연변이(R536L, G548P)는 야생형 GCPⅡ와 비교하여 40% 정도 활성을 유지한다는 것을 확인하였다(도 3a 참조). 추가적으로, GCPⅡ의 NAAG 분해와 Aβ 분해간의 경쟁적 저해 효과를 알아보기 위하여, rhGCPⅡ를 [H]³이 라벨된 NAAG(20 μM) 및 Aβ 펩타이드를 농도별로 인큐베이트시켰다. 그 결과, GCPⅡ의 NAAG 분해 활성은 Aβ 펩타이드에 영향을 받지 않았다는 것을 확인하였다(도 3b 참조). 따라서, S1' 포켓에서의 NAAG 가수분해는 Aβ에 의해 영향받지 않는다는 것을 확인하여 GCPⅡ에서의 NAAG 분해와 Aβ 분해기전이 다르다는 것을 확인하였다.

본 발명자들은 돌연변이 GCPⅡ의 Aβ clearance 활성을 동정하기 위하여, 다양한 돌연변이 플라스미드를 내인성의 GCPⅡ를 발현하지 않는 것으로 알려진 PC3 세포에 형질도입시켰다. 48시간 후, 상기 세포 용해물을 Aβ(2 μM)와 혼합하여 밤새도록 인큐베이트시켰다. 남은 Aβ 펩타이드는 6E10 항체를 이용하여 닷 블롯팅(dot blotting) 및 웨스턴 블롯팅(western blotting)으로 확인하였다. 그 결과, K699S 돌연변이는 야생형보다 Aβ를 좀 더 분해하였지만 G548P 돌연변이는 Aβ 분해 활성을 잃었다는 것을 확인하였다(도 4a, b 참조). 또한, 배양 배지에서 외인적으로 처리된 Aβ 펩타이드에서 GCPⅡ의 분해 활성을 확인하기 위하여, 형질도입 후 다음 날, 배지 내에 Aβ를 1 ng/ml로 처리하였고 37℃에서 8 시간 동안 인큐베이트시킴으로써 ELISA 분석을 수행하였다. 그 결과, 웨스턴 블롯팅과 유사하게, 남은 Aβ은 G548P는 제외하고 K699S에 의해 감소하였다는 것을 확인하였다(도 4c 참조). 따라서, S1 포켓이 Aβ를 분해에서 S1' 포켓보다 좀 더 중요하다는 것을 통하여 NAAG 가수분해 활성 및 Aβ 분해 활성의 작용은 GCPⅡ 효소에 따라 다르게 조절된다는 것을 확인하였다.

본 발명자들은 GCPⅡ의 S1 포켓에 특이적인 억제 화합물을 동정하기 위하여 GCPⅡ에 대한 가상 스크리닝을 켐디브 데이타베이스(ChemDiv database)의 396,047개의 화합물에 대하여 수행하였다. 이 중에서 S1 자리에 특이적으로 결합한 경우의 화합물을 선별하였고, NAAG를 자르는 S1' 자리에 결합하는 화합물은 제외하였다. 그 결과, 1972개의 화합물을 선별하였고, 1,947개의 히트 화합물 중 중복되는 스캐폴드(scaffold)를 대표하는 구조 100개를 선발하였다. 이 중에서 58개의 화합물을 재조합 GCPⅡ 및 Aβ와 함계 배양하여 GCPⅡ의 Aβ 분해 정도에 미치는 화합물을 확인하였다. 그 결과 본 발명자들은 상기 화학식 1로 표시되는 3-플루오로-N-(4-메톡시펜에틸)-N-(1-(4-메톡시페닐)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일)벤즈아마이드(3-fluoro-N-(4-methoxyphenethyl)-N-(1-(4-methoxyphenyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)benzamide)을 동정할 수 있었다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물을 재조합 인간 GCPⅡ 및 Aβ와 섞은 후 웨스턴 블랏팅을 이용하여 GCPⅡ의 Aβ 분해 활성을 분석하였다. 그 결과, 상기 화합물은 GCPⅡ의 S1 포켓에 특이적으로 작용하여 Aβ 분해를 현저하게 억제함을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물이 NAAG 분해에 미치는 영향을 알아보기 위해, 재조합 인간 GCPⅡ 및 NAAG를 섞은 후 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 그 결과, 상기 화합물은 GCPⅡ의 NAAG를 분해하지 않아 GCPⅡ의 S1' 포켓에는 작용하지 않음을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

따라서 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 NAAG의 분해에는 영향을 미치지 않으면서, GCPⅡ의 Aβ의 분해를 현저하게 억제하는 GCPⅡ의 S1 포켓에 특이적인 억제 화합물이다.

Aβ는 신경세포의 시냅스 소포의 방출을 조절하는 역할을 하며, 많은 양의 Aβ는 시냅스 손상을 일으킨다고 알려져 있다. 그러나 작은 양의 Aβ를 초기 알츠하이머 질환에 있어서 시냅스 손실에 대한 보상작용으로 작은 양의 Aβ를 주입하면 시냅스 강화를 일으킨다고 알려져 있다. 특히 네프릴신이라는 Aβ 분해물질효소의 저해제인 티오르판이라는 물질을 사용하여 Aβ 분해를 막을 경우 시냅스 강화가 일어난다는 보고가 있었다(Efrat Abramov, Amyloid-β as a positive endogenous regulator of release probability at hippocampal synapses, Nature neuroscience, vol.12, num. 12, 2009).

또한 알츠하이머 질환을 포함한 신경퇴행성 질환에 있어서 수반되는 인지능력과 기억력상실의 주요 원인은 시냅스 손실에 의한 것이라고 알려져 있다. 특히 노인성 치매와 같은 알츠하이머 질환 및 혈관성 치매에 있어서는 특징적 현상으로 알려져 있는 독성단백질 Aβ의 축적과 타우단백질의 엉킴에 앞서 시냅스의 손실이 먼저 나타난다고 알려져 있다. 따라서 본 발명의 화합물은 바람직하게는 알츠하이머 질환의 초기단계에 사용될 수 있다.

인간의 노인성 치매와 같은 병리현상이 나타나도록 유전조작된 치매모델 쥐를 관찰한 결과 뇌에 Aβ 축적과 타우단백질 엉킴이 나타나기 5개월 전에 인지기능이 크게 손상되기 시작했으며, 이는 Aβ 축적과 타우 단백질 엉킴이 치매의 근본적인 원인이 아니고 시냅스 손실에 의해 시작된다는 보고가 있었다. 분자수준에서 시냅스의 생성을 조절하는 PKC효소에 작용하는 브리오스타틴과 합성된 브리오스타틴 유사물질을 치매모델 쥐에 12주 동안 투여한 결과 새로운 시냅스의 생성이 촉진되고 남아있는 시냅스가 보존되는 것으로 나타났다고 보고되었다. 또한 이와 함께 PKC효소의 감소가 멎고 수용성 Aβ가 증가하면서 Aβ 축적, 타우단백질 엉킴, 인지기능 손실 등 치매의 특징적 증상도 사라졌다.

따라서 본 발명의 화합물은 신경퇴행성 질병에 있어서, 질병의 단계에 따라 Aβ 분해를 억제하여 세포 내 Aβ의 항상성을 유지할 수 있을 뿐만 아니라, 시냅스 강화를 일으켜 신경퇴행성 질병의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물뿐만 아니라, 이의 약학적으로 허용되는 염, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세미체, 또는 입체이성질체를 모두 포함한다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1의 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.

동량의 화학식 1로 표시되는 화합물 및 산 수용액 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다.

상기 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 조성물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 0.03 g/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 8 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 GCPⅡ의 S1 포켓만을 특이적으로 억제하는 화합물이므로, 순수하게 S1'포켓의 활성을 보고자하는데 유용하게 이용될 수 있다. 또한 S1 과 S1'포켓이 서로 포어(pore)를 양분하는 정도로 붙어 있어, 상호가 영향을 미칠 가능성이 높은데, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 S1 포켓만을 특이적으로 억제하여 GCPⅡ가 연관된 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.

상기에서 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 루게릭병 및 치매를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 알츠하이머 질환이나, 이에 한정되지 않는다.

상기에서 화학식 1로 표시되는 화합물은 GCPⅡ의 S1 포켓을 특이적으로 억제하는 화합물일 수 있다.

본 발명은 1) 시험관내(in vitro)에서 GCPⅡ발현 세포주에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 피검물질을 동시에 또는 순차적으로 처리하는 단계; 2) 단계 1)의 세포주에서 GCPⅡ의 S1 또는 S1' 포켓의 활성수준을 측정하는 단계; 및 3) 단계 2)의 GCPⅡ의 S1 또는 S1' 포켓의 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가하거나 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 단계 2)에서 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 S1을 특이적으로 억제하므로, GCPⅡ S1 과 S1'포켓의 활성과 관련된 피검물질을 선별하는데 모두 사용될 수 있다.

상기 단계 2)에서 GCPⅡ의 활성을 보는 방법은 이에 한정되는 것은 아니지만 GCPⅡ의 Aβ분해활성을 보거나, GCPⅡ의 NAAG 분해활성을 보는 방법으로 할 수 있다.

상기 단계 3)에서 대조군에 비해, S1 포켓이 억제된 GCP의 S1 또는 S1'포켓의 활성을 억제시키는 피검물질 또는 활성을 증가시키는 피검물질 모두 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물은 GCPⅡ의 S1 포켓을 특이적으로 억제하여, Aβ의 분해를 억제하여 시냅스 강화를 일으키고, 세포 내 Aβ의 항상성을 유지시켜 신경퇴행성 질환의 예방 및 개선용 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 신경퇴행성 질환의 예방 및 개선 목적으로, 상기 화합물을 식품, 음료 등의 건강보조 식품에 첨가할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 2- PMPA 가 Aβ 및 NAAG 분해에 미치는 영향 확인

<1-1> 세포배양 및 형질도입

HEK293T 세포 및 H4 세포(American Type Culture Collection, ATCC, Edinburg, VA, USA)를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)(FBS; GIBCO) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)(GIBCO)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's 배지)(DMEM; GIBCO)에, PC3 세포를 10% 우태아 혈청(FBS; GIBCO) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(GIBCO)이 첨가된 RPMI 배지 1640 (GIBCO)에 5% CO₂를 포함하는 습식 배양기(humidified incubator)에서 37℃에서 배양하였다. 일시적인 형질도입을 제조사의 지침서를 따라 Lipofectamine 2000 시약 또는 Lipofectamine Plus 시약(Invitrogen)을 이용하여 수행하였다.

<1-2> Aβ 펩타이드의 준비

Aβ_1-40또는Aβ_1-42(Invitrogen) 펩타이드를 최종적으로 1mM 농도로 차가운 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoroisopropanol, HFIP)(HFIP; Sigma)과 함께 준비하였다. 실온에서 40 분 동안 흔들었고 4℃에서 20 분 동안 둔 다음, HFIP를 진공상태에서 제거하였다. 펩타이드 펠릿(pellet)을 -70℃에 저장하였다. 상기 펠릿을 최종 5mM 농도가 되도록 DMSO로 용해시켰고 최종 1mM 농도가 되도록 증류수를 첨가하였다.

<1-3> ELISA 분석을 통한 2- PMPA 가 Aβ 분해에 미치는 영향 확인

hGCPⅡ 및 다양한 돌연변이 hGCPⅡ 유전자를 암호화하는 벡터(vector)를 12-웰 플레이트에서 PC3 세포 내로 형질도입시켰다. 배양 배지를 약 30 시간 후에 2-PMPA((2-(Phosphonomethyl) pentanedioic acid)가 있거나 또는 없이 Aβ_1-40또는Aβ_1-42펩타이드가 처리된 배지로 바꾸었고, 세포를 다시 8 시간 동안 인큐베이트시켰다. 상기 배지를 수득하였고 제조사의 프로토콜을 따라 ELISA 키트(Invitrogen)를 이용하여 남은 Aβ_1-40또는Aβ_1-42를 분석하였다. 공(empty) pcDNA3 공 벡터로 형질도입된 세포를 음성 대조군으로서 이용하였다.

그 결과, 도 1a에서 보는 바와 같이 rhGCPⅡ는 대조군과 비교하여 약 80% Aβ_1-40를분해시켰지만, 2-PMPA는 GCPⅡ의 Aβ_1-40분열에 효과가 없음을 확인하였다(도 1a).

<1-4> NAAG 분해 분석을 통한 2- PMPA 가 NAAG 분해에 미치는 영향 확인

내인성으로 또는 과발현된 글루타메이트 카르복시펩티다아제 Ⅱ(Glutamate carboxypeptidase Ⅱ, GCPⅡ) 단백질의 활성을 하기와 같은 방법으로 측정하였다. 세포 용해물(50 μg)을 37℃에서 한 시간 동안 50 mM HEPES 및 150 mM NaCl을 포함하는 총 100 μl의 부피에서 GCPⅡ 특이적 억제제인 2-PMPA의 20 nM 또는 EDTA가 함께 있거나 또는 없이 NAAG(N-acetyl-L-aspartyl-L-[3,4-3H] glutamate; NEN corporation)의 20μM과 함께 인큐베이트시켰다. 반응 후에, 시료 혼합물(sample mixture)을 96 웰 컬럼(well column)(Havard apparatus)에 준비된 AG 1-X8 음이온교환 수지(anion-exchange resin)(Biorad)에 사용하였고 5분 동안 2000 rpm으로 원심분리하였다. 시료 혼합물과 함께 묶인 수지(resin)를 0.5 mM 포름산염(formate)(100 ml)으로 용리하였고 5분 동안 2000 rpm으로 원심분리하였다. 전이한 모든 용리된 시료를 1 ml의 섬광 용액(Optiphase HiSafe; Wallac)과 함께 혼합하였고 방사능을 섬광 계수기(Wallac Inc.)로 측정하였다.

그 결과, 도 1b에서 보는 바와 같이 2-PMPA가 GCPⅡ에 의한 NAAG 가수분해를 완전히 차단한 것을 확인하였다(도 1b).

<1-5> GCP Ⅱ 플라스미드 및 렌티바이러스 제작을 통한 2- PMPA 가 렌티바이러스 GCPⅡ의 Aβ 분해에 미치는 영향 확인

hGCPⅡ 플라스미드를 하기에 기재한 것과 같이 준비하였다. 인간 별아교세포에 해당하는 U87-MG 세포에서 RNA를 분리한 후 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에서 hGCPⅡ의 증폭을 위하여 하기의 프라이머를 이용하여 PCR 방법을 이용하였다. 플라스미드 생성을 위하여 PCR 산물을 pcDNA3 벡터내에 클로닝하였다:

정방향 5′-GATGTGGAATCTCCTTCACGAAAC-3'; 및

역방향 5′-ATCCTCTTAGGCTACTTCACTCAAAG-3'.

렌티바이러스 hGCPⅡ를 Macrogen Inc. (Seoul, Korea)로 준비하였다. hGCPⅡ cDNA를 인간 거대세포바이러스(cytomegalovirus)(CMV) 프로모터 및 형광 단백질(GFP)이 있는 IRES 서열을 포함하는 렌티바이러스 컨스트럭트(construct)(LentiM1.4-hGCPII) 내에 클로닝하였다. 바이러스 제작을 위하여, hGCPⅡ, VSV-G 및 gag-pol 발현 벡터를 Lipofectamine Plus(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 293T 세포 내에 함께 형질도입시킨 후, 단량체의 AβDMF 세포 내에 처리하고 2-PMPA를 처리하였다. 세포 성장 배지에서의 Aβ_1-40의 농도를 상기 실시예 <1-3>의 방법으로 분석하였다.

그 결과, 도 1c에서 보는 바와 같이 2-PMPA는 렌티바이러스 GCPⅡ의 Aβ_1-40분해를 차단하지 않았음을 확인하였다(도 1c).

<1-6> 형질전환 동물

이중-형질도입 APP Swedish/PS1△E9 마우스를 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)에서 구입하였고 C57BL/6J 백그라운드 계통(background strain)에서 야생형 마우스와 교배(crossing)하는 것에 의해 이중 유전자접합체(hemizygotes)를 유지하였다. 모든 동물들을 표준 동물 관리 프로토콜에 따라 사육하였고 한국 식약청(the Korean Food and Drug Administration)에서 무균사육시설(pathogen-free facility)에서 유지하였다. 마우스 유전자형을 하기의 프라이머(primer)를 이용하여 PCR 방법으로 확인하였다:

PrP(mouse prion protein):

정방향 5'-CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG-3';

역방향 5'-GTGGATAACCCCTCCCCCAGCCTAGACC-3';

인간(human) APP:

정방향 5'-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3'; 및

역방향 5'-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG-3'.

Aβs의 뇌 수준에서 GCPⅡ 억제제의 효과를 측정하기 위하여, 처리된 군은 복강내 주사로 한 달 동안 PBS 2X/wk에 용해된 2-PMPA (10 mg/kg)를 주입하였다. 처리하지 않은 군은 대조군으로서 같은 양의 PBS를 주입하였다. 마우스가 8 달이 되었을 때 처리를 시작하였다.

<1-7> 2- PMPA 의 마우스 뇌에서의 효과 확인

2-PMPA의 효과를 마우스의 뇌에서 알아보기 위하여, 상기 실시예 <1-6>의 방법으로 형질전환된 8달 된 APP Swedish/PS1Δ9 마우스의 복강 내에 1달 동안 2-PMPA의 10 mg/kg 또는 PBS 2/wk을 9 번 처리하였다. 피질 막 단편(cortical membrane fraction)에서 Aβ_1-40및Aβ_1-42의 수준을 상기 실시예 <1-3>의 방법으로 분석하였고 GCPⅡ의 NAAG 분해 활성을 상기 실시예 <1-4>의 방법으로 측정하였다.

그 결과, 도 1d에서 보는 바와 같이 2-PMPA를 처리한 마우스에서 NAAG 분해는 PBS 대조군과 비교하여 약 90% 감소한 것을 확인하였고(도 1d), 도 1e에서 보는 바와 같이 2-PMPA의 처리에 의해 Aβ_1-40및Aβ_1-42의 수준은 변화하지 않았다는 것을 확인하였다(도 1e).

< 실시예 2> GCP Ⅱ의 위치선택적 돌연변이 발현 확인

<2-1> GCP Ⅱ의 위치선택적 돌연변이( Site - directed mutagenesis )

pcDNA-hGCPⅡ 플라스미드(50 ng)를 주형(template)으로 사용하였고, 각 돌연변이를 희망했던 돌연변이를 생산(harboring)하는 두 개의 상보적 올리고뉴클레오티드 프라이머(표 1)로 도입하였다. Pfu Ultra High-Fidelity DNA 폴리메라아제(polymerase)(stratagene)의 2.5U를 이용하여 연장시켰고 열린 원형 가닥(nicked circular strand)(95℃, 5 분 → (95℃, 50 초 → 55℃, 1 분 → 80℃, 8 분 20 초 → 72℃, 1 분) 22번 순환(cycle) → 4℃, 무한대(∞))에서 결과로 초래된 돌연변이 프라이머(125 ng)를 만들었다. 메틸화(methylated)되고, 돌연변이 되지 않은 부모형 DNA(nonmutated parental DNA) 주형을 37℃에서 한 시간 동안 Dpn I (NEB)의 20U로 digest시켰다. 그런 다음, 원형(circular) dsDNA를 DH5a 적격 세포(competent cell) 내로 변환시켰다. 각각의 돌연변이를 순서결정법(sequencing)(Cosmo corporation)으로 확인하였다.

그 결과, 도 2a에서 보는 바와 같이 GCPⅡ의 7개의 돌연변이(R210A, D387N, P388A, R536L, G548P, Y552I, K699S)를 제작하였다(도 2a).

<2-2> 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 통한 GCP Ⅱ 돌연변이 발현 확인

GCPⅡ 돌연변이의 발현을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-1>의 방법을 따라 돌연변이 플라스미드를 HEK293T 세포 내에 형질도입시킨 후, 세포를 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)(PBS; GIBCO)으로 세척하였고 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)(Sigma)이 있는 RIPA 완충용액(150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0.5 % sodium deoxycholate, 0.1 % SDS, 50 mM Tris at pH8.0)으로 용해시켰다. 용해물을 브레드포드(Bradford) 분석으로 단백질의 농도를 측정하였다. 단백질의 같은 농도를 β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 첨가하여 10 분 동안 끓였고 10% SDS-PAGE로 분리하였다. 단백질을 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막(GE Healthcare)으로 전기이동시켰고 한 시간 동안 실온에서 5% 탈지 건조 밀크(nonfat dry milk)를 넣은 TBS-T로 차단(block)하였다. 그런 다음, 상기 막을 4℃에서 밤새도록 5% 탈지 건조 밀크에 anti-PSMA (abcam; ab41034, 1:1000), Y-PSMA (Maine Biotech, 1:1000) 또는 anti-a-tubulin 항체(antibody) (Sigma-Aldrich; T6199, 1:50000)와 함께 인큐베이트시켰다. TBST-T로 세 번 세척한 후, 블롯을 실온에서 2 시간 동안 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (Jackson IR; 115-035-071, 1:10000) 또는 HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (Jackson IR; 115-035-046, 1:10000)와 함께 인큐베이트시켰다. 세 번 세척한 후, 단백질을 화학발광의 기질(chemiluminescent substrate)(Thermo Scientific)을 이용하여 검출하였다.

그 결과, 도 2b에서 보는 바와 같이 밴드의 패턴은 rhGCPⅡ와 유사했고 하나의 밴드는 GCPⅡ의 예측된 크기인 98 kDa에서 두드러지게 보인 것을 확인하였다(도 2b).

< 실시예 3> GCP Ⅱ 돌연변이의 NAAG 분해에 미치는 영향 확인

GCPⅡ 돌연변이의 NAAG 분해에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-1>의 방법에 따라 S1' 포켓(R210A, K699S) 및 S1 포켓(R536L, G548P)에 치환이 있는 돌연변이 단백질을 H4 세포에 형질도입시켰다. NAAG의 가수분해를 측정하기 위하여, 상기 실시예 <1-4>의 방법에 따라 세포 용해물을 [H]³이 라벨된 NAAG(20 μM) 및 GCPⅡ의 특이적 기질과 함께 인큐베이트시켰고 상기 실시예 <2-2>의 방법에 따라 단백질 발현의 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 3a에서 보는 바와 같이 S1' 포켓 돌연변이(R210A, K699S)는 NAAG를 가수분해하는 활성을 완전히 잃어버렸으나, S1 포켓 돌연변이(R536L, G548P)는 야생형 GCPⅡ와 비교하여 40% 정도 활성을 유지하고 있음을 확인하였다(도 3a).

GCPⅡ의 NAAG 분해에서 Aβ의 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 <1-4>의 방법에 따라 rhGCPⅡ를 [H]³이 라벨된 NAAG(20 μM) 및 Aβ 펩타이드와 함께 동시에 인큐베이트시켰다.

그 결과, 도 3b에서 보는 바와 같이 GCPⅡ의 NAAG 분해 활성은 Aβ 펩타이드에 영향을 받지 않았다는 것을 확인하였다(도 3b).

< 실시예 4> GCP Ⅱ 돌연변이의 Aβ 분해에 미치는 영향 확인

<4-1> GCP Ⅱ/Aβ 복합체 모델링

Aβ-S1 및 S1' 포켓의 결합의 MODE를 program O (http://xray.bmc.uu.se/alw yn/A-Z_frameset.html) (PDB file: 1z0q (Ab), 2oot (GCPII))를 이용하여 만들었다. 계산적 모형(computational docking)을 메뉴얼 도킹(manual docking) 방법을 이용하여 수행하였다.

GCPⅡ 돌연변이의 Aβ 분해에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-5>의 방법 및 상기 실시예 <4-1>의 방법에 따라, 다양한 돌연변이 플라스미드를 내인성의 GCPⅡ를 발현하지 않는 것으로 알려진 PC3 세포에 형질도입시켰다. 48시간 후, 상기 세포 용해물을 Aβ(2 μM)와 혼합하여 밤새도록 인큐베이트시켰다.

<4-2> 닷 블롯팅(dot blotting)을 통한 GCP Ⅱ 돌연변이의 Aβ 분해에 미치는 영향 확인

발현된 GCPII에 의해 잘리지 않고 남은 Aβ 펩타이드의 양을 확인하기 위하여 세포 용해물과 Aβ(2 μM)와 혼합물을 하기의 닷 블롯팅(dot blotting) 방법 및 상기 실시예 <2-2>의 방법으로 확인하였다. 세포 용해물과 Aβ(2 μM)와 혼합물 1 ㎕를 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 막에 떨어뜨린 후 완전히 말렸다. 말린 막을 한 시간 동안 실온에서 5% 탈지 건조 밀크(nonfat dry milk)를 넣은 TBS-T로 차단(block)하였다. 그런 다음, 상기 막을 4℃에서 밤새도록 5% 탈지 건조 밀크에 anti-Aβ antibody, 6E10 (SIGNET; SIG-39300, 1:2000)와 함께 인큐베이트시켰다. TBS-T로 세 번 세척한 후, 막을 실온에서 1시간 동안 HRP-confugated goat anti-mouse IgG (Jackson IR; 115-035-071, 1:10000)와 함께 인큐베이트시켰다. 세 번 세척한 후, 단백질을 화학발광기질을 이용하여 검출하였다.

그 결과, 도 4a, b에서 보는 바와 같이 K699S 돌연변이는 야생형보다 Aβ를 좀 더 분해하였지만 G548P 돌연변이는 Aβ 분해의 활성을 잃었다는 것을 확인하였다(도 4a, b).

Aβ 펩타이드에서 GCPⅡ의 분해 활성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-3> 및 상기 실시예 <4-1>의 방법에 따라, 형질도입 후 다음 날, 배지 내에 Aβ를 1 ng/ml로 처리하였고 37℃에서 8 시간 동안 인큐베이트시켰다.

그 결과, 도 4c에서 보는 바와 같이 남은 Aβ은 G548P를 제외하고 K699S에 의해 감소하였다는 것을 확인하였다(도 4c).

이상의 결과로, 본 발명자들은 S1' 포켓에는 NAAG가 결합할 수 있으나, Aβ는 결합하지 못하며, S1 포켓에는 Aβ의 결합이 일어날 수 있다는 것을 알 수 있었다. 상기의 결과를 토대로 본 발명자들은 GCPⅡ의 활성자리의 구조를 확인하여 GCPⅡ의 억제 화합물을 구조에 기반한 가상 스크리닝으로 동정하였다.

< 실시예 6> GCP Ⅱ 억제 화합물의 동정

<6-1> GCP Ⅱ에 대한 가상 검색

GCPⅡ에 대한 Aβ 분해능에 대한 억제제 스크리닝을 위해 켐디브 데이타베이스(ChemDiv database)의 396,047개의 화합물을 GCPⅡ의 S1 자리와의 결합 모델링(binding modeling)을 통해서 적절한 화합물을 동정하였다.

GCPⅡ에 대한 가상 스크리닝 연구는 트리포스사(Tripos)의 SYBYL 7.3 프로그램에 내장된 UNITY를 이용하여 수행되었다. 공지된 GCPⅡ의 삼차원 결정 구조 (PDB ID: 2PVW)에 켐브릿지(ChemBridge)와 켐디브(ChemDiv)사의 데이터베이스에 포함된 총 396,047개의 화합물을 도킹(docking)함으로써 가상스크리닝을 진행하였다. 특히, GCPⅡ의 삼차원 구조 2PVW에는 두 개의 리간드 결합자리 (S1, S1')가 존재하는데 이 중 S1'자리는 NAAG 분해와 연관된 글루타메이트(glutamate) 결합자리로서 GCPⅡ의 선택적 저해제로 알려진 2-PMPA가 결합하고 있으며, S1 자리는 Aβ의 분해와 관계된 자리로 알려져 있다.

본 발명자들은 S1 자리에 선택적으로 결합하는 리간드를 발굴하기 위하여 도킹(docking) 연구시 리간드 결합자리를 S1 자리에 한정하였다. 가상 스크리닝 후 S1 자리에 결합한 리간드 중 도킹 점수(docking score)가 -40 이상이 되는 물질들을 1차적으로 선별하였으며, 이후 시각검사(visual inspection)을 실시하여 S1'자리에 도킹되었거나 S1-S1' 자리에 걸쳐서 도킹된 물질들을 걸러내었다.

또한 본 발명자들은 Aβ를 자를 것이라고 예상되는 S1 자리에 특이적으로 결합한 경우의 화합물을 선별하였고(도 5a), NAAG를 자르는 S1' 자리에 결합하는 화합물(도 5b)은 제외하였다.

그 결과, 본 발명자들은 총 1,947개의 히트(hit) 화합물들을 얻게 되었다. 인비트로(In vitro) 검정에 이용될 물질은 1,947개의 히트 화합물 중 중복되는 스캐폴드(scaffold)를 대표하는 구조 100개를 선발하였다.

<6-2> GCP Ⅱ의 Aβ 분해 정도에 영향을 미치는 화합물 동정

실시예 <6-1>에서 선별한 화합물 100개 중에서, 켐디브(ChemDiv)에서 구매할 수 있는 화합물 63개를 이용하여, GCPⅡ의 Aβ 분해 정도에 영향을 분석하였다. 상기 63개의 화합물 중에서, DMSO에 녹는 58개의 화합물을 재조합 GCPⅡ및 Aβ와 함께 배양하여 GCPⅡ의 Aβ 분해 정도에 영향을 미치는 화합물을 확인하였다.

그 결과, Aβ를 현저하게 분해하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 동정하였다:

[화학식 1]

.

<6-3> 웨스턴 블랏팅(western blotting)을 이용한 화학식 1로 표시되는 화합물의 GCP Ⅱ의 Aβ 분해 활성 분석

상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 GCPⅡ의 Aβ 분해에 미치는 영향을 알아보기 위하여 순수하게 분리된 재조합 인간 GCPⅡ 30.8 ng/ml 와 Aβ 1-42 8 mM 를 섞은 후 상기 화합물을 10 mM씩 넣어 준 후 전체 부피를 25 ml 로 맞추고 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 혼합물을 3-5 ml 정도 4-12% 농도구배 겔(gradient gel)에 로딩(loading) 한 후 분리 시켰다. 분리된 단백질을 PVDF 막(PVDF membrane)으로 이동시킨 후 5% 무지건조유(non fat dry milk)(TBS-T)로 1시간 동안 블로킹(bloking) 하였다. 분해된 Aβ 1-42 를 관찰하기 위하여 6E10 (Covance, 1:5000)으로 4℃에서 하룻밤 동안 보관하였다. TBS-T로 3번 세척한 후 실온에서 HPR-컨쥬게이트된 GAM IgG(HRP-conjugated goat anti-mouse IgG)(Jackson IR, 1:10000)으로 2시간 배양하였다. 다시 한번 TBS-T로 3번 세척한 후 켐일루미네신트 기질(chemiluminescent substrate)(Thermo Scientific)으로 Aβ를 검출하였다(도 6).

그 결과, 도 6에 나타났듯이, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 GCPⅡ의 Aβ 분해를 현저하게 억제함을 확인할 수 있었다.

<6-4> 웨스턴 블랏팅(western blotting)을 이용한 화학식 1로 표시되는 화합물의 NAAG 분해 활성 분석

상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 GCPⅡ의 NAAG 분해에 미치는 영향을 알아보기 위하여 순수하게 분리된 재조합 인간 GCPⅡ 35 ng/ml 와 20 mM의 [³H] NAAG, 10mM의 화학식 1의화합물을 섞은 후 전체 부피를 50 mM 트리스버퍼(Tris buffer)를 이용하여 100 ml로 맞추고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 20분 전에 증류수(DW)와 AG1-X8 레신(resin)을 1:1로 섞어놓은 후 레신은 96 웰 컬럼플레이트(well column plate)(Havard apparatus)에 100 ml씩 로딩(loading)하였다. 배양이 끝난 후 혼합물을 레신이 로딩된 컬럼에 각각 넣어주고 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리 한다. 다시 컬럼에 0.5 M 포르메이트를 100 ml 넣어주고 5 분 후에 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리 한다. 원심분리 후 컬럼을 통과하여 나온 샘플을 2 ml 튜브로 옮기고 액체섬광용액(liquid scintillation solution)(Optiphase HiSafe)를 1 ml 첨가한 후 교반 한 후 방사능 섬광계수기를 이용하여 그 값을 측정하였다.

그 결과, 화학식 1의 경우에는 NAAG의 분해에 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다(도 7).

이상의 결과로, 본 발명자들은 NAAG의 분해에는 영향을 미치지 않으면서, GCPⅡ의 Aβ의 분해를 현저하게 억제하는 GCPⅡ의 S1 포켓에 특이적인 억제 화합물을 선별할 수 있었다.

하기는 본 발명의 화합물을 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

1-1. 산제의 제조

화합물 1 500 ㎎

유당 100 ㎎

탈크 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1-2. 정제의 제조

화합물 1 500 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-3. 캅셀제의 제조

화합물 1 500 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-4. 주사제의 제조

화합물 1 500 ㎎

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-5. 액제의 제조

화합물 1 100 ㎎

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액체를 제조한다.

< 제조예 2> 건강식품의 제조

화합물 1 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎎

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

< 제조예 3> 건강 음료의 제조

화합물 1 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

< 제조예 4> 기타 건강식품의 제조

4-1. 음료의 제조

꿀 522 ㎎

치옥토산아미드 5 ㎎

니코틴산아미드 10 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

이노시톨 30 ㎎

오르트산 50 ㎎

화합물 1 0.48~1.28 ㎎

물 200 ㎖

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

4-2. 츄잉껌의 제조

껌베이스 20 %

설탕 76.36~76.76 %

화합물 1 0.24~0.64 %

후르츠향 1 %

물 2 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.

4-3. 캔디의 제조

설탕 50~60 %

물엿 39.26~49.66 %

화합물 1 0.24~0.64 %

오렌지향 0.1 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.

4-4. 밀가루 식품의 제조

화합물 1 0.5 내지 5 중량부를 밀가루 100 중량부에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4-5. 유제품( dairy products )의 제조

화합물 1 5 내지 10 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

4-6. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화 시켜서 건조한 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메시의 분말로 제조하였다. 검은콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조한 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메시의 분말로 제조하였다. 상기에서 제조한 곡물류 및 종실류와 본 발명의 화합물 1을 다음과 같은 비율로 배합하여 제조하였다.

현미 30 %

율무 15 %

보리 20 %

들깨 7 %

검정콩 7 %

검은깨 7 %

화합물 1 3 %

영지 0.5 %

지황 0.5 %

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 3-플루오로-N-(4-메톡시펜에틸)-N-(1-(4-메톡시페닐)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일)벤즈아마이드(3-fluoro-N-(4-methoxyphenethyl)-N-(1-(4-methoxyphenyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)benzamide) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]

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제 1항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 루게릭병 및 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 GCPⅡ의 S1 포켓(pocket)을 특이적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 시냅스 강화를 일으키는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 세포 내 아밀로이드베타(Aβ)의 항상성을 유지하는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 3-플루오로-N-(4-메톡시펜에틸)-N-(1-(4-메톡시페닐)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일)벤즈아마이드(3-fluoro-N-(4-methoxyphenethyl)-N-(1-(4-methoxyphenyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)benzamide) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물:
[화학식 1]

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제 6항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 루게릭병 및 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 GCPⅡ의 S1 포켓(pocket)을 특이적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물.
1) 시험관내(in vitro)에서 GCPⅡ 발현 세포주에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물과 피검물질을 동시에 또는 순차적으로 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 GCPⅡ의 S1 또는 S1' 포켓의 활성수준을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 GCPⅡ의 S1 또는 S1' 포켓의 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가하거나 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 및 치료제 스크리닝 방법:
[화학식 1]

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제 9항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 루게릭병 및 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료제 스크리닝 방법.
1) 시험관내(in vitro)에서 GCPⅡ에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물과 피검물질을 동시에 또는 순차적으로 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 GCPⅡ의 S1 또는 S1' 포켓의 활성수준을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 GCPⅡ의 S1 또는 S1' 포켓의 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가하거나 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 및 치료제 스크리닝 방법:
[화학식 1]

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제 11항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 루게릭병 및 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 예방 및 치료제 스크리닝 방법.
하기 화학식 1로 표시되는 3-플루오로-N-(4-메톡시펜에틸)-N-(1-(4-메톡시페닐)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일)벤즈아마이드(3-fluoro-N-(4-methoxyphenethyl)-N-(1-(4-methoxyphenyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)benzamide) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 개선용 건강식품:
[화학식 1]

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제 13항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 루게릭병 및 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 개선용 건강식품.
제 13항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 GCPⅡ의 S1 포켓(pocket)을 특이적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 개선용 건강식품.
제 13항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 시냅스 강화를 일으키는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 개선용 건강식품.
제 13항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 세포 내 Aβ의 항상성을 유지하는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환의 개선용 건강식품.