KR101123023B1

KR101123023B1 - 조류 조직 샘플중의 바이러스 검출 분석 방법

Info

Publication number: KR101123023B1
Application number: KR1020057006626A
Authority: KR
Inventors: 베누고팔 케이 나이르; 수잔 진 베이전트; 리챠드 죤 윌리엄 쿠리
Original assignee: 와이어쓰 엘엘씨
Priority date: 2002-10-15
Filing date: 2003-10-14
Publication date: 2012-03-15
Also published as: AR041627A1; NZ539299A; KR20050053776A; CA2500429C; MXPA05003850A; US20060269910A1; US7524651B2; WO2004035821A1; BR0315340A; JP2006502743A; TWI331217B; CA2500429A1; EP1551997A1; AU2003271722A1; AU2003271722B2; TW200411181A; JP4491411B2; BRPI0315340B1

Abstract

본 발명은 깃털로부터 유래된 유전자 물질이 바이러스 기원의 유전자 물질의 존재에 대해 시험됨을 특징으로 하는, 조류 조직 샘플에서 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.

조류 조직 샘플, 마렉병 바이러스, MDV

Description

조류 조직 샘플중의 바이러스 검출 분석 방법{Assay methods for detection of a virus in an avian tissue sample}

본 발명은 분석 방법 및 특히, 조류 조직 샘플중의 바이러스, 특히, 마렉(Marek)병 바이러스(MDV)의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.

마렉병 바이러스(MDV)는 닭에서 림프구 증식 질환을 일으키는 헤르페스바이러스이다. MDV에 대한 백신이 도입된 이후에도, 당해 감염은 여전히 가금류 산업에 상당한 손실을 유발한다. MDV는 3개의 혈청형으로 분류되고 이 모두는 잠복성 감염을 초래한다. 혈청형 1은 발암성 바이러스를 포함하고 혈청형 2는 비-발암성 바이러스를 포함하고 혈청형 3은 칠면조 헤르페스바이러스(HVT)를 포함한다[문헌참조: Bulow et al (1976) Zentralblatt fur Veterinarmedizin, 23B, 391-402].

마렉병의 통상적인 진단은 임상적 징후 및 병리학적 변화를 기초로한다. 그러나, MDV의 만연을 감시하기 위해서는 보다 특이적인 방법이 요망된다. 한천 겔 침전 시험에 의한 깃털 모낭 상피세포에서 바이러스 항원의 검출법은 문헌[참조: Haider et al (1970) Poultry Science, 49, 1654-1657]에 기재되어 있다. 상이한 혈청형은 한천 겔 침전 시험[문헌참조: Lee et al (1983) Journal of Immunology, 130, 1003-1006]에 의해 구별될 수 있지만 당해 시험의 감도는 효소 결합된 면역흡착 분석(ELISA) 및 DNA 하이브리드화법보다는 떨어진다[문헌참조: Davidson et al (1986) In: Current research on Marek's disease. Proceedings of the 5 ^th International Symposium on Marek's Disease (pp. 311-316). Tallahassee: Rose Printing Company, Inc.].

바이러스 분리를 위해 바람직한 샘플은 연층(buffy-coat) 세포이고 이는 민감한 1차 세포 배양물과 동시 배양될 수 있다. 면역형광 분석법(문헌참조: Kitamoto et al(1979). Biken Journal, 4, 137-142) 또는 ELISA(문헌참조: Cheng et al(1984) Avian Diseases, 4, 900-911)는 MDV 혈청형의 후속 동정을 위해 사용될 수 있다. 또한, 혈청형은 제한 엔도뉴클레아제 분석(문헌참조: Ross et al (1983). Journal of General Virology, 64, 2785-2790) 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)(문헌참조: Wang et al (1993) Molecular and Cellular Probes, 7, 127-131)에 의해 동정될 수 있다. 원위치 하이브리드화는 감염된 조직중에 MDV 게놈을 검출하는데 사용되어 왔지만[문헌참조: Endoh et al (1996) Journal of Veterinary Medical Science, 58, 969-976; Ross et al (1997) Journal of General Virology, 78, 2191-2198], 당해 기술은 아마도 통상적인 진단에 대해서도 많은 노력을 요구한다[문헌참조:Davidson et al (1995) Avian Pathology, 24, 69-94; and Davidson et al (1996) In: Current research on Marek's disease. Proceedings of the 5^th International Symposium on Marek's Disease (pp. 311-316). Tallahassee: Rose Printing Company, Inc.), applied MDV serotype 1-specific PCR techniques to full blood and tumour tissue samples from commercial chicken and turkey flocks, the majority of which had neoplastic disease. Wang et al (1993) Molecular and Cellular Probes, 7, 127-131; Young, P. & Gravel, J. (1996) In Current research on Marek's disease. Proceedings of the 5^th International Symposium on Marek's Disease (pp. 308-310),. Tallahassee: Rose Printing Company, Inc.; and Silva, R.F. & Witter R.L. (1996) In Current research on Marek's disease. Proceedings of the 5^th International Symposium on Marek's Disease (pp. 302-307). Tallahassee: Rose Printing Company, Inc., applied a MDV serotype 1-specific PCR protocol to various tissues of chickens experimentally inoculated with the JM/102 strain ].

문헌[참조: Handberg et al (2001) Avian Pathology 30 : 243-249 ]은 닭에서 MDV의 검출을 위한 혈청형 1- 및 혈청형 3- 특이적 PCR의 용도를 기재하고 있다. 조직 샘플은 혈액(연층 세포), 비장, 간, 피부, 깃털 선단 및 난소로 부터 취득하였다.

본 발명은 추가로 조류 조직 샘플에서 바이러스, 특히, MDV를 검출하기 위한 방법을 제공한다.

제1 측면에서, 본 발명은 유전자 물질을 조류 조직 샘플로부터 추출하고 추출된 유전자 물질을 시험하여 바이러스 기원의 유전자 물질을 검출함을 포함하는, 조류 조직 샘플이 겨드랑이 부분(axillary tract)의 하나 이상의 깃털로부터 유래함을 특징으로 하는, 조류 조직 샘플에서 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.

깃털 샘플을 사용하여 생존 동물에 대해 시험을 수행할 수 있다. 깃털의 샘플 채취는 현장 조건하에서 단순하고 신속하며 실용적이다. 깃털 샘플을 적합한 용기내에 넣을 수 있고, 경우에 따라, 즉시 시험되거나 장래 시험을 위해 보관될 수 있다. 반대로, 혈액 샘플 채취는 혈액 응고가 발생하지 않도록 냉장 조절된 조건하에 혈액의 운반을 포함하는 큰 주의를 요구한다. 혈액 응고는 시험 결과가 음성이도록 유도한다. 비장 및 종양 샘플과 같은 내부 기관 샘플은 습윤 빙상에서 운반되어야만 하고 현장 조건하에서는 실용적이지 못하다.

겨드랑이 부분의 깃털을 선택하고 이로부터 조직 샘플을 채취함으로써 본 발명은 새의 다른 부분으로부터 조직 샘플을 채취하는 공지된 방법 보다 상당한 잇점을 제공한다.

놀랍게도, 본 발명자는 바이러스가 기타 깃털에서 보다 고수준으로 겨드랑이 부분의 깃털에서 검출될 수 있어 기타 깃털을 포함하는 기타 조직 샘플에서 검출될 수 없는 경우에도 바이러스가 겨드랑이 부분의 깃털에서는 검출될 수 있음을 밝혔다. 따라서, 본 발명의 방법은 특히, 겨드랑이 부분의 깃털 조직 샘플에서 백신 종의 존재를 검출함으로써, 특정 무리의 새가 MDV 백신으로 효과적으로 면역화되었지는지를 모니터하는데 적합하다.

"조류"는 임의의 새를 포함하지만 바람직하게는 상업적으로 사육되는 닭, 칠면조, 오리등과 같은 가금류인 새를 포함한다.

"겨드랑이 부분의 깃털"이란 첨부된 깃털의 다이아그람(도 1)에서 새의 "겨드랑이"로 표시된 영역에 위치한 깃털을 의미함을 포함한다. 바람직하게, 선택된 겨드랑이 부분의 깃털은 "핀(pin) 깃털", 즉 미성숙한 성장 깃털이다. 용어 "핀 깃털"은 당업자에게 익숙할 것이다. 예를 들어, 문헌[참조: van Tyne J & Berger AJ (1959) Fundamentals of Ornithology, John Wiley, New York]은 핀 깃털을 "아직 완전하게 거죽(sheath)이 형성되지 않은 새롭게 성장하는 깃털"이라고 언급한다. 문헌[참조: Lucas AM & Stettenheim PR (1972) Avian Anatomy, Integument Part 1, US Government Printing Office, Washington, pp 199-200]은 "새로운 깃털은 이것이 형성되는 동안에 거죽내부에 촘촘하게 접혀져 있다"고 기재하고 있다. 이것은 피부위에 출현함으로써, 무딘 선단의 긴 원뿔형이고 약간 습윤된 표면을 갖는다. 임의의 세대의 당해 단계에서의 깃털은 흔히 "핀 깃털"로서 불리운다[문헌( Lucas & Stettenheim (1972))으로부터 발췌한 도 1(a) 참조].

바람직하게, 겨드랑이 부분의 깃털은 유리하게 1개월 미만의 병아리로부터 채취한다.

바람직한 양태에서, 당해 방법은 면역화후 13일째에 또는 13일 전에, 바람직하게는 면역화 후 8일 내지 12일에, 보다 바람직하게는 면역화 후 9 내지 11일에, 즉, 면역화후 9일, 10일 또는 11일째에 병아리로부터 채취한 샘플에 대해 수행한다.

바람직하게, 당해 방법은 샘플중의 바이러스, 특히 MDV의 양에 대한 정량적 정보를 제공한다.

바람직하게, 당해 방법은 MDV 혈청형 1에 대해 특이적이고 보다 바람직하게 당해 방법은 MDV-1 리스펜스 (Rispens) 종 CVI 988에 대해 특이적이다. 후자 종은 제조원[Fort Dodge, IA, USA]으로부터 제조되고 아메리칸 컬쳐 컬렉션(ATCC)(Mannassas, VA, USA))으로부터 구입가능한 상업적 백신 종이다.

유리하게, 당해 방법은 PCR 반응의 사용을 포함한다. 바람직하게, 당해 PCR 반응을 수행하기 전에, 시험될 추출된 유전자 물질을, 임의의 제제로 처리하여 존재할 수 있는 모든 깃털 조직 인자의 억제 효과를 제거한다. 당해 억제 효과는 멜라닌과 연관되어 나타나고 따라서 갈색 새로부터의 깃털이 샘플 채취되는 경우 특정 문제가 될 수 있다. 바람직하게, 당해 제제는 소 혈청 알부민, 돼지 알부민 및 양 알부민 하나 이상으로부터 선택된다.

당업자는 바이러스, 특히 MDV, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 유전자 물질을 검출하기 위해, 문헌[참조: Handberg et al(2001) ]의 방법과 같은 특정 범위의 검출 방법을 숙지하고 있다. MDV-1 종 CVI 988을 검출하기 위해 특히 바람직한 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:

(i) MDV의 132 bp 반복 뉴클레오타이드 서열에 플랭킹되어 있는 뉴클레오타이드 서열로부터 선택되는, 핵산 폴리머라제에 대한 정배향 및 역배향 프라이머를 제공하는 단계;

(ii) 프라이머 사이의 핵산 서열을 증폭시키는 단계;

(iii) 증폭된 핵산 서열에서 132bp 반복 서열의 수를 검출하는 단계 및

(iv) 132 bp 반복 서열의 수를 바이러스 핵산의 실체와 관련시켜 조직 샘플중의 MDV의 유형을 동정하는 단계(여기서, 다중 카피의 132 bp 반복 서열은 MDV-1 종 CVI988임을 암시한다).

본 발명에 따른 MDV를 검출하는데 사용하기 위한 바람직한 정량적 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:

(a) MDV 특이적 표적 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하는 단계,

(b) 추출된 유전자 물질을 프로브와 접촉시켜, 당해 프로브가 이의 표적 MDV 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하도록 하는 단계,

(c) 상기 프로브가 이의 표적 MDV 폴리뉴클레오타이드에 결합하였는지를 측정하는 단계 및

(d) 표적 폴리뉴클레오타이드의 존재가 샘플중의 MDV의 존재를 지시함을 토대로 하여, 샘플이 MDV를 함유하는지를 측정하는 단계.

단계 (d)는 바람직하게 샘플중의 바이러스의 양을 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다.

유리하게, 프로브가 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합하였는지를 측정하는 단계는 프로브의 결합 부위를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오타이드의 영역을 증폭시킴을 포함한다.

바람직하게, 프로브는 5' AGA CCC TGA TGA TCC GCA TTG CGA CT 3'(서열 번호 1)의 서열을 갖는다.

바람직하게, 증폭은 하기의 프라이머로 프라이밍된다:

GA 종 Meq 유전자 서열에서 NT 위치 1341번 내지 1361번에 위치한 정배향 프라이머(GGT CTG GTG GTT TCC AGG TGA-서열 번호 2).

GA(조지아(Georgia)) 종은 조지아의 난소 종양 기원의 1964 분리체이다. 참조문헌: C.S. Eidson & S.C. Schmittle (1968). Studies on acute Marek's disease. I. Characteristics of isolate GA in chickens. Avian Diseases 12;467-476.

NT 위치 1413번 내지 1393번에 위치한 역배향 프라이머(GCA TAG ACG ATG TGC TGC TGA -서열 번호 3).

유리하게, 프로브는 형광성으로 표지되고 프로브가 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합하였는지를 측정하는 단계는 프로브의 형광성 방출을 측정함을 포함한다.

2개의 형광성 염료는 짧은 올리고 프로브(5' 리포터 형광색소, 일반적으로 6-FAM 및 3' 켄처 형광색소, 일반적으로 TAMRA)의 반대 말단에 직접 접합시켜 물리적으로 인접하도록 한다. 고에너지 형광단(FAM)이 520nm에서 예상되는 형광성 방출 대신에 488nm에서 여기되는 경우, 포획된 에너지는 보다 낮은 에너지 형광단(TAMRA)로 전달되고 580nm(형광 공명 에너지 전달 FRET가 발생한다)에서 방출된다. 플루오레신/로다민 리포터/켄처 조합체를 사용하여, FRET는 당해 그룹이 25 내지 30개의 염기 DNA로 분리되어 있는 경우에도 효과적으로 발생한다. TaqMan^TM 분석 과정동안에, 2개의 형광단은 Taq DNA 폴리머라제 5'-뉴클레아제 작용에 의해 서로간에 물리적으로 탈리되고 이후에, 488nm 자극은 520nm에서 가시적인 FAM 방출을 유도한다.

2중 표지된 프로브는 일반적으로 FAM, TET, HEX, JOE 또는 VIC와 같은 5'-리포터 염료 및 TAMRA 또는 다브실 (Dabcyl)(범용 켄처)과 같은 3' 켄처 그룹을 갖는다.

적합한 형광성 표지는 당업자의 통상적인 지식 범위내에 있다. 하기의 시약은 제조원[Sigma-Aldrich]으로부터 시판되고 HEX는 헥사클로로-플루오레신을 의미하고, TET는 테트라클로로플루오레신을 의미하고, Joe는 6-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신이고, ROX는 5-카복시-로다민이고, 다브실은 4-((4-(디메틸아미노)페닐)아조)벤조산이다.

이들 모두에 대한 구조 및 추가의 정보는 분자 프로브 웹사이트 www.probes.com상에서 구할 수 있다. VIC 염료는 제조원[Applied Biosystems]으로부터 시판되고 있다.

6-FAM = 6-카복시플루오레신; (포스포르아미디트); 황녹색 염료; 최대 흡광도 = 494nm, 최대 방출 = 525nm.

HEX = 포스포르아미디트; 분홍 염료; 최대 흡광도 = 535, 최대 방출 = 556nm.

TET = 포스포르아미디트; 오렌지 염료; 최대 흡광도 = 521, 최대 방출 = 536.

VIC = 최대 흡광도 538, 최대 방출 = 554.

JOE = 최대 흡광도 521, 최대 방출 = 547.

TAMRA = 6-카복시-테트라메틸-로다민; 최대 흡광도 = 555, 최대 방출 = 580.

다브실 = 최대 흡광도 = 453, 최대 방출 부재(범용 켄처).

이전의 기술로부터, 본 발명의 방법의 중요한 측면은 바이러스, 특히 MDV 감염을 검출하기 위해 이전에 사용된 조류 조직 샘플보다 간편하고 유용한 조류 조직 샘플의 용도임이 명백하다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면은 조류 조직 샘플을 제공하는 것이다.

제2 측면에서, 본 발명은 겨드랑이 부분에서 하나 이상의 깃털로부터 분리된 조류 조직 샘플을 제공하는 것이다.

분리됨이란 조직 샘플중에 천연에서는 정상적으로 결합되는 실질적인 양의 물질이 없음을 의미한다. 예를 들어, 조직 샘플은 용기내에 저장될 수 있거나 다양한 분리, 추출 및/또는 정제 방법에 의해 본래의 겨드랑이 부분의 깃털로부터 유래될 수 있다.

바람직하게, 분리된 조직 샘플은 기부(proximal) 부분(피부에 접착되어 있고 펄프를 함유하는 미늘(barb)이 없는 부분)으로 이루어진다. 따라서, 겨드랑이 부분의 깃털의 기부 부분은 깃털의 말초(distal)(미늘) 부분으로부터 분리되는 것이 바람직하다. 이것은 단순히, 가위로 깃털의 기부 부분을 절단하고 말초 부분을 제거함으로써 용이하게 성취된다.

제3 측면에서, 본 발명은 조류 조직 샘플로부터의 유전자 물질 함유 추출물을 제공하고 이때 추출물은 본 발명의 제2 측면과 관련하여 기재된 바와 같이 조직 샘플로부터 채취한다.

본 발명의 제2 및 제3 측면에 따른 샘플은 현장에서 수거되고/되거나 제조될 수 있거나 제조 및 시험을 위해 실험실과 같은 별도의 위치로 운반될 수 있는 것으로 인식된다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면은 별도의 위치로 운반하는데 적합한 형태로 저장된, 본 발명의 제2 및/또는 제3 측면에 따른 샘플에 관한 것이다.

깃털은 예를 들어, 20ml 스테릴린 (Sterilin) 범용 플라스틱 튜브중에 완벽하게 저장될 수 있거나 DNA 제조를 위해 요구되는 기부 부분을 절단한 후, 예를 들어, 1ml 에펜도르프 스냅 캡 또는 스크류 캡 튜브중에 저장될 수 있다. 또한, 깃털은 열 밀봉 또는 묶는 플라스틱 백중에 저장될 수 있다. 단기간(예를 들어 1주) 저장을 위해, 깃털은 4℃에서 저장될 수 있지만 장기간 저장을 위해서는 이들은 -20℃에서 동결 저장되어야만 한다.

DNA는 스크류 캡 또는 스냅 캡의 0.5ml 또는 1.5ml 에펜도르프 튜브중에 -20℃에서, Tris-EDTA 완충액 중에서 저장되어야만 하거나, DNA가 타크만(Taqman) 분석에 사용되어야만 하는 경우, EDTA가 타크만 반응을 억제하기 때문에 물중에 저장되어야만 한다.

또한, 당해 방법의 결과는 잘 이해될 수 있는 포맷으로 제공된다. 바람직하게, 당해 결과는 정보 캐리어상에 기록되거나 저장된다. 그러나, 결과를 제공하는 단계는 결과를 구두로 전달하는 것일 수 있다.

"정보 캐리어"란 종이, 컴퓨터 디스크와 같은 임의의 정보 저장 수단, 인터넷 기반 정보 전달 시스템, 예를 들어, 전자메일 또는 인터넷 페이지 또는 전자 파일을 의미한다. 물론, "인식가능한 포맷"이란 또한 적합한 키로 판독될 수 있는 암호화된 정보를 포함한다.

본 발명의 특정 측면을 구체화하는 실시예가 하기의 도면을 참조로 기재될 것이다:

도 1(a)는 처음 4세대동안에 피부상의 깃털의 발육을 보여준다. 원형은 아직까지 성장하고 있는 깃털을 지적하고 반점은 완전히 성장한 깃털을 지적한다.

도 1(b)는 겨드랑이 부분을 나타내는 닭에서의 깃털 패턴의 다이아그람이다.

겨드랑이 부분은 병아리의 밑면에 위치하고 각각의 측면은 날개 아래, 흉골 옆을 따라 하부 목으로부터 상부 복부까지를 포함한다. 도 1은 문헌[the book 'Bird Structure: An approach through evolution development and function in the fowl'. D.A.Ede, Publisher: Hutchinson Educational, 1964]으로부터 발췌한 것이다. 깃털 패턴은 모든 새에서 동일하다.

도 2(a) 내지 2(d)는 겨드랑이 부분의 깃털에 대한 사진이고 본 발명에 따른 조직 샘플을 제공하기 위해 보유된 부분을 보여주는 각각의 깃털들을 클로우즈 업한 것이다. 도 2(a) 및 2(b)는 겨드랑이 부분의 깃털을 나타낸다. 도 2(c) 및 2(d)는 분석을 위해 채취한 깃털 부분을 나타낸다.

도 3은;

타크만 기술을 사용하여 Meq 프라이머(78bp 생성물)에 의해 검출된 바와 같은 혈청형 CVI988 백신의 투여 반응을 나타낸다. CVI988 백신은 세균성 인공 염색체(BAC) 벡터로부터 수득하였다.

당해 실험은 Meq 타크만 프라이머/프로브 세트의 용도를 시험하고 최적화하기 위해 수행되었다. BAC10 DNA는 이것이 많은 카피의 바이러스 게놈을 함유하는 것으로 공지되어 있기때문에 표적 DNA로서 사용되었다. 타크만 분석은 세균성 인공 염색체(BAC10)으로 클로닝된 리스펜스 바이러스 게놈으로부터 유래된 DNA중의 Meq 유전자를 검출하는데 사용되었다. 당해 DNA는 10배 희석으로 사용되었다. 실시간의 PCR의 각 사이클동안에, 리포터 형광색소 FAM이 방출되고 형광을 발산할 수 있다. 따라서, 각 사이클에서 형광 강도는 증가한다. Ct 값(형광성이 고정된 역치를 초과하는 사이클)은 표적 서열의 개시 카피 수에 대한 측정치이다. Ct값이 낮을 수록 표적 서열의 개시 카피 수는 높아진다. 40의 Ct 값은 표적 서열이 존재않거나 표적 서열이 검출될 수 없음을 지적한다. 이러한 수치는, 1:10 내지 1:10000의 DNA 제조물의 희석이 Meq PCR 생성물을 검출가능한 양이 되도록 함을 보여준다. Ct 값은 DNA 희석의 증가에 직비례하여 증가한다.

도 4:

닭 배아 섬유아세포(CEF) 및 세균 인공 염색체(BAC)에서의 CVI988 백신의 투여 반응.

당해 실험을 수행하여 리스펜스-MVD 감염된 세포로부터 유래하는 DNA에 대한 Meq 타크만 프라이머/프로브 세트의 사용을 시험하고 최적화하였다.

타크만 분석을 사용하여 BAC10으로부터 유래된 DNA와 리스펜스 MDV 감염된 병아리 배아 섬유아세포(CEF)로부터 유래된 DNA에서 Meq 유전자를 검출하였다. DNA는 10배 희석하여 사용하였다 . 당해 수치는 BAC10 DNA와 리스펜스-감염된 CEF DNA 둘다에 대한 Ct 값이 DNA 희석의 증가에 직비례하여 증가함을 보여준다.

도 5:

닭 비장 및 CEF에서 CVI988 백신의 투여 반응.

본 실험을 수행하여 리스펜스-MDV 감염된 닭 기원의 조직 샘플로부터 유래된 DNA에 대한 Meq 타크만 프라이머/프로브 세트의 사용을 시험하고 최적화하였다.

타크만 분석을 사용하여 리스펜스 접종된 병아리(11 dpi) 및 나이가 동일한 비접종 병아리의 비장 기원의 DNA에서 Meq 유전자를 검출하였다. 리스펜스 감염된 CEF 세포 기원의 DNA 는 양성 대조군으로서 사용하였다. 당해 DNA는 10배 희석된 1mg/ml의 스톡으로 사용하였고 반응당 1㎕를 사용하였다. 비접종된 비장 DNA에 대한 Ct 값이 40미만이지만 이들은 명백하게 DNA 농도의 증가와 함께 증가하지 않았다. 그러나, 접종된 비장 DNA에서 Meq 검출은 DNA가 순수하게 사용되거나 1:10의 희석에서 사용되는 경우 당해 기준선 이상으로 상당히 증가하였다. 따라서, 본 발명자는 MDV 접종된 병아리의 조직 샘플로부터 채취한 DNA의 타크만 분석을 위해 1mg/ml의 스톡으로부터 1㎕의 DNA 즉 반응당 1㎍의 DNA를 사용하기로 설정했다.

도 6:

감염 15 내지 20일 후, 최대 복제를 입증하는 닭 깃털에서의 CVI988 백신의 복제에 대한 시간 추이.

본 실험을 수행하여 타크만 분석에 의한 접종된 병아리의 깃털 겨드랑이 부분에서의 리스펜스 MDV 감염에 대한 시간 추이를 관찰하였다.

타크만 분석을 사용하여 리스펜스로 접종한 후 0(비접종), 10, 15, 20 및 28dpi에서 병아리의 깃털 선단으로부터 제조된 DNA에서 Meq 유전자를 검출하였다. 5마리의 병아리 그룹으로부터 각각의 시점(4마리의 병아리는 0 dpi에서)에서 샘플을 채취하였다. 타크만 분석에서 1㎍의 DNA를 사용하였다. 각각의 그룹에 대한 평균 Ct 값을 플롯팅한다. Ct 값은 0 내지 15dpi에서 감소하고 이어서 20 내지 28dpi에서 다시 증가하는데 이는 감염 15-20 dpi에서 최대를 나타낸다.

도 7:

본 실험을 수행하여 132bp 반복 PCR에 의해 접종된 병아리의 깃털 겨드랑이 부분의 리스펜스 MDV 감염에 대한 시간 추이를 관찰하였다.

DNA를 0(비접종), 10, 15, 20 및 28dpi에서 리스펜스-접종된 병아리의 깃털 선단으로부터 제조하였다. 5마리 병아리 그룹으로부터 각 시점(4마리의 병아리는 0dpi에서)에서 샘플을 채취하였다. 1㎍의 DNA를 PCR(반응당 10㎍의 BSA를 포함)에 사용하였고 당해 샘플은 에티디움 브로마이드를 함유하는 1% 아가로스 겔상에 적용하였다.

(M)= 람다 분자 크기 마커, (-) = 물(음성 대조군), (+) = 리스펜스 BAC10 DNA(양성 대조군). 감염 후 일수는 겔 아래에 나타낸다.

(a) 각각의 DNA 샘플의 PCR 양질과 양을 확인하기 위해, PCR을 수행하여 모든 병아리 세포에 존재하는 내인성 레트로바이러스 서열을 검출하였다. 360bp 내인성 레트로바이러스 생성물은 모든 깃털 샘플에서 검출되었고 이는 각 샘플의 PCR 성질을 확인시킨다.

(b) 132 bp 반복 PCR을 수행하였다. (+)로 표시된 레인은 리스펜스 BAC10--6개의 카피로 수득된 132 bp 반복 래더(ladder) PCR 생성물은 명백하게 구분됨을 보여준다. 음성 대조군은 4마리의 비접종된 병아리중 3마리와 같이 어떠한 PCR 생성물을 나타내지 않는다. 4번째 비접종된 병아리는 3개 카피의 반복체와 동일한 희미한 생성물을 나타내고 이것은 병아리가 동일한 방에 거주된 접종된 병아리에 의해 접촉 감염되었음을 지적한다. 접종된 병아리 모두는 11, 15, 20 및 28dpi에서 132 bp의 반복체에 양성이다. 많은 경우에 우세한 특정 반복체 카피 수를 나타내는 PCR 생성물과 당해 우세한 생성물에 의해 나타난 카피 수는 샘플 마다 다양하였다. 이것은 특정 수의 반복체와 함께 접종 바이러스의 서브클론이 상이한 병아리에서 우세함을 지적한다.

도 8:

그래프는 리스펜스 BAC10 DNA를 사용한 Meq 유전자 반응에 대한 표준 곡선을 나타낸다.

도 9:

그래프는 백신 접종 (A) 8일, (B) 13일, (C) 19일 및 (D) 26일 후에 각각의 병아리의 다양한 깃털 부분에서의 리스펜스 바이러스 적재량을 비교한 것이다.

도 10:

그래프는 대수적 스케일 상에서 (A)로서 플롯팅된 Meq 유전자와 직비례 스케일상에서의 (B)로서 플롯팅된 Meq 유전자에 대한 실시간 PCR에 의해 측정되는 다양한 깃털 부분에서의 리스펜스 바이러스 적재량을 나타낸다.

실시예 1: MDV-1에 대한 정량 PCR 분석

타크만^TM 정량 PCR은 형광성 역치(Ct 값에 의해 수학적으로 정의됨)에 도달하는데 요구되는 PCR 사이클 수를 측정함에 의해 개시 PCR 표적 양을 정량하는데 사용되도록 확립된 기술이다. 샘플에서 표적 서열의 카피 수가 증가할 수록 Ct 역치에 도달하기 위한 PCR 사이클은 적어야만 한다.

타크만 프라이머 및 프로브는 MDV 종 GA(이후 참조)의 Meq 유전자 서열로부터 디자인하였다. 당해 서열은 문헌[참조: Jones D, Lee L, Liu JL, Kung HJ, Tillotson JK]에 공개되어 있다. 마렉병 바이러스는 림프모구세포 종양에서 고도로 발현되는 fos/jun 발암유전자와 유사한 기본적 류신 지퍼 유전자를 암호화하고 있다[문헌참조: Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1992 May 1; 89(9):4042-6]. 서열 승인 번호는 M89471(서열 번호 9)이다. 적용된 바이오시스템 '프라이머 발현' 소프트웨어를 사용하여 Meq 서열 기원의 최적의 프라이머/프로브 서열을 선별하였다.

본 분석에 사용되는 특정 프라이머는 MDV 혈청형 1 바이러스의 meq 유전자에서 73bp 서열을 증폭시킨다. 당해 영역은 백신 종 및 야생 분리체 둘다에 공통영역이다.

기재된 실험은 혈청형 1 마렉병 바이러스의 예로서 CVI 988 백신을 사용한다. 프라이머가 지시되는 서열의 영역은 MDV 혈청형 1 바이러스에서 보존되어 있기 때문에 당해 결과는 모든 혈청형 1 마렉 바이러스에 적용될 수 있다.

깃털 선단 샘플에 대한 타크만^TM Meq 유전자 PCR 분석을 위한 프로토콜

1. 요구되는 재료:

시약:

●TNE 완충액(실온에서 보관)은 트리스(10mM), NaCl(150mM), EDTA(1mM)을 함유하고 pH는 HCl을 사용하여 pH 7.5로 조절한다.

●나트륨 도데실 설페이트(SDS) 10% 용액(실온에서 보관).

●프로테이나제 K[제조원(Sigma # P-6556)으로부터 시판되는 동결건조된 분말 및 물중의 20mg/ml의 스톡을 구성하며 -20℃에서 보관].

●시그마(카탈로그 번호 P-4557)에서 구입된 페놀 pH 7.9(4℃에서 보관).

●클로로포름(-20℃에서 보관).

●3M 나트륨 아세테이트 pH 5.2(실온에서 보관).

●여과된 순수 에탄올(실온에서 보관).

●여과된 70% 냉장 에탄올(4℃에서 보관).

●PCR 등급의 물.

●여과된 800㎍/ml의 소 혈청 알부민(BSA)를 함유하는 PCR 등급의 물.

●얼음.

●타크만^TM PCR 코어 시약- 타크만^TM 완충액, MgCl₂, dNTP, Taq 폴리머라제, 우라실 N-글리코실라제(퍼킨 엘머 바이오시스템(Perkin Elmer Biosystems))

Meq 정배향 프라이머 5'GGT CTG GTG GTT TCC AGG TGA 3' (서열 번호 2)(MWG Biotech).

Meq 역배향 프라이머 5'GCA TAG ACG ATG TGC TGC TGA 3'(서열 번호 3) (MWG Biotech)

Meq 프로브 5'FAM AGA CCC TGA TGA TCC GCA TTG CGA CT 3'(서열 번호 1) TAMRA

(Sigma-Genosys Ltd)

(FAM & TAMRA는 형광성 태그이다)

6-FAM = 6-카복시플루오레신; (포스포라미디트); 황녹색 염료; 최대 흡광도 494nm, 최대 방출 = 525nm.

TAMRA = 6-카복시-테트라메틸-로다민; 최대 흡광도 = 555, 최대 방출 = 580nm.

5'FAM-3'TAMRA 표지된 프로브는 제조원[Sigma-Genosys Ltd.(London Road, Pampisford, Cambridgeshire, CB2 4EF, UK. Tel. 01223 839200)]으로부터 시판된다.

5'VIC-3'TAMRA 표지된 프로브는 제조원[Applied Biosystems Ltd.(Kelvin Close, Birchwood Science Park North, Warrington, Cheshire, WA3 7PB)]으로부터 시판된다.

기타 제조원은 다음과 같다:

●Integrated DNA Technologies (IDT) 1710 Commercial Park, Coralville, IA, 52241, USA

●Oswel Research Products Ltd.: Lab 5005, Medical and Biological Sciences Building, University of Southampton, Boldrewood, Bassett Crescent East, Southampton, SO16 7PX, Tel: 02380 592984

장치

●스테릴린 20ml 플라스틱 범용 튜브

●청결 가위 및 핀셋

●50℃로 설정된 물 욕조

●미세원심분리기

●1.5ml의 스냅 캡 에펜도르프 튜브(오토클레이빙됨)

●1.5ml의 스크류 캡 에펜도르프 튜브(오토클레이빙됨)

●0.5ml의 스냅 캡 에펜도르프 튜브(오토클레이빙됨)

●진공/동결 건조기(필수 사양 아님)

●분광광도계

●PCR용 캐비넷, 피펫 및 오토클레이빙된 선단

●열 고정 96웰 PCR 플레이트 및 캡(퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템)

●ABI 프리즘 7700 서열 검출기(퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템)

2. 깃털 수거:

●각각의 닭의 상박 깃털 부분으로부터 8 내지 10개의 '핀' 깃털(많은 펄프를 갖는 짧고 새롭게 성장하는 깃털)을 뽑아낸다(도면 참조).

●연구실 운반용 플라스틱 '범용' 튜브에 깃털을 넣는다.

3. 깃털 선단으로부터 DNA의 제조

●깃털의 기부 1cm(즉, 피부에 부착되어 있고 펄프를 함유하는 미늘 부재 부분- 사진 참조)를 절단하고 보호한다. 깃털의 말초 미늘 부분을 버린다.

●각각의 닭에 대해, 8 내지 10개의 보호된 깃털 말단을 1.5ml 들이 스냅 캡 에펜도르프 튜브에 넣는다.

●100㎍의 프로테이나제 K(사용 직전에 프로테이나제 K를 첨가한다)를 함유하는 500㎕의 프로테이나제 K 샘플 완충액(0.5%의 SDS를 함유하는 TNE 완충액)을 첨가한다.

●1.5 내지 2시간동안 물 욕조에서 50℃에서 항온처리한다.

●튜브를 미세원심분리(6000rpm, 10분)하여 깃털 선단 및 파편을 펠렛화한다.

●상등액을 새로운 스냅 캡 튜브로 옮긴다(깃털이 갈색 새로부터 기원하는 것인 경우, 상등액은 멜라닌의 존재로 갈색이될 것이다).

●동일 용적(500㎕)의 페놀을 상등액에 다시 첨가한다.

●볼텍싱한다.

●13000rpm에서 2분동안 원심분리한다.

●상부상(수성)을 새로운 스냅 캡 튜브로 옮긴다.

●동일 용적(500㎕)의 페놀을 상등액에 다시 첨가한다.

●볼텍싱한다.

●13000rpm에서 12분동안 원심분리한다.

●상부상(수성)을 새로운 스냅 캡 튜브로 옮긴다.

●동일 용적(500㎕)의 냉각 클로로포름을 첨가한다.

●볼텍싱한다.

●13000rpm에서 2분동안 원심분리한다.

●상부상을 1.5ml의 스크류 캡 튜브로 옮긴다.

●1ml의 여과된 100% 에탄올을 첨가한다.

●50㎕의 3M 나트륨 아세테이트를 첨가한다.

●튜브를 뒤집으면서 약하게 혼합하고 실온에서 20분동안 방치한다(DNA는 침전됨으로써 육안으로 관찰될 수 있다).

●13000rpm에서 2분동안 원심분리하여 DNA를 펠렛화한다(백색 닭이 사용되는 경우, 펠렛은 백색일 것이고 갈색 닭을 사용한 경우 펠렛은 갈색일 것이다).

●상등액을 버린다.

●에탄올을 튜브의 측면을 따라 약하게 흘림에 이어서 쏟아 버림(DNA 펠렛이 소실되지 않도록 주의한다)에 의해 펠렛을 70%의 냉각 에탄올 500㎕로 2회 세정한다.

●튜브의 개방된 정상부분을 파라핀으로 밀폐시키고 바늘을 사용하여 파라필름 (Parafilm)중에 구멍을 낸다.

●튜브를 약 5분동안 진공 건조기에 넣고 펠렛을 건조시킨다(또는 통기 건조).

약하게 볼텍싱함에 의해 펠렛을 50㎕의 PCR 양질의 물에 재현탁시킨다.

분광광도계를 사용하여 DNA 제제의 농도를 측정한다.

농도를 물중에서 1mg/ml로 조정한다.

-20℃에서 저장한다.

4. 타크만^TM 정량적 PCR 분석(퍼킨 엘머 바이오시스템)

●PCR용 피펫 및 오토클레이빙된 팁을 사용하여 PCR용 캐비넷중에 반응물을 준비한다.

●빙상에서 수행한다.

●적정 수의 샘플에 대한 하기의 시약을 함유하는 마스터 혼합물을 제조한다-각각의 샘플에 대해 2회 반응을 준비한다.

(반응당 주어진 용적):

●볼텍싱하여 완전히 혼합되도록 한다.

●열 고정 PCR 플레이트를 빙상에서 플레이트 홀더상에 놓고 24㎕의 마스터 혼합물을 사용될 각각의 웰에 첨가한다.

●1㎕의 오토클레이빙된 물을 받침 부재 조절(NTC) 웰에 첨가하고 임의의 DNA 샘플을 개방하기 전에 이들 웰을 캡핑한다.

●1㎕의 양성 대조군 DNA(= 1㎕의 1mg/ml 제제), 예를 들어, 리스펜스 감염된 CEF 기원의 DNA를 적정한 웰에 첨가하고 이들 웰을 캡핑한다.

●1㎍의 샘플 DNA(=1㎕의 1mg/ml 제제)를 적정한 웰에 첨가하고 캡핑한다.

●플레이트를 원심분리기에서 간단히 펄싱한다.

●플레이트를 ABI 프리즘 7700 서열 검출기(어플라이드 바이오시스템)중에 놓고 컴퓨터를 준비하여 FAM 형광성(Meq 프로브)을 판독하고 샘플을 진행시킨다.

●열순환 계수

50℃ 2분

95℃ 10분

94℃ 15초 ) x 40

60℃에서 1분)

●마이크로소프트 엑셀을 사용하여 데이타를 분석하고-각각의 샘플에 대해 Ct값(형광 생성물의 양이 처음에 기준 수준 이상으로 검출되는 PCR 사이클)이 존재할 것이다. 각각의 DNA 샘플에 대해 2회에 대한 평균 Ct 값을 계산한다.

상기 실험의 결과는 도 6에 나타낸다.

주의

정배향 프라이머(GGT CTG GTG GTT TCC AGG TGA-서열 번호 2)는 GA 종 Meq 유전자 서열중에 NT 위치 1341번 내지 1361번에 위치한다. 역배향 프라이머(GCA TAG ACG ATG TGC TGC TGA-서열 번호 3)은 NT 위치 1413번 내지 1393번에 위치한다. 프로브는 Meq 표적 서열상에 2개의 프라이머 사이에서 특이적으로 어닐링하도록 디자인되었다(도 8 참조).

PCR 동안에, 형광성 프로브는 2개의 프라이머 사이에 결합하고 각각의 연장 사이클 동안에, Taq 폴리머라제의 5' 뉴클레아제 활성은 프로브를 절단하여 이어서 형광 발산할 수 있는 리포터 형광색소 FAM을 방출시킨다. 따라서, 각각의 사이클과 함께, 형광 강도는 증가한다. Ct 값(형광성이 고정된 역치를 초과하는 사이클)은 표적 서열의 개시 카피수에 대한 측정값이고 개시 카피 수가 높을 수록 Ct값은 저하된다.

PCR 동안에 소 혈청 알부민의 사용: 깃털 조직(특히, 갈색 닭 기원의 조직)은 멜라닌을 함유하고 있고 이는 PCR을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 반응에서 BSA의 사용은 이러한 멜라닌 유도 억제를 극복한다. 실험은 갈색 닭에서 수행하였다. BSA의 첨가는 문헌[참조: Giambernardi et al (1998) Biotechniques 25: 564-6]의 방법에 따른다.

실시예 2: 특이적 MDV-1(CVI 988 백신) 종의 검출 방법

발명에 대한 본 실시예는 닭 깃털중에 CVI 988 마렉 백신의 존재를 검출하기 위한 특히 개질된 버젼의 132개 염기쌍(bp) 반복 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 시험의 용도에 관한 것이다.

132개 염기쌍 반복 유전자 서열은 마렉병 바이러스(혈청형 1) 게놈의 내부 반복체 긴(IR₁) 절편중에 위치한다. MDV 1의 완전한 게놈 서열은 문헌[참조: Tulman et al. (Sept 2000) J Virol. Vol. 74 No. 17, p7980-7988]에 기재되어 있고 승인번호 AF 243438하에 진뱅크(GenBank)에 기탁되었다. 혈청형 1 마렉병의 CV1 988 분리체는 다중 카피의 당해 반복체 절편을 갖고 있는 반면 야생 종은 단일 카피를 갖고 있다[문헌참조: Silva et al (1992) Avian Dis 36 : 521-528; and Becker et al (1993) Virus Genes 7 : 277-287]. 카피 수의 측정은 백신 종을 야생 종으로부터 구분할 수 있게 해준다[문헌참조: Becker et al (1992) J Virol Methods 40 : 307-322 and Kopacek et al (1993) Acta Virol 37 : 191-195].

깃털은 첨부된 도면에 따라 샘플 채취하고 겨드랑이 부분의 깃털의 기부 선단을 사용한다. PCR 분석(하기 참조)은 백신 접종한지 11일 내지 28일에 동물중에 다중 카피의 132bp 절편이 존재함을 입증하였다. 백신 접종은 1일된 새에 대해 수행하였다.

다양한 허용가능 한 시험은 신선한 샘플로서 채취하거나 훗날 시험을 위해 보관된 임의의 나이의 새의 깃털을 사용하여 CV1988 백신의 존재를 측정하는 것이다.

깃털 선단 샘플에 대해 132 bp 반복 PCR을 위한 프로토콜

1. 요구되는 재료:

시약:

●나트륨 도데실 설페이트(SDS) 10% 용액(실온에서 보관).

●프로테이나제 K[제조원(Sigma # P-6556)으로부터 시판되는 동결건조된 분말 및 물중의 20mg/ml의 스톡을 구성하며 -20℃에서 보관).

●클로로포름(-20℃에서 보관).

●3M 나트륨 아세테이트 pH 5.2(실온에서 보관).

●여과된 순수 에탄올(실온에서 보관).

●여과된 70% 냉각 에탄올(4℃에서 보관).

●PCR 등급의 물.

●제조원[Bio/Gene Ltd, Kimbolton, Cambridgeshire, England]으로부터 시판되는 Taq 골드 DNA 폴리머라제(5U/㎕), Taq 완충액, MgCl₂(25mM)

●제조원[Promega(USA)]로부터 입수된 dATP, dTTP, dCTP, dGTP(100mM 스톡); 본 발명자는 각각 10mM로 이들 4개 모두를 함유하는 혼합물을 제조하고 -20℃에서 보관한다.

●DNA 분자 크기 마커.

●아가로스 및 TBE 완충액

●프라이머 서열:

MD-132 정배향; 5'TACTTCCTATATAGATTGAGACGT3'(서열 번호 4)

MD-132 역배향: 5'GAGATCCTCGTAAGGTGTAATATA-3'(서열 번호 5)

장치

●스테릴린 20ml 플라스틱 범용 튜브

●청결 가위 및 핀셋

●50℃로 설정된 물 욕조

●미세원심분리기

●1.5ml의 스냅 캡 에펜도르프 튜브(오토클레이빙됨)

●1.5ml의 스크류 캡 에펜도르프 튜브(오토클레이빙됨)

●0.5ml의 스냅 캡 에펜도르프 튜브(오토클레이빙됨)

●진공/동결 건조기(필수 사양 아님)

●분광광도계

●PCR용 캐비넷, 피펫 및 오토클레이빙된 팁

●열 순환기

●아가로스 겔 장치

2. 깃털 수거:

●연구실 운반용 플라스틱 '범용' 튜브에 깃털을 넣는다.

3. 깃털 선단으로부터 DNA의 제조

●1.5 내지 2시간동안 물 욕조에서 50℃에서 항온처리한다.

●동일 용적(500㎕)의 페놀을 상등액에 다시 첨가한다.

●볼텍싱한다.

●13000rpm에서 2분동안 원심분리한다.

●상부상(수성)을 새로운 스냅 캡 튜브로 옮긴다.

●동일 용적(500㎕)의 페놀을 상등액에 다시 첨가한다.

●볼텍싱한다.

●13000rpm에서 2분동안 원심분리한다.

●상부상(수성)을 새로운 스냅 캡 튜브로 옮긴다.

●동일 용적(500㎕)의 냉각 클로로포름을 첨가한다.

●볼텍싱한다.

●13000rpm에서 2분동안 원심분리한다.

●상부상을 1.5ml의 스크류 캡 튜브로 옮긴다.

●1ml의 여과된 100% 에탄올을 첨가한다.

●50㎕의 3M 나트륨 아세테이트를 첨가한다.

●상등액을 버린다.

●튜브의 개방된 정상부분을 파라핀으로 밀폐시키고 바늘을 사용하여 파라필름중에 구멍을 낸다.

●튜브를 약 5분동안 진공 건조기에 넣고 펠렛을 건조시킨다(또한 통기 건조).

●약하게 볼텍싱함에 의해 펠렛을 50㎕의 PCR 양질의 물에 재현탁시킨다.

●분광광도계를 사용하여 DNA 제제의 농도를 측정한다.

●농도를 물중에서 1mg/ml로 조정한다.

●-20℃에서 저장한다.

4. 132bp 반복체 PCR:

●적정 수의 샘플에 대한 하기의 시약을 함유하는 마스터 혼합물을 제조한다(반응당 주어진 용적):

●볼텍싱하여 완전히 혼합되도록 한다.

●19㎕의 '마스터 혼합물' 분취액을 오토클레이빙된 0.5ml 스냅 캡 에펜도르프 튜브에 넣는다.

●1㎍의 DNA(= 1㎕의 1mg/ml 제제 또는 DNA 제제가 덜 농축된 경우 보다 큰 용량)을 첨가한다.

●볼텍싱하여 완전히 혼합되도록 한다.

●(본 발명자의 열 순환기는 가열된 뚜껑을 갖고 있어 본 발명자는 반응물에 광유를 도포할 필요가 없다).

●하기의 순환 변수를 사용하여 열 순환기를 작동시킨다.

95℃ 2분 1회

95℃ 1분)

50℃ 30초 ) x 40회

72℃ 1분)

72℃ 10분 1회

아가로스 겔상에서 반응 생성물을 분석한다.

당해 실험의 결과는 도 7에 나타낸다.

주의

센스 프라이머를 반복체의 65bp 상류에 위치시키고 안티센스 프라이머는 반복체의 105bp 하류에 위치시킨다. 따라서, 예상되는 밴드 크기는 단일 반복체에 대해 302bp(즉, 65 + 132 + 105)이고 이중 반복체(302 + 132)에 대해서는 434bp이고 삼중 반복체(434 + 132)등에 대해서는 566bp이다. 리스펜스 백신 종은 많은 탠덤 반복체를 생산한다.

실시예 3 -PCR을 사용한 깃털 선단 DNA중에서 리스펜스 바이러스 게놈의 검출: 상이한 깃털 부분에 대한 샘플의 비교

방법

리스펜스 백신 접종 병아리로부터 깃털 샘플 채취

2주된 로드 아슬란드(Rhode Island) 빨간 병아리에 복막내 경로를 통해 1000pfu의 포트 도즈(Fort Dodge) 리스펜스 백신 바이러스를 접종하였다. 동일 나이의 백신 접종되지 않은 병아리를 별도의 방에 거주시켰다. 모든 병아리의 2개 날개에 딱지를 붙여 실험 전반에 걸쳐 각각의 병아리를 구별할 수 있도록 하였다. 백신 접종 후 8일, 13일, 19일 및 26일째에 5마리의 백신 접종된 병아리(#921, #923, #924, #925) 및 백신 접종되지 않은 병아리(#946)로부터 샘플을 채취한다. 약 6개의 핀 깃털을 목, 상완골, 척추, 겨드랑이 및 대퇴부 부분 각각으로부터 뽑아낸다. 나머지 5개 깃털 부분은 깃털의 수가 너무 적어 4개의 경우에 대한 샘플 채취를 허용하지 않았기 때문에 또는 생존하는 병아리의 연약한 피부 영역으로부터 뽑아낸다는 것은 비윤리적인 것으로 간주되기 때문에 사용되지 않았다.

깃털 선단으로부터 DNA를 제조하였고 실시간 PCR에 적용하여 하기 요약된 바와 같이 바이러스 Meq 유전자를 검출하였다.

깃털 선단 샘플로부터 DNA의 제조

DNA는 상기된 바와 같이 깃털 선단으로부터 제조하였다. 간략하게, 깃털 선단을 100㎍의 프로테이나제 K를 함유하는 500㎕의 TNE-SDS 완충액중에 20시간동안 50℃에서 항온처리하였다. 상등액을 페놀에 이어서 빙냉 클로로포름으로 추출하였다. 에탄올/나트륨 아세테이트를 사용하여 DNA를 침전시키고 펠렛화하고 진공 건조시키고 이어서 물중에 200㎍/ml의 농도로 재현탁시켰다.

Meq 유전자를 검출하기 위한 실시간(TaqMan) PCR 분석

25㎕의 2회 반응물을 상기된 바와 같이 준비하고 Taq 골드 DNA 폴리머라제 및 프라이머를 사용하여 200ng의 깃털 선단 DNA 기원의 바이러스 Meq 유전자 및 숙주 오보트랜스페린(Ovo) 유전자(표 1)를 증폭시켰다. BSA는 반응당 10㎍의 농도로 존재하였다. 반응 역학은 FAM-형광 태그된 Meq 프로브 및 VIC-형광 태그된 Ovo 프로브(표 1)를 포함시킴에 의해 수행되었다. 각각의 샘플에 대해 2회 반응물이 있다. 열순환 변수는 다음과 같다: 50℃에서 1회(2분), 95℃에서 1회(10분)에 이어서, 94℃(15초) 및 60℃(1분)에서 40회. 시험중에 깃털 샘플 뿐만 아니라 반응 플레이트는 또한 계수된 리스펜스 게놈 카피를 함유하는 10배 희석된 리스펜스 BAC10 DNA(세균 인공 염색체로 클로닝된 리스펜스 바이러스 게놈)을 포함하였다.

마이크로소프트 엑셀을 사용하여 데이타를 분석하였다. 각각의 반응에 대해, Ct 값(형광성 생성물의 양이 처음 기본 수준 이상으로 검출되는 PCR 사이클)과 이어서 40-Ct 값을 구하였다. 40의 Ct값은 어떠한 표적 서열이 존재하지 않음을 지적한다. 값은 '40-Ct'로서 제공하여 보다 높은 값이 보다 많은 바이러스 게놈 카피와 동일시되도록 한다.

리스펜스 BAC10 샘플에 대해, 40-Ct 값은 바이러스 게놈의 카피 수(로그 스케일)에 대해 플롯팅하여 표준 곡선을 작성하였다. 플롯의 선형 부분에 대한 방정식을 측정하였다. 시험중에 있는 깃털 샘플에 대해, 40-Ct 값은 Ovo(모든 닭 세포에 존재하는 '하우스-키핑 유전자(house-keeping gene)'에 대한 40-Ct 값에 따라 표준화하여 각각의 샘플을 위해 사용되는 DNA의 양에 있어서의 약간의 차이를 보정하였다. 이어서 2회 반응물에 대한 평균 표준화된 40-Ct 값을 측정하였고 표준 곡선을 사용하여 이를 리스펜스 게놈 카피 수로 전환시켰다.

결과

깃털 샘플 채취 및 DNA 제조

처음에는 10개의 깃털 부분의 각각으로부터 샘플을 채취할려고 계획했었지만 목, 상완골, 척추, 겨드랑이 및 대퇴부 부분을 사용하는 것만이 실행가능하였다. 나머지 5개 깃털 부분은 깃털의 수가 너무 적어 4개의 경우에 대한 샘플 채취가 가능하지 않았기 때문에, 또는 생존하는 병아리의 연약한 피부 영역으로부터 뽑아낸다는 것은 비윤리적인 것으로 간주되기 때문에 사용되지 않았다. 충분한 핀 깃털을 백신 접종 후 8일, 13일 및 19일째에 각각의 부분으로부터 수득하였다. 26일까지(병아리가 거의 6주된 경우) 핀 깃털은 보다 굵고 성숙한 깃털로 대체되기 시작하였다. 모든 샘플로부터 충분한 DNA를 수득하였고 상이한 부분 기원의 동일한 수의 깃털로부터 수득된 DNA의 양에는 큰 차이가 없었다. Meq 및 Ovo Ct 값을 실시간 PCR을 위한 직비례의 검출 범위로 적용하기 위해서는 DNA를 200ng/㎕의 농도로 희석시킬 필요가 있고 실시간 PCR 반응을 위해서는 당해 스톡 1㎍을 사용할 필요가 있음이 밝혀졌다.

상이한 시점에서, 상이한 깃털 부분에서 및 상이한 병아리에서 바이러스 적재량이 정확히 비교될 수 있도록 하기 위해, 정량적으로 실시간 PCR을 수행하였다.

각각의 반응에 대해, 40-Ct 값을 계산하였다. 리스펜스 BAC10 샘플에 대해, 40-Ct 값을 바이러스 게놈의 카피 수(로그 스케일)에 대해 플로팅하여 표준 곡선(도 8)을 작성하였다. 따라서, 정확한 검출의 하한치는 50카피수이고 0의 40-Ct 값을 사용한 임의의 샘플은 200ng의 깃털 선단 DNA당 50카피 미만의 리스펜스 게놈을 함유하였다.

플롯의 직비례 부분에 대한 방정식은 다음과 같다: y = 1.8102 Ln(X)-6.796. 시험중에 있는 깃털 샘플 각각에 대해 표준화된 40-Ct 값을 당해 방정식을 사용하여 리스펜스 게놈 카피 수로 전환시켰다(표 2A, B, C 및 D; 도 9A, B, C 및 D 참조). 예상되는 바와 같이, 임의의 소정의 시점에서 각각의 병아리간에는 상당한 차이가 있었다. 그러나, 소정의 개체의 5개의 상이한 깃털 부분에서 검출된 바이러스 수준은 유사하였다. 각각의 병아리에서 시험된 4개의 시점중에서, 바이러스 적재량은 13일째에 가장 높았고 19일째 및 26일째에 감소하였다.

4마리의 백신 접종된 병아리에 대해, 평균 게놈 카피 수(200ng의 깃털 DNA 당)는 각각의 시점에서 각각의 깃털 부분에 대해 측정하였고 대수적 스케일(도 5) 또는 직비례 스케일(도 10B)을 사용하여 백신 접종 후의 시점에 대해 플롯팅하였다. 8일째에, 평균 카피수는 200ng의 DNA당 10⁴ 내지 10⁵ 카피였다. 13일째에, 평균 카피수는 5 x 10⁶ 내지 5 x 10⁷ 였고 19일째에는 10⁶ 내지 10⁷ 이었고 26일째에는 10⁵ 내지 10⁶ 이었다.

대수적 플롯 (도 10A)은 5개의 깃털 부분 각각에서 바이러스 복제 역학이 유사함을 지적하였다. 그러나, 직비례 플롯에서 차이가 나타났다(도 10B). 이러한 플롯은 13일째에 4마리의 병아리에 대한 평균 바이러스 적재량이 기타 4개의 부분 보다 겨드랑이 부분에서 4배까지 증가하였음을 보여준다. 이러한 시점에서, 상완골 및 목 부분에서 바이러스 적재량은 각각의 시점에서 매우 밀접하게 관련되어 있고 대퇴부 및 척추 부분의 바이러스 적재량을 초과하였다. 깃털 부분간에 이러한 차이는 8, 19일 또는 26일째에는 명백하지 않았다.

백신 접종되지 않은 대조군 병아리(#946)에 대해서는, MDV DNA의 부재하에 예상되는 바와 같이 다수의 샘플이 0의 40-Ct 값을 가졌다. 그러나, 몇몇 샘플에 대해서는, 40-Ct 값은 3이하였다(데이타는 나타내지 않음). 실시간 PCR에서는 흔히 '음성' 샘플이 0을 초과하는 40-Ct 값을 갖는 경우가 있고 4미만의 값은 신뢰할 수 없는 것으로 간주되었다. 따라서, 3의 40-Ct 값이 리스펜스의 약 200카피와 동일하지만 이러한 값은 백신 접종된 병아리 기원의 샘플에 대해 수득된 임의의 값 보다 100배 낮고 음성인 것으로 간주될 수 있다. 도 5B에 나타낸 바와 같이, 백신 접종되지 않은 병아리의 5개의 깃털 부분에 대한 평균 카피 수는 기준선을 넘지 않는다.

실시간 PCR 분석의 요약

●깃털 부분 각각에서의 바이러스 적재량은 백신 접종 후 8일, 13일, 19일 및 26일째에 실시간 PCR에 의해 검출 가능할 정도로 충분하다.

●바이러스 적재량은 백신 접종 후 8일, 19일 및 26일째와 비교하여 백신 접종 후 13일째에 모든 시험된 깃털 부분에서 가장 높았다.

●백신 접종 후 13일째에, 겨드랑이 부분에서의 바이러스 적재량이 상완골 및 목 부분에서 보다 2배 이상 높았고, 척추 및 대퇴부 부분에서 보다 4배 이상 높았다.

<110> Wyeth <120> Assay Methods for detection of a virus in an avian tissue sample <130> AM101125 <150> GB 0223960.6 <151> 2002-10-15 <150> GB 0312241.3 <151> 2003-05-29 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> DNA Probe <400> 1 agaccctgat gatccgcatt gcgact 26 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Synethetic DNA Primer <400> 2 ggtctggtgg tttccaggtg a 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> DNA Probe <400> 3 gcatagacga tgtgctgctg a 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> DNA Probe <400> 4 tacttcctat atagattgag acgt 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> DNA Probe <400> 5 gagatcctcg taaggtgtaa tata 24 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> DNA Probe <400> 6 cactgccact gggctctgt 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> DNA Probe <400> 7 gcaatggcaa taaacctcca a 21 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Synethetic DNA Primer <400> 8 agtctggaga agtctgtgca gcctcca 27 <210> 9 <211> 2466 <212> DNA <213> DNA <400> 9 gaattcggtg atataaagac gatagtcatg catgacgtgg ggggctggat cgactgatat 60 ctaatggttc gggagtgata cggagacggg gggggggggg aaatgatcga tttataccta 120 cctcttaaat aaactattgc tcctttataa aatgacaggt gaattgtgac cgttcgcgaa 180 cgtgtaattc ttcaatactt tcgggtctgt gggtgttgct tttttaatta ttattttggt 240 tcggggaggt tggtgctgga atgttaagaa taaattccgc acactgattc ctaggcaggc 300 gtctcttgca ggtgtatacc agggagaagg cgggcacggt acaggtgtaa agagatgtct 360 caggagccag agccgggcgc tatgccctac agtcccgctg acgatccgtc ccccctcgat 420 ctttctctcg ggtcgacttc gagacggaaa aaaaggaaaa gtcacgacat ccccaacagc 480 ccctccaaac accccttccc tgacggccta tctgaggagg agaaacagaa gctggaaagg 540 aggagaaaaa ggaatcgtga cgccgctcgg agaagacgca ggaagcagac ggactatgta 600 gacaaactcc atgaagcatg tgaagagctg cagagggcca atgaacacct acgtaaggaa 660 attcgagatc taaggactga gtgcacgtcc ctgcgtgtac agttggcttg tcatgagcca 720 gtttgcccta tggcggtacc cctaacggtg acccttggac tgcttaccac cccgcacgat 780 cccgttcctg aacctcccat ttgcactcct ccacctccct caccggatga acctaacgct 840 ccacattgct ccggttccca acctcctatc tgtacccccc ctcctcccga tacggaggaa 900 ctttgcgccc agctctgctc gaccccacca cctcccatct ctactcccca tattatctac 960 gctccggggc cttcccccct ccaacctcct atctgtaccc cccctcctcc cgatgcggag 1020 gagctttgcg cccagctctg ctcgacccca ccacctccca tctgtactcc ccattccctc 1080 ttctgccctc cccagcctcc atctccggag ggaatcttcc ctgcattgtg tcctgttacc 1140 gagccgtgta cccctccatc gccggggacg gtttacgctc agctttgtcc tgttggccag 1200 gctccccttt ttaccccatc tcccccacat ccggctccgg agccggagag gctttatgct 1260 cgtcttaccg aggatcccga acaggattcc ttgtattcgg gccagattta tattcagttt 1320 ccctcggata ctcagtctac ggtctggtgg tttccaggtg acgggagacc ctgatgatcc 1380 gcattgcgac tctcagcagc acatcgtcta tgccccatgt ttcttctccc ctagttatat 1440 ataatagttt tcatagtttc gggaagatca acataaagga aagggttaaa ggcattattt 1500 atcgatttac tgacataaaa aaatcctctg gggtaacaaa ttttccctta ccgtgtagct 1560 tagactcgga agaactattt taagttacat ggtcaaaaga tttgttggct ccaggagttc 1620 cgaagtatga gataaactta gctatgtgga aaacttctgg ggcaacatct ctcggcccca 1680 gactgcttaa atggcaaatt ctcgttctat acagaacggt tggggaaggg gggggggggg 1740 gtatatggag tattattcgg gatatggctt ctatgaagct gcggtaagtt ttccaggctc 1800 aaaaactatg cctggctgtt ttttttttta gaagggatat ggacatcgca cattaaggaa 1860 tattaaagat aacaggatgg acattcggat gtaaaaggaa taagcgaaac ctttagcaga 1920 tgtgagttaa tgcagtctcg tataattcgg tggtgctgat taggttatcg taaggaacaa 1980 cacgattgat ctctcatccg cgtcccagca atcaggccta tgtccctctc ctgtggccag 2040 ctcactggct gtgcactgtg cgattctaag tgctacagtc gtgagcagat caatggatcg 2100 gggctcgcgc aacactactg taattaaata ttcgtttatg aattatgcaa atatgcacag 2160 ataatatata cagggatgca cagacatact cctatgcacc gatacacagg cacataggca 2220 gatgtcgaca ttaacgaata tacaggcacg gacctccagg aacatatgga aaatacctca 2280 tcgcagagac gcttatgcag gagtaatctg cgttaagtcg ttactggatt gtaacggcta 2340 tccggagact ctcttcccct tttgcttgtt cactgtgcgg cattattaca tttacaccgg 2400 taatgctgcg catgaaagag cgaacggaac gaggctcgta cgacattaca agaatagttt 2460 gaattc 2466

Claims

유전자 물질을 조류 조직 샘플로부터 추출하는 단계 및 추출된 유전자 물질을 시험하여 바이러스로부터의 임의의 유전자 물질을 검출하는 단계를 포함하는 조류 조직 샘플중의 바이러스 검출 방법으로서, 조류 조직 샘플이 겨드랑이 부분(axillary tract)의 하나 이상의 깃털로부터 유래함을 특징으로 하는, 조류 조직 샘플중에서 바이러스를 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 샘플중의 바이러스 양에 대한 정량적 정보를 제공함을 특징으로 하는, 바이러스의 검출 방법.
제1항에 있어서, 마렉병 바이러스(Marek's disease virus(MDV))에 대해 특이적임을 특징으로 하는, 바이러스의 검출 방법.
제3항에 있어서, MDV 혈청형 1에 대해 특이적인 방법.
제4항에 있어서, MDV-1 리스펜스 (Rispens) 종 CVI988에 대해 특이적임을 특징으로 하는, MDV 검출 방법.
제5항에 있어서,

(i) MDV의 132 bp 반복 뉴클레오타이드 서열에 플랭킹되어 있는 뉴클레오타이드 서열로부터 선택되는, 핵산 폴리머라제에 대한 정배향 및 역배향 프라이머를 제공하는 단계;

(ii) 프라이머 사이의 핵산 서열을 증폭시키는 단계;

(iii) 증폭된 핵산 서열에서 132bp 반복 서열의 수를 검출하는 단계 및

(iv) 132 bp 반복 서열의 수를 바이러스 핵산의 실체와 관련시켜 조직 샘플중의 MDV의 유형을 동정하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

(a) 바이러스 특이적 표적 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하는 단계,

(b) 추출된 유전자 물질을 프로브와 접촉시켜, 당해 프로브가 이의 표적 바이러스 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하도록 하는 단계,

(c) 상기 프로브가 이의 표적 바이러스 폴리뉴클레오타이드에 결합하였는지를 측정하는 단계 및

(d) 표적 폴리뉴클레오타이드의 존재가 샘플중의 바이러스의 존재를 지시함을 토대로 하여, 샘플이 바이러스를 함유하는지를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
제7항에 있어서, 프로브가 표적 뉴클레오타이드에 결합하였는지를 결정하는 단계 (c)가, 프로브의 결합 부위를 포함하는 표적 폴리뉴클레오타이드 영역을 증폭시킴을 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 증폭이,

정배향 프라이머(GGT CTG GTG GTT TCC AGG TGA) 및 역배향 프라이머(GCA TAG ACG ATG TGC TGC TGA)로 프라이밍되는 방법.
제9항에 있어서, 프로브가 서열 5'AGA CCC TGA TGA TCC GCA TTG CGA CT 3'의 서열을 갖는 방법.
제7항에 있어서, 프로브가 형광성으로 표지되고 프로브가 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합하는였지를 결정하는 단계가 프로브의 형광성 방출을 측정함을 포함하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, PCR 반응을 사용하는 것과 관련되는 방법.
제12항에 있어서, PCR 반응을 수행하기 전에, 시험될 추출된 유전자 물질을 임의의 제제로 처리하여, 존재할 수 있는 모든 깃털 조직 인자의 억제 효과를 극복하는 방법.
제13항에 있어서, 제제가 소 혈청 알부민, 돼지 알부민 및 양 알부민중 하나 이상으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 바이러스의 검출 방법.
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