KR101131110B1 - 이온빔을 이용한 이종세포의 패턴 형성 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이온빔을 이용한 이종세포의 패턴 형성 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 각종 기판 위에 생체분자의 흡착방지용 고분자 박막을 형성시킨 다음, 이온빔을 선택적으로 조사하여 생체분자의 흡착방지용 고분자 패턴을 형성시키고, 이후에 1차 세포를 배양하여 1차 세포 패턴을 형성시킨 후, 2차 세포를 배양하여 이종세포의 패턴을 형성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 다양한 재료 위에 손쉽게 다양한 모양 및 크기의 생체분자의 흡착방지용 고분자 패턴을 형성할 수 있으며, 이를 통하여 다양한 형태의 이종세포의 패턴을 형성할 수 있고, 이종세포의 패턴을 형성하는 과정이 매우 간단하고 생체적합성이 매우 뛰어나, 신약 진단 시스템이나 생화학 무기 및 병원균의 검출을 위한 세포 센서나 세포 칩, 피부재생을 위한 조직공학 등의 분야뿐만 아니라 세포-세포, 세포-표면, 세포-매트릭스 사이의 상호작용 등 같은 기본적인 세포생물학을 연구하는 학문적인 분야에도 매우 유용하게 적용될 수 있다.

Description

이온빔을 이용한 이종세포의 패턴 형성 방법{Patterning method of two different types of cells using ion implantation}
본 발명은 이온빔을 이용한 이종세포의 패턴 형성 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 각종 기판 위에 생체분자의 흡착방지용 고분자 박막을 형성시킨 다음, 이온빔을 선택적으로 조사하여 생체분자의 흡착방지용 고분자 패턴을 형성시키고, 이후에 1차 세포를 배양하여 1차 세포 패턴을 형성시킨 후, 2차 세포를 배양하여 이종세포의 패턴을 형성하는 방법에 관한 것이다.
미세 전기기계 시스템의 급속한 발전에 따라 생명 분야, 의료 등의 기술들을 미세 전기기계 시스템과 접목하여 질병의 조기 진단 및 치료, 신약 후보군의 검출 등과 같은 다양한 생명공학 분야에 활용하기 위한 많은 연구개발 활동들이 진행되어져 왔다.
이러한 질병의 진단 및 치료, 신약 후보 군의 검출을 위한 바이오센서나 바이오칩 등을 제작하는데 있어서 기존의 DNA 칩, 단백질 칩으로 대표되던 것에서 최근에는 세포를 기반으로 하는 칩을 구현함으로써 실제 질병 진단과 발현, 치료에 관해 세포 단계에서 조사가 이루어지는 연구가 활발히 진행되고 있는 추세에 있다.
이러한 세포를 이용한 바이오칩이나 바이오센서 등의 제작을 위해서는 살아 있는 세포를 기판 표면에 선택적으로 부착하여 세포 패턴을 형성하는 ‘세포 패터닝 기술’이 매우 중요시된다.
‘세포 패터닝 기술’은 앞서 언급한 바와 같이 바이오센서, 미세배열, 조직 공학 및 세포 연구의 발달에서 중요하기 때문에 많은 연구개발이 이루어져 왔다. 지금까지 개발된 다양한 기술들에 대한 접근법은 크게 세 가지로 구분될 수 있다.
첫 번째로, 기판의 표면을 선택적인 화학적 개질을 통해 개질된 부분에만 세포가 부착되도록 하는 방법, 두 번째로, 표면을 선택적으로 모폴로지(Morphology)를 변화시키는 물리적 개질을 이용하는 방법, 마지막으로는 기판의 표면의 원하는 패턴 형성을 위해서 직접 배열하는 방법으로 구분될 수 있다. 이러한 접근법들을 기반으로 하여 포토리소그래피, 소프트 리소그래피 등의 방법을 이용한 다양한 세포패터닝 기술들 개발되어져 왔다 (Jun Nakanishi et al., Anal. Sci., 24, pp 67 (2008)). 하지만, 기존의 기술들은 한 종류의 세포를 이용한 패터닝 기술들이 개발되어져 왔다.
최근에는 한 종류의 세포만을 이용한 패터닝 기술은 단지 동종 세포 간에 단순한 정보만을 파악할 수 있기 때문에, 보다 진화된 고성능의 바이오센서, 바이오칩 등의 제작, 완벽한 피부 재생 등을 위해서는 한계가 있다. 따라서 두 종류 이상의 세포를 동시에 배양하여 이종세포 간에 상호작용에 대한 정보를 밝힐 수 있는 이종세포의 패턴 형성에 관한 패터닝 방법들이 많이 연구되고 있다.
지금까지 알려진 이종세포의 패턴 형성 방법들에는 포토리소그리피 방법 (Photolithography), 세포 부착 재료를 적층하는 증착 방법 (Layer by layer deposition), 탄성고무시트 방법(elastomeric membrane), 마이크로유체칩 방법(Microfluidics channels), 마이크로컨텍 인쇄방법(microcontact printing) 등이 있다(Ali Khademhosseini et al., Biomaterials, 25, pp 3583 (2004); Satoshi Jinno et al., J. Biomed. Mater. Res. A, 87, pp 278 (2008)).
그러나, 상기 포토리소그래피 방법은 굽어지거나 편평하지 않은 기판 위에서의 고른 적용이 쉽지 않고 레지스트를 현상하는 과정에서 유기 용매를 사용하여 세포 친화적인 기판 가공 단계를 제공하지 못한다. 또한 패터닝된 표면 위에만 선택적으로 단일 세포가 부착되는 특징 때문에 다양한 세포 패턴을 얻는 데에는 한계를 갖는다. 또한 세포의 원활한 부착을 위해 고농도의 단백질을 적용할 경우, 점성에 의해 기존 세포가 떨어져 나가는 경우가 있다.
또한, 상기 마이크로유체칩(Microfluidics channels)을 이용한 패터닝은 세포친화적인 표면을 선택적으로 제공하기 힘들고 패턴 모양이나 크기의 조절이 용이하지 않은 문제가 있다.
나아가, 상기 마이크로컨텍 인쇄방법(Microcontact printing)은 세포 종류에 따른 기판의 상대적인 접착성에 의존해야 하는 문제가 있다. 이런 문제를 극복하기 위해서는 세포외 기질을 구성하는 다양한 세포 부착 단백질을 적용해야 하는 복잡한 단계가 요구된다. 또한, 세포의 원활한 부착을 위해 고농도의 단백질을 적용할 경우, 점성에 의해 기존 세포가 떨어져 나가는 문제가 있다.
이런 방법들은 세포 부착을 유도하기 위한 처리 과정 등 공정 자체가 복잡하기 때문에 시간 소모가 많고 결과를 재연하는 데 있어 문제가 있으며, 독성 유기 용매들의 이용으로 세포배양 환경으로서 적합하지 않은 단점들이 있기 때문에 실용화되기에는 아직 많은 연구가 더 필요한 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은, 생체적합성 고분자 재료 위에 세포를 선택적으로 부착하기 위해, 생체분자의 흡착을 방지하는 고분자의 패턴을 형성하는 방법을 연구하던 중, 이온빔 조사를 통해서 생체분자의 흡착방지용 패턴을 형성할 수 있고, 생체분자의 흡착 방지 패턴이 형성된 재료 위에 첫 번째로 한 종류의 세포를 배양하여 패턴을 형성시킨 후, 다른 종류의 세포를 배양했을 때 두 번째로 배양된 세포가 선택적으로 첫 번째의 세포 패턴 사이의 공간에 부착됨을 이용하여, 하나의 기판 위에 이종세포들에 대한 패턴 형성이 가능함을 알아냄으로써 발명을 완성하였다.
이종세포를 형성하기 위한 기존의 방법들은 세포 부착을 유도하기 위한 처리 과정 등의 공정이 복잡하기 때문에 시간 소모가 많고, 결과를 재연하는 데 있어 문제가 있으며, 독성 유기 용매들의 이용으로 인해 세포배양 환경으로서 적합하지 않은 단점들이 있다.
본 발명의 목적은 제조 공정이 단순하고, 또한 공정 자체가 매우 깨끗하여 생체적 합성이 뛰어난 이온빔을 이용한 이종세포의 패턴 형성 방법을 제공하는 데 다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 생체분자의 흡착 방지용 고분자 용액을 기판 위에 도포하여 고분자 막을 형성하는 단계(단계 1); 상기 단계 1의 고분자막 상의 비가교 부분을 마스크 처리할 후, 이온빔을 조사하여 고분자를 가교시킨 다음, 고분자 용액에 사용된 용매로 상기 비가교 부분을 제거하여 생체분자의 흡착 방지용 고분자 패턴을 형성시키는 단계(단계 2); 및 상기 단계 2의 생체분자의 흡착방지용 고분자 패턴이 형성된 기판 위에 세포를 1차 배양하여 1차 세포 패턴을 형성시킨 후, 그 위에 세포를 2차 배양하여 2차 세포 패턴을 형성하는 단계(단계 3)를 포함하는 이온빔을 이용한 이종세포의 패턴 형성 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 유리 및 실리콘 기판뿐만 아니라, 가격이 저렴한 다양한 플라스틱 기판에도 적용이 가능하며, 이종세포의 패턴을 형성하는 과정이 매우 간단하고 깨끗하기 때문에 생체적합성이 매우 뛰어나므로, 신약 진단 시스템이나 생화학 무기 및 병원균의 검출을 위한 세포센서, 피부 재생을 위한 조직 공학 등의 산업적 분야뿐만 아니라 세포-세포, 세포-표면, 세포-매트릭스 사이의 상호작용 등과 같은 기본적인 세포생물학을 연구하는 학문적인 분야에도 매우 유용하게 적용할 수 있어 바이오산업 발전에 이바지할 수 있는 획기적인 기술이다.
도 1은 본 발명에 따른 이온빔을 이용한 이종세포 패턴을 형성하는 과정을 간략히 나타낸 모식도이고;
도 2는 다양한 이온주입량에서 수소이온을 선택적으로 조사하여 형성된 생체분자의 흡착 방지 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) 패턴들의 광학현미경 사진이고; 및
도 3은 2.5×1014 ions/cm2에서 선택적으로 조사를 통해 형성된 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) 패턴위에 형성된 (a) 1차 세포패턴 (NIH3T3), (b) 2차 세포패턴 (L929), 그리고 (c) 1차/2차 세포 이종세포 패턴 (NIH3T3/L929)들에 대한 형광현미경 사진들이다.
이하, 본 발명을 설명한다.
본 발명은,
생체분자의 흡착방지용 고분자 용액을 기판 위에 도포하여 고분자 막을 형성하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 형성된 고분자막 상의 비가교 부분을 마스크 처리한 후, 이온빔을 조사하여 고분자를 가교시킨 다음, 고분자 용액에 사용된 용매로 상기 비가교 부분을 제거하여 생체분자의 흡착방지용 고분자 패턴을 형성시키는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2의 생체분자의 흡착방지용 고분자 패턴이 형성된 기판 위에 세포를 1차 배양하여 1차 세포 패턴을 형성시킨 후, 그 위에 다시 이종의 세포를 2차 배양하여 2차 세포 패턴을 형성시키는 단계(단계 3);
를 포함하는 것을 특징으로 하는 이온빔을 이용한 이종세포의 패턴 형성 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명에 따른 상기 단계 1은 생체분자의 흡착방지용 고분자 용액을 기판 위에 도포하여 고분자 막을 형성하는 단계로서, 구체적으로는 생체분자의 흡착방지용 고분자 용액을 실리콘 웨이퍼, 유리, 또는 고분자 등의 다양한 기판 위에 도포하여 고분자 막을 형성시키는 단계이다.
상기 단계 1의 생체분자는 세포, 단백질 및 DNA 등을 사용할 수 있고, 사용되는 기판은 세포배양용 폴리스티렌 페트리 디쉬(polystyrene Petri Dish), 유리, 실리콘 웨이퍼 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 단계 1에서 사용될 수 있는 생체분자의 흡착방지용 고분자는 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜, 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) 삼중블록 공중합체, 올리고당 및 폴리디메틸실록산 등을 사용할 수 있다. 이때, 상기 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드)는 HO(CH2CH2O)n-(CH(CH3)-CH2-O)m-(CH2-CH2-O)nH으로 표시되고, 여기서 n 및 m 은 반복단위를 나타내고, 각각 10 ～ 130 범위의 정수인 것을 사용할 수 있다.
그 예로는, 상업적으로 널리 판매되고 있는 F127 (n=98, m=67), F108 (n=128, m=54), F88 (n=104, m=39), F68 (n=75, m=30), P123 (n=20, m=70), P105 (n=37, m=56) 및 L44(n=10, m=22) 등이 있다.
나아가, 상기 단계 1의 고분자 용액에 사용되는 용매는 물, 메탄올 및 에탄올 등을 사용할 수 있다. 이때, 생체분자의 흡착방지용 고분자의 함량은 1 중량% ～ 70 중량%인 것이 바람직하다. 만약, 고분자의 함량이 1 중량% 미만인 경우에는 용액의 점성이 너무 낮아 막이 잘 형성되지 않는 문제가 있고, 70 중량%를 초과하는 경우에는 용액의 점성이 너무 커서 막이 잘 형성되지 않는 문제가 있다.
본 발명에 따른 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 형성된 고분자막 상의 비가교 부분을 마스크 처리한 후 이온빔을 조사하여, 고분자를 가교시킨 다음, 고분자 용액에 사용된 용매로 상기 비(非)조사 부분(비가교된 영역)을 제거하여 생체분자의 흡착방지용 고분자 패턴을 형성시키는 단계이다.
제조된 생체분자의 흡착방지용 고분자 막 위에 마스크를 덮고 이온빔을 선택적으로 조사하여 조사된 부분은 이온빔 조사에 의하여 고분자를 가교시킨 후, 상기 단계 1에서 고분자 막을 제조할 때에 사용한 것과 동일한 용매로 조사가 되지 않아 고분자에 가교가 일어나지 않은 부분을 녹여내는 현상 과정을 거쳐서 생체분자의 흡착방지용 고분자 패턴을 형성하는 단계이다.
상기 단계 2에서 이온빔 조사를 시행할 때는, 이온빔 전류밀도를 1 μA/cm2 이하로 조절함이 바람직하고, 주입 원소는 탄소, 산소, 수소, 아르곤, 헬륨, 네온 또는 제논 등의 가스들을 사용할 수 있고, 이온빔 에너지는 1 ~ 300 keV인 것이 바람직하다. 총이온 조사량은 1×109 ~ 1×1016 ions/cm2 인 것이 바람직하다. 만약, 상기 총이온 조사량이 1×109 ions/cm2 미만인 경우, 고분자 재료에 충분한 가교가 일어나지 않는 문제점이 있고, 1×1016 ions/cm2를 초과하는 경우, 고분자 재료의 열적 변형 또는 분해가 발생하는 문제점이 있다.
본 발명에 따른 상기 단계 3은 상기 단계 2의 생체분자의 흡착방지용 고분자 패턴이 형성된 기판 위에 세포를 1차 배양하여 1차 세포 패턴을 형성시킨 후, 그 위에 다시 이종의 세포를 2차 배양하여 2차 세포 패턴을 형성하는 단계이다.
구체적으로는 먼저 상기 단계 2에서 형성된 생체분자의 흡착 방지용 고분자 패턴 위에 적색 형광 염색된 1차 세포 현탁 배지를 고루 뿌려주고 약 3일간 세포배양기에서 배양하고 형성된 1차 세포 패턴 위에 녹색 형광염색된 2차 세포 현탁 배지를 다시 고루 뿌려준 후, 약 3일간 동물세포 배양기에서 배양하여 이종세포의 패턴을 얻을 수 있다.
이때, 상기 3단계에 사용된 동물세포주로는 인간 및 쥐 유래의 섬유아세포, 각질세포, 암세포 등이 있고, 바람직하게는 세포신호전달, 세포간 상호작용 등 세포생물학 연구에 많이 사용되는 NIH3T3(mouse fibroblast), L929(mouse fibroblast), HEK293(human embryonic kidney fibroblast), HaCaT(human keratinocyte), HepG2(human hepatocellular carcinoma), HeLa(human cervical cancer), MCF-7(breast cancer), HUVECs(human umbilical vein endothelial cells) 등의 세포들이 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 이온빔을 이용한 NIH3T3 / L929 이종세포 패턴의 형성
단계 1: 생체분자의 흡착 방지용 고분자 막 형성
폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)를 물 용매에 10 중량%의 용액을 만들고 세포배양용 폴리스티렌 페트리 디쉬(polystyrene (PS), SPL) 위에서 회전 도포하여 생체분자의 흡착방지용 고분자 막을 제조하였다.
단계 2: 생체분자의 흡착 방지용 고분자 패턴 형성
상기 단계 1에서 생체분자의 흡착방지용 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) 막에 마스크(SUS, 100 μm 의 공간 패턴, 200 μm 피치)를 통하여 수소 이온을 주입하였다. 상기 주입 단계에서 사용된 이온주입장치는 300 keV 의 이온주입장치이며, 50 ~ 250 keV의 이온빔 에너지로 1×109 ~ 1×1016 ions/cm2의 이온을 조사하였다. 이온빔 조사 후, 물을 사용하여 이온주입이 되지 않은 부분을 제거하는 현상 과정을 통해 생체분자의 흡착방지용 고분자 패턴을 형성하였다.
단계 3: 이종세포의 패턴 형성
상기 단계 2에서 제조된 상기 단계 2의 2.5×1014 ions/cm2의 이온주입량에서 생체분자의 흡착방지용 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드)패턴이 형성된 기판 위에 배양 중이던 1차 세포를 트립신 용액으로 배양용 디쉬로부터 떼어내어 적색 형광(PKH26)으로 염색한 후, 2.5×105 cells/ml로 염색된 1차 세포를 생체분자의 흡착 방지용 고분자 패턴 위에 3일간 배양하여 1차 세포 패턴을 형성시켰다. 그 다음, 1차 세포와 같은 방법으로 녹색 형광(CFSE) 염색된 2.5×105 cells/ml의 2차 세포 현탁 배지를 형성된 1차 세포 패턴 위에 3일간 배양하여 이종세포의 패턴을 형성하였다. 단일세포 및 이종세포의 패턴을 형성하는 단계에서 각 세포는 10%의 우태 혈청이 함유된 DMEM 배지에서 5% CO2 및 37 ℃의 조건의 동물세포 배양기에서 배양되었다. 상기 단계를 통하여 형성된 단일세포 또는 이종세포 패턴을 살펴보기 위하여 광학현미경 및 형광현미경을 사용하였다.
< 실시예 2> 이온빔을 이용한 HaCaT / HepG2 이종세포 패턴의 형성
단계 1: 생체분자의 흡착 방지용 고분자 막 형성
단계 1은 상기 실시예 1의 단계 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
단계 2: 생체분자의 흡착 방지용 고분자 패턴 형성
단계 2는 상기 실시예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
단계 3: 이종세포의 패턴 형성
이종세포들로 HaCaT/HepG2를 사용한 것을 제외하고는, 단계 3은 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 3> 이온빔을 이용한 HeLa / HEK293 이종세포 패턴의 형성
단계 1: 생체분자의 흡착 방지용 고분자 막 형성
단계 1은 상기 실시예 1의 단계 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
단계 2: 생체분자의 흡착 방지용 고분자 패턴 형성
단계 2는 상기 실시예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
단계 3: 이종세포의 패턴 형성
이종세포들로 HeLa/HEK293를 사용한 것을 제외하고는, 단계 3은 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 4> 이온빔을 이용한 HUVEC / MCF -7 이종세포 패턴의 형성
단계 1: 생체분자의 흡착 방지용 고분자 막 형성
단계 1은 상기 실시예 1의 단계 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
단계 2: 생체분자의 흡착 방지용 고분자 패턴 형성
단계 2는 상기 실시예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
단계 3: 이종세포의 패턴 형성
이종세포들로 HUVEC/MCF-7를 사용한 것을 제외하고는, 단계 3은 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 5> 이온빔을 이용한 NIH3T3 / L929 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 폴리에티렌옥사이드로 대체하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 1, 2 및 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 6> 이온빔을 이용한 HaCaT / HepG2 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 폴리에티렌옥사이드로 대체하는 것을 제외하고는, 단계 1 및 2는 각각 상기 실시예 1의 단계 1 및 2와 동일한 방법으로 수행하였고, 단계 3에서는 HaCaT/HepG2를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 7> 이온빔을 이용한 HeLa / HEK293 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 폴리에티렌옥사이드로 대체하는 것을 제외하고는, 단계 1 및 2는 각각 실시예 1의 단계 1 및 2와 동일한 방법으로 수행하였고, 단계 3에서는 HeLa/HEK293를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 8> 이온빔을 이용한 HUVEC / MCF -7 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 폴리에티렌옥사이드로 대체하는 것을 제외하고는, 단계 1 및 2는 각각 상기 실시예 1의 단계 1 및 2와 동일한 방법으로 수행하였고, 단계 3에서는 HUVEC/MCF-7를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 9> 이온빔을 이용한 NIH3T3 / L929 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 폴리에티렌글리콜로 대체하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 10> 이온빔을 이용한 HaCaT / HepG2 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 폴리에티렌글리콜로 대체하는 것을 제외하고는, 단계 1 및 2는 각각 상기 실시예 1의 단계 1 및 2와 동일한 방법으로 수행하였고, 단계 3에서는 HaCaT/HepG2를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 11> 이온빔을 이용한 HeLa / HEK293 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 폴리에티렌글리콜로 대체하는 것을 제외하고는, 단계 1 및 2는 각각 상기 실시예 1의 단계 1 및 2와 동일한 방법으로 수행하였고, 단계 3에서는 HeLa/HEK293를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 12> 이온빔을 이용한 HUVEC / MCF -7 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 폴리에티렌글리콜로 대체하는 것을 제외하고는, 단계 1 및 2는 각각 상기 실시예 1의 단계 1 및 2와 동일한 방법으로 수행하였고, 단계 3에서는 HUVEC/MCF-7를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 13> 이온빔을 이용한 NIH3T3 / L929 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 올리고당으로 대체하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 14> 이온빔을 이용한 HaCaT / HepG2 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 올리고당으로 대체하는 것을 제외하고는, 단계 1 및 2는 각각 상기 실시예 1의 단계 1 및 2와 동일한 방법으로 수행하였고, 단계 3에서는 HaCaT/HepG2를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 15> 이온빔을 이용한 HeLa / HEK293 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 올리고당으로 대체하는 것을 제외하고는, 단계 1 및 2는 각각 상기 실시예 1의 단계 1 및 2와 동일한 방법으로 수행하였고, 단계 3에서는 HeLa/HEK293를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 16> 이온빔을 이용한 HUVEC / MCF -7 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 올리고당으로 대체하는 것을 제외하고는, 단계 1 및 2는 각각 상기 실시예 1의 단계 1 및 2와 동일한 방법으로 수행하였고, 단계 3에서는 HUVEC/MCF-7를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 17> 이온빔을 이용한 NIH3T3 / L929 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 폴리디메틸실록산으로 대체하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 18> 이온빔을 이용한 HaCaT / HepG2 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 폴리디메틸실록산으로 대체하는 것을 제외하고는, 단계 1 및 2는 각각 상기 실시예 1의 단계 1 및 2와 동일한 방법으로 수행하였고, 단계 3에서는 HaCaT/HepG2 를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 19> 이온빔을 이용한 HeLa / HEK293 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 폴리디메틸실록산으로 대체하는 것을 제외하고는, 단계 1 및 2는 각각 상기 실시예 1의 단계 1 및 2와 동일한 방법으로 수행하였고, 단계 3에서는 HaCaT/HepG2 를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실시예 20> 이온빔을 이용한 HUVEC / MCF -7 이종세포 패턴의 형성
실시예 1의 단계 1의 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) (HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H, F127, Aldrich)을 폴리디메틸실록산으로 대체하는 것을 제외하고는, 단계 1 및 2는 각각 상기 실시예 1의 단계 1 및 2와 동일한 방법으로 수행하였고, 단계 3에서는 HUVEC/MCF-7를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
상기 각 실시예의 사용한 세포들을 하기 표 1에 정리하여 나타내었다.
실시예
번호		 세포종류 생체분자 흡착 방지용 고분자
1차 배양세포 2차 배양세포
실시예 1 NIH3T3 L929 HO(CH2-CH2-O)98-(CH(CH3)-CH2-O)67-(CH2-CH2-O)98H
실시예 2 HaCaT HepG2
실시예 3 HeLa HEK293
실시예 4 HUVEC MCF-7
실시예 5 NIH3T3 L929 폴리에틸렌옥사이드
실시예 6 HaCaT HepG2
실시예 7 HeLa HEK293
실시예 8 HUVEC MCF-7
실시예 9 NIH3T3 L929 폴리에틸렌글리콜
실시예 10 HaCaT HepG2
실시예 11 HeLa HEK293
실시예 12 HUVEC MCF-7
실시예 13 NIH3T3 L929 올리고당
실시예 14 HaCaT HepG2
실시예 15 HeLa HEK293
실시예 16 HUVEC MCF-7
실시예 17 NIH3T3 L929 폴리디메틸실록산
실시예 18 HaCaT HepG2
실시예 19 HeLa HEK293
실시예 20 HUVEC MCF-7
< 실험예 1> 단계 2의 이온빔 조사에 의한 생체분자의 흡착 방지 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) 패턴 형성 여부의 확인
실시예 1의 단계 2에서 생체분자의 흡착방지용 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) 막에 수소이온을 1×1014 ~ 5×1014 ion/cm2 정도 선택적으로 조사한 후, 생체분자의 흡착 방지 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) 패턴이 형성되었는지의 여부를 확인하기 위하여 광학현미경 (Optical Microscopy)을 이용하였으며, 그 분석 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2의 광학현미경 사진들에 나타낸 바와 같이, 주어진 모든 이온주입량(ions/cm2)에서는 이온빔의 선택적인 조사에 의해 조사된 부분에 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) 막에 가교가 일어나 용매에 의한 현상 시에 제거되지 않고 남게 되어 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) 패턴이 형성되었음을 확인하였다.
< 실험예 2> 단계 3의 이종세포 패턴의 형성 여부의 확인
이온빔을 이용하여 형성된 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) 패턴 위에 이종의 세포들의 패턴이 형성되었는지의 여부를 확인하기 위하여 광학현미경 및 형광현미경 및 공초점현미경을 사용하여, 실시예 1에 의해 형성된 NIH3T3/L929 이종세포 패턴을 분석하였다. 분석 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3의 (a)에 나타낸 바와 같이 생체분자의 흡착방지 고분자 패턴을 제외한 부분에 1차 세포 (NIH3T3)가 먼저 패턴을 형성하였고 도 3의 (b)에 나타낸 바와 같이 먼저 형성된 세포패턴을 제외한 부분에 2차 세포 (L929)가 배양됨으로써 도 3의 (c)에 나타낸 바와 같이 이종세포간의 패턴이 형성되었음을 확인할 수 있었다.

Claims (7)

  1. 생체분자의 흡착방지용 고분자용액을 기판 위에 도포하여 고분자 막을 형성하는 단계(단계 1);
    상기 단계 1에서 형성된 고분자 막 상의 비가교 부분을 마스크 처리한 후, 이온빔을 조사하여 고분자를 가교시킨 다음 고분자 용액에 사용된 용매로 상기 비가교 부분을 제거하여 생체분자의 흡착방지용 고분자 패턴을 형성시키는 단계(단계 2); 및
    상기 단계 2의 생체분자의 흡착방지용 고분자 패턴이 형성된 기판 위에 세포를 1차 배양하여 1차 세포 패턴을 형성시킨 후, 그 위에 다시 이종의 세포를 2차 배양하여 2차 세포 패턴을 형성시키는 단계(단계 3);
    를 포함하는 이온빔을 이용한 이종세포의 패턴 형성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 1에서, 기판은 세포배양용 폴리스티렌 페트리디쉬, 유리 및 실리콘 웨이퍼로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이온빔을 이용한 이종세포의 패턴 형성 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 1에서 사용될 수 있는 생체분자의 흡착방지용 고분자는 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜, 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드) 삼중블록 공중합체, 올리고당 및 폴리디메틸실록산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이온빔을 이용한 이종세포의 패턴 형성 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드-코-에틸렌 옥사이드)는 HO(CH2CH2O)n-(CH(CH3)-CH2-O)m-(CH2-CH2-O)nH으로 표시되고, 여기서 n 및 m 은 반복단위를 나타내고, 각각 10 - 130 범위의 정수인 것을 특징으로 하는 이온빔을 이용한 이종세포의 패턴 형성 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 1의 고분자 용액 내의 생체분자의 흡착방지용 고분자의 함량은 1 중량% ~ 70 중량% 인 것을 특징으로 하는 이온빔을 이용한 이종세포의 패턴 형성 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 2의 이온빔의 총조사량은 1× 109 내지 1× 1016 ions/cm2인 것을 특징으로 하는 이온빔을 이용한 이종세포의 패턴 형성 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계 3의 세포들은 섬유아세포주, 각질세포주 및 암세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이온빔을 이용한 이종세포의 패턴 형성 방법.
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