KR101133226B1 - 돼지 정소 추출물 ｍ１을 함유하는 빈혈질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 조혈줄기세포의 증식과 적혈구 수의 증가, 헤모글로빈 양의 증가를 유도하는 돼지 정소 추출물 M1을 유효성분으로 함유하는 빈혈질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 돼지 정소 추출물 M1의 적절한 처리 또는 투여를 통하여 조혈줄기세포에 기인한 그리고 적혈구 세포 수, 헤모글로빈의 수에 기인한 빈혈을 치료할 수 있는 새로운 빈혈치료제제로서 가임기, 비가임기, 임신 중인 여성, 및 남성의 적혈구 및 헤모글로빈 관련 빈혈을 치료하는데 있어서 치료제로써의 기능을 기대할 수 있다.
돼지, 정소, 빈혈, 조혈줄기세포, 적혈구, 헤모글로빈

Description

돼지 정소 추출물 Ｍ１을 함유하는 빈혈질환 예방 및 치료용 조성물{A Composition Containing Pig Testis Extracts for Preventing and Treating Anemia}
본 발명은 돼지 정소 추출물 M1을 함유하는 빈혈질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로 보다 구체적으로는 조혈줄기세포의 증식과 적혈구 수의 증가, 헤모글로빈 양의 증가를 유도하는 돼지 정소 추출물 M1을 유효성분으로 함유하는 빈혈질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
혈액 세포 중 적혈구는 산소를 조직세포에 공급하고 이산화탄소 수송을 통한 세포 사이액 내 pH를 조절하는데 핵심적인 역할을 수행한다(de Rosa et al., 2007). 따라서 골수 내 줄기세포의 지속적 증식과 분화를 통하여 적혈구의 수를 일정하게 유지하여야한다(Antponiou et al., 2009). 또한 적혈구 내 헤모글로빈의 양과 헤모글로빈 내 철을 함유한 햄 그룹의 온전한 기능을 필요로 한다.
골수 내 조혈과정(hematopoiesis)에서 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)의 증식 조절은 국부 또는 호르몬 조절계하에 있다. 조혈 유도 제(Hematopoietic inducing agent)로 알려진 에리트로포이에틴(erythropoietin)과 과립구-콜로니-촉진 인자(granulocyte-colony-stimulating factor)와 같은 성장인자나 시토카인은 매우 잘 알려진 적혈구 분화를 촉진하는 조절자로 작용한다 (Antoniou et al., 2009). 이들은 계(system) 수준에서 에스트로겐을 포함한 스테로이드 호르몬에 의하여 조절될 수 있다고 밝혀지고 있다. 방사선 조사로 조혈 시스템(hematopoietic system)이 파괴된 생쥐에서 에스트로겐은 혈액생성을 촉진한다 (Zhou and Mi, 2009). 다른 한편 고농도의 에스트로겐이 빈혈을 유도할 수 있다고 알려져 있다(Blobel et al., 1995, Blobel and Orkin, 1996). 글루코코리티코이드 수용체(Glucocorticoid receptor)는 이들 리간드와 결합하여 적혈구 기원세포(erythroid progenitor cell)의 분화와 증식을 조절하는 주된 조절자로 에스트로겐 수용체와 c-Kit, c-ErbB의 활성 상위에 있는 것으로 알려져 있다 (Wessely et al., 1997). 이들 조절요인들은 표적 세포의 수용체를 통하여 Spi-1, p53, GATA-1, 적혈구 크뤼펠-유사 인자(erythroid Kruppel-like factor), C/EBP 베타 등의 활성 조절을 통하여 적혈구의 생성을 조절한다(Blobel et al., 1995; Coghill et al., 2001; Hirai et al., 2006; Quang et al., 1995).
빈혈은 헤모글로빈 수의 감소, 혈액 내 헤모글로빈의 양적 감소, 헤모글로빈 분자의 산소결합 능력의 저하로 인한 조직세포로의 산소 공급이 감소한 생리적 반응으로 정의된다. 빈혈은 400 종류 이상이 있고, 철 결핍, 엽산 등의 영양소 결핍, 용혈성, 염증성 질화, 골수기능 저하 등 다양한 원인에 의해 발병되는데 그 비율이 매우 높고 특히 여성에서 출산 등과 관련하여 남성에 비하여 보다 많이 발 현되는 것으로 보고되고 있다. 높은 비율로 관찰되는 빈혈은 여러 병리적 현상을 수반하기 때문에 이것을 치료하기 위하여 원인별로 다양한 치료가 시도되어 왔다. 철 성분의 공급, 영양소 공급이 원인이 된 빈혈의 치료 방법은 식이요법 등을 통하여 상대적으로 쉽게 접근을 할 수 있다.
그러나 조혈줄기세포의 증식과 분화가 원인이 된 경우 성장인자, 사이토카인, 덱사메타손(dexamethasone, glucocorticoid계의 스테로이드 호르몬), 남성호르몬계열(androgens), 에스트로겐계열(estrogen)등을 이용한 빈혈 치료 제제를 개발하여 치료하고자 시도되어 왔다.
예를 들어 아라테스프(Aranesp), 프로크리트(Procrit), 동화스테로이드의 하나인 난드롤론(nandrolone) 등이 사용되고 있다. 그러나 다른 질병 징후 군에서 보이는 부작용이 밝혀지고 있다. 예를 들어 조혈자극제가 주성분인 아라테스프(Aranesp), 프로크리트(Procrit)와 같은 빈혈제는 뇌졸중의 위험을 높이는 것으로 알려졌다.
이처럼 다양한 방법으로 빈혈을 치료하고자 노력하여 오고 있으나 많은 문제점들을 안고 있다. 따라서 이러한 문제점을 극복하고 좋은 결과를 가져올 물질을 찾기 위한 많은 연구들이 진행되고 있다.
골수 내 조혈줄기세포의 활동 조절은 위에서 알아보았듯이 스테로이드계에 의해 조절된다. 내분비계 장애물질은 주로 에스트로겐과 안드로겐 유사물질로 알려있어 골수 내 조혈줄기세포의 활성에 영향을 줄 수 있어 빈혈 발병율이 증가할 가능성이 높아지고 있다 (Stefanidou et al., 2009).
또한 심장 관련 질환, 암, 혈관 이상, 신장 질환 등의 병변이 관찰되는 경우에 기존에 개발된 제제를 공통적으로 사용하는데 큰 제한점을 가지고 있다. 적혈구생성 촉진제(Erythropoiesis-stimulating agent; ESA)는 1991년 이후 반복적인 혈액공급을 면하기 위하여 미국에서 사용되어 왔다. ESA인 이포겐(Epogen; Johnson & Johnson's Procrit) 과 아라네스프(Aranesp)(상표명)(Darbepoetin Alfa, Amgen Pharmaceuticals)은 골수 내에서 적혈구 생성을 촉진하는 제제로 사용되어 왔으나 일부 환자에서 심혈관계의 이상, 혈전 형성 등의 부작용이 보고되었다. 이에 따라 ESA는 2006년 이후 사용이 감소되었다. 다른 한편으로, 현재 빈혈치료재로 사용되고 있는 제제들은 높은 비용부담과 장기적인 투여로 인한 부작용이 보고되고 있다.
따라서 현시점에서 기존의 문제점을 극복할 수 있는 부작용이 없고 저렴한 비용의 빈혈치료제제의 개발이 필요한 상황이다. 특히 기존에 개발될 ESA를 대체할 AKB-6548 (Akebia therapeutics, Inc. 2009), 저산소승-유발성 인자 프로릴 하이드로실라아제(hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase) 효소계 조절물질 (Palkion, Inc. 2009) 등과 같은 제제의 연구개발이 활발히 진행되고 있다
한편 현재 우리나라의 돼지 사육 농가는 대부분 수컷 돼지고기에서 발생하는 웅취를 제거하여 고급 돈육을 생산하기 위해, 수퇘지의 정소를 출생 직후에서 2주령 사이에 거세하고 사육하는 방법을 사용하고 있지만, 비거세돈으로 사육한 경우에는 도축장에서 도축과정 중 정소를 적출하고 있으며, 적출된 정소는 현재 산업적으로 이용가치가 매우 낮아 극히 일부만 구이용으로 음식점에 제공되고 있고 나머 지 대부분은 도축부 산물로 폐기처분 되거나 일부가 가축의 사료로 재활용되고 있다.
돼지 정소를 이용하는 방법으로 대한민국 특허출원 제10-2007-0119975 “난드롤론 생산 방법”에서는 수퇘지(boar)의 정소(testis) 또는 수퇘지 정소의 간질세포(Leydig cell)를 이용하여 난드롤론을 제조하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허출원 제10-2007-0119976호 “안도스테론 제조방법”에는 수퇘지의 정소 간질 세포에서 만들어지는 웅취 물질인 안도스테론의 생화학적 생산 메카니즘을 분석한 바 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 부작용이 없는 신규한 빈혈 치료제를 개발하고자 예의 연구를 거듭한 결과, 돼지 정소로부터 유래된 추출물이 조혈줄기세포의 증식과 적혈구 수의 증가, 헤모글로빈 양의 증가를 유도한다는 사실을 밝혀내고 본 발명에 이르게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 돼지 정소 추출물 M1을 함유하는 빈혈 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적은 돼지 정소 추출물 M1을 제조하고, 상기 추출 물이 조혈줄기세포의 증식과 적혈구 수의 증가, 헤모글로빈 양의 증가를 유도하며, 세포 독성평가에서도 M1 처리군과 대조군이 비슷한 정도의 효과를 지니고 있었으며, 암컷의 생식력을 교란하지 않는 것을 실험적으로 밝혀냄으로써 달성되었다.
본 발명은 돼지 정소 추출물 M1을 유효성분으로 함유하는 빈혈 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 돼지 정소 추출물 M1은 조혈줄기세포의 증식, 적혈구의 수적 증가, 적혈구내 헤모글로빈의 양적 증가를 유도하는 기능을 갖는다.
본 발명에 있어서, 돼지 정소 추출물 M1이라 함은 본 발명의 방법에 따라 돼지 정소로부터 유래된 하기 표 1의 호르몬 조성을 갖는 돼지 정소 추출물을 의미한다.
본 발명에 있어서, "유효성분"이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능, 효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서 빈혈질환이라 함은 헤모글로빈 수의 감소, 혈액 내 헤모글로빈의 양적 감소, 헤모글로빈 분자의 산소결합 능력의 저하로 인한 조직세포로의 산소 공급이 감소한 생리적 반응을 의미하며, 철 결핍, 엽산 등의 영양소 결핍, 용혈성, 염증성 질화, 골수기능 저하 등 다양한 원인에 의해 발병되는 질환을 의미한다.
본 발명에 따른 치료학적 효과를 달성하는데 사용되는 돼지 정소 추출물 M1 의 d양은 투여 방법, 치료할 대상, 및 치료할 질환에 따라 달라지며, 통상적인 의약의 투여량에 의존하나, 보다 바람직하게는 상기 돼지 정소 추출물 M1의 유효투여량은 하루에 0.1 내지 10 ㎎/㎏(몸무게) 범위 내에서 투여된다. 또한 1일 유효투여량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투여할 수 있다. 또한, 제형에 따라 경구투여, 비경구투여(주사) 또는 국소 투여용 모두 가능하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 경구투여 경우 기존의 모든 다양한 형태로 제조가능하며 예를 들어 정제, 분말제, 건조시럽, 씹을 수 있는 정제, 과립제, 츄잉정, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제, 드링크제, 설하정 등의 여러 가지 형태로 존재할 수 있다. 본 발명에 따른 정제는 유효량으로 생체이용성이 있는 임의의 형태 또는 방식, 즉, 경구경로로 환자에게 투여될 수 있으며, 치료 또는 예방하려는 질병 상태의 특성, 질병의 단계, 및 그 밖의 관련 사정에 따라 적합한 투여 형태 또는 방식을 용이하게 선택할 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물이 정제인 경우 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있으며, 이러한 부형제의 비율 및 성질은 선택된 정제의 용해도 및 화학적 특성, 선택된 투여경로 및 표준 약제실무에 의해 결정될 수 있다.
또한 본 발명은 돼지 정소 추출물 M1을 유효성분으로 함유하는 빈혈질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하 거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
또한 본 발명은 조혈줄기세포 및 이로부터 분화되는 세포에 돼지 정소 추출물 M1을 투여하는 것을 포함하는 조혈줄기세포, 적혈구의 증식 및 헤모글로빈 양 증가 및 촉진 방법을 제공한다.
상기 본 발명에 따른 조혈줄기세포, 적혈구의 증식 및 헤모글로빈 양 증가 및 촉진 방법은 ㄱ) 개체로부터 골수세포를 분리하는 단계; ㄴ) 상기 골수세포를 세포 배양하는 단계; ㄷ) 상기 배양된 세포에 분화유도배양액을 처리하는 단계; 및 ㄹ) 상기 배양된 세포에 돼지 정소 추출물 M1을 처리하는 단계로 이루어진다.
본 발명에서는 종래의 방법에 따라 돼지 정소로부터 추출물을 제조하였다. 우선, 돼지로부터 정소를 분리하고, 분리한 정소를 클로로포름/메탄올 (50/50,v/v) 혼합용액을 사용하여 추출하였다. 하지만, 상기 정소의 추출에 사용할 수 있는 용매는 이에 제한된 것으로 아니며, 당업계에 잘 알려진 다른 용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세데이트, 클로로포름, 에테르, 헥산 및 디클로로메탄으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 사용하여 돼질 정소를 추출할 수 있다.
본 발명에 따른 돼지 정소 추출물 M1은 정소에 추출용매를 가하여 균질화시키는 단계, 상기 균질화된 혼합 용액을 여과하여 잔존물을 제거하는 단계, 상기 잔존물이 제거된 여과액을 분별하여 하층과 상등액을 분리하는 단계, 상기 분리된 하 층에서 수분을 제거하는 단계, 및 상기 수분이 제거된 추출물을 농축하여 최종 돼지 정소 추출물 M1을 수득하는 단계에 따라 제조된다.
상기와 같이 제조된 본 발명의 돼지 정소 추출물 M1에 대하여 조혈줄기세포의 수적 증가, 적혈구 수의 증가, 헤모글로빈의 양적 증가 유도를 호르몬 추출 방법과 추출물의 성분 및 호르몬 처리 방법, 세포독성 평가와 생식주기 변화 분석, FACS를 이용한 CD34 표지 조혈줄기세포의 수적 변동 분석, 말초혈액에서의 RBC 의 수적 변화 분석 및 적혈구 내 헤모글로빈 양의 분석 실험을 통해 수행하였다.
그 결과 본 발명에 따른 돼지 정소 추출물 M1은 세포독성의 원인이 되지 않음을 확인 할 수 있었고, 생식주기가 주기적으로 진행되는데 방해하지 않는 다는 것을 확인하였으며, 임신을 유지시키고 출산을 정상적으로 진행시키며 기형을 유발시키지도 않았다. 또한 본 발명에 따른 돼지 정소 추출물 M1은 효율적으로 조혈줄기세포의 증식을 유도하였고, 적혈구의 수를 유의적으로 증가시켰으며, 적혈구 내 헤모글로빈의 양 또한 유의적으로 증가시켰음을 확인하였다. 이러한 사실로부터 본 발명에 따른 돼지 정소 추출물 M1이 빈혈 치료에 있어서의 효능을 직접적으로 작용하고 있어 빈혈에 있어 매우 유용한 물질임이 입증되었다.
본 발명에 따른 돼지 정소 추출물 M1은 체내 환경에서 조혈줄기세포의 증식과 적혈구 생성을 촉진하며, 적혈구 내 헤모글로빈의 양을 증진시키는 효과가 있기 때문에 적절한 처리 또는 투여를 통하여 조혈줄기세포에 기인한 그리고 적혈구 세 포 수, 헤모글로빈의 수에 기인한 빈혈을 치료할 수 있는 새로운 빈혈치료제제로서 가임기, 비가임기, 임신 중인 여성, 및 남성의 적혈구 및 헤모글로빈 관련 빈혈을 치료하는데 있어서 치료제로써의 기능을 기대할 수 있다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 돼지 정소 추출물 M1의 제조
본 실시예에서는 종래의 방법에 따라 돼지 정소에서 가장 효율적으로 스테로이드 호르몬을 다량 분리 및 정제하기 위하여 부정소 및 상피 조직을 모두 제거하고, 순수한 정소를 분리하였다(대한민국 특허 출원 제10-2009-0035625호). 분리한 정소는 조직균질기로 갈기 위해 10-30g 크기로 미리 잘라서 -20℃ 냉동고에 얼려 보관하였다. 정소의 호르몬을 추출하기 위한 용매는 클로로포름/메탄올 (50/50,v/v) 혼합용액을 사용하였다.
우선, 1,000 mL 비이커에 25-50g 사이의 정소 조각을 넣고 8배의 클로로포름/메탄올 혼합용액을 가하고 3분간 균질화 하였다. 균질화가 끝난 후 와트만(whatman) No. 2 여과지를 사용해서 여과하여 걸리는 잔존물은 모두 제거하였다. 수득한 여과액을 모두 250 mL 분별 깔대기에 넣고 0.9% 생리 식염수용액을 소량 첨가하여 가볍게 흔들어 준 뒤 약 10분간 정치하였다. 분리된 하층을 회수병에 넣고 상등액은 다시 한 번 생리식염수를 첨가하여 흔든 뒤 약 20분간 방치하고 이때 분리된 하층을 회수병에 합쳤다. 이 과정을 한 번 더 실시하여 총 3회를 실시하고 하층은 모두 같은 회수병에 넣었다. 회수병에 회수된 하층은 아직 약간의 물 층이 포함되어 있으므로 24시간 동안 가만히 세워두었고, 정치하여 분리된 상층의 물은 피펫을 사용하여 모두 폐기하였다. 상층의 폐기 후에 남은 유기용매 추출물을 라운드 형태의 감압회전 농축기를 이용하여 농축하여 돼지 정소 추출물 M1을 수득하였다.
실험예 1 : 돼지 정소 추출물 M1의 호르몬 농도 측정
상기 실시예에서 제조한 돼지 정소 추출물 M1의 호르몬 농도는 주로 효소면역측정법(ELISA 또는 EIA)을 사용하여 측정하였다.
난드롤론(nandrolone)의 함량 분석은 19-Nortestosterone-EIA kit(Euro-Diagnostica, B. V.5082NOR1p)를 이용하여 수행하였으며, 테스토스테론(testosterone)의 함량 분석은 Testosterone ELISA kit(DRG, EIA-1559)를 이용하여 수행하였고, 안드로스테네디온(androstenedione) 함량 분석은 Androstenedione ELISA kit(DRG, EIA-3265)을 이용하여 수행하였다. 또한, 에스트라디올(estradiol)과 에스트론(estrone)의 함량 분석은 Estradiol ELISA kit (DRG, EIA-2693)과 Estron ELISA kit(DRG, EIA-4174)을 이용하여 수행하였다.
각 웰(well)에 대조군, 샘플, 표준물질 각 50㎕를 분주하고, 효소컨쥬게이트 100㎕씩 첨가한 후 1시간 동안 실온에서 방치하였다. 방치를 마친 분석 플레이트는 세정 완충액으로 4번 세척 후 기질 용액 150㎕ 첨가하여 30분 동안 방치하였다. 30분 후 정지 용액 50㎕를 첨가하고, 450nm로 측정하였다.
농축된 돼지 정소 추출물 M1의 호르몬 농도는 하기 표 1에 정량 분석하여 예시하였다.
<표 1>
돼지 정소 추출물 M1의 호르몬 농도
호르몬 함량
난드롤론(μg/g) 3.24
테스토스테론(μg/g) 13.00
안드로스테네디온Androstenedione(ng/g) 0.41
에스트라디올(ng/g) 0.68
에스트로겐(ng/g) 0.40
이어서 상기 돼지 정소 추출물 M1을 100% 에탄올 일차 용매로 녹이고 생체 주사용 참기름 (sesame oil)을 첨가하여 1g/mL 농도로 만들었다. 참기름으로 100배 희석한 것을 100%로 정의하고 0.1%, 1%, 10%, 50% 농도로 희석하여 사용 하였다. 이들 각 농도(0.1%, 1%, 10%, 50%, 100%)의 돼지 정소 추출물 M1의 생리적 조건에서 기른 6-8주령의 CD-1 생쥐에 21일 동안 피하주사 하였다 (각 그룹당 6마리).
이와 같은 처리를 통하여 본 발명에 따른 돼지 정소 추출물 M1이 가지고 있는 세포독성, 임신, 배아, 출산, 새끼 기름, 조혈줄기세포의 증식, 적혈구 수의 변화, 적혈구내 헤모글로빈의 양적 변화에 대한 생리 활성을 분석하였다.
실험예 2 : 세포독성 평가와 생식주기 변화 분석
상기와 같이 각 농도의 돼지 정소 추출물 M1을 농도별 6마리의 생리조건하에서 자란 건강한 CD-1 암컷 생쥐에 21일간 피하에 주사하였다. 주사하는 동안 생식주기의 변화를 분석하기 위하여 질도말법을 수행하였다. 대조군으로 참기름(sesame oil)만을 주사한 생쥐와 19-nortestosterone (3mg/kg BW)을 처리한 생쥐로 하여 그 효과를 분석하였다. 처리 21일 후 마취제(sodium Pentobarbital)를 이용하여 마취 하고 말초혈액을 채취하였다. 그리고 바로 경추파괴로 희생시킨 후 골수를 얻기 위하여 대퇴골, 세포독성 분석을 위하여 간 조직, 난소, 자궁을 적출하여 일부는 조직학적 분석을 위하여 고정하고 다른 일부는 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
이어서, 돼지 정소 추출물 M1의 장기 처리에 의한 독성을 간 조직의 구조적 특징변화를 통하여 분석하였다. 간 조직을 10% 중성 포르말린 완충액에서 24시간 고정하고 알코올을 이용하여 탈수시킨 후, 파라핀으로 포매하였다. 포매된 조직을 4μm 두께로 박편하고 파라핀을 제거 후 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여 광학현미경하에서 관찰하였다. 흥미롭게도 참기름만을 주사한 대조군과 돼지 정소 추출물 M1을 농도별로 처리한 군 간에 세포의 특성 차이가 없어(도 1 참조), 돼지 정소 추출물 M1이 세포독성의 원인이 되지 않음을 확인 할 수 있다.
도 1-1의 A는 참기름만을 투여한 대조군, B는 난드롤론을 투여한 군, C는 0.1% 돼지 정소 추출물 M1, D는 100% 돼지 정소 추출물 M1에 대한 조직사진으로, 빈혈치료제로 사용되고 있는 vehicle 처리군과 차이가 없었고, 난드롤론과의 상대 비교에서도 감소되어 있음을 보였다.
도 1-2는 0.1% 1%, 10%, 50%, 100% 돼지 정소 추출물 M1로 처리한 개체에서 얻은 간 조직 사진이다. 간 조직을 상대비교에서 농도간 차이가 vehicle군에 비하여 차이가 없음을 밝혔다. 이 결과로 보아 돼지 정소 추출물 M1은 생체에서 독성이 없음을 알 수 있다.
다른 한편으로 생식 주기에 돼지 정소 추출물 M1이 미치는 영향을 알아보기 위하여 돼지 정소 추출물 M1 투여시기 동안 질 도말법(vaginal smearing)을 이용하였다. 난드롤론을 단독투여한 군에서는 점진적으로 생식주기가 불규칙하게 되었다. 그러나 돼지 정소 추출물 M1을 처리한 경우 생식주기가 참기름을 처리한 대조군과 큰 차이 없이 주기적으로 진행되는 결과를 보였다(도 2 참조). 이들 결과를 바탕으로 돼지 정소 추출물 M1이 생식주기가 주기적으로 진행되는데 방해하지 않는 다는 것을 확인 하였다.
실험예 3 : 돼지 정소 추출물 M1의 모체 및 배아와 태아에 대한 영향 분석
본 실험예에서는 돼지 정소 추출물 M1을 빈혈관련 치료 제제 또는 예방제제로 임신부에 사용될 경우 모체 또는 배아와 태아에 서 예상될 수 있는 문제가 무엇인지를 알아보기 위하여, 배아발생 이상, 유산 경향성, 기형 유발율을 비교 분석하였다.
착상시기 이전에 배 발생에 미치는 영향을 알아보기 위하여, vehicle을 임신 1일부터 출산 때까지(group 1), 0.1% 돼지 정소 추출물 M1을 임신 1일부터 5일까 지(group 2), 기관분화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 임신 5일부터 13일(group 3), 기관분화후 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 임신 13일부터 21까지(group 4) 처리하였다. 다른 한편으로 임신 1일부터 출산 때까지 0.1% 돼지 정소 추출물 M1을 매일 투여하였다(group 5).
그 결과 실험군 간에 유산율에 차이가 없이 임신이 유지되고 출산을 정상적으로 하여 태어난 개체수가 실험군가 차이가 없었고 기형의 형태를 갖는 새끼도 없음을 확인하였다(표 2 참조).
<표 2>
0.1% 돼지 정소 추출물 M1의 모체 및 배아와 태아에 대한 영향
Groups 계산상 유산율(%) 실험상 유산율(%)
대조군 1.42(1/70) -
Group 1 0.00(0/68) 1.49(1/67)
Group 2 1.23(1/81) 1.35(1/74)
Group 3 0.00(0/70) 0.00(0/65)
Group 4 1.42(1/70) 1.47(1/68)
군들 사이에 유의적인 차이는 없었음.
실험예 4 : FACS를 이용한 CD34 표지 조혈줄기세포의 수적 변동 분석
본 실험예에서는 돼지 정소 추출물 M1에 의한 조혈줄기세포의 증식 촉진 여부를 알아보기 위해 조혈줄기세포 표지인자인 CD34를 이용하여 알아보았다. 0.1% 돼지 정소 추출물 M1을 상기 실험예에서와 같이 주사한 후 희생시켜 대퇴골을 회수하였고 PBS 용액을 이용하여 골수를 추출하였다.
이어서 CD34 특이항체와 반응하게 한후 유세포분리기(fluorescent activated cell sorter)를 이용하여 CD34 조혈줄기세포를 계수하여 분석하였다. 기존에 빈혈제로 사용되어왔던 난드롤론을 투여한 군에서 유의하게 조혈줄기세포의 수가 증가하였고, 또한 0.1% 돼지 정소 추출물 M1 군에서도 유의한 증가를 보였다. 난드롤론과 돼지 정소 추출물 M1을 비교분석할 때, 돼지 정소 추출물 M1이 더 효율적으로 조혈줄기세포의 증식을 유도함을 확인하였다 (도 3 참조).
실험예 5 : 말초혈액에서의 RBC 의 수적 변화 분석
상기 실험예에서와 동일한 조건으로 0.1% 돼지 정소 추출물 M1을 처리한 후 말초혈액을 수획하였고, 혈액응고를 막기 위하여 EDTA를 1 mg/mL 농도로 첨가하였다. 이어서 분석기를 이용하여 적혈구의 수를 계수하였다. 적혈구의 수는 대조군에 비하여 난드롤론과 돼지 정소 추출물 M1 군에서 유의하게 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 돼지 정소 추출물 M1이 빈혈 치료에 있어서의 효능을 직접적으로 작용하고 있음을 확인하였다 (도 4 참조)
실험예 6 : 적혈구 내 해모글로빈 양의 분석
상기 실험예 5에서 얻은 혈액 내 적혈구에서 헤모글로빈의 양적 분석을 poah100i (Sysmex)을 사용하여 수행하였다. 적혈구 내 헤모글로빈의 양은 0.1% 돼지 정소 추출물 M1에서 유의적으로 증가함을 확인하였다(도 5 참조). 이는 돼지 정소 추출물 M1이 빈혈에 있어 매우 유용한 물질임을 입증하는 것이다.
도 1a 및 1b는 본 발명에 따른 돼지 정소 추출물 M1의 간세포 독성 효과를 확인한 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 돼지 정소 추출물 M1이 생리주기에 미치는 영향 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 돼지 정소 추출물 M1에 의한 골수 내 조혈줄기세포 수 증가 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 돼지 정소 추출물 M1에 의한 말초혈액 내 적혈구 수 증가 효과 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 돼지 정소 추출물 M1에 의한 적혈구내 헤모글로빈 양의 증가 효과 확인 결과를 나타낸 도이다.

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 돼지 정소 추출물 M1을 유효성분으로 포함하며,
    상기 돼지 정소 추출물 M1은
    정소를 잘라 클로로포름 및 메탄올을 포함한 혼합용매로 추출하는 단계;
    상기 추출물을 균질화한 후 여과하여 여과액을 얻는 단계;
    상기 여과액을 분별깔대기에 넣고, 0.9% 생리식염수 용액을 첨가하여 흔들어 준 뒤 정치하는 단계; 및
    분리된 하층을 모아 농축하는 단계로 제조되는 것을 특징으로 하는 빈혈 질환 치료 및 예방용 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물이 조혈줄기세포의 증식을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 빈혈 질환 치료 및 예방용 약제학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 조성물이 적혈구의 수를 증가시키는 것을 특징으로 하는 빈혈 질환 치료 및 예방용 약제학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 조성물이 헤모글로빈의 양을 증가시키는 것을 특징으 로 하는 빈혈 질환 치료 및 예방용 약제학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 제2항에 있어서, 상기 돼지 정소 추출물 M1이 스테로이드 호르몬으로서 난드롤론(nandrolone), 테스토스테론(testosterone), 안드로스테네디온(androstenedione), 에트스라디올(estradiol) 및 에스트론(estrone)을 포함하는 것을 특징으로 하는 빈혈 질환 치료 및 예방용 약제학적 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 돼지 정소 추출물 M1이 가임기 여성의 임신력을 저해하지 않는 것을 특징으로 하는 빈혈 질환 치료 및 예방용 약제학적 조성물
  9. 제2항에 있어서, 상기 돼지 정소 추출물 M1이 임신 중 여성에서 배아와 태아의 발달에 부정적 영향이 없이 온전하게 발생할 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 빈혈 질환 치료 및 예방용 약제학적 조성물.
  10. 돼지 정소 추출물 M1을 유효성분으로 포함하며,
    상기 돼지 정소 추출물 M1은
    정소를 잘라 클로로포름 및 메탄올을 포함한 혼합용매로 추출하는 단계;
    상기 추출물을 균질화한 후 여과하여 여과액을 얻는 단계;
    상기 여과액을 분별깔대기에 넣고, 0.9% 생리식염수 용액을 첨가하여 흔들어 준 뒤 정치하는 단계; 및
    분리된 하층을 모아 농축하는 단계로 제조되는 것을 특징으로 하는 빈혈 질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물.
  11. 시험관 내에서 조혈줄기세포 및 이로부터 분화되는 세포에 돼지 정소 추출물 M1을 투여하는 것을 포함하며,
    상기 돼지 정소 추출물 M1은
    정소를 잘라 클로로포름 및 메탄올을 포함한 혼합용매로 추출하는 단계;
    상기 추출물을 균질화한 후 여과하여 여과액을 얻는 단계;
    상기 여과액을 분별깔대기에 넣고, 0.9% 생리식염수 용액을 첨가하여 흔들어 준 뒤 정치하는 단계; 및
    분리된 하층을 모아 농축하는 단계로 제조되는 것을 특징으로 하는 조혈줄기세포, 적혈구의 증식 및 헤모글로빈 양 증가 및 촉진 방법.
  12. 제11항에 있어서, 하기 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조혈줄기세포, 적혈구의 증식 및 헤모글로빈 양 증가 및 촉진 방법
    ㄱ) 개체로부터 골수세포를 분리하는 단계;
    ㄴ) 상기 골수세포를 세포 배양하는 단계;
    ㄷ) 상기 배양된 세포에 분화유도배양액을 처리하는 단계; 및
    ㄹ) 상기 배양된 세포에 돼지 정소 추출물 M1을 처리하는 단계.
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