KR101112590B1

KR101112590B1 - 폴리하이드록시 알칸산의 제조방법

Info

Publication number: KR101112590B1
Application number: KR1020090068387A
Authority: KR
Inventors: 윤성철; 수주; 최문환
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2009-07-27
Filing date: 2009-07-27
Publication date: 2012-03-13
Also published as: US20110020886A1; US8658403B2; KR20110010982A

Abstract

본 발명은 폴리하이드록시 알칸산(polyhydroxyalkanoic acid , 이하 'PHA'라 함)의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 당, 치환된 지방산 및 살리실산(salicylic acid)을 포함하는 배지에서 제조된 슈도모나스 속 균주의 phaZ 변이체를 이용 배양하여, 장쇄 방향족 단량체를 고함량으로 함유하는 폴리하이드록시 알칸산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

폴리하이드록시 알칸산, 슈도모나스 플루오레슨스 BM07, 살리실산, 슈도모나스 플루오레슨스 BM07-phaZ 변이체, 방향족 PHA, 11-POU

Description

폴리하이드록시 알칸산의 제조방법{Method for preparing polyhydroxyalkanoic acid}

폴리하이드록시 알칸산(PHAs)은 과량의 탄소원이 존재하면서, 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 다른 영양분이 부족한 불균형 성장조건하에서, 미생물이 에너지나 탄소원의 저장물질로 미생물 내부에 축적하는 폴리에스터이다. PHA는 기존의 석유로부터 유래된 합성고분자와 유사한 물성을 가지면서 완전한 생분해성을 보이기 때문에, 기존의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다.

폴리하이드록시 알칸산(PHAs)은 다양한 미생물 내에 과립형 봉입체(granular inclusion bodies)의 형태로 축적된다. 일반적으로, 미생물이 생산하는 PHAs는 단쇄 길이(C₄ 및 C₅)(SCL-) 및 중쇄 길이(C₆ - C₁₄)(MCL-) PHA 두가지 종류로 나누어지며, 이 중 중쇄 길이 폴리하이드록시 알칸산(MCL-PHAs)은 불포화 단량체를 포함하여 측쇄에 페닐기, 페녹시기, 알켄기 등의 다양한 작용기를 도입시켜 투명성을 증가시키는 것과 같이 물성을 개선시킬 수 있기 때문에 주목받고 있다. 예를 들어, ω-위치에 방향족 치환기를 가진 MCL 지방산들로부터 유래된 단량체를 포함하는 MCL-PHA는 약물학 및 다양한 분야에서 출발물질(starting intermediate)들로 이용될 수 있다.

MCL-PHA를 생산하는 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.)은 페닐기를 포함하는 카르복시산으로부터 방향족 폴리에스터를 생산할 수 있는 대표적인 박테리아이다. 그러나, 페닐기 또는 변형된 페닐기(예를들면, 5-페닐벨러레이트(5-phenylvalerate, 이하 '5PV'라 함), 5-(4'-톨릴)-벨러레이트(5-(4'-tolyl)-valerate) 등)를 포함하는 몇몇 전구체는 단일 탄소원(sole carbon source)으로 공급될 경우 박테리아에 의해 쉽게 이용될 수 없다. 이에 탄소원으로 쉽게 이용되기 어려운 화합물의 이용성을 증가시키기 위해 공동기질대사법(cometabolism method)이 제안되었다. 대부분의 연구는 좋은 폴리머 생산 기질(예를 들면, 옥탄산(octanoic acid) 또는 노난산(nonanoic acid))이 일반적으로 공동기질(cosubstrate)로 사용되는 공동기질대사법을 사용하였다. 상기 공동기질대사법에 의할 경우, 얻어지는 중합체는 일반적으로 방향족 단일중합체(homopolymer), 방향 족/지방족 공중합체 및 지방족 중합체의 혼합물이며, 회수된 중합체 혼합물로부터 목적물인 순수한 방향족 단일 폴리에스터를 분리하기 위해서는 용액ㅇ침전 단계를 반복적으로 수행하는 장시간의 분류 과정이 요구되는 문제가 있었다.

따라서, 대량의 순수 방향족 폴리에스터를 제조하는 기술을 개발할 필요성이 대두되었다. 슈도모나스 퓨티다 BM01(Pseudomonas putida BM01)에서 몇 가지 저탄소수의 카르복시산(C₂ ~ C₅), 과당, 포도당 등은 PHA 생산은 거의 유도하지 않으면서 다량의 세포성장을 지원할 수 있다는 것을 알았다. ω-페닐알칸산(ω-phenylalkanoic acids) 또는 11-페녹시운데카노익산(11-phenoxyundecanoic acid, 이하 '11-POU'라 함)과의 공동대사에서 이러한 탄소원의 사용으로 인해 지방족 단량체가 거의 도입되지 않은 순수한 방향족 폴리에스터들에 대한 생산성이 높아졌다.

PHA 합성 관련 저해제들은 특정 대사경로의 중간체들을 PHA 합성경로로 보내는데 사용될 수 있다. 아크릴산(acrylic acid)은 박테리아에 대한 β-산화 억제제(β-oxidation inhibitor)로 알려졌고, SCL-PHA를 축적하는 대표적인 세균인 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)를 옥탄산을 탄소원으로 이용하여 배양할 경우 MCL 단량체를 공동모노머(comonomer)로서 PHA에 도입시키는데 성공적으로 이용되었다. 2-브로모옥탄산(2-Bromooctanoic acid, 이하 '2-BrOA라 함)은 슈도모나스 종에서 당류로부터 세포성장에는 영향을 주지 않고 MCL-PHA 축적만을 저해하는 것으로 알려졌다. 따라서, 2-BrOA는 공동으로 첨가된 무관(unrelated, 예를 들어 과 당) 탄소원으로부터 (R)-3-하이드록시아실((R)-3-hydroxyacyl)-ACP→CoA 전이효소 (PhaG)에 의해 유도된 (R)-3-하이드록시아실 단량체로 구성된 PHA의 형성을 효과적으로 저해하므로, 슈도모나스 종에서 작용기를 가진 카르복시산으로부터 기능적으로 디자인된 PHA의 제조에 있어 매우 유용하게 이용될 수 있다.

MCL-PHA의 형성에 대한 또 다른 저해제가 최근에 알려졌다. SCL-PHA 및 MCL-PHA 둘다 축적이 가능한 슈도모나스 에루지노사 BM114(Pseudomonas aeruginosa BM114)를 중쇄 카르복시산(예를 들면, C8, C9 및 C10 카르복시산)에서 배양하였을 때 아크릴산(acrylic acid)의 처리가 단지 SCL-PHA 만의 형성을 저해하는데 반하여 살리실산(salicylic acid)의 처리는 단지 MCL-PHA 만의 형성을 억제하였다.

MCL-PHA의 물성은 작용기가 도입된 공간 측쇄의 길이(length) 및 균일성(uniformity)에 따라 다르다. 따라서, 측쇄 단량체의 분포(distribution)를 조절하는 것은 물성을 향상 시킬 것으로 기대된다. 일반적으로, MCL-PHA에서 단량체의 분포(distribution)는 PHA 합성효소의 특이성 및 세포내 단량체 전구체의 농도에 의존적이다. MCL 지방산이 탄소원으로 사용되었을 때, 단량체 전구체는 β-산화 경로 및 PHA 합성 경로를 연결하는 효소(들)(예를 들면, 에노일-CoA 하이드라타제(enoyl-CoA hydratase, PhaJ))를 통하여 거의 공급된다. 이전 연구에서, 살리실산에 의한 β-산화 억제와 11-POU 및 과당의 공동기질대사를 결합한 합성 체제하에서, 슈도모나스 플루오레슨스 BM07(Pseudomonas fluorescens BM07)에 의해 축적된 PHA의 방향족 단량체 분포가 중쇄 길이에서 더 긴 장쇄 유니트(unit)로 전환됨을 확인하였다.

따라서, 살리실산은 3-하이드록시-9-페녹시노나노에이트(3-hydroxy -9-phenoxynonanoate, 이하 '9POHN'라 함)와 같은 긴 단량체 전구체를 생산함에 있어 효과적인 매개체가 될 수 있었으며, 단순한 공동기질 방법(simple cosubstrate method)에 의한 경우 보다 2배 정도 많이 생산할 수 있었다. 살리산의 존재하에서 단일 탄소원으로 11-POU만 포함한 배지에서는 세포 성장이 미비하였기 때문에, 살리실산에 의한 현저한 증가는 과당 및 11-POU를 포함하는 공동기질대사법에 의해서만 가능하였다.

세포내 PHA 분해효소 PhaZ는 세포내 PHA 과립을 분해시켜 세포에 필요한 에너지 및 구성요소를 위해 가수 분해된 단량체를 공급하는 역할을 한다. 슈도모나스 퓨티다 KT2442 (Pseudomonas putida KT2442)에서 phaZ를 제거한 변이세포를 옥타노에이트(octanoate)에서 배양하였을 때 세포내에 PHA의 축적이 증가하는 것으로 알려졌다. 동시에, phaZ 유전자의 파괴는 세포내 β-산화 중간물질(β-oxidation intermediates)의 레벨(levels) 및 반감기(half-lives)에 영향을 주고, 결국 공동으로 첨가된 작용기 치환된 지방산(예를 들면, 11-POU)으로부터 유래된 3-하이드록시-단량체 유니트들(3-hydroxy-monomer-units)이 PHA로 도입되는 속도에 영향을 줄 것으로 기대되었다. 본 발명에서는, 슈도모나스 플루오레슨스 BM07의 phaZ 유전자를 삽입에 의한 돌연변이 기술로 파괴하여 돌연변이체에서 방향족 PHA의 생산성 뿐만 아니라 방향족 단량체 유니트 분포의 전환에 대한 살리실산의 효과를 확인하였다.

본 발명자는 살리실산(1mM)의 처리를 통해, BM07-ΔphaZ 변이체에서 더 긴 방향족 단량체 유니트의 레벨 및 11-POU에서 PHA로의 전환율이 야생형에서 보다 현저하게 증가시키는 것을 확인하였다. 살리실산에 의한 전환율의 증가는 5-페닐벨러레이트 및 6-페닐카프로에이트(6-phenylcaproate)와 같은 다른 형태의 방향족 카르복시산에 대해서도 관찰되었다.

본 발명의 목적은 슈도모나스 속 균주 phaZ 변이체를 이용하여 야생형에서보다 곁가지가 더 길어진 장쇄 방향족 단량체를 고함량으로 함유하는 방향족 폴리하이드록시 알칸산을 고순도로 제조할 수 있는 방법을 제시하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 폴리하이드록시 알칸산의 제조방법에 관한 것으로, 당, 치환된 지방산 및 살리실산을 포함하는 배지에서, 슈도모나스 속 균주를 배양함으로써, 장쇄 방향족 단량체를 고함량으로 함유한 고순도 방향족 폴리하이드록시 알칸산을 수득하는 것을 기술적 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 (i) 슈도모나스 속 균주에서 폴리하이드록시 알칸산 분해 효소 유전자를 제거하여 슈도모나스 속 균주의 변이체를 제조하는 단계; (ii) 상기 슈도모나스 속 균주의 변이체로부터 장쇄 방향족 단량체를 고함량으로 함유한 고순도 방향족 폴리하이드록시 알칸산을 수득하는 단계를 포함하는 폴리하이드록시 알칸산의 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 폴리하이드록시 알칸산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (ⅰ) 당, 치환된 지방산 및 살리실산을 포함하는 배지에서, 슈도모나스 속 균주를 배양하는 단계; (ⅱ) 상기 슈도모나스 속 균주에서 폴리하이드록시 알칸산 분해 효소 유전자를 제거하여 슈도모나스 속 균주의 변이체를 제조하는 단계; (ⅲ) 상기 슈도모나스 속 균주의 변이체로부터 장쇄 방향족 단량체를 고함량으로 함유한 고순도 방향족 폴리하이드록시 알칸산을 수득하는 단계를 포함하는 것을 기술적 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 슈도모나스 속 균주에서 폴리하이드록시 알칸산 분해 효소 유전자를 제거한 것을 특징으로 하는 변이체에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 세포 배양시 슈도모나스 플루오레슨스 BM07(P. fluorescens BM07) 내의 폴리하이드록시 알칸산 분해 효소 유전자를 제거하고, 살리실산(SA)을 첨가 함으로써, 작용기 치환 MCL-PHA에서 효과적으로 방향족 스페이서(spacer)의 길이를 증가시키고, 슈도모나스 플루오레슨스 BM07에서 11-POU의 PHA 로의 전환율을 현저히 증가 시켜, 야생형에서보다 현저히 많은 양의 고순도 장쇄 방향족 폴리하이드록시 알칸산을 수득할 수 있는 효과가 있다.

상기 슈도모나스 속 균주는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens)이고, 보다 바람직하게는 슈도모나스 플루오레슨스 BM07(Pseudomonas fluorescens BM07, 기탁번호: KCTC 10005BP)일 수 있다.

상기 당은 슈도모나스 속 균주의 생육을 위한 탄소원으로 사용될 수 있는 것이라면 모두 사용될 수 있다. 예를 들면, 과당(fructose), 글루코스, 갈락토스, 만노스 등이 있으며, 바람직하게는 과당을 사용할 수 있다. 배지 내 당 함량은 50 내지 70 mM이 바람직하며, 보다 바람직하게는 배지 내 당 함량이 50 mM일 수 있다.

상기 치환된 지방산은 특별히 제한되는 것은 아니나, 방향족 치환 카르복시산을 사용하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 페닐(phenyl)기, 치환된 페닐기, 페녹시기(phenoxy) 등으로 치환된 카르복시산을 사용할 수 있다. 치환된 지방산의 배지 내 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 3 내지 10 mM의 함량으로 포함하는 것이 바람직하다.

상기 살리실산은 배지 내 함량이 0.1 내지 2 mM 일 수 있으며, 바람직하게는 배지 내 함량이 1 mM일 수 있다.

상기 배지는 슈도모나스 속 균주의 생육에 적합한 것이라면 어느 것을 사용하여도 무방하나, 바람직하게는 M1 미네랄염 배지(M1 mineral salt medium: 1.06g (NH₄)₂SO₄, 2.3g KH₂PO₄, 7.3g Na₂HPO₄ㅇ12H₂0, 0.25g MgSO₄ㅇ7H₂0, 0.3g NaHCO₃, 0.1g CaCl₂ㅇ2H₂0, 0.03g 구연산 철 암모늄(ferric ammonium citrate) 및 2 ml 미량원소 용액(microelement solution))을 사용할 수 있다. 상기 미량원소 용액은 200 ml의 0.5N 염산에 0.556g FeSO₄ㅇ7H₂0, 0.396g MnCl₂ㅇ4H₂0, 0.034g CuCl₂ㅇ2H₂0, 0.06g H₃BO₃, 0.006g NaMoO₄ㅇ2H₂0, 0.562g CoSO₄ㅇ7H₂0, 0.058g ZnSO₄ㅇ7H₂0, 및 0.004g NiCl₂ㅇ6H₂0가 첨가된 용액이다.

배양 조건으로는 균주가 최대생장(maximal growth)에 이를 때 까지 10 내지 30 ℃, 바람직하게는 30℃로 배양할 수 있다.

상기 방향족 단량체는 3-하이드록시-5-페녹시벨러레이트(5POHV), 3-하이드록시-7-페녹시헵타노에이트(7POHH), 3-하이드록시-9-페녹시노나노에이트(9POHN) 및 3-하이드록시-11-페녹시운데카노에이트(11POHUN)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 (i) 슈도모나스 속 균주에서 폴리하이드록시 알칸산 분해 효소 유전자를 제거하여 슈도모나스 속 균주의 변이체를 제조하는 단계; (ii) 상기 슈도모나스 속 균주의 변이체로부터 장쇄 방향족 단량체를 고함량으로 함유한 고순도 방향족 폴리하이드록시 알칸산을 수득하는 단계를 포함하는 폴리하이드록시 알칸산의 제조방법에 관한 것이다.

상기 폴리하이드록시 알칸산 분해 효소 유전자는 phaZ (유전자 은행 등록번호(accession number): FJ472656)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 폴리하이드록시 알칸산의 제조방법에 관한 것으로, (ⅰ) 당, 치환된 지방산 및 살리실산을 포함하는 배지에서, 슈도모나스 속 균주를 배양하는 단계; (ⅱ) 상기 슈도모나스 속 균주에서 폴리하이드록시 알칸산 분해 효소 유전자를 제거하여 슈도모나스 속 균주의 변이체를 제조하는 단계; (ⅲ) 상기 슈도모나스 속 균주의 변이체로부터 장쇄 방향족 단량체를 고함량으로 함유한 고순도 방향족 폴리하이드록시 알칸산을 수득하는 단계를 포함하는 것을 기술적 특징으로 한다.

상기 (ⅰ)단계의 슈도모나스 속 균주는 슈도모나스 플루오레슨 스(Pseudomonas fluorescens)이고, 보다 바람직하게는 슈도모나스 플루오레슨스 BM07(Pseudomonas fluorescens BM07, 기탁번호: KCTC 10005BP)일 수 있다.

상기 (ⅰ)단계의 당은 슈도모나스 속 균주의 생육을 위한 탄소원으로 사용될 수 있는 것이라면 모두 사용될 수 있다. 예를 들면, 과당(fructose), 글루코스, 갈락토스, 만노스 등이 있으며, 바람직하게는 과당을 사용할 수 있다. 배지 내 당 함량은 50 내지 70 mM이 바람직하며, 보다 바람직하게는 배지 내 당 함량이 50 mM일 수 있다.

상기 (ⅰ)단계에서 치환된 지방산은 특별히 제한되는 것은 아니나, 방향족 치환 카르복시산을 사용하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 페닐(phenyl)기, 치환된 페닐기, 페녹시기(phenoxy) 등으로 치환된 카르복시산을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 11-페녹시운데카노익산(11-phenoxyundecanoic acid, 이하 11-POU라 함)을 사용하였다. 치환된 지방산의 배지 내 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 3 내지 10 mM의 함량으로 포함하는 것이 바람직하다.

상기 (ⅰ)단계에서 살리실산은 배지 내 함량이 0.1 내지 2 mM 일 수 있으며, 바람직하게는 배지 내 함량이 1 mM일 수 있다.

상기 (ⅰ)단계의 배지는 슈도모나스 속 균주의 생육에 적합한 것이라면 어느 것을 사용하여도 무방하며, 본 발명의 일 실시예에서는 M1 미네랄염 배지(M1 mineral salt medium: 1.06g (NH₄)₂SO₄, 2.3g KH₂PO₄, 7.3g Na₂HPO₄ㅇ12H₂0, 0.25g MgSO₄ㅇ7H₂0, 0.3g NaHCO₃, 0.1g CaCl₂ㅇ2H₂0, 0.03g 구연산 철 암모늄(ferric ammonium citrate) 및 2 ml 미량원소 용액(microelement solution))를 사용하였다. 상기 미량원소 용액은 200 ml의 0.5N 염산에 0.556g FeSO₄ㅇ7H₂0, 0.396g MnCl₂ㅇ4H₂0, 0.034g CuCl₂ㅇ2H₂0, 0.06g H₃BO₃, 0.006g NaMoO₄ㅇ2H₂0, 0.562g CoSO₄ㅇ7H₂0, 0.058g ZnSO₄ㅇ7H₂0, 및 0.004g NiCl₂ㅇ6H₂0가 첨가된 용액이다.

상기 (ⅰ) 단계 이전에 슈도모나스 속 균주를 종배양(seed culture)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 슈도모나스 속 균주의 종배양은 NR 배지(Nutrient rich medium)(1% 효모 추출물, 1.5% 뉴트리언트 브로쓰 및 0.2% 황산 암모늄 함유)에서 30℃, 175rpm으로 12시간 동안 배양함으로써 수행될 수 있다.

상기 (ⅱ)단계에서 폴리하이드록시 알칸산 분해 효소 유전자는 phaZ 일 수 있다.

상기 (ⅲ)단계에서 방향족 단량체는 3-하이드록시-5-페녹시벨러레이트(5POHV), 3-하이드록시-7-페녹시헵타노에이트(7POHH), 3-하이드록시-9-페녹시노나노에이트(9POHN) 및 3-하이드록시-11-페녹시운데카노에이트(11POHUN)일 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 일 실시예를 도면을 참조하여 설명하도록 한다. 하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 예시한 것으로, 본 발명을 이에 한정하려는 것은 아니다.

<실시예>

PHA 생산을 위한 박테리아 균주 및 배지

하기 [표 1]과 같이 실험실에서 분리한 슈도모나스 플루오레슨스 BM07(P. fluorescens BM07)와 두 개의 BM07 변이체 균주를 상호비교를 위해 사용하였다. 1% 효모 추출물, 1.5% 뉴트리언트 브로쓰(nutrient broth) 및 0.2% 황산 암모늄를 포함하는 영양소가 풍부한(NR) 배지를 야생형 균주의 종배양(seed culture), 유지 및 보관에 사용하였다. 변이체의 종배양에서 군체를 루리아 베르타니(LB) 배지에 넣고 30℃, 175 rpm/12h에서 배양하였다. PHA 합성 배지로는 M1 미네랄염 배지(1.06g (NH₄)₂SO₄, 2.3g KH₂PO₄, 7.3g Na₂HPO₄ㅇ12H₂O, 0.25g MgSO₄ㅇ7H₂O, 0.3g NaHCO₃, 0.1g CaCl₂ㅇ2H₂O, 0.03g 구연산 철 암모늄(ferric ammonium citrate) 및 2 ml 미량원소 용액(microelement solution))를 사용하였다. 상기 미량원소 용액은 200 ml의 0.5N 염산에 0.556g FeSO₄ㅇ7H₂O, 0.396g MnCl₂ㅇ4H₂O, 0.034g CuCl₂ㅇ2H₂O, 0.06g H₃BO₃, 0.006g NaMoO₄ㅇ2H₂O, 0.562g CoSO₄ㅇ7H₂O, 0.058g ZnSO₄ㅇ7H₂O, 및 0.004g NiCl₂ㅇ6H₂O가 첨가된 용액이다.

본 배양(main culture)을 위해 NR 또는 LB 배지에서 자란 500μl의 배양액을 50mM 과당, 5mM 11-POU, 0 또는 1 mM 살리실산 및 0.1 g/L 황산암모늄을 함유하는 50ml M1 미네랄-염 배지가 들어있는 250 ml 플라스크(flask)로 옮기고, 30℃에서 배양하였다. 살리실산은 수산화나트륨을 첨가하여 용해하였으며, 용액의 pH는 배지에 첨가하기 전 7.2로 맞추었다.

[표 1] 본 발명의 실시예에 사용된 균주, 플라스미드 및 올리고뉴클레오타이드

Strains/plasmids	Relevant characteristics
Strains
E. coli S17-1	recA harboring the tragenes of plasmid RP4 in the chromosome, proA, thi-1
P. fluorescens BM07	wild type, isolated from activated sludge medium-chain-length polyhydroxyalkanoates-producing strain
BM07 phaG mutant	derivative of BM07, phaG-, phaG-lacZ
BM07 phaZ mutant	derivative of BM07, phaZ-, phaZ-lacZ
Plasmids
pVIK112	R6K, promoterless lacZ, Km^R
pJKG	phaG internal fragment in pVIK112
pXJZ	phaZ internal fragment in pVIK112
Oligonucleotides
07G 31	5'-AAAGAATTCCAGGGTCAGTATCGGGTT-3'
07G 489	5'-AAATCTAGACCGATGGTGCTGTTCAC-3'
07Z-F	5'-CGCGAATTCTTCCGTACCGTCAACCTGG-3'
07Z-R	5'-GCTCTAGAGGATCTTGTGCAGCCAGTGA-3'
pVIK-R	5'-GGTCATAGCTGTTTCCTGTCAG-3'

세포성장은 건조세포중량(dry cell weight, DCW)의 측정으로 결정하였다. 잔류 과당은 DNS법을 사용하여 측정하였고, 잔류 11-POU 또는 다른 카르복시산은 기체 크로마토그래피에 의해 측정되었다. 세포는 배양액을 원심분리(10,000 ㅧ g, 10min)하여 분리하였고, 메탄올로 세척하고, 실온에서 48시간 동안 진공상태에서 건조시켰다. 잔류 NH₄ ⁺는 Nessler 시약을 사용하여 측정하였다. 시간에 따른 배양을 관찰하기 위해 정해진 샘플링 시간(매 4 또는 6 시간)과 같은 수의 배양 플라스크 세트가 준비되었고, 동일한 배양 조건 하에서 배양되었다. 플라스크들 중 하나를 매 정해진 시간에 회수하고, 배지(50ml)를 원심분리한 후 분석하였다.

P. fluorescens BM07- ΔphaG 또는 P. fluorescens BM07- ΔphaZ 변이체의 제조

본 실시예에서 사용된 박테리아 균주, 플라스미드 및 올리고뉴클레오타이드는 [표 1]에 나타난 바와 같다. Escherichia coli 균주는 LB 배지에서 37℃에서 진탕배양(180rpm) 함으로써 성장 시켰다. 필요한 경우, 적당 양의 항생제(카나마이신(kanamycin): 20 ug/ml 또는 엠피실린(ampicillin): 100 ug/ml))를 배지에 첨가하였다. 벡터를 제조하기 위해 플라스미드 분리, 겔 전기영동, 형질전환, PCR 및 클로닝을 기존의 표준 방법으로 수행 하였다.

단일 상동 재조합(single homologous recombination)에 의한 변이체를 만들기 위해 삽입 돌연변이 방법을 사용하였다. P. fluorescens BM07 phaG (유전자 은행 등록번호(accession number): EU499366) 유전자의 내부 부분을 07G 31/07G 489 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시켜 459-bp 조각을 만들었다. 상기 조각을 pVlK112 벡터의 EcoR l 및 Xbal 클로닝 사이트에 클론화시켜 pJKG를 만들었다. 그 후 상기 pJKG 플라스미드를 전기천공법(electroporation)에 의해 E. coli S17-1 λpir에 삽입하였다. E. coli S17-1 λpir(pJKG) 및 P. fluorescens BM07를 각각 도너(donor) 및 리시피언트(recipient)로서 필터를 이용하여 접합하였다. 접합체들을 X-gal, 카나마이신 및 엠피실린이 첨가된 LB 한천배지에 도말하고 30℃에서 24시간 배양한 후 피전달접합균주(transconjugants)를 선별하였다. 상기 피전달접합균주를 확인하기 위하여 07G 31/pVIK-R 프라이머 쌍으로 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 상기 pVIK-R 프라이머는 pVIK112 플라스미드의 염기서열 정보(sequence information)를 기초로 디자인 하였다. 07G 31/pVIK-R 프라이머 쌍을 사용한 PCR은 피전달접합균주에서만 원하는 크기의 조각을 얻었다. P. fluorescens BM07 phaZ (유전자 은행 등록번호(accession number): FJ472656)의 내부 부분을 증폭시키기 위하여 07Z-F/07Z-R 프라이머 쌍을 사용하였다. 상기 증폭된 309-bp 조각을 pVlK112의 EcoR l 및 Xbal 클로닝 사이트로 서브클론(subclone)하여 pXJZ를 만들었다. phaZ 변이체의 제조와 확인은 상기 설명한 방법으로 수행하였다.

세포내 PHA의 정량평가

HP-5 캐필러리 컬럼 및 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector)가 장착된 Hewlett-packard사의 HP5890 Series Ⅱ 기체 크로마토그래프를 사용하여 세포의 황산/메탄올 처리로부터 회수된 메틸에스터를 분석함으로써 세포내 PHA의 단량체 조성을 결정하였다. GC 수행 조건은 다음과 같다: 초기온도 80℃, 2min; 8℃/min의 가열비율(heating rate); 최종온도 250℃, 1.75 min; 3 ml/min의 이동상가스(He) 유량; 주입기 온도 230℃; 검출기 온도 280℃. 각각의 GC 피크(peak)의 동정과 정량화는 정량적인 NMR 분석에 의해 이미 알고 있는 구조의 PHA에 대한 표준곡선을 이용하여 수행하였다.

열 전이(thermal transition) 분석

속슬렛 장치(Soxhlet apparatus)를 이용하여 세포들로부터 8시간 동안 클로로포름으로 PHA를 추출하였다. 상기 클로로포름 용액을 농축하여 차가운 메탄올에 침전시켜 중합체를 회수한 후, 얻어진 중합체를 클로로포름에 다시 용해시키고, 메 탄올에 재침전 시킨 후 진공 건조 오븐에서 24시간동안 건조시켰다. 데이터 스테이션 시스템을 구비한 DSC Q200(TA instruments)를 사용하여 순수 분리된 PHA의 열전이를 측정하였다. 분석할 10mg의 건조된 PHA 시료를 DSC 샘플 팬에 옮겨 실온에서 적어도 2주 이상 보관한 후 DSC 분석을 수행하였다. DSC 분석은 -80에서 100℃까지 10℃/min로 가열하였다.

NMR 분석

펄스-퓨리어 트랜스폼 모드(pulse-Fourier transform mode)의 Bruker AMX-500 스펙트로미터를 이용하여 125 MHz ¹³C- 및 500 MHz ¹H-NMR 스펙트라를 얻었다. 용매 CDCl₃에 폴리에스터를 ~30mg/ml 농도로 녹여 25℃에서 분석하였다. ¹³C-NMR 스펙트라에 대한 데이터 수집은 zgig30 프로그램을 이용하였고, 게이티드 디커플링 모드(gated decoupling mode)하에서 10 μs 펄스 폭, 30-s 펄스 반복, 30000Hz 스펙트라 폭, 64K 데이터 포인트 및 5000 어큐물레이션(accumulations)의 조건으로 수행하였다. 화학이동(chemical-shift)의 표준물질로서 테트라메틸실란(tetramethylsilane)이 사용되었다. 2차원 ¹H-¹H Homo-COSY, ¹H-¹³C Hetero-COSY, HMBC 및 DEPT 스펙트라 또한 25℃에서 기록되었다.

3-하이드록시 메틸 에스터(3-Hydroxyacid Methyl Esters)의 가스크로마토그 래피/질량분석기(GC/MS) 분석

황산/메탄올 가수분해 반응에 의해 얻어진 3-하이드록시 메틸에스터들의 구조 동정을 위하여 HP-5MS 5% 페닐 메틸 실록스(Penyl Methyl Silox) 칼럼(column)을 장착한 GC/MS(Agilent 5975C)에서 스펙트라를 얻었다. 이동상 가스로 1 ml/min의 헬륨을 사용하였다. 메틸에스터가 들어있는 클로로포름 용액 1 μl를 칼럼에 주입하여 분석하였다. 주입기 및 검출기의 온도는 각각 270℃ 및 280℃이었고, 120℃에서 5분, 5℃/min로 250℃까지 가열한 후 5분, 10℃/min로 280℃까지 가열한 후 5분의 오븐프로그램을 사용하였다. 애질런트(Agilent) 데이터 시스템에 11-POU로부터 유도된 3-하이드록시 메틸에스터의 질량 스펙트라 데이터가 없기 때문에, 정확한 동정을 위하여 매스 스펙트럼상의 피크들을 정확하게 지정하였으며, 이는 도 2에 나타낸 바와 같다.

BM07-ΔphaZ 변이체에서 옥타노에이트 또는 과당으로부터 PHA 축적의 증가

도 1에 의하면, 40 mM 옥타노에이트에서 5일 동안 배양된 BM07 야생형이 건조세포중량당 17 wt%의 PHA를 생산한 반면, BM07-ΔphaZ 변이체는 44 wt%까지 PHA를 축적하였다. 야생형의 경우 60시간의 배양 후 탄소원이 소모되었을 때, 최고 세포 성장 및 PHA 축적에 도달하였다. BM07-ΔphaZ 변이체에서도 세포성장 또는 PHA 축적이 최고조에 도달하는데 걸리는 시간은 야생형과 크게 차이가 나지 않았다. 야생형과 phaZ 변이체서 시간에 따른 옥타노에이트 또는 과당의 소모 양상 또한 매우 유사하였다. 따라서, P. putida KT2442와 유사하게, BM07 균주에서 phaZ의 불활성 화는 PHA의 분해를 감소시키면서, 동시에 MCL-PHA의 축적을 증가시켰다. 반면에, 슈도모나스 레시노보란스(Pseudomonas resinovorans)에서 phaZ의 변이는 PHA 축적에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 보고 되었다. BM07-ΔphaZ 변이체의 배양은 40mM의 옥타노에이트에서 보다 70mM의 과당에서 더 적은 양(34 wt%)의 PHA를 축적시켰다. 야생형의 경우, 과당 배지에서 축적된 PHA(~27wt%)가 옥타노에이트 배지에서 축적된 PHA보다 더 적게 감소하였다. 도 1에 의하면, 기대한 바와 같이 과당에서 배양된 BM07-ΔphaG 변이체는 PHA를 거의 축적하지 못하였다. 그러나, 옥타노에이트에서 BM07-ΔphaG 변이체를 배양하였을 때, 배양 시간에 따른 PHA 축적 및 감소는 야생형과 유사한 양상을 나타냈다.

11-POU 유래 PHA에서 방향족 단량체 유니트의 동정 및 정량 분석

도 2에 의하면, 50mM의 과당, 8mM의 11-페녹시운데카노익산 및 1mM의 살리실산에서 배양된 P. fluorescens BM07-ΔphaZ에서 생산된 PHA(표 2의 sample 4 참조)의 메틸에스터의 가스 크로마토그램은 17.9, 22.7, 26.6 및 30.1min의 머무름 시간에서 4개의 주요 피크(peak)를 나타내었다. 초반의 3개의 피크(peak)는 이미 동정된 메틸에스터의 표준물질로부터 각각 3-하이드록시-5-페녹시벨러레이트(5POHV), 3-하이드록시-7-페녹시헵타노에이트(7POHH) 및 3-하이드록시-9-페녹시노나노에이트(9POHN)의 메틸에스터로 확인되었다. 4개의 메틸에스터가 일련의 유사한 구조의 화합물일 것으로 생각되어, 공통의 분열 종(fragmentation species)을 찾기 위하여 26.6 및 30.1 min에서 보이는 두 GC 피크와 관련된 2개의 질량 스펙트라를 비교하 였다. 94 m/z에서의 피크는 페놀 양이온 종 Ph-OH⁺에 기인한 것임이 틀림없다. 280.1((B)에서) 및 308.2((C)에서) m/z에서의 피크는 각각 메틸-3-하이드록시-9-페녹시노나노에이트 및 메틸-3-하이드록시-11-페녹시운데카노에이트에 대한 분자이온(M⁺) 종으로 지정될 수 있다. 262.1((B)에서) 및 290.2((C)에서) m/z에서의 피크는 각각 상기의 분자이온 종에서 물 분자가 빠진 (M-H₂O)⁺피크로 지정될 수 있다. (B)에서, 137.1, 206.1 및 248.1 m/z에서의 일련의 피크는 순차적으로 262.1 m/z의 (M-H₂O)⁺종으로부터 하나의 에틸렌 유니트의 연속적인 제거를 통해 유도되는 것으로 지정될 수 있고, (C)에서, 165.1, 234.1 및 276.1 m/z에서의 일련의 피크는 290.2 m/z의 (M-H₂O)⁺종으로부터 하나의 에틸렌 유니트의 연속적인 제거를 통해 유도되는 것으로 지정될 수 있다. 따라서, (B) 및 (C)사이의 밀접하게 관련된 질량 분열 양상으로부터, 30.1min에 나타난 GC 피크는 3-하이드록시-11-페녹시운데카노에이트(11POHUN)의 메틸에스터 화합물인 것으로 확인되었다.

11-POU 유래 PHA에서 4개의 단량체 유니트의 정량 분석은 그들의 정확한 비율을 측정할 필요가 있었다. 따라서, 정량화를 위해 단량체 구성물들과 연관하여 해상이 좋은 시그널(signals)을 얻기 위하여 상세한 NMR 분석을 수행하였다. NMR에 의해 분석된 시료들 중, sample 1은 세포를 50mM의 과당 및 5mM의 11-POU을 포함하 는 배지에서 62시간 동안 30℃, 175 rpm으로 배양한 것이며, sample 2는 세포를 50mM의 과당, 8mM의 11-POU, 1mM의 살리실산을 포함하는 배지에서 84시간 동안 30℃, 175 rpm으로 배양한 것이고, sample 3은 세포를 50mM의 과당, 8mM의 11-POU, 1mM의 살리실산을 포함하는 배지에서 72시간 동안 30℃, 175 rpm으로 배양한 것이며, sample 4는 세포를 50mM의 과당, 8mM의 11-POU, 1mM의 살리실산을 포함하는 배지에서 62시간 동안 30℃, 175 rpm으로 배양한 것이다. 도 3a에서 상단의 스펙트라는, 500MHz ¹H-NMR 스펙트로미터를 사용하여 단량체 유니트의 다른 비율을 가지는 PHAs를 분석한 것이다. 3개의 더 짧은 단량체 유니트를 가지는 PHA의 탄소 및 양성자들에 대한 상세한 화학이동 지정(chemical shift assignments)은 이전에 보고되었다. 양성자 피크 중에서, 5.36, 2.00 및 1.73 ppm에서 나타난 피크는 각각 -O-C H (R)-(5POHV의 back-bone methine), -O-CH(C H ₂-CH₂-O-Ph)-(C=O)-(5POHV의 back-bone methine에 인접한 side-chain methylene) 및 7POHH의 -C H ₂-CH₂-O-Ph에서 유래한 양성자들로 지정되었고, 이것은 ¹H-¹H Homo COSY, ¹H-¹³C Hetero COSY, HMBC 및 DEPT 스펙트럼의 분석에서 확인되었다. PHA에서 4개의 단량체가 검출되었기 때문에, 양성자 NMR 스펙트럼 만으로는 단량체 유니트의 비율을 계산할 수 없었다. 본 발명자는 이전의 연구에서, 단량체 유니트의 정량 측정을 위해서 유사한 형태의 화학 그룹에 대해 해상이 좋은 ¹³C 시그널이 이용될 수 있음을 제안하였다. 도 3b에서 나타난 바와 같이, 분석된 탄소들 중에서 - C H2-O-Ph의 메틸렌 탄소에 대한 확장된 스펙트라 영역은 63.7, 67.35, 67.67 및 67.80 ppm에서 정량을 위해 정확히 적분될 수 있을 만큼 충분히 잘 분리된 흡수를 나타내었는데, 4개의 흡수 피크는 각각 5POHV, 7POHH, 9POHN 및 11POHUN에서의 탄소에 기인한다. 도 3c에 나타난 바에 의하면, 2-D Hetero COSY 스펙트럼에서 두 교차 피크(cross-peaks)가 보이는데, 상부의 피크는 5POHV와 관련된 것이고, 하부의 피크는 다른 3개의 더 긴 단량체 유니트와 관련된 것이다. 5POHV 보다 긴 단량체 유니트의 함량 증가는 페녹시 그룹(-C H ₂ -O-Ph)에 부착된 메틸렌 양성자의 최대 흡수(maximum absorption)를 3.92에서 3.89ppm로 이동시킬 뿐만 아니라 하부의 교차 피크를 더 강하게 하였다. 실제로, 4개의 단량체 유니트 모두에 대한 -C H ₂ -O-Ph의 양성자들은 분리되지 않고 하나의 양성자 피크를 나타내었다. 그러나, back-bone -O-C H (R)-의 메틴 양성자에서의 흡수는 두 그룹으로 나뉘어 졌는데, 5.36 ppm은 5POHV에 대해 지정되고, 5.17 ppm은 7POHH, 9POHN 및 11POHUN 그룹에 대해 지정된다. 표 2에서 탄소 시그널로부터 계산된 단량체 유니트 비율이 단량체 유니트의

[표 2] back-bone methine 양성자(2개의 signal: down field의 것은 5POHV와 관련 있고, up field의 것은 7POHH, 9POHN 및 11-POHUN와 관련 됨)과 phenoxy-group과 인접한 메틸렌 탄소(4개의 signal이 각각 4개의 단량체 유니트에 관련 됨)에 대해 적분된 면적비로부터 계산된 mol% 비율의 비교

Sample #	Strain used in PHA synthesis	Chemical group used in calculation	5POHV mol%	7POHH mol%	9POHN mol%	11POHUN mol%
Sample 1	BM07-phaG	C¹³ NMR Phenoxy- C H₂-	81	15	4	--
Sample 1	BM07-phaG	H-NMR -O-C H (R)-	82	18
Sample 2	BM07-phaG	C¹³ NMR Phenoxy- C H₂-	41	35	19	5
Sample 2	BM07-phaG	H-NMR -O-C H (R)-	44	56
Sample 3	BM07-phaG	C¹³ NMR Phenoxy- C H₂-	29	40	25	6
Sample 3	BM07-phaG	H-NMR -O-C H (R)-	32	68
Sample 4	BM07-phaZ	C¹³ NMR Phenoxy- C H₂-	22	43	27	8
Sample 4	BM07-phaZ	H-NMR -O-C H (R)-	--	--

정량화에 의미가 있는지를 확인하기 위해, 7POHH, 9POHN 및 11POHUN 세 개의 공여의 합계를 5.36 및 5.17 ppm 흡수로부터 계산된 비율과 비교하였다. 그러나, 도 3a의 sample 4에 의하면, 지방족 단량체 유니트의 존재(~10% 또는 그 이하)에 기인하는 흡수가 오직 방향족 단량체 유니트에만 연관된 5.36 및 5.17 ppm 흡수 영역의 부정확한 측정을 야기하므로, [표 2]에서 BM07-Δ phaZ 변이체에서 합성된 PHA(sample 4)는 비교 분석에서 제외되었다. 따라서, 탄소 시그널로부터 계산된 비율은 양성자 시그널로부터 계산된 비율과 잘 일치한다. 본 발명에서, [표 2]에서의 sample 들에 대해 계산된 단량체 유니트의 비율은 가스 크로마토그래피 분석에서 11-POU 유래 방향족 PHA의 단량체 유니트 조성의 측정을 위한 표준 곡선(curve)을 얻기 위하여 사용되었다.

살리실산(Salicylic Acid)에 의해 BM07 균주의 11-POU 유래 PHA의 지연된 축적(delayed accumulation)

50 mM 과당 및 5 mM 11-POU의 혼합물에서 배양된 BM07 야생형은 11-POU 유래 방향족 PHA(지방족 단량체 유니트는 4 wt% 이하로 검출되었음)를 축적하였고, 이때 과당은 주로 세포성장을 위해 이용되었다. 도 4a에 의하면, 저해제 살리실산이 없을 때는 세포 성장 및 PHA 축적이 동시에 일어났다. 탄소원 둘 다 30~40 시간 내에 소모되었다. 유사하게 BM07-ΔphaZ 변이체에서도 세포성장과 동시에 PHA 축적이 관찰되었다. BM07-ΔphaZ 변이체가 1mM의 살리실산의 존재하에서 50 mM 과당 및 5 mM 11-POU의 혼합물에서 배양되었을 때는, 최대 세포 성장(maximum cell growth)이 50~60 시간에 일어났으나 PHA 축적은 70 시간 근방에서 최고치를 보이면서 현저하게 지연되었다. 따라서, 도 4b에 의하면, 살리실산은 11-POU 유래 방향족 PHA의 축적을 현저하게 지연시켰지만, 세포성장을 현저하게 늦추지는 않았다. 상기 지연된 PHA 축적은 salicyl-CoA에 의한 β-ketothiolase의 억제에 기인할 수 있다. P. fluorescens BM07에서 살리실산은 대사되지 않으므로, 상기 지연된 축적은 "유효" 억제제 농도("effective" inhibitor concentration)의 변화에 기인한 것은 아니라고 판단된다.

도 4b의 데이터로부터 다시 계산된 방향족 단량체 유니트의 mol% 프로파일에 따르면, 살리실산의 존재하에서 배양된 BM07-ΔphaZ에서, PHA 축적이 강성한 60~70 시간 사이동안 5POHV의 mol% 증가(20에서 30)와 동시에 9POHN의 농도 감소(29에서 21)가 관찰되었으나, 7POHH 및 11POHUN의 mol%는 일정하게 유지되었다. 그러나, 살리실산 없이 배양된 야생형에서는 배양 전 기간동안 세 단량체 유니트(5POHV, 7POHH 및 9POHN)의 몰 비율의 현저한 변화가 없었다. 따라서, 살리실산 처리된 세포의 단량체 유니트 비율의 변화는 살리실산의 억제효에 의해 야기된 것으로 판단된다.

11-POU에서 배양된 BM07- Δpha Z 또는 Δpha G에서 살리실산에 의한 단량체 조절(modulation)

야생형에서 50 mM 과당과 11-POU의 공동기질대사에서, 5 mM의 11-POU는 전체 PHA 함량의 ~20% 이하까지 지방족 단량체 유니트의 도입을 억제시킬 수 있었다. 따라서, 본 발명에서는 지방족 단량체의 합성을 최소화 하기 위하여 함께 첨가된 11-POU의 농도를 5 mM로 고정하였다(표 3 참조). 살리실산 없이 배양된 야생형 대조구와 비교하여, 1 mM 살리실산의 첨가는 지방족 단량체의 도입을 전체 PHA 함량의 ~10%까지 더 억제하였고, 전체 PHA 함량도 조금 증가시켰다. 살리실산 없이 배양된 BM07-ΔphaZ에서 지방족 MCL-단량체 유니트의 양은 전체 PHA 중 50% 이상으로 현저하게 증가하였다. 그러나, 표 3에 의하면, 배양배지에 1 mM의 살리실산의 첨가는 야생형 대조구 함량에 필적할 만큼 지방족 단량체를 전체 PHA 중의 ~10% 함량으로 현저하게 감소시켰으며, 대신에 살리실산이 없을 때보다 방향족 PHA의 함량을 2배 이상 증가시켰다. 따라서, 살리실산의 억제효과는 야생형에서 보다 BM07-ΔphaZ 에서 더 강한 것으로 나타났다. 이는, β-산화(β-oxidation)에 대한 억제효과와 더불어, 혼합된 탄소원에서 배양된 BM07 균주에서 살리실산이 지방족 단량체 전구체가 과당으로부터 PhaG를 통해 유도되는 지방족 MCL-PHA의 축적 또한 억제할 수 있다는 것을 의미한다. 야생형 및 BM07-ΔphaG 변이체에 대해 보고된 것과 유사하게, BM07-ΔphaZ에서 살리실산은 또한 방향족 단량체 유니트의 분포를 더 긴 유니트로 전환시켰다. 게다가, [표 3에 의하면, 3개의 균주 중에서 BM07-Δ

[표 3] 1단계 배양조건(30℃) 하에서, 50mM 과당 및 5mM 11-POU 혼합물에서 배양된 P. fluorescens BM07 균주에서 합성된 폴리에스터들의 단량체 조성에 대한 살리실산의 효과

BM07 strain	Co-added compounds (mM)	Culture time (h)	Dry cell weight (g/L)	Polyester content (wt %)	PHA (aliphatic monomer) (wt %)	PHA (aromatic monomer) (wt %)	Monomer-unit composition (mol%)				Conversion yield
BM07 strain	Co-added compounds (mM)	Culture time (h)	Dry cell weight (g/L)	Polyester content (wt %)	PHA (aliphatic monomer) (wt %)	PHA (aromatic monomer) (wt %)	5POHV	7POHH	9POHN	11- POHUN	Conversion yield
Wild type	No inhibitor No inhibitor 1 mM Salicylic acid 1 mM Salicylic acid	48 72 48 72	1.74 1.64 1.36 1.78	22.4 22.9 23.9 29.3	4.5 3.2 3.1 2.5	17.9 19.7 20.8 26.8	82 81 30 47	15 16 46 35	3 3 19 16	-- -- 5 2	0.31 0.33 0.26 0.45
phaG mutant	No inhibitor No inhibitor 1 mM Salicylic acid 1 mM Salicylic acid	72 96 72 96	1.32 1.18 1.54 1.60	23.5 24.1 31.9 38.9	2.3 2.0 1.1 0.8	21.2 22.1 30.8 38.1	83 84 20 33	14 13 47 40	3 3 29 22	-- -- 4 5	0.28 0.26 0.42 0.56
phaZ mutant	No inhibitor No inhibitor 1 mM Salicylic acid 1 mM Salicylic acid	72 96 72 96	1.82 1.82 1.68 1.72	44.5 44.7 48.9 53.0	23.7 23.1 4.8 4.3	20.8 21.6 44.1 48.7	80 80 28 26	16 16 40 41	4 4 25 25	-- -- 7 8	0.38 0.40 0.67 0.75

phaZ 변이체가 11-POU에서 PHA로 약 70~80% 이상의 최대 전환율 및 가장 높은 PHA의 축적을 나타내었다. [표 3]에 의하면, 3 mM 11-POU/50 mM 과당에서 BM07-Δ phaG의 PHA 전환율은 단지 0.34였으나, 11-POU의 공급량을 5 mM로 증가시켰을 때 전환율(0.56 이상)과 장쇄 단량체 유니트의 생산이 증가하였다. 반면에, 가장 짧은 단량체 유니트 5POHV의 함량은 20 mol% 까지 감소하였다. 문헌에서는 아직 보고되지 않은 기질 분자 11-POU와 동일 수의 탄소를 가지는 가장 긴 단량체 유니트 11-POHUN는 BM07-ΔphaZ에서 가장 효과적으로 도입되었다.

살리실산에 의한 다른 ω-방향족 지방산의 전환율의 증가

비싼 기질로부터 기능성 PHA의 생산에서, 기질의 PHA로의 전환율은 경제성과 관련하여 중요한 척도가 된다. 본 발명자의 이전 연구에서, 20 mM 5-페닐벨러레이트(5-phenylvalerate, 5PV)/50mM 부틸산(butyric acid)에서 배양된 P. putida BM01에서 poly(3-hydroxy-5-phenylvalerate) (P(3HPV))의 생산에 대한 5-페닐벨러레이트의 전환율은 0.33인 것으로 보고되었다(표 4 참조). 10 mM 6-페닐카프로에이트(6-phenylcaproate,

[표 4] 1단계 배양조건(30℃) 하에서, 50mM 과당 및 10mM 5PV 또는 6PC 혼합물에서 배양된 P. fluorescens BM07 균주에서 합성된 방향족 폴리에스터들의 전환율에 대한 살리실산의 효과

Aromatic substrate	Strains	Co-added compounds (mM)	Culture time (h)	Dry cell weight (g/L)	Aromatic PHA content (wt%)	Conversion yield
5PV	P. putida BM01	20mM 5PV 50mM butyric acid	40	2.49	47	0.33
	M07 wild-type	No inhibitor 1mM salicylic acid	60 72	2.02 1.98	31 34	0.36 0.38
	BM07-phaG	No inhibitor 1mM salicylic acid	60 72	1.86 1.86	30 37	0.31 0.39
	BM07-phaZ	No inhibitor 1mM salicylic acid	60 72	2.04 2.10	33 50	0.39 0.59
6PC	P. putida BM01	20mM 5PV 30mM butyric acid	40	1.45	30	0.22
	BM07 wild-type	No inhibitor 1mM salicylic acid	48 60	1.86 1.78	17 33	0.16 0.31
	BM07-phaG	No inhibitor 1mM salicylic acid	48 60	1.66 1.70	17 35	0.15 0.31
	BM07-phaZ	No inhibitor 1mM salicylic acid	60 72	1.66 1.72	22 36	0.19 0.33

6PC)/ 30 mM의 부틸산의 혼합물에서 배양되었을 경우, BM01은 P(5 mol% 3-hydroxy-4-phenylbutyrate-co-95 mol% 3-hydroxy-6-phenyl- caproate)를 0.22의 전환율로 축적하였다. BM07 야생형 및 변이체 균주가 50 mM의 과당 및 10 mM의 5PV 또는 6PC의 혼합물에서 배양될 경우, 11-POU의 경우와 유사하게, 1 mM의 살리실산의 첨가는 종래 BM01 세포에 대해 보고한 것 보다 효과적으로 두 페닐 치환 지방산의 전환율을 향상시켰다. BM07-ΔphaZ 변이체에서 더 높은 전환율의 증가가 5PV 기질에 대해 관찰 되었으며, 0.59까지 증가 하였다. 따라서, 전화율에서 phaZ 제거의 효과는 짝수의 탄소 기질 보다 홀수의 탄소 기질에 대해서 더 효과적이었다. 추가로, BM07 균주는 P. putida BM01과는 달리 P(3-hydroxy-6-phenylcaproate)(P(3HPC)) 단일중합체를 축적시켰다. 살리실산의 유무에 상관없이 50 mM 과당 및 10 mM 5PV 또는 6PC의 혼합 기질에서 BM07 균주의 배양은 지방족 단량체가 없는 방향족 PHA를 생산하였다. 따라서, BM01 균주가 짧은 배양시간 동안 더 많은 양의 PHA를 축적함에도 불구하고, BM07 균주가 BM01 균주 보다 더 나은 방향족 PHA 생산균주로 여겨진다.

방향족 MCL-PHA의 열 전이(thermal transition)에 대한 측쇄(side-chain) 길이의 효과

[도 5]에 나타난 바와 같이, 지방족 MCL-PHA와는 달리, 모든 방향족 MCL-PHA 시료에서 유리 전이(glass transition)는 보이는 대신, 어떠한 용융 전이(melt transition)도 보이지 않았다. 본 발명에서, 방향족 PHA의 무정형성은 광각 X-선 회절(wide-angle X-ray diffraction) 분석에 의해 확인되었다. 짧은 측쇄를 가진 두 단일중합체 P(3HPV) 및 P(3HPC)는 각각 21 및 6℃에서 유리 전이를 가졌다. P(3HPV)와 비교하여 P(3HPC)의 측쇄 길이가 더 길어짐으로써 T_g가 감소한 것으로 여겨진다. 유사하게 T_g의 감소가 11-POU로부터 합성된 서로 다른 측쇄 길이의 넓은 분포를 가지는 방향족 PHA에서도 관찰되었다. 이러한 혼합된 공중합체 시스템에서, T_g의 감소는 명백히 측쇄 길이의 연장 효과에 기인한 것이다. 도 5에 나타난 sample (C), (D), (E) 및 (F)는 표 2에서 ¹³C-NMR 피크 비율을 사용하여 분석된 단량체 조성의 sample과 동일한 것들이다. 다른 MCL-PHA 중합체 필름들은 일반적으로 반투명 또는 불투명인데 반하여, 오랫동안 실온에서 보관한 P(3HPV) 중합체 필름(~3mm 두께)은 투명한 것이 특징이다.

도 1은 70 mM 과당 또는 40 mM 옥탄산을 포함하는 M1 배지(30℃)에서 배양된 BM07 야생형, BM07-ΔphaZ 및 BM07-ΔphaG 변이체에서 시간에 따른 PHA 축적의 프로파일을 비교한 것을 나타낸 것이다.

도 2는 50 mM 과당, 8 mM 11-POU 및 1mM 살리실산를 포함하는 배지에서 배양된 P. fluorescens BM07-ΔphaZ에서 생산된 PHA를 황산/메탄올 가수분해 시켜 생성한 3-하이드록실 단량체 유니트의 메틸에스터에 대한 GC/MS 분석을 나타낸 것이다. 상기 도 2에서, (A)는 PHA에서 4개의 방향족 단량체 유니트에 대한 메틸에스터의 가스 크로마토그래피 분리를 나타내며, (B는 (A)에서의 26.6 min 피크에 대한 양 이온 m/z 프로파일을 나타내고; (C)는 (A)에서의 30.1 min 피크에 대한 양 이온 m/z 프로파일을 나타낸 것이다.

도 3은 표 2에 계산 된 것처럼 단량체 유니트의 조성비가 다른 3개의 sample(sample 1, 2 및 4)들의 NMR 분석을 나타낸 것이다. 상기 도 3에서, 도 3a는 500 MHz H-NMR 스펙트라를; 도 3b는 125 MHz ¹³C-NMR 스펙트라(단, phenoxy- C H2-메틸렌 탄소 영역에 대해서만 나타냈음)를; 도 3c는 2D Hetero-COSY NMR 스펙트라(단, phenoxy-CH2-메틸렌 영역에 대한 교차피크만 나타냈음)를 나타냈으며, 상기 도 3a, 3b 및 3c 모든 스펙트라에 대해, 상단의 스펙트럼은 sample 1; 중단의 스펙트럼은 sample 2; 하단의 스펙트럼은 sample 4에 관한 것이다.

도 4는 시간에 따른 세포성장과 11-POU로부터 유래된 단량체 유니트의 PHA로 의 도입을 관찰한 것이다. 상기 도 4에서, 도 4a는 살리실산의 첨가없이 50 mM 과당 및 5 mM 11-POU를 포함하는 배지에서 배양된 P. fluorescens BM07 야생형에 대해; 도 4b는 50 mM 과당, 5 mM 11-POU 및 1mM 살리실산를 포함하는 배지에서 배양된 P. fluorescens BM07-ΔphaZ 변이체에 대해 각각 나타낸 것이다.

도 5는 BM07 야생형 및 변이체에서 생산된 PHA의 유리 전이에 대한 측쇄 길이의 효과를 나타낸 것이다. 상기 도 5에서, (A)는 P(3HPV) 단일중합체를; (B)는 P(3HPC) 단일중합체를; (C)는 P(81 mol% 5POHV-co-15 mol% 7POHH-co-4 mol% 9POHN)를; (D)는 P(41 mol% 5POHV-co-35 mol% 7POHH-co-19 mol% 9POHN-co-5 mol% 11POHUN)를; (E)는 P(29 mol% 5POHV-co-40 mol% 7POHH-co-25 mol% 9POHN-co-6 mol% 11POHUN)를; (F)는 P(22 mol% 5POHV-co-43 mol% 7POHH-co-27 mol% 9POHN-co-8 mol% 11POHUN)를 각각 나타낸 것이다.

Claims

(i) phaZ 유전자를 제거하여 슈도모나스 속 균주의 변이체를 제조하는 단계; (ii) 상기 슈도모나스 속 균주의 변이체를 당, 살리실산, 방향족 치환 카르복시산 포함 배지에 배양하는 단계; (iii) 상기 변이체로부터 장쇄 방향족 단량체를 함유한 방향족 폴리하이드록시 알칸산을 수득하는 단계;를 포함하는 폴리하이드록시 알칸산의 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 당은 과당인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시 알칸산의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 당의 함량은 50 내지 70 mM 인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시 알칸산의 제조방법
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제1항에 있어서, 상기 방향족 치환 카르복시산은 페닐(phenyl)기, 치환된 페닐기 또는 페녹시(phenoxy)기로 치환된 카르복시산인 것을 특징으로 하는 폴리 하이드록시 알칸산의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 방향족 치환 카르복시산은 11-POU(11-phenoxyundecanoic acid)인 것을 특징으로 하는 폴리 하이드록시 알칸산의 제조방법.
제1항에 있어서, 배지에 포함된 방향족 치환 카르복시산의 함량은 3 내지 10m M 인 것을 특징으로 하는 폴리 하이드록시 알칸산의 제조방법.
제1항에 있어서, 배지에 포함된 살리실산의 함량은 0.1 내지 2mM 인 것을 특징으로 하는 폴리 하이드록시 알칸산의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 슈도모나스 속 균주는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens )인 것을 특징으로 하는 폴리 하이드록시 알칸산의 제조방법
제 11항에 있어서,

상기 슈도모나스 플루오레슨스는 슈도모나스 플루오레슨스 BM07(Pseudomonas fluorescens BM07, 기탁번호: KCTC 10005BP)인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시 알칸산의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 배지는 M1 미네랄염 배지(1.06g (NH₄)₂SO₄, 2.3g KH₂PO₄, 7.3g Na₂HPO₄?12H₂O, 0.25g MgSO₄?7H₂O, 0.3g NaHCO₃, 0.1g CaCl₂?2H₂O, 0.03g 구연산 철 암모늄 및 2 ml 미량원소 용액)인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시 알칸산의 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 방향족 단량체는 3-하이드록시-5-페녹시벨러레이트(5POHV), 3-하이드록시-7-페녹시헵타노에이트(7POHH), 3-하이드록시-9-페녹시노나노에이트(9POHN) 및 3-하이드록시-11-페녹시운데카노에이트(11POHUN)인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시 알칸산의 제조방법
슈도모나스 속 균주에서 phaZ 유전자가 제거된 변이체.
제 16항에 있어서,

상기 슈도모나스 속 균주는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens )인 것을 특징으로 하는 변이체.
제 17항에 있어서,

상기 슈도모나스 플루오레슨스는 슈도모나스 플루오레슨스 BM07(Pseudomonas fluorescens BM07, 기탁번호: KCTC 10005BP)인 것을 특징으로 하는 변이체.
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