KR101184589B1 - 항생제 함유 배지를 이용한 미세조류의 무균 배양 방법 - Google Patents

항생제 함유 배지를 이용한 미세조류의 무균 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세조류의 무균 배양 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세균 등 각종 오염균들이 포함된 미세조류 샘플로부터 미세조류를 항생제 선택성을 가진 배지를 이용하여 무균적으로 분리 및 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법을 사용하는 경우, 미세조류의 순수 분리가 효율적으로 가능하게 되고, 이러한 순수 분리된 미세조류는 바이오에너지 산업에 적용하기 위한 최적의 배양 조건 확립과 분자생물학적 응용에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항생제 함유 배지를 이용한 미세조류의 무균 배양 방법{AN AXENIC CULTURE METHOD FOR ISOLATION OF MICROALGAE USING A MEDIUM CONTAINING ANTIBIOTICS}
본 발명은 미세조류의 무균 배양 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세균 등 각종 오염균들이 포함된 미세조류 샘플로부터 미세조류를 항생제 선택성을 가진 배지를 이용하여 무균적으로 분리 및 배양하는 방법에 관한 것이다.
세계는 현재 기후변화로 인한 환경위기와 부존자원 고갈이라는 자원위기를 동시에 직면하고 있다. 특히, 온실가스(greenhouse gas) 방출에 의한 지구 온난화로 인해 세계 GDP의 5~20%에 달하는 막대한 경제적 손실이 예상되고 있으며(Stern Review, 2006), 이에 따라 세계 각국은 바이오에너지에 대한 투자와 설비를 크게 늘리고 있으며 세계시장과 산업구조는 저탄소 녹색성장체제로 빠른 속도로 전환되어 가고 있다.
우리나라는 2008년 기준 세계 10대 석유소비국이자 세계 5대 석유수입국(U.S. Energy Information Administration, 2008)으로서 에너지의 해외수입의존도가 절대적인 수준이다. 지난 2005년 발효된 교토의정서(Kyoto Protocol, 1997)에서 한국은 개발도상국으로 분류되어 의무대상국에서 제외되었으나, 2008년 이후 자발적 의무부담을 요구받은 상태이며 2013년 이후 온실가스 의무 감축국으로 분류될 가능성이 아주 높은 상황이며, 이에 따른 탄소배출권 거래시장의 확대에 대한 대비도 시급한 현실이다.
우리나라는 최근 신재생에너지의 중요성을 인식하고 전체 1차 에너지 사용량의 2.4%에 불과한 신재생 에너지 비중을 오는 2015년 4.3%, 2020년에는 6.1%, 2030년에는 11%로 늘리는 목표(지식경제부, 제3차 신/재생에너지 기술개발 및 이용/보급 기본계획안, 2008)하에 기술개발 및 보급사업 등에 대한 지원강화를 모색하고 있으나, 전체 에너지의 97.5%를 원자력 및 화석연료에 의존하고 있는 현실이다(2008년 신재생에너지 보급통계, 에너지관리공단, 신재생에너지센터, 2008).
바이오에탄올로 대표되는 1세대 바이오에너지는 생물연료 생산을 위한 대규모 경작지 확대로 인해 세계 식량부족 및 2차적인 환경오염이라는 또 다른 문제점들을 야기하고 있다. 우리나라에서 사용되는 신재생에너지의 약 30%를 바이오에너지가 차지하고 있으나(지식경제부, 제3차 신/재생에너지 기술개발 및 이용/보급 기본계획안, 2008), 2세대 목질계의 사용이 대부분을 차지하고 있기 때문에 이에 따른 산림의 황폐화가 예상되고 있다.
한편, 3세대 바이오에너지 원료로 전세계적인 관심과 연구가 집중되고 있는 미세조류(예를 들어, 남조류)는 무균상태로 순수분리하는 기술과 최적의 배지 조성 및 생장 조건 결정 등을 통한 대량 배양 방법 등이 핵심적인 기술로 인식되고 있으며, 특히, 미세조류의 무균 순수분리는 종의 생리학적, 분류학적 및 생명공학적 연구를 위해서 필수적인 것이다.
한국의 하천 호수에서 채집한 미세조류는 다양한 오염균과 혼합되어 있으며, 이 상태로는 최적배양조건 분석이 불가능하다. 또한, 미세조류의 종 특성 분석 및 분자생물학적 분류 체계 확립도 순수분리된 경우에만 가능하다. 나아가, 미국 등 선진국에서 집중 투자하고 있는 생명공학적 종 개량도 순수분리된 경우에만 가능하다.
따라서, 한국의 기후와 수자원에 최적화된 한국형 미세조류 바이오에너지 생산을 위해서는 한국토착 미세조류 자원의 활용이 필수이며, 이산화탄소 흡수, 오폐수 정화, 하천 호수 수질 개선과 동시에 그린에너지 생산이 가능하여 기름 한방울 나지 않는 한국의 지속적 신재생 에너지원으로 가장 적합하고 할 수 있다. 그러므로, 미세조류의 바이오에너지 생산 산업화를 위해서는 고속생장, 지질 고함유, 광범위한 환경 적응력 등의 특성을 가지는 우량종 선발이 필수이며 이의 순수분리 기술은 미래 한국형 청정 에너지 생산의 기본적이고 원천적인 기술이라 할 것이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 현황으로부터 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 바이오에너지 생산 산업화를 위하여 필수적인 테마라고 할 수 있는 미세조류의 순수 분리 방법을 제공하고자 한다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여,
본 발명은 미세조류(microalgae)가 포함된 시료를 이미페넴(imipenem) 및 사이클로헥시마이드(cyclohexamide)를 함유하는 배지에 접종하여 암 조건(dark condition)하에서 배양한 후, 명?암 주기를 번갈아가며 재배양하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 무균 배양(axenic culture) 방법을 제공한다.
상기 미세조류는 남조류(cyanobacteria)인 것이 바람직하다.
상기 이미페넴의 농도는 50~200μg/ml인 것이 바람직하다.
상기 사이클로헥시마이드의 농도는 20~250μg/ml인 것이 바람직하다.
상기 배지는 포도당을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 배양은 상기 시료를 전배양(subculture)한 후 원심분리하여 얻은 펠릿(pellets)을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 전배양은 사이클로헥시마이드를 함유하는 배지에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 전배양의 배지에 함유되는 사이클로헥시마이드의 농도는 20~250μg/ml인 것이 바람직하다.
상기 배양은 1~3주 동안 수행되는 것이 바람직하다.
상기 배양은 20~30℃에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 명?암 주기는 명:암 = 1~3:1인 것이 바람직하다.
상기 명?암 주기는 1일인 것이 바람직하다.
상기 재배양은 20~30℃에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 배양 및 재배양은 BG-110 한천 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 방법에는 상기 재배양 후, 성장한 미세조류 사상체(filaments)를 새로운 배지에 무균적으로 이동시켜 반복배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 반복배양은 미세조류가 순수 분리될 때까지 반복하는 것이 바람직하다.
상기 반복배양은 BG-110 한천 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 분리된 미세조류를 배지에 접종한 후 암실에서 확인배양하여 상기 미세조류가 무균 분리된 것을 확인하는 방법을 제공한다.
상기 확인배양은 7~14일 동안 수행되는 것이 바람직하다.
상기 확인배양은 R2A 또는 LB 한천 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법을 사용하는 경우, 미세조류의 순수 분리가 효율적으로 가능하게 되고, 이러한 순수 분리된 미세조류는 바이오에너지 산업에 적용하기 위한 최적의 배양 조건 확립과 분자생물학적 응용에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 남조류가 포함된 시료를 채취한 대청호의 사진이다.
도 2는 남조류의 대사과정을 설명한 모식도 및 이의 현미경 사진이다.
도 3은 순수 분리 전의 시료를 배양한 사진이다.
도 4는 순수 분리 후의 남조류의 배양 사진이다.
도 5는 순수 분리된 남조류를 배양한 세포 배양액 사진이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 미세조류 무균배양 방법은 미세조류(microalgae)가 포함된 시료를 이미페넴(imipenem) 및 사이클로헥시마이드(cyclohexamide)를 함유하는 배지(medium)에 접종하여 암 조건(dark condition)하에서 배양(culture)한 후, 명?암 주기를 번갈아가며 재배양하는 것을 특징으로 한다.
상기 미세조류는 바이오에너지 산업에 사용 가능한 종류라면 그 종류에 제한이 없으나, 바람직하게는 남조류(cyanobacteria)이다. 미세조류의 일종인 남조류는 약 35억 년 전 지구상에 출현하여 부산물로 산소를 방출했던 최초의 생물체로서 오늘날과 같은 산소적 환경의 지구 대기조성에 크게 기여하였다. 남조류는 절대적 광합성 독립영양균(photoautotrophs)으로 탄소원으로 이산화탄소(CO2)를 사용하며 소량의 미량원소만 존재하면 대기 중 질소가스를 고정하여 단시간에 대량의 바이오에너지 재료물질(biomass) 생산이 가능한 특징이 있다.
특히, 남조류는 바이오에너지 생산을 위해 재배되는 육생작물들과 비교하여 높은 광합성 효율을 가지고 있으며, 대규모 면적의 경작지를 요구하지 않는다는 장점이 있고, 한정된 영양분만을 필요로 하며 성장률이 매우 빠르고(3.5~6시간 내에 2배 이상 성장하는 종도 있음) 공해 및 온실가스를 배출하지 않으며, 대기 중 이산화탄소를 고정하는 환경 친화적인 미생물로서 바이오에너지 산업에 적합한 생물종이다(도 2참고). 상기 미세조류가 포함된 샘플은 강, 하천, 바다 등에서 채취될 수 있으며, 바람직하게는 담수호에서 채취되는 것이다.
본 발명의 무균 배양 방법은 미세조류 이외의 오염균이 완전히 제거된 순수 분리된 미세조류를 제공하고자 하는 것이며, 순수 분리는 미세조류의 유전학적, 생리학적 및 분류학적 연구에 필수적인 필요조건이라고 할 수 있다. 순수 분리를 위하여는 미세조류의 생육에는 영향이 거의 미치지 않고, 오염균들만을 선택적으로 제거하는 방법이 사용될 수 있는데, 본 발명은 이러한 오염균의 선택적 제거를 위하여 이미페넴과 사이클로헥시마이드를 함유하는 배지를 사용한다.
상기 이미페넴과 사이클로헥시마이드의 농도는 순수 분리하고자 하는 미세조류의 종류에 따라 조절될 수는 있으나, 바람직한 이미페넴의 농도는 50~200μg/ml이고, 사이클로헥시마이드의 농도는 20~250μg/ml이다. 상기 범위보다 적은 농도를 사용하는 경우에는 오염균들의 효과적인 제거가 어려워지며, 상기 범위보다 많은 농도를 사용하는 경우에는 미세조류의 생장이 어려워지는 문제점이 생긴다.
상기 배지에는 포도당이 포함될 수 있다. 미세조류는 독립광합성 세균으로서 생장을 위하여 탄소원을 거의 필요하지 않는다. 그러나, 배지에 포도당, 바람직하게는 0.1% 농도의 포도당이 첨가되면 암 조건 하에서 미세조류의 생장은 영향을 받지 않으나, 오염균들은 포도당을 탄소원으로 이용하여 세포분열을 계속하게 되어 이미페넴의 세포벽 합성 억제 기작에 의해 사멸 속도가 증가되는 효과를 나타낸다.
본 발명의 배양 단계는 자연으로부터 채취된 미세조류가 포함된 시료를 직접 접종할 수도 있으나, 바람직하게는 상기 샘플을 전배양한 후 원심분리하여 얻은 펠릿을 사용한다. 전배양 과정에서는 배지에 추가적으로 사이클로헥시마이드를 첨가할 수 있는데, 이에 의하여 시료 내의 진핵성 오염균들을 제거하는 효과를 가진다. 상기 사이클로헥시마이드의 농도는 시료의 상태에 따라 적절히 조절될 수 있으나, 20~250μg/ml의 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 농도보다 적은 양을 사용하는 경우에는 시료 내의 오염균의 제거가 충분하지 못하여 배양시 효과적인 무균 배양이 이루어질 수 없고, 상기 농도보다 많은 양을 사용하는 경우에는 미세조류의 생장에 악영향을 미치는 문제점이 있다. 전배양된 배양물은 미세조류가 세균보다 무거운 특성을 이용하여 원심분리하여 세포 펠릿을 얻고 상기 펠릿을 아래의 배양시 사용하게 된다.
본 발명의 배양은 미세조류 사상체가 충분히 육안으로 관찰될 수 있는 기간 동안 배양될 수 있으며, 바람직하게는 1~3주이다. 배양 시간이 1주 미만인 경우 미세조류가 충분한 사상체를 생성시킬 정도로 생장할 수 없으며, 3주를 초과하는 경우에는 이미페넴의 항생효과가 사라져 오히려 오염균의 번식이 늘어나는 문제점이 있다. 상기 배양은 20~30℃에서 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 25℃에서 배양하는 것이다. 미세조류의 생육 환경은 종에 따라 다양할 수 있지만, 일반적인 우리나라 담수에 생존하는 미세조류의 경우 상기 온도에서 가장 활발한 생장을 하므로 상기 온도 범위에서 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명의 순수 분리를 위한 배양 단계에서는 이미페넴과 사이클로헥시마이드의 사용과 더불어 배양 조건으로서 암 조건하에서 배양하는 것이 특징이다. 이와 같은 암 조건하에서는 독립영양생물인 미세조류의 생장은 정지하게 되고, 세균 등의 종속영양생물만이 외부로부터 영양분을 유입하여 생장하게 되는데, 유입되는 영양분 중에 포함되어 있는 이미페넴과 사이클로헥시마이드가 오염균의 세포벽 합성을 억제하여 오염균을 제거하는 역할을 한다.
본 발명의 방법은 상기 배양 단계 후 명?암 주기를 번갈아가면서 재배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이와 같은 단계는 상기 배양 과정 동안 살아남은 미세조류에 일정한 간격으로 빛을 주어 미세조류가 생장을 회복시키는 과정이다. 명?암 주기는 미세조류의 종에 따라 변화될 수 있으나, 바람직하게는 1일이다. 즉, 16시간의 명기와 8시간의 암기 조건하에서 재배양시키는 것이 바람직하다.
상기 재배양은 미세조류의 생장을 회복시키는 단계로서 20~30℃에서 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 25℃에서 배양하는 것이다. 미세조류의 생육 환경은 종에 따라 다양할 수 있지만, 일반적인 우리나라 담수에 생존하는 미세조류의 경우 상기 온도에서 가장 활발한 생장을 하므로 상기 온도 범위에서 재배양하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 배양 및 재배양은 미세조류를 생장시킬 수 있는 배지라면 어떠한 종류라도 무방하나, 바람직하게는 BG-110 배지이고, 가장 바람직하게는 BG-110 한천 배지이다.
본 발명의 방법에 따른 상기 배양과 재배양을 거친 배지에 육안으로 미세조류 사상체가 관찰되면 순수 배양을 위한 마지막 단계로서 성장한 미세조류 사상체를 새로운 한천 배지에 무균적으로 이동시켜 오염균들과 물리적으로 분리시키는 추가적인 반복배양 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 이 반복배양 단계에 의하여 미세조류의 순수 분리가 완성될 수 있으며, 상기 반복배양은 순수 분리가 완결될 때까지 반복하는 것이 바람직하다. 본 발명의 상기 배양 및 재배양은 미세조류를 생장시킬 수 있는 배지라면 어떠한 종류라도 무방하나, 바람직하게는 BG-110 배지이고, 가장 바람직하게는 BG-110 한천 배지이다.
상술한 방법에 의하여 미세조류가 포함된 시료로부터 미세조류만을 순수 분리되며, 본 발명은 미세조류가 순수 분리되었는지 여부를 판단하기 위하여 다음과 같은 추가적인 확인 방법을 제공한다. 상기 확인 방법은 순수 분리되었다고 판단되는 배지 상의 미세조류 사상체를 새로운 배지에 접종한 후, 암실에서 배양하여 미세조류 이외의 오염균들의 증식 여부를 확인하는 것이다.
상기 확인배양은 7~14일 동안 수행되는 것이 바람직하며, 7일 미만으로 배양하는 경우 생장이 느린 오염균의 존재 여부를 확인할 수 없으며, 14일을 초과하는 경우 배양 시간만 길어질 뿐 오염균의 존재 여부가 변경되는 경우는 거의 없다. 상기 확인배양은 일반적인 세균 배양용 배지를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 R2A 또는 LB 배지이고, 가장 바람직하게는 R2A 또는 LB 한천 배지이다.
이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참고하여 바람직한 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 본 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예일 뿐이며, 본 발명의 범위가 아래에서 설명된 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
1. 시료의 준비
남조류가 풍부하게 존재하는 환경시료를 2009년 9월 2일에 대청호에서 채취하였다. 채취된 시료를 즉시 실험실로 옮겼다. 도 1은 시료를 채취한 대청호의 모습을 찍은 사진이다.
2. 전배양 및 세포 수거
준비된 샘플 1ml를 사이클로헥시마이드 250μg/ml가 함유된 BG-110 배지 100ml에 접종하였다. 플라스크를 남조류 성장이 육안으로 충분히 관찰될 때까지 160rpm, 25℃에서 배양하였다. 세포배양액 1.5ml를 3000×g에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 버리고 펠릿을 배양에 사용하였다.
3. 배양 및 재배양
상기 펠릿을 0.1% 포도당, 이미페넴(100μg/ml), 사이클로헥시마이드(20μg/ml)을 함유한 BG-110 한천 배지에 획선 접종하고, 빛이 없는 조건하에서 25℃에서 24시간 동안 배양하였다. 다음으로, 배지를 빛이 있는 상태에서 16시간, 빛이 없는 상태에서 8시간을 주기로 25℃에서 배양하면서 매일 상태를 관찰하였다.
4. 반복 배양
재배양으로 한천 배지에 육안으로 남조류가 관찰되면, 남조류 사상체를 선별하여 무균적으로 새로운 BG-110 한천 배지에 이동시켰다. 매일 변화를 관찰하면서, 반복 배양 과정을 순수 분리될 때까지 반복실시하였다.
5. 무균 배양의 확인 및 순수 배양
순수 분리되었다고 판단되는 배지로부터 남조류 사상체를 LB 한천 배지에 획선 접종하고, 빛이 없는 조건하에서 7일간 배양하였다. 남조류 이외의 오염균의 증식이 관찰되지 않음을 확인하고, 남조류의 무균 배양을 최종 확인하였다. 무균 배양 전과 무균 배양 후의 배지를 도 4에 나타내었다.
최종적으로 무균 분리된 남조류를 40ml BG-110 배지에서 배양하여 세포 배양물을 얻었다(도 5).

Claims (20)

  1. 미세조류가 포함된 시료를 20-250㎍/ml 농도의 사이클로헥시마이드를 함유한 배지에서 전배양(subculture)한 후, 전배양물을 원심분리하여 얻은 펠릿(pellets)을 50-200㎍/ml 농도의 이미페넴(imipenem), 20-240㎍/ml 농도의 사이클로헥시마이드(cyclohexamide) 및 포도당을 함유하는 한천배지에 획선 접종하여 암 조건(dark condition)하에서 배양한 후, 명 암 주기를 번갈아가며 재배양한 후, 성장한 미세조류 사상체(filaments)를 새로운 한천배지에 무균적으로 이동시켜 미세조류가 순수분리될 때까지 반복배양하고 분리된 미세조류를 R2A 또는 LB 한천 배지에 접종한 후 암실에서 7-14일 동안 확인배양하여 상기 미세 조류가 무균분리된 것을 확인하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 무균 배양(axenic culture)방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 미세조류는 남조류(cyanobacteria)인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 1항에 있어서, 상기 배양은 1~3주 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 배양은 20~30℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 명?암 주기는 명:암 = 1~3:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 명?암 주기는 1일인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 재배양은 20~30℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 배양 및 재배양은 BG-110 한천 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제 1항에 있어서, 상기 반복배양은 BG-110 한천 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
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