KR101145689B1 - Transgenic bentgrass plants with herbicide resistance and disease resistance - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제초제 저항성 및 병 저항성을 갖는 형질전환 잔디에 관한 것으로, 보다 상세하게는 제조제 저항성 유전자 bar 및 병 저항성 유전자 PepEST1가 도입된 제초제 저항성 및 병 저항성 형질전환 잔디로서, 상기 본 발명에 따른 형질전환 잔디는 제초제 저항성 및 병 저항성을 동시에 가짐으로써 생육에 대한 안정성이 유지되면서, 생물적, 비생물적 스트레스에 대한 내성이 증가된 잔디의 계통을 육성할 수 있을 뿐만 아니라 레져 및 스포츠산업을 비롯한 사회 전반에서 급격히 증가되는 고부가가치 유전공학 잔디 품종 개발에 크게 기여할 것이다. The present invention relates to a transformed grass having herbicide resistance and disease resistance, and more particularly, to a herbicide resistant and disease resistant transformed grass into which a producer resistance gene bar and a disease resistance gene PepEST1 are introduced. Transition turf maintains growth stability by having herbicide resistance and disease resistance at the same time, while not only fostering a system of grass with increased resistance to biological and abiotic stresses, but also to leisure and sports industries. It will contribute greatly to the development of high value-added genetically engineered grass varieties that are rapidly increasing in the first half.

Description

제초제 저항성 및 병 저항성을 갖는 형질전환 잔디{Transgenic bentgrass plants with herbicide resistance and disease resistance}Transgenic bentgrass plants with herbicide resistance and disease resistance

본 발명은 제초제 저항성 및 병 저항성을 갖는 형질전환 잔디에 관한 것으로, 보다 상세하게는 제조제 저항성 유전자 bar 및 병 저항성 유전자 PepEST1가 도입된 제초제 저항성 및 병 저항성 형질전환 잔디에 관한 것이다.The present invention relates to a transgenic grass having herbicide resistance and disease resistance, and more particularly, to a herbicide resistant and disease resistant transgenic grass into which a producer resistance gene bar and a disease resistance gene PepEST1 are introduced.

벤트그라스는 경제적으로 매우 중요한 한지형 잔디로서, 부드러운 표면 질감과 밀식 생장, 그리고 낮은 예초에 대한 높은 내성으로 인하여 골프장의 퍼팅 그린이나 골프 코스의 페어웨이에 주로 사용되는 잔디이다. 이 밖에도 조경용 잔디 광장, 도로 주변의 잔디 및 가축의 사료 등으로 쓰일 수 있으며, 벤트그라스의 잔디 색은 올리브 그린에서 옅은 녹색을 띄고 있다. Ventgrass is an economically important cold-land grass that is mainly used for golf courses on putting greens or golf courses due to its soft surface texture, dense growth and high resistance to low mowing. In addition, it can be used for landscaping grass squares, grass around roads and livestock feed, and the grass color of Bentgrass is light green from olive green.

이러한 벤트그라스 재배 및 관리를 위해서는 적절한 배수, 관개, 병해관리 등이 특히 중요하다. 특히, 우리나라와 같이 여름철에 고온 다습한 기후를 갖는 경우에, 토양의 곰팡이에 의한 병 발생이 크게 문제가 되며, 더구나 벤트그라스와 같이 밀식 생장으로 인한 통기성과 투수성이 불량한 잔디의 경우 높은 발병률을 보이고 있다.Proper drainage, irrigation, and disease management are especially important for the ventgrass cultivation and management. In particular, in case of having a high temperature and humidity climate in summer, as in Korea, the disease caused by the fungus of the soil is a big problem, moreover, in the case of poorly breathable and permeable grass due to dense growth, such as bentgrass has a high incidence rate It is showing.

또한, 잔디는 심는 것뿐만 아니라 관리가 매우 중요한 것으로, 특히 번식력이 강하고 뿌리가 질긴 크로버나 쑥 등의 잡초에 의해 잔디의 번식력이 약화되어 잔디가 제대로 성장하지 못함으로써 고가의 잔디를 죽이는 경우가 빈번하게 발생하고 있으며, 이로 인하여 잔디를 다시 심는 문제점이 뒤따르고 있어 유지관리 비용이 많이 드는 작물로서 잔디는 생명공학 기법을 이용한 고부가가치 유전공학 잔디 품종 개발의 필요성과 기대가 증대되고 있다.In addition, grass is not only planted, but management is very important. Especially, the grass is weakened by weeds such as crocus or wormwood with strong fertility and roots. As a result, there is a problem of replanting the grass, which is a costly maintenance crop, and the need for and development of high value-added genetic engineering grass varieties using biotechnology is increasing.

이에 본 발명자들은 잔디밭 특히 벤트그라스의 생육에 대한 안정성이 유지되면서, 유용한 농업적 특성 또는 기능성을 부여하는 유전자를 도입하여 잔디의 효율적인 품종 육성방법에 관한 연구를 수행해오던 중 제초제 저항성 및 병 저항성을 동시에 가지는 형질전환 잔디를 개발하고 본 발명을 완성하였다.The present inventors, while maintaining stability on the growth of lawns in particular bentgrass, while introducing a gene that gives useful agricultural characteristics or functionality, while conducting research on efficient breeding methods of grass at the same time herbicide resistance and disease resistance Eggplants have developed transgenic grass and completed the present invention.

본 발명의 목적은 잡초 제거를 위해 사용되는 여러 종류의 제초제의 과량 사용에 따른 피해도 줄이고, 여름철의 고온 다습한 기후에 의해 발생하는 곰팡이 병에 저항성을 동시에 갖는 기능성 형질전환 잔디를 제공하고자 한다.An object of the present invention is to reduce the damage caused by the excessive use of various types of herbicides used for weed removal, and to provide a functional transgenic grass simultaneously having resistance to fungal diseases caused by high temperature and high humidity in summer.

본 발명에 따른 형질전환 잔디는 PepEST1 유전자 및 Bar 유전자가 포함된 벡터를 이용하여 형질전환 된 것을 특징으로 하며, 상기 잔디는 벤트그라스(Bentgrass)인 것을 특징으로 한다.Transformed grass according to the invention is characterized in that the transformed using a vector containing the PepEST1 gene and Bar gene, the grass is characterized in that the Bentgrass (Bentgrass).

본 발명에 따른 형질전환 잔디는 글루포시네이트(glufosinate)를 유효성분으로 함유하는 제조제 저항성 및 갈색 잎마름병 또는 동전 마름병에 대한 병 저항성을 갖는 것을 특징으로 한다.Transformed grass according to the present invention is characterized by having a resistance to the manufacture of glufosinate (glufosinate) as an active ingredient and to brown leaf blight or coin blight.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 PepEST1 유전자 및 Bar 유전자가 포함된 벡터로 형질전환 된 제초제 저항성 및 병 저항성을 동시에 갖는 형질전환 잔디를 제공한다.The present invention provides a transgenic grass having both herbicide resistance and disease resistance transformed with a vector containing the PepEST1 gene and the Bar gene.

상기 PepEST1 단백질은 곰팡이의 부착기 형성(appressorium formation) 및 감염된 균사의 형성을 억제하여 곰팡이가 식물체로 침입하는 것을 미연에 방지하기에 병 발생이 일어나지 않는 것으로 보고 된 바 있으며(Kim et al., 2001), 상기 Bar(bialaphos resistance gene) 단백질은 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 자신이 생산한 포스피노트리신을 아세틸화하여 무독화시키는 효소인 포스피노트리 신아세틸전이효소(phosphinothricin acetyltransferase)의 유전자를 암호화하며, 제초제인 포스피노트리신과 비알라포스(bialaphos)에 대한 저항성이 보고 된 바 있다.The PepEST1 protein has been reported to prevent disease from occurring because it inhibits mold formation and infected mycelium, preventing mold from entering the plant (Kim et al., 2001). The Bar (bialaphos resistance gene) protein encodes a gene of phosphinothricin acetyltransferase, an enzyme that acetylates and detoxifies phosphinothricin produced by Streptomyces hygroscopyus itself. Resistance to phosphorus phosphinothricin and bialaphos has been reported.

보다 상세하게는 본 발명의 형질전환 잔디는 상기 PepEST1 유전자 및 Bar 유전자가 포함된 벡터로 형질전환 되는 것으로, 상기 PepEST1 유전자 및 Bar 유전자는 발현을 위해 유비퀴틴 프로모터(Pubi) 또는 35S 프로모터(P35S)를 이용하고 있으며, 전사 종결자로는 ARBCS(TArbcs) 터미네이터 또는 35S 터미네이터(T35S)를 이용하고 있으며, 구체적인 예로서 PepEST1 유전자는 유비퀴틴 프로모터와 ARBCS 터미네이터 사이에, Bar 유전자는 35S 프로모터와 35S 터미네이터 사이에 존재하며, PepEST1 유전자 및 Bar 유전자가 포함된 벡터로 제초제 저항성 및 병 저항성을 동시에 갖는 형질전환 잔디를 제조하는 것을 특징으로 한다.More specifically, the transgenic grass of the present invention is transformed with a vector including the PepEST1 gene and Bar gene, and the PepEST1 gene and Bar gene are ubiquitin promoters (P ubi ) or 35S promoters (P 35S ) for expression. As a transcription terminator, ARBCS (T Arbcs ) Terminator or 35S Terminator (T 35S ) is used. As a specific example, the PepEST1 gene is between the ubiquitin promoter and the ARBCS terminator, and the Bar gene is between the 35S promoter and the 35S terminator. In the present invention, a transgenic grass having both herbicide resistance and disease resistance is produced by a vector containing the PepEST1 gene and the Bar gene.

본 발명에 따른 상기 벡터는 도 1의 제한효소 지도를 갖는 것을 특징으로 하며, 상기 벡터는 아그로박테리움(agrobacterium)에 의해 잔디 배발생능 캘러스에 형질전환 되는 것으로, 상기 캘러스는 0.2 내지 0.8 ㎎/ℓ의 키네틴(kinetin)이 포함된 캘러스 유도 배지에서 배양된 것을 특징으로 한다.And characterized by having the vector is the restriction enzyme map of Fig. 1 according to the present invention, the vector is Agrobacterium to be transformed into a grass embryogenic capacity callus by tumefaciens (agrobacterium), wherein the callus is from 0.2 to 0.8 ㎎ / It is characterized in that cultured in callus induction medium containing l of kinetin (kinetin).

보다 상세하게는 잔디 종자를 소독한 후, 종자를 캘러스 유도 배지에 치상하여 25℃에서 4주간의 암 배양을 통해서 배발생능 캘러스를 획득하고, 형질전환에 적합한 캘러스를 선발하여 0.5 mg/L 키네틴(kinetin)이 첨가된 캘러스 유도 배지에서 1주일간 배양한 후, 숙주 미생물인 형질전환 된 아그로박테리움 EHA105을 이용 하여 제초제 저항성 및 병 저항성을 동시에 갖는 형질전환 잔디를 제조하였다. 상기 형질전환 된 아그로박테리움 EHA105는 본 발명에 따른 도 1의 B에 나타낸 제한효소 지도를 갖는 잔디 형질전환용 벡터를 통상의 방법으로 숙주 미생물인 아그로박테리움 EHA105에 형질전환 시킨 것이다.More specifically, after disinfecting the grass seed, seed is placed in callus induction medium to obtain embryogenic callus through cancer culture at 25 ° C. for 4 weeks, and the callus suitable for transformation is selected and 0.5 mg / L kinetin After culturing for one week in the callus-inducing medium to which (kinetin) was added, a transformed grass having both herbicide resistance and disease resistance was prepared using the transformed Agrobacterium EHA105 which is a host microorganism. The transformed Agrobacterium EHA105 is transformed into a host microorganism Agrobacterium EHA105 by a conventional method of the grass transformation vector having the restriction enzyme map shown in FIG. 1B according to the present invention.

본 발명에서는, 형질전환 잔디의 잎으로부터 게놈 DNA, total RNA 및 total 단백질을 분리하여 분자생물학적 분석을 수행하였다.In the present invention, genomic DNA, total RNA and total protein were isolated from the leaves of the transgenic grass and molecular biological analysis was performed.

보다 상세하게는 형질전환 된 잔디의 유전자 도입여부를 확인하기 위하여 게놈 중합효소 연쇄반응을 수행하여 bar 및 PepEST1 유전자의 도입을 확인하고, 상기 게놈 중합효소 연쇄반응으로 확인된 개체의 잔디의 게놈 DNA를 제한효소 HindIII 또는 EcoRI으로 절단하여 중합효소 연쇄반응으로 증폭된 bar 유전자 단편을 프로브로 하여 서던 블롯(Southern blot) 분석을 수행한 결과 bar 유전자가 효율적으로 도입되었음을 확인하였다. 도 1 및 도 2를 참조한다. More specifically, the genomic polymerase chain reaction was performed to confirm the introduction of the transgenic grass and confirmed the introduction of bar and PepEST1 genes, and the genomic DNA of the grass of the individual identified by the genomic polymerase chain reaction was confirmed. Southern blot analysis was performed using a bar gene fragment amplified by restriction enzyme Hind III or EcoR I and amplified by polymerase chain reaction to confirm that the bar gene was efficiently introduced. See FIGS. 1 and 2.

또한, 도입 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여 상기 서던 블롯(Southern blot) 분석으로 확인된 개체들의 total RNA를 이용하여 중합효소 연쇄반응으로 증폭된 bar 유전자 또는 PepEST1 유전자 단편을 프로브로 하여 노던 블롯(Northern blot)을 수행한 결과 도입된 유전자의 mRNA 발현을 확인하고, 상기 노던 블롯(Northern blot) 분석으로 확인된 개체들의 total 단백질을 이용하여 PepEST1-specific polyclonal 항체와 anti-rabbit monoclonal 항체(Sigma, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행한 결과 도입된 유전자의 단백질의 효율적으로 발현되었음을 확인하였다. 도 3을 참조한다.In addition, Northern blot (Northern) using a bar gene or PepEST1 gene fragment amplified by polymerase chain reaction using total RNA of the individuals identified by Southern blot analysis to confirm the expression of the introduced gene. blot), and confirmed the mRNA expression of the introduced gene, using the total protein of the individuals identified by the Northern blot analysis using the PepEST1-specific polyclonal antibody and anti-rabbit monoclonal antibody (Sigma, USA) Western blot using was confirmed that the efficient expression of the protein of the introduced gene. See FIG. 3.

본 발명에 따른 형질전환 잔디는 글루포시네이트(glufosinate)를 유효성분으로 함유하는 제초제에 저항성이 있는 것으로, 상기 제조제는 D, L-글루포시네이트, D, L-글루포시네이트-암모늄, L-글루포시네이트, L-글루포시네이트-암모늄, 비알라포스 및 비알라포스-소디움으로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 한 종 이상인 것을 특징으로 한다.Transformed grass according to the invention is resistant to herbicides containing glufosinate (glufosinate) as an active ingredient, the preparation is D, L-glufosinate, D, L-glufosinate-ammonium, L -Glufosinate, L-glufosinate-ammonium, bialaphos and bialaphosium-sodium, characterized in that any one or more selected from the group consisting of.

구체적인 예로, 온실에서 2 주간 키운 형질전환 잔디 및 일반 잔디(NT, Non-transgenic)에 0.8%(v/v) BASTA(18% glufosinate ammonium 포함)를 살포하고 10일 후에 제초제 저항성 여부를 확인한 결과, 일반 잔디는 10일 후에 노랗게 말라 죽는 데 반해 형질전환 잔디의 개체들은 여전히 제초제 처리 전이나 처리 후에도 변함없이 푸르름을 유지하는 것을 확인하였다. 도 6을 참조한다.As a specific example, 0.8% (v / v) BASTA (including 18% glufosinate ammonium) was applied to transgenic grass and non-transgenic grass grown for two weeks in a greenhouse, and 10 days later, we checked herbicide resistance. Normal grass dries yellow after 10 days, whereas individuals in transgenic grass still remain green before or after herbicide treatment. See FIG. 6.

본 발명에 따른 형질전환 잔디는 갈색 잎마름병 또는 동전 마름병에 저항성을 가지는 것을 특징으로 하며, 상기 잔디는 벤트그라스(Bentgrass)인 것을 특징으로 한다.Transgenic grass according to the present invention is characterized by having resistance to brown leaf blight or coin blight, and the grass is characterized in that the Bentgrass (Bentgrass).

상기 벤트그라스에 병을 일으키는 대표적인 곰팡이 균에는 Rizoctonia solani AG1-1A, Sclerotinia homoeocarpa, Phythium aphanidermatum 등이 있으며, 이들 곰팡이들에 의해 각각 갈색 잎 마름병(Brown patch; Rizoctonia solani AG1-1A), 동전 마름병(Dollar spot; Sclerotinia homoeocarpa), 피시움 블라이트병(Phythium blight; Phythium aphanidermatum) 등이 발생한다. 특히 골프장에서 크게 문제되는 갈색 잎마름병의 경우, 여름철에서 초가을(7월 내지 9월)의 고온기(22 내지 28℃)에 주로 발병하며, 잔디밭에서 직경 수십 cm의 둥글고 짙은 갈색 패치를 보이는 특징을 가지고 있다. 이러한 병의 발생에는 지속적인 강우나 과다한 질소질 비료의 시비가 원인이 될 수도 있으며, 발병지의 잔디는 구름 형태로 시들고 직립경(直立莖)의 아래쪽에 병균이 침입하여 줄기가 쉽게 뽑혀 나오는 특징을 갖는다. 동전 마름병은 잔디 잎 또는 줄기에 불규칙적으로 황록색 또는 황갈색의 반점이 발생하며, 이른 아침 이슬이 남아 있을 때 간혹 균사(mycelium)를 눈으로 볼 수도 있다. 병이 진전되면 병반 주위는 보리 짚 색깔의 변색부를 부분적으로 나타내며, 잎이 마르고 잔디가 고사하게 된다. 병반의 크기는 미화 1달러 동전 모양으로(직경 3 내지 5cm) 확대되는 특징을 보인다. 이 병은 다른 병과 달리 질소 부족과 건조한 토양 상태에서 많이 발생하며 주로 초여름과 초가을의 기온이 높고 습한 기후에서 많이 발생한다. 병반이 보리짚색 깔대를 형성하고 주위는 진한 갈색을 띠는 것이 특징을 지니고 있다(김형기, 2001). Rizoctonia is a representative fungus that causes disease in the bentgrass. solani AG1-1A, Sclerotinia homoeocarpa , Phythium aphanidermatum , and each of these fungi causes brown leaf blight, Rizoctonia. solani AG1-1A), Dollar spot ( Sclerotinia homoeocarpa ), Phythium blight ( Phythium) aphanidermatum ), etc. In particular, brown leaf blight, which is a major problem in golf courses, is mainly affected by the high temperature (22-28 ° C) of early autumn (July-September) in summer, and has a feature of showing round, dark brown patches of several tens of centimeters in diameter on the lawn. have. The occurrence of this disease may be caused by continuous rainfall or excessive fertilization of nitrogenous fertilizers, and the grass of the diseased area is wilted in the form of clouds, and germs are invaded in the lower part of the upright diameter so that the stem is easily pulled out. Coin blight is irregularly yellowish green or yellowish brown spots on grass leaves or stems, and sometimes mycelium may be visible when early morning dew remains. As the disease progresses, the area around the bed will partially show a barley straw-colored discoloration, and the leaves will dry out and the grass will die. The size of the lesions is characterized by an enlargement of US dollar coins (3-5 cm in diameter). Unlike other diseases, the disease is caused by nitrogen deficiency and dry soil conditions, and is mainly caused by high, humid weather in early summer and early autumn. It is characterized by the fact that the lesions form barley straws and dark brown around them (Kim, 2001).

상기한 바와 같이 벤트그라스(Bentgrass)는 갈색 잎마름병 또는 동전 마름병에 매우 높은 민감성을 나타내는 것으로, 본 발명에 따른 형질전환 잔디는 상기 병에 대한 저항성을 가지는 것을 특징으로 한다.Bentgrass (Bentgrass) as described above exhibits a very high sensitivity to brown leaf blight or coin blight, transgenic grass according to the invention is characterized in that it has resistance to the disease.

구체적인 예로, 도입 유전자의 항진균 활성을 조사하기 위하여 벤트라스에 주요한 곰팡이 병을 일으키는 세 종류의 곰팡이인 갈색마름병(Rizoctonia solani AG1-1A), 동전마름병(Sclerotinia homoeocarpa), 피시움 블라이트병(Phythium aphanidermatum)의 균사체들 접종하고, 정제된 단백질을 농도별로 접종하여 신장하는 균사의 억제하는 정도를 확인한 결과, 농도 의존적으로 갈색마름병(Rizoctonia solani AG1-1A) 또는 동전마름병(Sclerotinia homoeocarpa)의 발병률을 저해하는 것을 확인하였다. 도 4를 참조한다.As a specific example, three types of fungi, Rizoctonia , which cause major fungal diseases in Ventras to investigate the antifungal activity of the transgene. solani AG1-1A), coin blight (Sclerotinia homoeocarpa), Fish Umm Blight disease (the mycelium inoculation and vaccination with the purified protein concentration by checking the degree of inhibition of mycelium extending the results of Phythium aphanidermatum), a concentration-dependent manner Brown Rizoctonia solani AG1-1A) or Sclerotinia homoeocarpa was found to inhibit the incidence of. See FIG. 4.

또한, 형질전환 잔디의 자른 잎 및 형질전환 잔디 전체 식물체의 병 저항성에서도, 곰팡이 병 감염에 의한 다수의 병반과 함께 잎이 시드는 일반 잔디와는 달리 형질전환 잔디에서는 곰팡이 병에 의한 병반이 없는 건강한 잎을 관찰할 수 있었다. 도 5 및 도 7을 참조한다. In addition, in the resistance of crops of the transformed grass and disease of the whole plant of the transformed grass, healthy leaves without lesions caused by the fungal disease in the transgenic grass, unlike the general grass that leaves with a large number of lesions caused by fungal disease infection Could be observed. See FIGS. 5 and 7.

본 발명에 따른 형질전환 잔디는 제초제 저항성 및 병 저항성을 가짐으로써 생육에 대한 안정성이 유지되면서, 생물적, 비생물적 스트레스에 대한 내성이 증가된 잔디의 계통을 육성할 수 있을 뿐만 아니라 레져 및 스포츠산업을 비롯한 사회 전반에서 급격히 증가되는 고부가가치 유전공학 잔디 품종 개발에 크게 기여할 것이다. Transformed turf according to the present invention has the herbicide resistance and disease resistance, while maintaining stability to growth, can not only cultivate a system of grass with increased resistance to biological and abiotic stress, but also leisure and sports It will contribute greatly to the development of high value-added genetically engineered grass varieties, which are rapidly increasing in industry and society as a whole.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

[[ 실시예Example 1] 잔디 형질전환용 벡터 제작  1] Development of vector for grass transformation

잔디 형질전환을 위한 유전자 벡터는 pCAMBIA 3301 벡터 (http://www.cambia.org)에 잔디 형질전환에 필요한 유전자 카세트를 삽입하여 사용하였다. 단자엽 식물인 잔디의 형질전환을 위하여 옥수수의 유비퀴틴(ubiquitin) 유전자의 프로모터(Pubi)를 사용하였으며, 애기장대의 RBCS 유전자(ARBCS)의 터미네이터(TArbcs)를 전사 종결자(transcriptional terminator)로 사용하였다. 고추의 PepEST1 유전자는 유비퀴틴 프로모터와 ARBCS 터미네이터 사이에 BamHI과 SacI 제한 효소를 이용하여 삽입하였다. 이때 PepEST1 유전자는 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭하였으며, 하기 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 유전자 삽입에 사용된 제한효소 염기서열(BamHI, SacI)은 밑줄로 표시하였다.Gene vector for turf transformation was used by inserting the gene cassette required for turf transformation in the pCAMBIA 3301 vector (http://www.cambia.org). The ubiquitin gene promoter (P ubi ) of corn was used for the transformation of grass, a monocotyledonous plant, and the terminator (T Arbcs ) of RBCS gene (ARBCS) of Arabidopsis was used as a transcriptional terminator. It was. Pepper's PepEST1 gene was inserted between the ubiquitin promoter and the ARBCS terminator using BamH I and Sac I restriction enzymes. At this time, the PepEST1 gene was amplified using a polymerase chain reaction, and the polymerase chain reaction was performed using the following primers. Restriction enzyme sequences used for gene insertion ( BamH I, Sac I) are underlined.

PepEST1 정방향 프라이머: 5’- CCGGATCCATGGCTACGCAAAGTTTTG-3’PepEST1 forward primer: 5'- CC GGATCC ATGGCTACGCAAAGTTTTG-3 '

PepEST1 역방향 프라이머: 5’- GGGAGCTCTTAATTTGTAGTAGCAC-3’PepEST1 reverse primer: 5'- GG GAGCTC TTAATTTGTAGTAGCAC-3 '

또한, 도 1에 나타낸 바와 같이 잔디 형질전환을 위한 유전자 벡터는 PepEST1 유전자 및 제초제 저항성 유전자인 bar 유전자를 포함하고 있을 뿐만 아니라 리포터 유전자로 카탈라아제 인터론(catalase intron)을 포함하고 있는 베타 글루코지다제(intron-GUS) 유전자를 포함하고 있으며, 이를 형질전환에 이용하였다. In addition, as shown in FIG. 1, the gene vector for turf transformation includes not only the PepEST1 gene and the bar gene, which is a herbicide resistance gene, but also a beta glucosidase including a catalase intron as a reporter gene. intron-GUS) gene, which was used for transformation.

[[ 실시예Example 2] 제초제 저항성 및 병 저항성을 갖는 형질전환 잔디 제조 2] Manufacture of Transgenic Grass with Herbicide Resistance and Disease Resistance

(1) 아그로박테리움 (1) Agrobacterium EHA105EHA105 를 이용한 형질전환Transformation using

상기 실시예 1에서 제작한 형질전환용 벡터를 이용하여 잔디에 형질전환을 하기 위하여 우선, 잔디 종자(Bentgrass “Crenshaw” 품종)의 표면을 70% 에탄올(v/v)로 10분 처리 한 뒤에, 2%(w/v) 차염소산나트륨(sodium hypochlorite)으로 20분간 소독한 후, 종자를 캘러스 유도 배지(MS basal salts, vitamins, 30 g/L sucrose, 2 mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D), 3 g/L gelrite; pH 5.8) 에 치상하였다.In order to transform the grass using the transformation vector prepared in Example 1, first, after treating the surface of the grass seed (Bentgrass "Crenshaw" varieties) with 70% ethanol (v / v) for 10 minutes, After 20 minutes of disinfection with 2% (w / v) sodium hypochlorite, the seeds were seeded with MS basal salts, vitamins, 30 g / L sucrose, 2 mg / L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid ( 2,4-D), 3 g / L gelrite; pH 5.8).

배발생능 캘러스는 배지에 치상한 잔디 종자를 25℃에서 4주간 암 배양을 통해서 획득하였으며, 이렇게 얻은 캘러스는 2주에 한 번씩 계대 배양을 해주며 한 달간 캘러스 유도 배지에서 배양하였다. 계대 배양 과정에서, 형질전환에 적합한 캘러스를 선발하여 0.5 mg/L 키네틴(kinetin)이 첨가된 캘러스 유도 배지에서 1주일간 배양한 후, 통상의 방법으로 아그로박테리움 EHA105에 상기 실시예 1에서 제작한 형질전환용 벡터를 형질전환 시켰다. 상기 형질전환 된 아그로박테리움 EHA105를 O.D600 0.5까지 LB 배지(Luria-Bertani medium; Difco, USA)에서 배양한 후, 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 LB 배지와 동일한 부피의 접종 배지(infection media; 1/2 MS media, 2% sucrose, 1% glucose, 100 mM acetosyringone, pH 5.2)로 현탁한 뒤 4시간 동안 배양하였다. 1 주일간 0.5 mg/L 키네틴이 포함된 캘러스 유도 배지에서 배양한 캘러스를 형질전환 된 아그로박테리움 EHA105가 있는 배지와 섞어준 후에 15분간 부드럽게 흔들어주면서 배양한 후, 필터 페이퍼 위에 올려놓아 건조시키면서 캘러스에 필요이상 붙은 아그로박테리움을 제거해주었다. 접종한 캘러스는 이후 공동배양 배지(co-cultivation media; 1/2 MS 배지, 2 mg/L 2,4-D, 2% sucrose, 1% glucose, 100 μM acetosyringone, 3 g/L gelrite, pH 5.8)에 옮긴 뒤, 25℃에서 약 3.5일 동안 암 상태로 배양하였다.Embryonic callus was obtained through the culture of grass seeded in the medium for 4 weeks at 25 ℃, the callus was cultured once every two weeks and cultured in callus induction medium for one month. During passage culture, callus suitable for transformation was selected and cultured in callus induction medium to which 0.5 mg / L kinetin was added for 1 week, and then prepared in Example 1 on Agrobacterium EHA105 by a conventional method. The vector for transformation was transformed. The transformed Agrobacterium EHA105 is OD 600 After incubation in LB medium (Luria-Bertani medium; Difco, USA), and centrifuged at 3,000 rpm for 15 minutes in the same volume of LB medium (infection media; 1/2 MS media, 2% sucrose, 1 % glucose, 100 mM acetosyringone, pH 5.2) and incubated for 4 hours. Callus cultured in a callus induction medium containing 0.5 mg / L kinetin for 1 week was mixed with a medium containing transformed Agrobacterium EHA105, incubated with gentle shaking for 15 minutes, and then placed on the filter paper and dried on callus while drying. Removed more Agrobacterium than necessary. Inoculated callus was then co-cultivated media (1/2 MS medium, 2 mg / L 2,4-D, 2% sucrose, 1% glucose, 100 μM acetosyringone, 3 g / L gelrite, pH 5.8). ), And cultured in a cancerous state at 25 ℃ for about 3.5 days.

(2) (2) GUSGUS stainingstaining 분석을 통한 형질전환 유무 확인 Confirmation of transformation through analysis

상기 (1)의 공동배양이 끝난 형질전환 된 캘러스를 GUS staining 분석을 통 해서 형질전환 유무를 확인한 후, 5 mg/L 포스피노트리신(phosphinothricin, PPT; Duchefa)와 250 mg/L 세포탁심(cefotaxime)이 포함된 캘러스 유도 배지에서 25℃에서 2주간 암 상태로 배양하였다. 2 주간 암 상태에서 배양한 캘러스를 동일한 캘러스 유도 배지에서 8 내지 10주간 100 μmolm-2s-1의 백색 형광램프(cool-white fluorescent lamp) 조건에서 배양하여 재분화를 유도하고, 포스피노트리신에 저항성을 보이는 새싹(green shoot)을 10 mg/L 포스피노트리신과 250 mg/L 세포탁심이 포함된 뿌리 유도 배지로 옮겨주어 뿌리를 유도하였다. 이후 재분화 된 형질전환 잔디 후보들을 흙으로 옮겨 심어 온실 조건에서 키운 후 후속 연구가 가능하게 하였다.After co-cultured transformed callus of (1) was confirmed by the GUS staining analysis for transformation, 5 mg / L phosphinothricin (PPT; Duchefa) and 250 mg / L cell taxim ( cefotaxime) was cultured in a callus induction medium containing cancer at 25 ° C. for 2 weeks. Callus cultured for 2 weeks in a cancer state was incubated in a 100 μmolm -2 s -1 cool-white fluorescent lamp condition for 8 to 10 weeks in the same callus induction medium to induce re-differentiation, and to phosphinothricin Roots were induced by transferring resistant green shoots to a root induction medium containing 10 mg / L phosphinothricin and 250 mg / L cytotaxy. Subsequently, the candidates for re-differentiated transgenic grass were transferred to soil and grown in greenhouse conditions for further study.

[[ 실시예Example 3] 게놈 중합효소 연쇄반응 분석 3] Analysis of genomic polymerase chain reaction

상기 실시예 2의 방법으로 형질전환 된 잔디의 유전자 도입여부를 확인하기 위하여 게놈 중합효소 연쇄반응을 이용하여 분석하였다. 일반 잔디와 형질전환 잔디에서 게놈 DNA를 추출 한 다음 bar, PepEST1 및 액틴 유전자의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.In order to confirm the gene introduction of the grass transformed by the method of Example 2 was analyzed using genomic polymerase chain reaction. Genomic DNA was extracted from normal turf and transgenic turf, and then polymerase chain reaction was performed using primer sets of bar, PepEST1, and actin genes.

bar 정방향 프라이머: 5’-CTACCATGAGCCCAGAACGACG-3’bar forward primer: 5'-CTACCATGAGCCCAGAACGACG-3 '

bar 역방향 프라이머: 5’-CTGCCAGAAACCCACGTCATGCCAGTTC-3’bar reverse primer: 5'-CTGCCAGAAACCCACGTCATGCCAGTTC-3 '

PepEST1 정방향 프라이머: 5’-CCTGCAGCTTACGATGCC-3’ PepEST1 forward primer: 5'-CCTGCAGCTTACGATGCC-3 '

PepEST1 역방향 프라이머: 5’-GCATGATAACCATCTCCAAAGAGC-3’PepEST1 reverse primer: 5'-GCATGATAACCATCTCCAAAGAGC-3 '

또한, 반응된 DNA의 정량을 확인하기 위해 액틴(actin) 유전자가 사용되었으 며 다음의 프라이머 세트를 이용하여 게놈 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. In addition, the actin (actin) gene was used to confirm the quantification of the reacted DNA, genomic polymerase chain reaction was performed using the following primer set.

actin 정방향 프라이머: 5’-AACTGGGATGATATGGAGAA-3’ actin forward primer: 5'-AACTGGGATGATATGGAGAA-3 '

actin 역방향 프라이머: 3’-CCTCCAATCCAGACACTGTA-3’actin reverse primer: 3′-CCTCCAATCCAGACACTGTA-3 ’

중합효소 연쇄반응 조건은 genomic DNA 200 ng 또는 5 ng의 잔디 형질전환용 벡터, 그리고 400 μM dNTPs, 200 μM의 프라이머 세트와 2 units의 EX Taq DNA polymerase(Takara, Japan)를 사용하였으며, 94℃에서 45초간 변성, 62℃ 에서 45초간 결합, 72℃ 에서 1분간 확장하는 과정을 30회 수행하였다. Polymerase chain reaction conditions were used for genomic DNA 200 ng or 5 ng turf transformation vector, 400 μM dNTPs, 200 μM primer set and 2 units of EX Taq DNA polymerase (Takara, Japan). The process of denaturation for 45 seconds, binding for 45 seconds at 62 ° C., and expansion for 1 minute at 72 ° C. was performed 30 times.

그 결과 도 2의 A에서도 확인할 수 있듯이, 형질전환 개체들(#6, 7, 15, 18, 19, 21, 24)에서 제초제 저항성 유전자 bar와 PepEST1 유전자가 도입되었음을 확인할 수 있다.As a result, as can be seen in Figure 2A, it can be confirmed that the herbicide resistance gene bar and PepEST1 genes were introduced in the transgenic individuals (# 6, 7, 15, 18, 19, 21, 24).

[[ 실시예Example 4] 형질전환 잔디의 분자생물학적 분석 4] Molecular Biological Analysis of Transgenic Grass

(1) 서던 (1) Southern 블롯Blot (( SouthernSouthern blotblot ) 분석) analysis

도입 유전자 수를 확인하기 위하여 서던 블롯(Southern blot) 분석을 수행하였으며. 다음과 같은 과정으로 수행되었다. 먼저 20 ㎍의 게놈 DNA를 HindIII 또는 EcoRI으로 자른 뒤 0.8% 아가로스 겔에 전기영동을 한 후에 Hybond N+membrane(Amersham Biosciences, UK)에 모세관 현상을 이용하여 transfer하였다. 탐침으로 사용된 bar 유전자는 중합효소 연쇄반응로 증폭하여 이용하였으며, Radiprime™ II 랜덤 프라이머 Labeling System(Amersham Biosciences, UK)와 [α32-P] dCTP를 이용하여 표지하였다. 표지되지 않은 뉴클레오티드는 Microspin™ G- 50 컬럼(Amersham Biosciences, UK)를 이용하여 제거하였다. 혼성화는 Quick Hyb(Stratagene, USA)를 5×SSC와 1:1 비율로 섞어서 사용하였다. 예비 혼성화(Pre-hybridization), 혼성화(hybridization), 세척(washing) 단계는 65℃ 조건에서 진행하였다. 혼성화 후 membrane을 워싱 버퍼 I(2×SSC, 0.1% SDS)으로 5분간 2회 세척을 실시 한 뒤, 워싱 버퍼 II(1×SSC, 0.1% SDS)로 5분간, 워싱 버퍼 III(0.5×SSC, 0.1% SDS)로 5분간 세척 한 후, 마지막으로 워싱 버퍼 Ⅳ(0.1×SSC, 0.1% SDS)로 15분간 세척 해주었다. Membrane은 X-ray 필름(Agfa, Belgium)에 끼워서 -70℃에서 3 내지 4일간 노출 시킨 뒤 확인하였다.Southern blot analysis was performed to confirm the number of transgenes. The procedure was as follows. First, 20 μg of genomic DNA was cut with Hind III or EcoR I, followed by electrophoresis on 0.8% agarose gel, and then transferred to Hybond N + membrane (Amersham Biosciences, UK) using capillary action. The bar gene used as a probe was amplified by polymerase chain reaction and labeled using the Radiprime ™ II random primer Labeling System (Amersham Biosciences, UK) and [α32-P] dCTP. Unlabeled nucleotides were removed using a Microspin ™ G-50 column (Amersham Biosciences, UK). Hybridization was used by mixing Quick Hyb (Stratagene, USA) with 5 × SSC in a 1: 1 ratio. Pre-hybridization, hybridization, and washing steps were performed at 65 ° C. After hybridization, wash the membrane twice with washing buffer I (2 × SSC, 0.1% SDS) for 5 minutes, then wash buffer III (1 × SSC, 0.1% SDS) for 5 minutes, and wash buffer III (0.5 × SSC). , 0.1% SDS) for 5 minutes, and finally wash with Washing buffer IV (0.1 × SSC, 0.1% SDS) for 15 minutes. Membrane was inserted into an X-ray film (Agfa, Belgium) and exposed after exposure at -70 ° C. for 3 to 4 days.

그 결과, 도 2의 B에서도 확인할 수 있듯이, 라인 #6과 #21은 한 개의 도입 유전자를, 라인 #24와 #19는 두 개의 도입 유전자를 지님을 확인하였고 라인 #18과 #7은 세 개 이상의 도입 유전자를 지님을 확인하였다.As a result, as shown in B of FIG. 2, lines # 6 and # 21 have one transgene, lines # 24 and # 19 have two transgenes, and lines # 18 and # 7 have three transgenes. It was confirmed that the above introduced gene.

(2) 노던 (2) Northern 블롯Blot (( NorthernNorthern blotblot ) 분석) analysis

도입 유전자의 mRNA 발현을 확인하기 위하여 노던 블롯(Northern blot) 분석수행 하였으며, 다음과 같은 과정으로 수행되었다. Total RNA는 Trizol reagent (Invitrogen, USA)를 이용하여 실험방법에 따라 추출하였다. 추출된 total RNA 10㎍을 포름알데히드(formaldehyde)가 포함되어 있는 1.2% 아가로스 겔에 전기영동 한 다음 Hybond N+membrane(Amersham Biosciences, UK)에 모세관 현상을 이용하여 transfer하였다. 프로브는 bar 또는 PepEST1 유전자를 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭하였으며, Radiprime™ II 랜덤 프라이머 Labeling System(Amersham Biosciences, UK)와 [α32P] dCTP를 이용하여 표지하였고, 표지되지 않은 뉴클레오티드는 Microspin™ G-50 컬럼(Amersham Biosciences, UK)을 이용하여 제거하였다. 혼성화는 상기 서던 블롯 분석과 동일한 과정으로 진행하였다. 그리고 Membrane은 X-ray film(Agfa, Belgium)에 끼워서 -70℃에서 3 내지 4일간 노출 시킨 뒤 확인하였다.Northern blot analysis was performed to confirm the mRNA expression of the transgene. Total RNA was extracted according to the experimental method using Trizol reagent (Invitrogen, USA). 10 μg of the extracted total RNA was electrophoresed on a 1.2% agarose gel containing formaldehyde and then transferred to a Hybond N + membrane (Amersham Biosciences, UK) using capillary action. Probes were amplified bar or PepEST1 gene using polymerase chain reaction and labeled using Radiprime ™ II random primer Labeling System (Amersham Biosciences, UK) and [α32P] dCTP, and the unlabeled nucleotides were microspin ™ G- Removed using 50 columns (Amersham Biosciences, UK). Hybridization proceeded in the same process as the Southern blot analysis. Membrane was inserted into an X-ray film (Agfa, Belgium) and exposed at -70 ° C. for 3 to 4 days.

그 결과 도 3의 A에서도 확인할 수 있듯이, 상기 서던 블롯에서 확인한 결과로서 도입 유전자 수가 하나이거나 두 개인 라인들(#6, 21, 15, 2, 24, 19) 모두에서 유전자 발현이 확인되었다. 반면에 3개 이상의 유전자가 도입된 #18에서는 유전자 발현이 되지 않은 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 3A, gene expression was confirmed in all lines (# 6, 21, 15, 2, 24, 19) having one or two introduced genes as a result of the Southern blot. On the other hand, the gene expression was not found in # 18 in which three or more genes were introduced.

(3) (3) 웨스턴Weston 블롯Blot (( WesternWestern blotblot ) 분석) analysis

도입 유전자의 단백질 발현을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯(Western blot) 분석수행 하였으며, 다음과 같은 과정으로 수행되었다. Total 단백질은 extraction buffer(70 mM Tris-HCl(pH 8.3), 35% ethylene glycol, 98 mM (NH4)2SO4, 7 mM sodium metabissulfate, 0.07% polyethyleneimine)를 이용하여 추출하였다. 단백질 30 ㎍㎍을 8% SDS-PAGE에 전기 영동하여 분리시킨 다음 Hybond-P membrane(Amersham Biosciences, UK)에 transfer 하였다. 도입 유전자의 단백질 발현 정도 확인을 위해서는 PepEST1-specific polyclonal 항체와 anti-rabbit monoclonal 항체(Sigma, USA)를 사용하였고, loading control인 βtubulin의 발현 정도 확인에는 polyclonal βtubulin 항체(Santacruz, USA)와 anti-goat monoclonal 항체(Sigma, USA)를 사용하였다. 그리고 ECLTMadvance 웨스턴 블롯팅 분석 시스템(Amersham Bioscience, UK)을 이용하여 분석하였다. 정제된 단백질인 GST-PepEST1이 양성 대조구로 사용되었으며, 순수 정제된 GST-fused PepEST1 단백질인 P.C가 양성 대조구로 사용되었다.Western blot analysis was performed to confirm the protein expression of the transgene. The procedure was as follows. Total protein was extracted using extraction buffer (70 mM Tris-HCl, pH 8.3), 35% ethylene glycol, 98 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 7 mM sodium metabissulfate, 0.07% polyethyleneimine). 30 μg of protein was separated by electrophoresis on 8% SDS-PAGE and then transferred to Hybond-P membrane (Amersham Biosciences, UK). PepEST1-specific polyclonal antibody and anti-rabbit monoclonal antibody (Sigma, USA) were used to confirm the expression level of the transgene, and polyclonal βtubulin antibody (Santacruz, USA) and anti-goat were used to confirm the expression level of βtubulin, a loading control. Monoclonal antibody (Sigma, USA) was used. And it was analyzed using ECL TM advance western blotting analysis system (Amersham Bioscience, UK). The purified protein GST-PepEST1 was used as a positive control, and the pure purified GST-fused PepEST1 protein PC was used as a positive control.

도 3의 B에서도 확인 할 수 있듯이 단백질 발현 분석 결과, 상기 노던 블롯의 결과와 동일하게 도입 유전자 수가 하나이거나 두 개인 라인들(#6, 21, 15, 2, 24, 19) 모두에서 단백질의 발현이 확인되었으나 3개 이상의 유전자가 도입된 #18에서는 단백질의 발현이 되지 않은 것을 확인할 수 있었다.As can be seen in B of FIG. 3, the result of protein expression analysis shows that the protein is expressed in both lines (# 6, 21, 15, 2, 24, and 19) having one or two introduced genes as in the northern blot. This was confirmed, but the expression of the protein was confirmed that the three or more genes were introduced in # 18.

[[ 실시예Example 5] 잔디 형질전환용 벡터 단백질의 항진균 활성 분석 5] Antifungal Activity Analysis of Vector Protein for Grass Transformation

도입 유전자의 항진균 활성(antifungal activity)을 조사하였으며, 이는 곰팡이의 균사가 생장하는 것을 억제하는 정도를 확인하는 것으로 판명하였다. 항진균 활성을 확인하기 위하여 벤트라스에 주요한 곰팡이 병을 일으키는 세 종류의 곰팡이인 갈색마름병(Rizoctonia solani AG1-1A), 동전마름병(Sclerotinia homoeocarpa), 피시움 블라이트병(Phythium aphanidermatum)를 이용하였으며, 상기 세 종류의 곰팡이 균사체들을 각각의 PDA(potato dextrose agar) 배지에 배양 후 20.5 cm 크기로 잘라, 이를 항진균 활성 분석 실험을 하는데 이용하였다. PDA 배지의 위와 아래 양쪽 끝에 확보한 균사체를 접종하였고 배지의 가운데에는 멸균된 종이 디스크를 올린 뒤, 각각의 디스크에 정제된 단백질을 농도(0, 38, 75, 150 ㎍)별로 접종하였다. 곰팡이 균사체를 접종한 PDA 배지는 25℃ 조건에 72 시간을 두어 디스크 주위로 신장하는 균사의 억제하는 정도를 확인하였다.The antifungal activity of the transgene was examined and found to confirm the degree of inhibition of fungal mycelial growth. Three types of fungi, Rizoctonia , which cause major fungal diseases in Ventras to identify antifungal activity solani AG1-1A), coin blight (Sclerotinia homoeocarpa ) and Physium aphanidermatum , and the three fungal myceliums were cut into 20.5 cm after incubation in each medium (potato dextrose agar) and used for antifungal activity assays. . Mycelia were inoculated at both the upper and lower ends of the PDA medium, and sterile paper disks were placed in the middle of the medium, and the purified proteins were inoculated at each concentration (0, 38, 75, 150 μg). PDA medium inoculated with the fungus mycelium was placed at 25 ° C. for 72 hours to confirm the degree of inhibition of mycelial growth around the disc.

그 결과 도 4의 결과에서도 발병률을 확인할 수 있듯이, 갈색마름병(Rizoctonia solani AG1-1A)에서 곰팡이 생장 억제가 가장 효율적으로 일어났으며, 농도 의존적으로 동전마름병(Sclerotinia homoeocarpa)에서는 곰팡이의 생장 억제가 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. As a result you can see the results in incidence of 4, had a brown blight (Rizoctonia solani AG1-1A) inhibit fungal growth is the most effective born up in a concentration-dependent manner Coin blight (Sclerotinia homoeocarpa) occurring in inhibiting the growth of fungi Could be observed.

[[ 실시예Example 6] 제초제 저항성 조사 6] Herbicide Resistance Survey

형질전환 된 잔디에 대한 제초제 저항성을 확인하기 위하여 BASTA제초제를 이용하였다. 온실에서 2 주간 키운 형질전환 잔디 후보에 0.8%(v/v) BASTA(18% glufosinate ammonium 포함)를 살포하고, 10일 후에 제초제 저항성 여부를 확인하였다. BASTA herbicide was used to confirm herbicide resistance to the transformed grass. 0.8% (v / v) BASTA (including 18% glufosinate ammonium) was applied to the transformed lawn candidates grown in the greenhouse for 2 weeks, and 10 days later, the herbicide resistance was confirmed.

도 6의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 일반 잔디(NT, Non-transgenic)은 10일 후에 노랗게 말라 죽는데 반해 형질전환 잔디의 개체들(#2, 6, 15, 18, 19, 21, 24)은 여전히 제초제 처리전이나 처리 후에도 변함없이 푸르름을 유지하는 것을 확인하였다.As can be seen from the results of FIG. 6, the general grass (NT, Non-transgenic) is dried yellow after 10 days, while the transformed grass (# 2, 6, 15, 18, 19, 21, 24) still remains It was confirmed that the greenness remained unchanged before or after treatment with the herbicide.

[[ 실시예Example 7] 병 저항성 조사  7] bottle resistance probe

형질전환 된 잔디의 곰팡이 병 저항성 조사는 잔디 잎과 식물체 전체를 이용하여 수행되었다.Investigation into fungal disease resistance of the transformed grass was carried out using grass leaves and whole plants.

(1) 형질전환 잔디 잎을 이용한 병 저항성 조사(1) Disease Resistance Survey Using Transgenic Grass Leaves

형질전환 잔디 잎을 이용한 병 저항성을 조사하기 위하여 PDA(potato dextrose agar) 배지에서 갈색마름병(Rizoctonia solani AG1-1A)의 병원균을 배양 한 후 갈색마름병의 병원균의 균사체를 PDA broth에 넣어 25℃ 항온기에서 O.D600가 0.9가 되게 준비하였다. 그리고 4주간 키운 잔디에서 자른 잎에 갈색마름병의 병원균을 각 5 ㎖을 접종하였으며, 잔디를 25℃ 장일조건(16시간 광조건/8시간 암조건)에서 접종 4일 후 갈색마름병 병원균에 의한 병반 형성을 관찰하여 잔디의 감염정도를 확인하였다. 또한 곰팡이 감염 정도를 보다 정확히 확인하기 위하여 염색 방법을 사용하였는데, lactophenol-blue 염색은 다음과 같이 진행하였다. 갈색마름병의 병원균에 감염된 잔디 잎을 고정 용액(50% EtOH 100 ㎖, formalin 6.5 ㎖, acetic acid 2.5 ㎖)에 3일간 두어 고정시킨 후, 고정된 잔디 잎에 lactophenol-blue 용액 500 ㎕를 떨어뜨리고 5분간 두어 갈색마름병의 병원균가 염색이 되도록 기다렸다. 그 후 슬라이드 글라스 위에 염색된 잔디 잎을 놓고, 커브 글라스를 덮은 뒤 이를 현미경에서 200(2010) 배율로 염색된 갈색마름병의 병원균를 관찰하였다.To investigate the disease resistance using transgenic grass leaves, cultured pathogens of brown blight ( Rizoctonia solani AG1-1A) in PDA (potato dextrose agar) medium, and put mycelium of brown blight pathogens in PDA broth in a 25 ℃ thermostat. The OD 600 was prepared to be 0.9. 5 ml each of the brown blight pathogens was inoculated on the leaves cut from the grass grown for 4 weeks. Observation confirmed the degree of infection of the grass. In addition, the staining method was used to more accurately determine the degree of fungal infection, lactophenol-blue staining proceeded as follows. Grass leaves infected with the brown blight pathogen were fixed in fixed solution (50% EtOH 100 ml, formalin 6.5 ml, acetic acid 2.5 ml) for 3 days, and then 500 µl of lactophenol-blue solution was dropped onto the fixed grass leaves. Leave for a minute and wait for the staining of brown blight. Thereafter, the dyed grass leaf was placed on the slide glass, the curved glass was covered, and the pathogen of the brown blight was dyed at 200 (2010) magnification under a microscope.

그 결과 도 5의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 곰팡이에 감염되어 병반이 관찰되는 일반 잔디(NT)에 비해 도입 유전자의 단백질 발현이 검증된 형질전환 잔디 라인들(#6, 21, 24)에서는 병반이 관찰되지 않았다.As a result, as can be seen from the results of Figure 5, the lesions were found in the transgenic grass lines (# 6, 21, 24) in which the protein expression of the introduced gene was verified compared to the general grass (NT), which is infected with the fungus and observed the lesion. Not observed.

(2) 형질전환 잔디 전체 식물체를 이용한 병 저항성 조사(2) Disease resistance investigation using whole plants of transgenic grass

형질전환 잔디 전체 식물체를 이용한 병 저항성 조사는 상기 (1)의 잔디 잎을 이용한 병 저항성을 조사와 비슷한 방법으로 수행되었다. 먼저 갈색마름병의 병원균을 O.D600를 0.9가 되게 준비하고, 4주간 키운 잔디 식물체에 갈색마름병의 병 원균 배양액을 각 10 ㎖씩 살포하였다. 이후 잔디를 25℃ 장일조건(16시간 광조건/8시간 암조건)에서 4주간 키운 후에, 식물체에서의 갈색마름병의 병원균에 의한 병반 형성을 관찰하여 잔디의 감염정도를 확인하였다. Investigation of disease resistance using the whole plant of transformed grass was carried out in a similar manner to the investigation of disease resistance using grass leaves of the above (1). First, the pathogens of brown blight were prepared to have an OD 600 of 0.9, and 10 ml of each of the pathogen cultures of brown blight was sprayed on the grass plants grown for 4 weeks. After the grass was grown for 4 weeks in 25 ℃ long conditions (16 hours light conditions / 8 hours dark conditions), the pathogenesis of the pathogen of brown blight on the plant was observed to confirm the degree of infection of the grass.

갈색마름병의 병원균에 의한 병반형성을 관찰한 결과 도 7에서도 확인할 수 있듯이, 일반 잔디에서는 곰팡이 병 감염에 의한 다수의 병반과 함께 잎이 시드는 것을 관찰할 수 있었으나, 형질전환 잔디에서는 곰팡이 병에 의한 병반이 없는 건강한 잎을 관찰할 수 있었다.As a result of observing the lesion formation by the pathogen of brown blight disease, as shown in FIG. 7, it was observed that the leaves withered together with many lesions caused by the fungal disease infection in the general turf, but the lesion caused by the fungal disease in the transgenic grass. You could observe healthy leaves without these.

도 1은 본 발명에 따른 형질전환 잔디에 이용한 벡터의 모식도를 나타낸 것이고,Figure 1 shows a schematic diagram of the vector used in the transgenic grass according to the present invention,

(A: 벡터의 T-DNA 영역 개략도, B: 전체 벡터 모식도)(A: Schematic diagram of the T-DNA region of the vector, B: Schematic diagram of the whole vector)

도 2는 본 발명에 따른 형질전환 잔디의 유전자 도입여부를 확인한 결과이며,Figure 2 is a result confirming the gene introduction of the transgenic grass according to the present invention,

(A: 게놈 중합효소 연쇄반응 분석, B: 서던 블롯 분석)(A: genomic polymerase chain reaction analysis, B: Southern blot analysis)

도 3은 본 발명에 따른 형질전환 잔디의 도입 유전자 발현여부를 확인한 결과이고,3 is a result confirming the expression of the transgene introduced transgenic grass according to the present invention,

(A: 노던 블롯 분석, B: 웨스턴 블롯 분석)(A: Northern blot analysis, B: Western blot analysis)

도 4는 본 발명에 따른 잔디 형질전환용 벡터 단백질의 항진균 활성을 확인한 결과를 보여주는 것이며,Figure 4 shows the results confirming the antifungal activity of the vector protein for turf transformation according to the present invention,

도 5는 본 발명에 따른 형질전환 잔디의 잎을 이용한 병(Rizoctonia solani) 저항성을 조사한 결과이고, 5 is a disease using the leaves of the transgenic grass according to the present invention ( Rizotonia solani ) is the result of investigating the resistance,

(A: 접종 4일 후의 병반, B: 접종 4일 후의 곰팡이 감염)(A: lesion after 4 days of inoculation, B: fungal infection after 4 days of inoculation)

도 6은 본 발명에 따른 형질전환 잔디의 전초를 이용한 제초제 저항성을 조사한 결과이며,6 is a result of examining the herbicide resistance using the outpost of the transformed grass according to the present invention,

도 7은 본 발명에 따른 형질전환 잔디의 전초를 이용한 병(Rizoctonia solani) 저항성을 조사한 결과이다.Figure 7 is a result of examining the resistance of the disease ( Rizoctonia solani ) using the outpost of the transformed grass according to the present invention.

Claims (7)

도 1의 제한효소 지도를 갖는 벡터로 형질전환 되는 것을 특징으로 하는 글루포시네이트(glufosinate) 저항성, 갈색 잎마름병(Rizoctonia solani) 및 동전 마름병(Sclerotinia homoeocarpa) 저항성 벤트그라스(Bentgrass) 품종 크렌쇼(Crenshaw) 잔디. Glufosinate- resistant, Rizoctonia solani and Sclerotinia homoeocarpa- resistant Bentgrass varieties Crenshaw, which are transformed with a vector having a restriction map of FIG. 1. grass. 삭제delete 제 1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 벡터는 아그로박테리움(agrobacterium) strains EHA105에 의해 0.2 내지 0.8 ㎎/ℓ의 키네틴(kinetin)이 포함된 캘러스 유도 배지에서 배양된 잔디 배발생능 캘러스가 형질전환 되는 것을 특징으로 하는 잔디.The vector is a grass characterized in that the grass embryogenic calli cultivated in a callus induction medium containing 0.2 to 0.8 mg / l of kinetin (kinetin) by agrobacterium ( Agrobacterium ) strains EHA105. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20030045387A (en) * 2001-12-04 2003-06-11 김두환 Method for breeding the bentgrass using the Agrobacterium tumefacience
KR20040084876A (en) * 2004-08-30 2004-10-06 금호석유화학 주식회사 Fungal resistant transgenic pepper plants and their production method

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