KR101100628B1 - 단백질성 화합물의 독성 효과를 변형시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

단백질성 화합물의 독성 효과를 변형시키기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈관누출증후군(VLS)을 촉진시키는 능력이 감소된 면역독소(IT) 및 사이토킨을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 VLS를 유도하는 아미노산 서열이 결핍되도록 돌연변이시킨 IT 및 사이토킨을 제공한다.
혈관누출증후군(VLS), 면역독소(IT), 사이토킨, 사람 제대 정맥 내피세포, 리신 A쇄 독소, 리보솜 불활성화 단백질(RIP)

Description

단백질성 화합물의 독성 효과를 변형시키기 위한 조성물 및 방법{Compositions and methods for modifying toxic effects of proteinaceous compounds}
본 명세서는 2002년 10월 29일자로 허여된 미국 연속출원번호 제10/282,935호의 우선권을 주장한다.
정부는 미국국립보건원의 허가번호 제CA-77701호에 따라 본 발명에 대한 권리를 가질 수 있다.
본 발명은 일반적으로 생리학 및 암 생물학 분야, 및 특히 혈관누출증후군(VLS)을 유도하거나 유발하는 독소 및 다른 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 VLS 및 기타 독성 부작용을 유도하는 아미노산 서열이 결핍되도록 돌연변이시킨 면역독소(IT) 및 사이토킨을 제공한다. 사이토킨 또는 면역독소를 암호화하는 DNA 단편을 돌연변이시켜 VLS 및 기타 독성 부작용을 유도하는 서열이 결핍된 면역독소를 생산하도록 하는 방법이 개시되어 있다.
VLS는 흔히 세균성 패혈증의 발병중 관찰되며 IL-2 및 각종 기타 사이토킨과 연루될 수 있다(문헌[참조: Baluna and Vitetta, 1996]). VLS의 근본적인 메카니즘은 불분명하며 이러한 메카니즘에는 내피세포(EC)에서 시작된 일련의 다단계증폭반응(cascade)이 관여하고 염증 다단계증폭반응 및 사이토킨이 관여하는 것으로 짐작된다(문헌[참조: Engert et al., 1997]). VLS는 혈관내피세포(EC)의 상해 및 조직간 부종을 초래하는 체액 및 단백질의 일혈, 체중 증가 및 이의 가장 중증 형태인 신장 상해, 실어증 및 폐부종을 포함하는 복합적 병인을 갖는다(문헌[참조: Sausville and Vitetta, 1997; Baluna and Vitetta, 1996; Engert et al., 1997]). 이제까지 사람에서 시험된 모든 IT 및 인터류킨 2(IL-2)와 같은 사이토킨, TNF 및 아데노바이러스 벡터와 관련하여 혈관누출증후군(VLS)이 주요 문제였다(문헌[참조: Rosenberg et al., 1987; Rosensten et al., 1986]).
IT는 식물, 진균류 또는 세균으로부터의 독소, 독소 아단위 또는 리보솜 불활성화 단백질(RIP)에 생화학적 또는 유전학적으로 결합된 모노클로날 항체(MAb) 또는 기타 세포-결합 리간드로 이루어진 하이브리드 분자이다(문헌[참조: Vitetta et al., 1993]). 지난 20년에 걸쳐, 구조적으로 안정성 및 활성에 대해 최적화되고 쥐, 원숭이 및 사람에서 시험관내 및 생체내 둘 다에서 활성이 평가된 탈당화(dg) 리신(ricin) A쇄(dgRTA)를 함유하는 IT가 개발되어 왔다(문헌[참조: Vitetta et al., 1993; Sausville and Vitetta, 1997; Baluna and Vitetta, 1996]).
dgRTA-IT가 혈관 내피세포를 손상시킴으로써 VLS를 유도하는 것으로 가정되어 왔다(문헌[참조: Soler-Rodriguez et al., 1993; Baluna et al., 1996]). 식물 독소, 리신(RTA) 및 기타 독소의 촉매적 A쇄로 제조된 IL-2 및 IT는 시험관 내 및 생체내에서 사람 EC를 손상시킨다(문헌[참조: Dutcher et al., 1991; Rosenberg et al., 1987; Vial and Descotes, 1992]). 사람 제대 정맥 EC(HUVEC)를 사용한 연구는 dgRTA 또는 dgRTA로 제조된 IT가 단백질 합성의 억제를 4시간 이상 소요하는 반면 한시간 내에 이들 세포를 손상시킬 수 있음을 입증하였다(문헌[참조: Soler-Rodriguez et al., 1993]). DgRTA-IT는 또한 섬유결합소(Fn)-매개 유착을 방해한다(문헌[참조: Baluna et al, 1996]). Fn은 사람 제대 정맥 내피세포(HUVEC)에 대한 dgRTA-매개 손상을 억제한다(문헌[참조: Baluna et al., 1996]). Fn에 대한 세포 유착은 Fn 분자 중 RGD 및 LDV 서열을 인식하는 인테그린에 의해 매개된다(문헌[참조: Makarem and Humphries, 1991; Wayner and Kovach, 1992]).
dgRTA에 연결된 3개의 MAb는 재발성 화학불응 림프종, 골수종, 호지킨병(Hodgkin's disease) 및 이식편대숙주병(GVHD)으로 투병중인 200명 이상의 사람에서 제1기 시험에서 평가하였다(문헌[참조: Sausville and Vitetta, 1997]). 이들 IT는 골수독성 또는 간독성의 증거를 나타내지는 않았지만, 이들 모두 저알부민혈증, 체중증가 및 가장 중증의 경우, 폐부종 및 저혈압으로 명시된 바와 같이 최대허용 용량(MTD)에서 VLS를 유도하였다(문헌[참조: Baluna et al., 1996]). 추가로, 이들은 3%의 환자에게서 MTD에서 근육통 및 횡문근융해를 유도하였고(문헌[참조: Sausville and Vitetta, 1997]); 이러한 부작용은 또한 VLS와 연관되어 있으며 근육부종을 초래할 수 있다. 추가로, 실어증이 5% 미만의 환자에게서 발생하며, 이들은 뇌미세혈관계의 부종에 의한 것일 수 있다.
이러한 용량 제한 독성(DLT)에도 불구하고, dgRTA-IT를 사용하였을 때의 임상 반응은 제1기 임상 시험 중 타각적(objective) 부분 또는 완전 반응을 경험한 재발성 화학불응 림프종 환자의 15 내지 30%에서 고무적인 것이였다(문헌[참조: Suasville and Vitetta, 1997]). 그러나, DLT, VLS는 환자에게서 제2기 및 제3기 시험을 계속하려는 열의를 감소시켜왔다.
분명히, dgRTA-IT 및 독소 및 RIP를 함유하는 기타 IT, 및 임상 제제로서의 사이토킨의 추가의 개발은 VLS의 제거 또는 감소를 위해 크게 독려된다. VLS가 유발되지 않거나 감소될 수 있다면, 현재 직면하고 있는 용량 제한 부작용이 없는 IT, 유전자 치료 및 사이토킨과 같은 각종 치료제를 보다 고용량으로 사용할 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 독성효과를 유발하는 각종 단백질성 화합물의 독성효과 유발 능력을 조절하는 방법 및 독성효과를 유발하는 조절 능력을 갖도록 변형시킨 단백질성 조성물을 제공함으로써 당해 분야의 결점을 극복한다. 일부 양태에서, 본 발명은 예를 들면, VLS를 포함하는 이러한 독성 효과를 촉진 또는 유발하는 능력이 감소된 IT를 생산할 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 IT는 예를 들면, GVDH, 비-호지킨병 및 호지킨 림프종, 골수종 및 일부 고형종양의 치료와 같은 많은 치료학적 적용을 위한 것이다. 본 발명은 또한 많은 독성 효과를 유발 또는 촉진시키는 서열의 돌연변이를 통한 단백질성 조성물의 VLS 촉진 능력을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 예를 들면, IT, IL-2, TNF 및 아데노바이러스, 및 독성 효과를 촉진시키 는 능력이 감소된 기타 단백질 또는 바이러스 및 이러한 화합물의 사용방법을 제공한다.
(x) D(y) 트리펩타이드 서열의 측면에 위치한(측면 영역) 아미노산을 변형시켜 단백질성 조성물의 VLS 유발 능력을 감소시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 “단백질성 조성물”은 약 200개 초과의 아미노산의 단백질 또는 유전자로부터 해독된 전체 길이의 내인성 서열, 약 100개 초과의 아미노산 폴리펩타이드 및/또는 약 3개 내지 약 100개의 아미노산으로부터의 펩타이드(길이 3, 4, 5, 6 등, 10, 11, 12, 13, 14 등, 20, 21, 22 등, 30, 40, 50, 60 등, 100, 110, 120 등, 200, 220, 240 등, 300, 350, 400 등, 500, 600, 700 등 및 1000개 아미노산 길이의 펩타이드 포함)를 지칭한다. 특정 측면에서, 이러한 서열 및/또는 측면에 위치한 아미노산의 변형방법은 아미노산 또는 아미노산 서열을 제거 또는 치환하는 것이다.
특정 양태에서, 변형된 단백질성 조성물은 (x)D(y) 서열을 갖는 단백질 및 VLS를 유도하는 (x)D(y) 서열의 능력을 변형시킨 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이(들)은 측면 영역, 단백질의 활성 부위, 및/또는 단백질의 (x)D(y) 서열에 있을 수 있다. 측면 영역 내에 위치하는 것으로 정의된 아미노산(들)은 천연 단백질 형태의 (x)D(y) 서열 중 아스파르트산의 약 10Å 내에 위치하는 아미노산, 천연 단백질 형태의 효소 부위 잔기(활성 부위)로부터 약 6Å 초과의 거리에 위치하는 아미노산, 천연 단백질 형태의 표면에 최소한 부분적으로 노출된 곳에 위치하는 아미노산 또는 이들 매개변수의 둘 이상의 배합을 포함할 수 있다. 측면 영역 내의 아미노산의 돌연변이는 본원에 기술한 임의의 다른 돌연변이와 조합될 수 있다. (x)D(y)를 포함하는 단백질은 독소, 사이토킨 또는 바이러스성 단백질일 수 있다. 특정 양태에서, 단백질은 독소이다. 독소는 리신 A쇄 독소(RTA), 아브린 A쇄 독소, 디프테리아 독소(DT) A쇄, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소(PE), 쉬가(Shiga) 독소 A쇄, 겔로닌, 모모딘, 미국자리공 항바이러스성 단백질, 사포린, 트리코산틴 또는 보리 독소를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 양태에서, 독소는 리신 A쇄 독소이다.
각종 양태에서, 변형된 단백질성 조성물은 (x)D(y) 서열 및 단백질의 독성을 변형시키는 측면 서열내의 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 본원에 기술한 조성물의 단백질(들)은 추가로 본원에 기술한 다른 돌연변이를 포함할 수 있다. 백신 조성물 및 백신접종의 방법과 같은 특정 양태에서, 불활성화된 단백질이 바람직할 수 있다(예를 들면, 활성 부위에 불활성화 변형을 포함하는 단백질). 당해 단백질(들)의 돌연변이체 아미노산은 상기한 바와 같은 (x)D(y) 서열의 측면 아미노산(들)을 포함할 수 있다. 단백질은 상기한 바와 같은 독소, 사이토킨 또는 바이러스성 단백질일 수 있다. 각종 양태에서 독소는 리신 A쇄 독소이다.
각종 양태에서, 리신 A쇄 독소는 측면 영역에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고 단백질의 활성화 부위에 돌연변이 또는 변형이 함께 있을 수 있으며, 이는 리신 A쇄 독소에 대한 백신접종 및/또는 본원에 기술한 바와 같은 단백질 중 (x)D(y)서열에 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 리신 A쇄 독소내의 돌연변이는 측면 영역 서열내의 아미노산에 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 이는 R48, N97 또 는 R48 및 N97를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 단백질의 돌연변이는 천연 아미노산의 치환, 변형 또는 결실을 포함한다. 특히, 천연 아미노산은 알라닌 잔기로 치환될 수 있다. 본 발명의 조성물은 약제학적 또는 약제학적으로 허용되는 조성물로서 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 천연 단백질성 조성물의 서열에 비교하여 측면 영역 서열내의 변형과 함께, (x)D(y)를 포함하는 서열의 하나 이상의 아미노산이 변형된, 상기한 그리고 본 명세서의 다른 부분에 기술된 방법에 따라 제조된 변형된 단백질성 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 단백질성 조성물은 독소, 사이토킨, 바이러스성 서열 또는 이의 배합물을 포함한다. 특정 측면에서, 독소는 예를 들면, 식물 독소, 진균 독소, 세균성 독소, RIP 또는 이의 배합물이다. 추가의 측면에서, 당해 독소는 아브린 A쇄, 디프테리아 독소(DT) A-쇄, 슈도모나스 외독소, RTA, 쉬가 독소 A쇄, 겔로닌, 모모딘, 미국자리공 항바이러스성 단백질, 사포린, 트리코산틴, 보리 독소 또는 이의 배합물을 포함한다. 다른 양태에서, 단백질성 조성물은 예를 들면, 인터류킨-2와 같은 사이토킨을 포함한다. 다른 측면에서, 단백질성 조성물은 예를 들면, 아데노바이러스 서열과 같은 바이러스 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 당해 조성물은 추가로 항체를 포함한다. 특정 측면에서, 당해 조성물은 추가로 IT를 포함한다. 특정 측면에서, IT는 추가로 하나 이상의 제2 제제(예를 들면, 하나 이상의 효능인자(effector) 분자)를 포함한다. 특정 측면에서, 효능인자 분자는 독소, 항-종양 제제, 치료학적 효소, 항바이러스성 제제, 바이러스, 사이토킨, 성장 인자 또는 이의 배합물이다. 다른 측면에서, 당해 제제는 하나 이상의 리포터 분자이다.
본 발명은 추가로 VLS, 아폽토시스, 디스인테그린-유사 활성 또는 EC 손상을 유도하는 능력이 감소된 하나 이상의 단백질성 분자를 포함하는 IT를 제공하며, 여기서 단백질성 분자는 하나 이상의 변형된 (x)D(y) 및/또는 측면 영역 서열을 갖는다.
특정 양태에서, 당해 조성물은 치료학적 제제(예를 들면, 하나 이상의 IT, 항체, 사이토킨, 바이러스 또는 이의 배합물)을 포함한다. 특정 양태에서, 당해 조성물 및 치료학적 제제는 공유적으로 접합되어 있다. 특정 측면에서, 당해 조성물은 치료학적 제제이다.
본 발명은 또한 환자에게서 독성을 촉진시키는 능력이 감소된 RTA를 제공하며, 여기서 위치 74 내지 76을 포함하는 (x)D(y) 서열이 변형되어 있다. 특정 양태에서, 위치 74의 루이신이 변형되며, 위치 75의 아스파테이트가 변형되고/거나 위치 76의 발린이 변형된다. 특정 측면에서, (x)D(y) 서열은 추가로 (x)D(y) 트리펩타이드 서열의 (x) 또는 (y)의 약 1개 내지 약 6개 잔기의 위치를 포함한다. 각종 양태에서, (x)D(y) 서열의 변형은 측면 영역 서열내의 변형(들)과 함께 있을 수 있다.
본 발명은 VLS를 유발하는 능력이 감소된 단백질성 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 하나 이상의 아미노산 서열이 제거되도록 변형된 단백질성 조성물은 서열 (x)D(y)를 포함하는 조성물과 접하고 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 당해 단백질성 조성물은 리보솜-불활성화 단백질(RIP)(겔로닌, 모모딘, 미국자리공 항바이러스성 단백질(PAP), 사포린 또는 트리코산틴을 포함하지만, 이에 제한되지는 않음); 독소 또는 독소 아단위(아브린 A쇄, 디프테리아 독소(DT) A-쇄, 슈도모나스 외독소-A(PE38-lys), RTA, 쉬가 독소 A쇄 또는 보리 독소를 포함하지만, 이에 제한되지는 않음); 사이토킨(IL-2를 포함하지만, 이에 제한되지는 않음)일 수 있다. 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드는 본 발명의 방법 및 조성물에 사용되는 RIP, 독소 또는 사이토킨으로부터 유래할 수 있다. 특정 측면에서, 단백질성 조성물은 VLS를 촉진시키거나 증강시키는 능력이 감소된 IT를 제조하는 데 사용될 수 있다. 다른 측면에서, IT에 사용하기 위한 단백질성 조성물은 RIP 및/또는 독소 서열이다.
본 발명의 특정 양태는 (x)D(y)의 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 동정하는 단계(여기서, (x)는 그룹 루이신, 이소루이신, 글라이신 및 발린 중에서 선택되고, (y)는 그룹 발린, 루이신 및 세린 중에서 선택된다); 및 상기한 바와 같이, (x)D(y) 서열의 측면 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시키는 단계(여기서, VLS를 유발하는 능력이 감소된다)를 포함하는, VLS를 유발하는 단백질성 조성물의 능력을 감소시키는 방법을 포함한다.
각종 양태는 (x)D(y)의 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 독소를 동정하는 단계(여기서, (x)는 그룹 루이신, 이소루이신, 글라이신 및 발린 중에서 선택되고, (y)는 그룹 발린, 루이신 및 세린 중에서 선택된다); 상기한 바와 같이, (x)D(y) 서열의 측면 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시키는 단계(여기서, VLS를 유발하는 능력이 감소된다); 및 당해 독소를 하나 이상의 항체를 포함 하는 독소에 결합시켜 면역독소를 생산하는 단계(여기서, 생산된 면역독소는 측면 아미노산 서열이 당해 독소로부터 변형되지 않은 유사 면역독소와 비교할 경우, 감소된 VLS 촉진 능력을 갖는다)를 포함하는, VLS를 유발하는 능력이 감소된 면역독소를 제조하는 방법을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열 (x)D(y)을 포함하는 하나 이상의 아미노산 서열을 동정하는 단계(여기서, (x)는 그룹 루이신, 이소루이신, 글라이신 및 발린 중에서 선택되고, (y)는 그룹 발린, 루이신 및 세린 중에서 선택된다); 및 서열 (x)D(y)을 포함하는 아미노산 서열을 변형시키는 단계를 포함하는, 독성 효과를 유발하는 단백질성 조성물의 능력을 변형시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 당해 변형은 하나 이상의 아미노산 서열의 돌연변이를 포함한다. 다른 양태에서는, 당해 아미노산 서열이 제거된다. 특정 측면에서, 당해 아미노산 서열은 서열 (x)D(y)(여기서, (x)D(y) 서열은 GDL, GDS, GDV, IDL, IDS, IDV, LDL, LDS, LDV, LDS, VDL 또는 VDV이다)을 포함한다. 특정한 보다 특이적인 양태에서, 본 발명은 천연 단백질성 조성물의 서열과 비교하여, (x)D(y)(여기서, (x)는 그룹 루이신, 이소루이신, 글라이신 및 발린 중에서 선택되고, (y)는 그룹 발린, 루이신 및 세린 중에서 선택된다)를 포함하는 서열 중 하나 이상의 아미노산이 변형된, 약제로서 사용하기 위한 변형 단백질성 조성물을 제공한다.
(x)D(y) 트리펩타이드 서열을 갖는 단백질성 조성물은 현재 공지되어 있거나 미래에 발견될 수 있을 것이다. 일부 양태에서, 단백질성 조성물은 독소, 사이토킨, 바이러스 서열 또는 이의 배합물을 포함한다. 특정 측면에서, 당해 독소는 식물 독소, 진균 독소, 세균 독소 RIP 또는 이의 배합물을 포함한다. 특정 측면에서, 당해 독소는 아브린 A쇄, 디프테리아 독소(DT) A-쇄, 슈도모나스 외독소, RTA, 쉬가 독소 A쇄, 겔로닌, 모모딘, 미국자리공 항바이러스성 단백질, 사포린, 트리코산틴, 보리 독소 또는 이의 배합물을 포함한다. 다른 양태에서, 단백질성 조성물은 사이토킨(예를 들면, 인터류킨-2)을 포함한다. 추가의 양태에서, 당해 단백질성 조성물은 바이러스 서열(예를 들면, 아데노바이러스 서열)을 포함한다. 특정 측면에서, 당해 단백질성 조성물은 추가로 IT를 포함하거나, IT에 포함되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "단수 부정관사"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 청구항(들)에 사용된 바와 같은 단어 "단수 부정관사"는 단어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, 하나 이상을 의미할 수 있다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해 질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 제시하는 한면, 오직 예시의 목적으로 제공되었으며, 본 발명의 정신 및 영역내에서 각종 변화 및 변형이 당해 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백해질 것이다.
본 명세서의 다음의 도면 형태 부분은 본 발명의 특정 양태를 추가로 증명하기 위해 포함시켰다. 본 발명은 본원에 제시한 특정 양태의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참고로 하여 보다 잘 이해할 수 있을 것이다.
도 1A 및 1B. RFB4-RTA-펩타이드의 생체내 효과. (도 1A) 혈관 사람 피부 이종이식체를 갖는 SCID 마우스에 RFB4-dgRTA(흑색), RFB4-LDV+(백색), RFB4-GOT(그물코) 또는 염수(평행선) 200㎍을 주사하고, 및 사람 피부의 생체조직절편의 습윤/무수 중량비를 측정하였다. (도 1B)SCID 마우스에 도 1A에 기술한 바와 같이 주사하였고, 폐의 습윤/무수 중량비를 측정하였다. 당해 값은 3회 실험 평균 ± SD을 나타낸다. 별표는 염수(-) 처리된 마우스(*p<0.02, **p<0.01)와 통계적으로 현저히 상이함을 나타낸다.
도 2A 및 2B. HUVEC에 대한 dgRTA 및 RFB4-LDV+의 결합 억제. (도 2A) 105개의 HUVEC를 PBS/BSA/아지드 100㎕ 중 100배 과량의 dgRTA(흑색), RFB4-LDV+(그물코), RFB4(음영), Fn(평행선) 또는 PE38-lys(백색)의 유무하에, FITC-dgRTA와 함께 빙상에서 30분동안 항온처리하였다. HUVEC에 대한 결합의 억제 퍼센트가 제시되어 있다. 당해 값은 3회 연구의 평균 ± SD의 평균을 나타낸다. (도 2B) 105개의 HUVEC를 FITC-RFB4-LDV+와 함께 30분 동안 빙상에서 항온처리한 것을 제외하고 도 2A와 동일하다.
도 3. 리신의 산-처리된 세파로스 4B 칼럼-정제의 개요
도 4. RCA-1 및 RCA-2의 세파크릴 S-200 칼럼-분리의 개요
도 5. dgRTA 및 dgRTB 쇄의 DEAE 세파로스 칼럼 및 산-처리 세파로스 4B 칼럼 분리의 개요
도 6. dgRTA의 블루-세파로스 CL-4B 칼럼-정제의 개요
도 7. dgRTA의 아시알로페투인-세파로스 칼럼-정제의 개요
도 8. RTA의 리본 도표. 활성 부위 잔기 측쇄, LDV 모티프 및 R48 및 N97을 갖는 리신 A쇄의 X-선 결정그래프 구조의 리본 표현.
도 9. RFB4-RTA IT의 생체내 VLS 효과. 비교를 위해 각종 RTA-IT로 처리한 SCID 마우스의 폐내의 125I-알부민 잔류를 PBS-처리 마우스에 의한 잔류에 대해 칭량함으로써 표준화하였다. (n=마우스 수. P값은 PBS 그룹과 각각의 그룹을 비교한다.)
도 10. SCID/다우디(Daudi) 생존 곡선. 방법에 기술한 바와 같이 처리한 SCID 마우스(n=10)을 생존 또는 마비에 대해 관찰하였으며, 이 중 하나는 당해 모델의 종말점이다. (백색 다이아몬드) PBS, (흑색 다이아몬드) RFV4, (백색 삼각형) RFB4-R48A, (흑색 삼각형) RFB4-N97A, (백색 사각형) RFB4-wt rRTA. P값(로그-등급 또는 윌콕손(Wilcoxon) 시험에 의한): RFB4-R48A 대 RFB4, P=0.0093 또는 P=0.0037, RFB4-N97A 대 RFB4, P=0.0018 또는 P=0.00012, RFB4-wt rRTA 대 RFB4, P=0.0022 또는 P=0.00012.
뱀에 물리거나 패혈쇼크를 유발하는 분자 또는 IT 또는 인터류킨과 같은 치료학적 제제와 같은 독소에 의해 초래된 세포 손상, 특히 내피세포 손상은 환자에게 문제로 남아있다. 세포 손상 유형은 VLS, 디스인테그린-유사 활성 및 아폽토시스를 포함한다.
VLS를 완화시키는 방법 및 조성물을 고안하기 위해, VLS를 유발하는 분자의 후보 서열을 평가하여 RTA, 독소, RIPS 및 IL-2가 세포-세포 및 세포-기질 상호작용을 방해하는 구조적 모티프를 공유할 수 있는지, 그리고 이에 따라 사람 EC를 손상시킬 수 있는지의 여부를 측정하였다. VLS-유발 독소, RIPS 및 IL-2의 서열을 비교하여, (x)D(y) 일치 모티프를 동정하였고, 여기서, (x)는 L, I, G 또는 V일 수 있으며 (y)는 V, L 또는 S일 수 있다. RTA 및 IL-2의 경우에, 분자 모형제작은 이들 모티프가 이들 각각의 분자의 표면에 완전하게 또는 현저히 노출되었음을 나타내었다. 유사 모티프가 인테그린의 기능을 붕괴시키는 바이러스 디스인테그린에 의해 공유되어 있으며, 이는 RTA, IL-2 및 아마도 다른 독소가 이들의 (x)D(y) 모티프에 의해 EC를 손상시킬 수 있으며, 따라서 디스인테그린일 수 있음을 나타낸다.
LDV 상동성 서열은 또한 IDS 서열을 함유하는 혈관 세포 유착 분자 1(VCAM-1) 및 GDV 서열을 함유하는 피브리노겐의 γ쇄를 포함하는 각종 무독성 분자의 혈관 기능에 관계되어 있기 때문에, 이러한 모티프의 혈관 누출 촉진 활성은 놀라운 예상밖의 일이었다(문헌[참조: Clements et al., 1994]). LDV는 α4β1 인테그린 수용체에 대한 이의 결합을 담당하는 섬유결합소의 CS1 도메인내의 최소 활성 부위를 구성한다(문헌[참조: Makarem and Humphries, 1991; Wayner and Kovach, 1992; Nowlin et al., 1993]). 섬유결합소는 당해 서열을 포함하지만, 이는 HUVEC를 손상시키지 않는다. 대신, FN은 당해 모티프를 포함하는 독성 제제의 VLS 활성과 뚜렷한 대조를 이루어, RTA-매개 손상으로부터 HUVEC를 보호한다(문헌[참조: Baluna et al., 1996]).
당해 모티프가 EC 손상을 담당하였는지의 여부를 측정하기 위해, 각각 RTA 또는 IL-2로부터의 펩타이드를 함유하는 짧은 LDV 또는 LDL을 제조하여 마우스 MAb에 부착시키고 시험관내에서 HUVEC에 대한 결합 능력 및 HUVEC 손상 능력을 연구하였고 생체내에서 피부 이종이식체의 마우스 폐 혈관계 및 사람 혈관계를 손상시키는 능력을 연구하였다. RTA의 하나의 활성 부위 돌연변이체 및 몇몇의 LDV 돌연변이체를 제조하였다. 이들 LDV 돌연변이체는 모형제작시, RTA의 활성 위치에 영향을 줄 것으로 기대되지 않는 보존적 변화를 포함하였다. 당해 서열(L74, D75, V76)을 함유하는 RTA로부터의 항체-결합 펩타이드는 2가지의 동물 모델에서, 시험관내에서 EC 손상을 유도하였고 생체내에서 혈관 손상을 유도하였지만, 결실 또는 변형된 서열을 갖는 펩타이드는 손상을 유도하지 않았다(문헌[참조: Baluna et al., 1999]). 이들 결과는 VLS-유발 부위가 활성 부위를 필요로 하지 않음을 입증하였다. 이는 RTA의 비-인접 활성 부위(LDV를 포함하지 않는)가 EC를 손상시키는데 필요하지 않거나, 혈관 손상에 단지 부분적으로만 기여함을 의미한다.
이들 결과는 활성 부위가 혈관 손상을 유발하는데 필요하지 않을 수 있으며, 감소된 VLS 촉진 활성을 갖는 하나 이상의 활성 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 제조될 수 있음을 입증하였다. 이러한 발견과 함께, 본원에 이르러 (x)D(y) 서열(들) 및/또는 측면 영역 서열의 하나 이상의 아미노산 결실(들) 또는 돌연변이(들)가 VLS를 감소 또는 예방할 수 있으며 치료 지수 또는 VLS-유발 분자의 허용 용량을 향상시킬 수 있게 되었다. 하나 이상의 펩타이드 및 하나 이상의 돌연변이된 모티프 및/또는 하나 이상의 측면 영역 서열을 포함하는 소분자 약물 억제제를 제조하여 VLS 촉진제에 의해 유발되는 VLS를 감소 또는 제거할 수 있을 것으로 기대된다.
각종 양태에서, 활성 부위 및/또는 (x)D(y) 모티프의 물리적 영역, 공간 또는 주변에 위치하고 있는 다른 잔기를 돌연변이시키거나 변형시켜 VLS를 저지, 감소 또는 제거할 수 있다. 측면 영역내의 돌연변이를 위한 표적이 되는 아미노산은 천연 단백질, 특히 RTA 및 이의 유도체의 표면상 또는 그 근처의 아미노산을 포함한다. 변형은 (x)D(y) 모티프의 영역내의 하전된 잔기를 제거하거나 치환시킬 수 있으며, 이는 당해 단백질의 표면상의 특정 영역내의 전하를 무효화하거나 역전시킬 수 있다. 또한 당해 변형은 (x)D(y) 서열 또는 단백질의 활성 위치의 물리적 영역, 공간 또는 주변의 아미노산의 크기 및/또는 친수성을 변화시킬 수 있다. 2가지의 예시적 측면 잔기는 아르기닌 48(R48) 및 아스파라긴 97이며, 이는 RTA의 3차원 구조 중 (x)D(y) 모티프에 물리적으로 인접해있는 것으로 밝혀졌다.
특정 양태에서, 단백질성 조성물의 디스인테그린 또는 디스인테그린-유사 활성을 감소시키거나 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다. 디스인테그린은 EC 손상능, 세포 부착 방해능 및/또는 혈소판 응집 방해능을 포함하는 각종 활성(들)을 갖는다. (x)D(y) 서열(들) 및/또는 하나 이상의 측면 영역 잔기의 하나 이상의 아미노산 결실(들) 또는 돌연변이(들)은 이들 서열을 포함하는 하나 이상의 분자의 디스인테그린-유사 활성을 감소시키거나 예방할 수 있을 것으로 사료된다. 하나 이상의 돌연변이된 모티프 및/또는 하나 이상의 측면 서열을 포함하는 하나 이상의 펩타이드 및 소분자 약물 억제제를 제조하여 이러한 제제의 디스인테그린-유사 활성을 감소시키거나 제거할 수 있을 것으로 사료된다.
추가로, RTA의 LDV 부위는 EC에서 아폽토시스를 유발하였다. 많은 독소 및 IT가 아폽토시스를 유발하며 단백질 합성을 억제하는 것으로 보고되어 왔다. 또한 (x)D(y) 서열(들) 및/또는 하나 이상의 측면 영역 잔기의 하나 이상의 아미노산 결실(들) 또는 돌연변이(들)가 이들 서열을 포함하는 하나 이상의 분자의 아폽토시스 활성을 감소시키거나 예방할 수 있을 것으로 사료된다. 하나 이상의 돌연변이된 모티프 및/또는 하나 이상의 측면 서열을 포함하는 하나 이상의 펩타이드 및 소분자 약물 억제제가 제조되어 이러한 제제의 아폽토시스 활성을 감소 또는 제거할 수 있을 것으로 기대된다. 따라서 아폽토시스 활성은 VLS를 유발하는 독소 또는 사이토킨을 초래하거나 이에 기여할 수 있다.
또한 (x)D(y) 서열(들) 및/또는 하나 이상의 측면 영역 잔기의 하나 이상의 아미노산 결실(들) 또는 돌연변이(들)가 이들 서열을 포함하는 분자의 EC 손상을 유발하는 능력을 감소시키거나 예방할 수 있을 것으로 사료된다. 하나 이상의 돌연변이된 모티프 및/또는 하나 이상의 측면 서열을 포함하는 하나 이상의 펩타이드 및 소분자 약물 억제제가 제조되어 이러한 제제의 EC 손상 활성을 감소 또는 제거할 수 있을 것으로 기대된다.
각각 이러한 서열을 제거 또는 부가하는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 다른 단백질성 물질 내의 (x)D(y), (x)D(y)T 또는 (x)D(y) 모티프의 측면 영역내의 돌연변이를 토대로 한 VLS 촉진 능력을 감소 또는 향상시키는 제제를 포함하는 조성물의 제조방법 및 조성물이 본원에 기술되어 있다. VLS 촉진 능력을 감소 또는 향상시키기 위한 상기한 바와 동일한 돌연변이가 각각, 아폽토시스 활성, EC 손상 및/또는 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단백질의 하나 이상의 디스인테그린-유사 활성을 감소 또는 향상시킬 것으로 사료된다. 따라서, VLS 촉진 능력을 향상 또는 감소시키는 본원에 기술된 모든 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드의 제조 방법을 감소된 아폽토시스 활성, EC 손상 및/또는 하나 이상의 디스인테그린-유사 활성을 갖는 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드의 제조를 위해 적용할 것이다. 이러한 모든 방법 및 이러한 방법에 의해 확인되거나 제조된 조성물이 본 발명에 포함된다.
A. VLS-유발 제제내의 (x)D(y) 모티프의 동정
세포-세포 및 세포-기질 상호작용에 영향을 주어 사람 EC를 손상시킬 수 있는 RTA, 기타 독소, RIP 및 IL-2 내의 상동성 구조 모티프를 동정하였으며 모형계에서 VLS를 촉진시키는 이들의 능력을 시험하였다. (x)D(y) 모티프(여기서, x는 L, I, G 또는 V이고, y는 V, L 또는 S이다)(표 1)는 VLS를 유발하는 RTA, 기타 독소, RIP 및 사이토킨의 서열에 공통적이다. 당해 모티프는 또한 인테그린의 기능을 방해하는 바이러스 디스인테그린에 의해 공유되어 있다(문헌[참조: Coulson et al., 1997]).
Figure 112008074944639-pct00035
1홀로톡신(holotoxin)의 효소적 활성쇄
2PE38은 PE 중 효소적 활성 도메인 III(잔기 405 내지 613)과 잔기 253 내지 354 및 381 내지 404를 지칭한다.
3식물 독소의 효소적 활성 A쇄의 상동체인 리보솜-불활성화 단백질(RIP)
1. RTA, 디스인테그린, PE38-lys 및 IL-2내의 (x)D(y) 모티프의 편재화
VLS 촉진에 있어서의 (x)D(y) 서열의 중요성이 발견되면서, 본원에 이르러 효과적 IT를 제조하는데 중요한 이들의 효소 활성은 유지하지만, 또한 이들의 VLS-유발 특성은 감소된 RTA 돌연변이체를 제조할 수 있게 되었다.
RTA내의 LDV 모티프(잔기 74-76, 서열번호 1)는 활성 부위에 포함된 Tyr-80 잔기 근처의 제1 도메인의 β-쇄의 C-말단에 있다(문헌[참조: Mlsna et al., 1993]). 효소의 활성 부위(잔기 80, 123, 177, 180, 209 및 211)은 LDV 서열을 포함하지 않기 때문에 RTA의 효소 활성은 당해 서열의 돌연변이 또는 결실에 의해 형향받지 않을 것이다(문헌[참조: Munishkin and Wool. 1995]).
RTA 및 IL-2의 결정 구조를 측정하기 위해, RTA(PDB 수탁번호 1br5.pdb) 및 IL-2(PDB 수탁번호 1irl.pdb)의 3차원 구조의 공간충전모형을 비교하였다. 특히, RTA의 LDV 잔기의 원자, IL-2의 LDL 잔기의 원자, 및 RTA의 활성 부위 잔기의 원자(Y80, Y123, E177, R180, N209 및 W211)를 당해 구조내의 이들의 상대적 위치를 고려하여 분석하였다. 당해 모델은 인사이트 II 프로그램{Insight II program(MSI)}을 사용하여 제조하였다. RTA의 결정 구조의 측정은 당해 모티프가 단지 부분적으로만 노출되어 있지만, 당해 분자의 구조적 유동성이 이의 접근가능성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 이와 본원에 기술한 다른 데이타로부터, (x)D(y) 모티프, C-말단 측면 아미노산(들), N-말단 측면 아미노산(들), 측면 영역 서열 또는 이의 배합물내의 변형이 각종 제제에 의한 VLS-유발 활성의 손실을 초래할 수 있을 것으로 사료된다.
디스인테그린으로 지칭되는 다른 단백질계는 흔히 RGD 서열을 함유한다. 로타바이러스내에 존재하는 한 디스인테그린의 경우, LDV 서열이 존재한다(문헌[참조: Coulson et al., 1997]). 디스인테그린은 EC를 손상시키거나 세포 부착 및/또는 혈소판 응집을 방해한다(문헌[참조: McLane et al., 1998; Huang, 1998; Tselepis et al., 1997]). 뱀독 디스인테그린 키스트린에서, 디스인테그린의 기능을 저해하지 않으면서 RGD를 LDV로 치환시킬 수 있다(문헌[참조: Tselepis et al., 1997]). 따라서, RTA 및 각종 다른 분자는 사람 EC를 손상시키는 데 있어서, 키스트린의 성질을 공유하는 디스인테그린일 수 있다(문헌[참조: Blobel and White, 1992; Lazarus and McDowell, 1993]). 특정 양태에서, 디스인테그린 또는 디스인테그린-유사 활성을 갖는 분자를, EC를 손상시키는 능력이 감소하도록, 세포 부착을 방해하는 능력이 감소하고/거나 혈소판 응집을 방해하는 능력이 감소되도록 변형 또는 제조할 수 있다. 이러한 분자는 (x)D(y) 서열 중 하나 이상의 잔기 또는 하나 이상의 측면 잔기를 돌연변이시킴으로써 제조할 수 있다. 또한 (x)D(y) 및/또는 측면 서열의 펩타이드 또는 펩타이드 유사체를 디스인테그린의 활성을 차단하도록 제조할 수 있을 것으로 사료된다.
PE38-lys에서 GDL 서열은 활성 부위로부터 멀리 위치해 있다(문헌[참조: Li et al., 1995]). 따라서, PE38-lys는 이의 활성을 완전히 제거하지 않으면서 이의 VLS 촉진 활성을 감소 또는 제거하도록 유사하게 돌연변이시킬 수 있다.
IL-2에서, 잔기 19 내지 21(서열번호 2)의 LDL 서열은 α-나선에 위치하며 단지 부분적으로만 노출되어 있다. LDL 모티프(표 1) 내의 Asp-20의 돌연변이는 IL-2의 IL-2 수용체의 β쇄에 대한 결합 및 이에 이은 세포 증식을 제거한다(문헌[참조: Collins et al., 1988]). IL-2가 시험관내에서 혈관 내피의 알부민에 대한 투과성을 직접적으로 증가시켰으며 이러한 효과는 항-IL-2 수용체 MAb에 의해 억제될 수 있음이 보고되었다(문헌[참조: Downie et al., 1992]). 실시예 1의 결과는 IL-2 내의 LDL 서열이 HUVEC를 손상시킴을 입증한다. 그러나, RTA와 대조적으로, IL-2의 LDL 내의 Asp-20은 수용체 결합 및 기능적 활성에 관계되어 있다(문헌[참조: Collins et al., 1988]). 따라서, 특정 양태에서, VLS를 제거 또는 감소시키기 위한 IL-2의 (x)D(y) 서열 및/또는 측면 서열(들)내의 돌연변이는 Asp-20을 보존시켜야 하거나 IL-2의 생물학적 활성을 감소시킬 수 있다고 사료된다.
2. 측면 서열내의 돌연변이
(x)D(y) 서열은 단지 VLS의 촉진만을 담당하는 것이 아닐 수 있다. 특정 양태에서, (x)D(y) 서열의 측면에 위치하고 있는 추가의 서열이 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 VLS를 촉진시키는 능력을 향상 또는 감소시키도록 돌연변이될 수 있다고 사료된다. 이들 측면 서열은 (x)D(y) 서열로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 100개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한 천연 단백질 형태내의 (x)D(y) 서열 중 아스파르트산으로부터 대략 10Å의 측면 영역내에 위치한 아미노산, 천연 단백질 형태의 활성 부위 잔기로부터 대략 6Å 초과 떨어진 곳에 위치한 아미노산, 최소한 천연 단백질 형태의 표면에 부분적으로 노출된 곳에 위치한 아미노산 또는 이들 매개변수의 2 또는 3개의 배합물을 포함할 수 있다.
예를 들면, LDV는 섬유결합소의 α4β1 인테그린 수용체에 대한 이의 결합을 담당하는 섬유결합소의 CS1 도메인 내의 최소 활성 부위를 구성한다(문헌[참조: Makarem and Humphries, 1991; Wayner and Kovach, 1992; Nowlin et al., 1993]). 그러나, 섬유결합소(FN)은 HUVEC를 손상시키지 않는다. 대신, FN은 RTA-매개 손상으로부터 HUVEC를 보호한다(문헌[참조: Baluna et al., 1996]). RTA와 달리, FN은 트레오닌 대신 C-말단 LDV-측면 프롤린을 갖는다.
디스인테그린에서, RGD의 측면에 위치한 잔기는 리간드 결합에 관계되어 있다(문헌[참조: Le et al., 1996]). LDV 또는 상동체-함유 분자가 혈관 온전성을 향상시키는 능력(예를 들면, FN) 또는 이를 방해하는 능력(예를 들면, RTA) 간의 차이는 LDV 모티프의 배향 또는 상호작용 가능성(즉, 결합) 및 따라서, 측면 서열에 따를 수 있다. 따라서, 이들 서열의 하나 이상의 아미노산 또는 N- 또는 C-말단 측면 서열의 하나 이상의 아미노산에의 변화는 분자를 내피세포를 손상시키는 분자(인테그린-유사)로부터 이들의 성장을 촉진시키는 분자로 전환시킬 수 있다. (x)D(y) 서열의 하나 이상의 측면 잔기 내의 변화는 분자의 VLS 촉진 능력을 향상 또는 감소시킬 수 있을 것으로 사료된다. 추가로, (x)D(y) 서열을 당해 단백질의 외부 표면에 노출시켜 다른 단백질(예를 들면, 수용체)과 상호작용하도록 하는 변화는 VLS 촉진 활성을 향상시키는 반면, 보다 적게 노출된 형태는 VLS 촉진 활성을 감소시킬 수 있을 것으로 사료된다.
a. 리신 A쇄-VLS 돌연변이에 대한 후보 잔기를 동정하기 위한 구조 분석
측면 영역 잔기로서의 아미노산의 동정은 하나 이상의 리신 A쇄 결정 구조에 의해 측정될 수 있으며, 이는 NCBI(GenBank), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/에서 입수할 수 있다. 이들 2가지 예시적 구조는 돌연변이 또는 복합체 내의 다른 존재물과의 공동-결정화가 없는 RTA 단독의 2가지 구조이다. 이들 구조를 NCBI, Cn3D v.4.0으로부터 입수 가능한 소프트웨어를 사용하여 분석 및 조작할 수 있다. 사용될 수 있는 예시 서열 또는 구조는 RTA(GenBank 수탁번호 1RTC) D.Mlsna, A.F.Monzingo, B.J.Katzin, S.Ernst & J.D.Robertus, 29-Oct-92; 및 rRTA(GenBank 수탁번호 1IFT) S.A.Weston, A.D.Tucker, D.R.Thatcher, D.J.Derbyshire & R.A.Pauptit, 5-Jul-96 및 이들 및 다른 데이타베이스에서 용이하게 입수할 수 있는 (x)D(y) 서열을 함유하는 것으로 확인된 다른 서열을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
변형된 경우, VLS를 제거, 감소 또는 저지할 수 있는 잔기를 동정하는 방법은 a) (x)D(y) 서열 및 특히 LDV 서열의 10Å 내의 모든 잔기를 동정하는 단계(예를 들면, 아스파르트산(D), 특히 RTA D75로부터 잔기의 거리); b) 각각의 잔기에 대해, '활성 부위'로부터 거리를 측정하는 단계(예를 들면, RTA의 6개의 주요 활성 부위 잔기(Y80, Y123, E177, R180, N209, W211)를 선택하고 각각의 후보자의 거리를 활성 부위의 최근점에 대해 '측정'하였다); c) 각각의 잔기에 대한 표면 노출의 시각적 조사 단계('Y'-예, 'P'-부분적, 또는 'N'-아니오로 등급을 정함); 및/또는 d) 단백질의 표면상의 각각의 잔사가 나타난 위치를 시각적으로 조사하는 단계{(x)D(y), LDV 및/또는 활성 부위에 비교하여 전면은 'F', 또는 후면은 'B'로, 또는 둘다(분자의 '가장자리' 또는 분자에 걸쳐 확장되어 있는)로 등급을 정함}를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
RTA의 경우에, 개별 RTA 구조로부터의 잔기를 비교하는 표를 만들어 아미노산 사이의 각각의 거리를 분석 및 확인할 수 있다. 통상, 표면/매몰면/후면 사이의 차이를 측정하고 각각의 잔기에 대한 일치에 도달한다(이들 측정의 주관적 특성에 기인하여, 예를 들면, 부분적 및 노출됨 사이의 차이를 정의하기 어려울 수 있다-표면에 대한 임의의 노출은 통상 최소한 '부분적' 노출로 분류된다). RTA에 대한 예시적 목록이 표 2에 제공되어 있다(LDVT를 포함하는 80개의 잔기 및 LDV의 10Å 내의 활성 부위(AS)의 4개의 잔기를 제공한다).
추가로, 당해 방법은 또한 e) 목록으로부터 모든 '회전(turn)' 잔기{예를 들면, P( 프롤린), G(글라이신)(RTA의 경우 8개 잔기)}를 제거하는 단계(일반적으로 이들은 분자의 강도를 완전히 방해하면서 변형된다); f) 목록으로부터 모든 매몰 잔기(이들은 위에 'N'으로 표시되어 있고; RTA 17 잔기의 경우, L74는 대조 목적을 위한 것이다) 및 당해 분자의 후면상에 독점적으로 노출되어 있는 모든 잔기(위에 측정되어 있는 바와 같으며, RTA27 잔기의 경우, V76은 대조 목적을 위한 것이다)를 제거하는 단계; g) 목록으로부터 활성 부위의 6Å 내에 있는 모든 잔기를 제거하는 단계를 포함한다{이들 거리는 독단적으로 선택되지만 3.0Å 떨어진 RTA D75 돌연변이체의 활성 감소, 및 6.0Å(6개 잔기) 떨어진 2가지 V76 돌연변이체의 RTA 활성의 유지를 기준으로 한다}. 예를 들면, 이러한 방법은 표 2의 예시 목록을 표 3의 예시 목록으로 감소시킨다(22개의 잔기는 여전히 대조를 위해 LDVT 및 활성 부위 잔기를 포함한다).
잔여 14개의 잔기(LDVT 및 활성 부위를 뺀)는 RTA의 LDV 영역으로부터의 거리 순서에 따라 표 4에 대략적으로 나열되어 있다. 변형된 경우, 표 2 및 표 3의 다른 잔기의 변형이 또한 적합한 결과를 가질 수 있지만, 잔기의 이러한 보존적 목록은 RTA의 VLS 활성을 제거, 감소 또는 저지시킬 수 있다. 이러한 선택은 통상 1) (x)D(y)에 대한 근접성, RTA의 경우 LDV 영역; 2) 활성 부위로부터의 거리; 및 3) 당해 분자의 (x)D(y) 서열과 동일한 면에 대한 표면 노출을 기준으로 하였다. 예를 들면, 이들 구조적 기준을 충족시키는 RTA의 N97 및 R48 둘 다는 RTA 활성을 유지시키면서 VLS를 감소, 제거 또는 저지할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 이들 변형 중 하나 이상을 단독으로 또는 다른 변형과 함께 사용하여 감소된 독성, 감소된 VLS 특성, 감소된 효소 활성 또는 이들의 배합을 갖는 단백질을 제조할 수 있다.
Figure 112005022871818-pct00002
Figure 112005022871818-pct00003
Figure 112005022871818-pct00004
Figure 112005022871818-pct00005
Figure 112005022871818-pct00006
B. 변형된 VLS 활성을 갖는 조성물의 제조
VLS, 아폽토시스 및 다른 효과를 유발하는 (x)D(y) 및 (x)D(y)T 모티프가 동정되면서, 신규한 계열의 VLS 억제제 분자를 제조하는 이들 분자가 최대의 유용한 효과를 발휘하게 할 수 있게 하였다. 예를 들면, 본원에 개시한 조성물 및 방법을 사용한 항암 치료제의 감소된 독성은 보다 큰 종양 또는 보다 진행된 질병을 치료하게 할 수 있다. 본원에 이르러 세포 사이의 상호작용 및 VLS 촉진, 아폽토시스 촉진, EC 손상을 억제하는 소약물 분자(들), 및/또는 디스인테그린-유사 분자를 동정 또는 합성할 수 있게 되었다. 특정 양태에서, (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 모티프 또는 이의 측면 서열을 토대로 하는 펩타이드 또는 약물-유사체를 생체내에서 VLS 또는 다른 활성을 억제하기 위해 사용할 수 있다. 내피 세포상의 LDV 모티프 결합 부위와 경쟁하는 펩타이드 또는 펩타이드-담체 접합체를 제조하고 VLS 또는 패혈증, IL-2 치료 등을 포함하는 각종 다른 상황에서의 다른 작용를 예방할 수 있다.
특정 양태에서, 또한 보다 큰 분자에 첨가된 하나 이상의 (x)D(y), (x)D(y)T 모티프 및/또는 특정 측면 서열이 조직내로의 일혈을 증가시킬 수 있다. 본원에 비추어, 소염제 또는 항전이제(문헌[참조: Jackson et al., 1997; Maeda et al., 1997; Greenspoon et al., 1994])로서 시험된 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열을 포함하는 펩타이드를 증가된 일혈 및 혈관계에 대한 독성 효과 둘 다에 대해 관찰할 수 있다. 그러나, 특정 양태에서, 조직내로의 일혈을 증가시키는 단백질성 조성물을 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 치료학적 조성물의 일혈 개선 또는 본 발명의 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 갖는 치료학적 조성물에 대한 일혈 촉진은 조직에 대한 치료제의 보다 많은 접근을 가능케 할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 치료제의 일혈 촉진 또는 감소 방법을 제공한다. 바람직한 치료제는 하나 이상의 IT, 항체, 사이토킨, 바이러스, 약물 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
(x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열이 결핍된 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 제조하기 위해, 보존된 아스파르트산(D)를 결실 또는 돌연변이시키고, 아스파르트산을 다른 아미노산으로 치환시키거나 하나 이상의 아미노산을 이의 위치 또는 이의 위치에 인접한 곳에 삽입시킬 수 있다. 이러한 임의의 아미노산은 결실 또는 돌연변이 사건의 결과로서 당해 서열내의 (D) 잔기를 치환시킬 수 있다.
대안적으로 하나 이상의 아미노산을 삽입시켜 (x) 잔기를 결실, 치환 또는 이동시켜 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열을 제거할 수 있다. 결실 또는 돌연변이 사건의 결과로서 당해 서열내의 (x) 잔기를 치환시킬 수 있는 임의의 아미노산은 바람직하게는 루이신(L), 이소루이신(I), 글라이신(G) 또는 발린(V)이 아니다.
또는 (y) 잔기를 하나 이상의 아미노산을 삽입시켜 결실, 치환 또는 이동시켜 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열을 제거할 수 있다. 결실 또는 돌연변이 사건의 결과로서 당해 서열내의 (y) 잔기를 치환시킬 수 있는 임의의 아미노산은 바람직하게는 발린(V), 루이신(L) 또는 세린(S)이 아니다.
추가로, (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열을 당해 서열을 변형 또는 변화시키는 임의의 돌연변이에 의해 제거할 수 있다. 이러한 돌연변이는 아미노산의 절단, 삽입, 치환 및 결실을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 화학적 변형은 또한 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열을 변형시켜 VLS를 유도 또는 촉진시키는 능력을 감소시킬 수 있을 것으로 사료된다.
따라서, (x)D(y) 서열 또는 측면 서열에 영향을 주는 이러한 돌연변이는 폴리펩타이드의 VLS 촉진 능력 또는 이들 서열과 관련된 다른 능력을 변형시킬 수 있을 것으로 사료된다. 예를 들면, VLS를 초래하는 하나의 바람직한 제제는 아브린 A쇄(GenBank 등록 번호 X76721; 서열번호: 3)이며, 이는 이의 아미노산 서열의 위치 68 내지 70에 IDV 서열을 함유한다. 글라이신(G)는 위치 67에 있다. 따라서, 위치 68에서의 이소루이신의 결실은 위치 67의 글라이신이 원위치 69의 아스파르트산 잔기(D)에 직접적으로 인접하게 할 것이다. 이어서 제조된 신규한 서열은 돌연변이된 아브린 A쇄의 위치 67-69에서의 GDV일 수 있다. 이들 신규한 트리펩타이드 서열은 여전히 VLS-유발 서열 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T에 일치한다. 그러나, 이러한 결실때문에 제조된 돌연변이 아브린 A쇄 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 구조내의 3개 아미노산 서열의 위치가 이동될 수 있을 것으로 사료된다. 3개 아미노산 서열의 위치 이동은 VLS를 촉진 또는 유발하기 위해 임의의 세포, 수용체 또는 분자를 접촉시키기에 덜 바람직한 위치로 이를 이동시킬 수 있다. 수득된 돌연변이 아브린 A쇄 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 VLS를 촉진 또는 유발하는 능력이 감소될 수 있으며, 따라서 본 발명에 포함될 것이다.
유사하게, 표 1에 나열된 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않는, VLS를 유발하는 다른 독소 또는 화합물을 돌연변이시켜 하나 이상의 (x)D(y) 및/또는 하나 이상의 측면 잔기를 제거할 수 있다(즉, 돌연변이시킬 수 있다). 그러나, VLS를 유발하는 능력이 감소된 독소 또는 화합물을 생산하기 위해, 임의의 잔여 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열의 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 표면에 대한 노출을 감소시키는 것이 바람직할 것으로 사료된다.
예를 들면, 최소한 부분적으로 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 비노출 부위에 위치하고 있는 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열, 또는 이와 달리 당해 분자의 표면에 대한 전체 또는 부분적 노출이 차폐된 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열은 세포, 수용체 또는 다른 분자와 덜 상호작용하여 VLS를 촉진 또는 유발할 것으로 예상된다. 따라서, 당해 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 제1 구조로부터의 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y) 서열 및/또는 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열의 완전한 제거는 VLS를 유발 또는 촉진시키는 능력이 감소된 독소 또는 분자를 제조하는데 불필요하다. 그러나, VLS를 유발 또는 촉진시키는 최소한의 능력을 갖는 조성물을 보증하기 위해 모든 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열을 제거하는 것이 바람직하다.
돌연변이가 덜 노출된 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 모티프를 갖는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 초래하는 경향이 있는지의 여부를 판단하기 위해, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법(X-선 결정학, NMR 또는 컴포터 모델링을 포함하지만, 이에 제한되지는 않음)에 의해 측정된 바와 같이, 돌연변이되지 않은 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 2차 및 3차 구조의 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열과 돌연변이된 서열을 비교함으로써 이동되거나 첨가된 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열의 추정 위치를 측정할 수 있다. 각종 폴리펩타이드 및 펩타이드 구조의 컴퓨터 모델 또한 문헌 또는 컴퓨터 데이타베이스에서 입수할 수 있다. 비제한적 실시예에서, 당해 분야의 숙련가는 엔트레츠(Entrez) 데이타베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)를 사용하여 돌연변이유발을 위한 표적 서열 및 영역을 동정할 수 있다. 엔트레츠 데이타베이스는 공지된 경우, 동정된 아미노산 서열에 대한 3-D 구조의 데이타베이스에 가교 결합시킨다. 이러한 분자 모형을 사용하여 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 내부에 매몰된 유사한 서열보다 외부 분자(예를 들면, 수용체)와 접촉하기 위해 보다 더 노출된 펩타이드 및 폴리펩타이드 내의 (x)D(y), (x)D(y)T 및/또는 측면 서열을 동정할 수 있다. 보다 많이 노출되어 외부 분자와 접촉된 (x)D(y), (x)D(y)T 및/또는 측면 서열은 VLS 및 이들 서열과 연관된 다른 독성 효과를 촉진 또는 감소시키는데 기여하는 경향이 보다 크며, 따라서 돌연변이유발을 위한 제1 표적이 될 수 있다. 특정 양태에서, 하나 이상의 (x)D(y), (x)D(y)T 및/또는 측면 서열의 첨가가 바람직한 경우, 외부 분자에 접촉되도록 보다 많이 노출된 단백질의 영역이 이러한 서열을 첨가하기 위한 부위로서 바람직하다. 돌연변이된 단백질 또는 야생형 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 구조는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이, X-선 결정학 또는 NMR을 사용하여 시험관내 또는 생체내 검정에 사용하기 직전에 측정할 수 있다.
일단 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열을 포함하는 아미노산 서열이 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 내에서 변형되거나 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 첨가하면, 하나 이상의 독성 효과를 촉진시키는 이의 능력에의 변화를 상기한 임의의 기법 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기법으로 검정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, (x)D(y) 서열, (x)D(y)T 또는 측면 영역 서열을 포함하는 아미노산 서열의 "변형되다", "변형된", "변형되고 있는", "변형"은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 내의 (x)D(y), (x)D(y)T 및/또는 측면 영역 서열을 포함하는 아미노산 서열의 화학적 변형 및 이러한 아미노산 서열의 임의의 돌연변이(삽입, 결실, 절단 또는 치환을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다)를 포함할 수 있다. 이러한 변화는 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열을 포함하는 하나 이상의 아미노산 서열(들)의 하나 이상의 독성 효과(즉, VLS, EC 손상, 아폽토시스, 디스인테그린-유사 활성을 촉진시키는 능력)를 변형시키는 것이 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같은 (x)D(y) 서열 또는 (x)D(y)T 서열을 포함하는 아미노산 서열은 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 트리- 또는 쿼트라펩타이드 서열에 대한 하나 이상의 측면 서열 C- 및/또는 N-말단을 포함할 수 있다. 이러한 "변형"은 합성된 펩타이드 또는 돌연변이된 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 생산하도록 발현시킨 핵산 서열에 만들어질 수 있다.
본 발명의 측면에서, (x)D(y), (x)D(y)T 및/또는 측면 영역 서열을 포함하는 아미노산 서열의 변형은 당해 아미노산 서열의 제거를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 (x)D(y), (x)D(y)T, 및/또는 측면 영역 서열을 포함하는 아미노산 서열의 "제거하다", "제거된", "제거되고 있는" 또는 "제거"는 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 트리- 또는 쿼트라-펩타이드 서열, 및/또는 하나 이상의 천연 측면 서열의 존재가 제거되거나 이의 활성이 감소된 1급 아미노산 서열 내의 돌연변이를 지칭한다. 용어 "제거된" 또는 "결핍된"은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
예를 들면, 돌연변이는 그룹 페닐알라닌(F); 시스테인/시스틴(C); 메티오닌(M); 알라닌(A); 트레오닌(T); 세린(S); 트립토판(W); 타이로신(Y); 프롤린(P); 히스티딘(H); 글루탐산(E); 글루타민(Q); 아스파르트산(D); 아스파라긴(N); 라이신(K); 및 아르기닌(R) 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 치환을 포함하지만, 이에 제한되지는 않으며, 하나 이상의 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열의 위치(x)에 표 1에 나타내져 있는 것들을 포함하지만. 이에 제한되지는 않는 돌연변이가 VLS를 촉진시키는 이의 능력을 감소시킬 것으로 사료된다. 아래의 표 5는 예시적으로 본 발명의 특정 측면에 유용할 것으로 사료되는 변형되거나 비통상적인 아미노산을 나열하지만, 이에 제한되지는 않는다.
Figure 112005022871818-pct00007
또한 그룹 이소루이신(I); 발린(V); 루이신(L); 페닐알라닌(F); 시스테인/시스틴(C); 메티오닌(M); 알라닌(A); 글라이신(G); 트레오닌(T); 세린(S); 트립토판(W); 타이로신(Y); 프롤린(P); 히스티딘(H); 글루탐산(E); 글루타민(Q); 아스파라긴(N); 라이신(K); 및 아르기닌(R) 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 치환을 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 하나 이상의 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열의 위치 (D)에서 표 1에 나타낸 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 돌연변이가 VLS를 촉진시키는 이의 능력을 감소시킬 것으로 사료된다.
그룹 이소루이신(I); 페닐알라닌(F); 시스테인/시스틴(C); 메티오닌(M); 알라닌(A); 글라이신(G); 트레오닌(T); 트립토판(W); 타이로신(Y); 프롤린(P); 히스티딘(H); 글루탐산(E); 글루타민(Q); 아스파르트산(D); 아스파라긴(N); 라이신(K); 및 아르기닌(R) 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 치환을 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 하나 이상의 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열의 위치 (y)에서 표 1에 나타낸 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 돌연변이가 VLS를 촉진시키는 이의 능력을 감소시킬 것으로 사료된다.
(x)D(y) 서열의 (x) 또는 (y) 잔기의 측면에 위치한 아미노산은 또한 VLS를 촉진시키는 이의 능력에 기여할 수 있다. 예를 들면, 그룹 이소루이신(I); 발린(V); 루이신(L); 페닐알라닌(F); 시스테인/시스틴(C); 메티오닌(M); 알라닌(A); 글라이신(G); 트레오닌(T); 세린(S); 트립토판(W); 타이로신(Y); 프롤린(P); 히스티딘(H); 글루탐산(E); 글루타민(Q); 아스파르트산(D); 아스파라긴(N); 라이신(K); 및 아르기닌(R) 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 치환을 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 하나 이상의 (x)D(y)T 서열의 위치 T에 표 1에 나타낸 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 돌연변이가 VLS를 촉진하는 이의 능력을 감소시킬 것으로 사료된다.
추가로 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열의 N- 또는 C-말단 측면 서열내의 하나 이상의 돌연변이, 화학적 변형, 이동 또는 다른 변형이 또한 VLS를 촉진시키는 능력이 감소된 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 초래할 수 있을 것으로 예상된다. 바람직하게는, 이러한 돌연변이 또는 변형이 활성 부위에 영향을 주지 않는 하나 이상의 잔기내에서 일어나야 할 것이다. 다른 양태에서, 당해 돌연변이 또는 변형은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 또는 N-말단 및/또는 C-말단으로부터 (x)D(y) 트리펩타이드 서열까지의 하나 이상의 잔기에서 발생할 것이다. 다른 측면에서, (x)D(y) 트리펩타이드에 인접하지 않은 하나 이상의 잔기가 (x)D(y) 모티프의 기능에 기여할 수 있다. 이러한 잔기는 본원에 기술된 바와 같이, 그리고 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 3차원 모형의 트리펩타이드 서열에 대한 이들의 근접성에 의해 확인될 수 있으며 측면 서열의 일부로서 변형시키고자 한다. 이러한 변형은 하나 이상의 "야생형" 측면 잔기가 변형, 제거, 이동, 화학적으로 변형되는 등에 한해서는, (x)D(y) 및 (x)D(y)T 서열의 변형에 대해 상기한 것들 중 어떠한 것이라도 포함할 수 있다.
VLS를 유발하는 능력이 감소된, 본 발명의 방법을 사용하여 제조한 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드는 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열을 함유하는 조성물에 의해 제조된 VLS에 대한 보호제로서 제공되도록 적용될 수 있다. 이러한 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드는 (x)D(y) 및/또는 (x)D(y)T 서열의 활성을 차단하는 억제제로서 제공될 수 있을 것으로 예상된다. 추가로, 이러한 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드는 VLS를 초래하는 능력이 감소된 IT를 제조하는데 사용될 수 있다.
1. 돌연변이유발
특정 측면에서, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산의 돌연변이유발을 사용하여 VLS, 아폽토시스 또는 (x)D(y) 및 측면 서열과 연관된 다른 효과를 촉진시키는 조성물의 능력을 향상 또는 감소시키기 위한 목적하는 돌연변이를 제조할 수 있다. 돌연변이유발은 본원에 개시되거나 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행할 수 있다.
한가지 특별히 유용한 돌연변이유발 기법은 다수의 잔기를 아미노산 알라닌으로 개별적으로 치환하여 단백질 형태에 대규모의 혼란 위험을 최소화시키면서 측쇄 상호작용의 손실 효과를 측정할 수 있는 알라닌 스캐닝(alanine scanning) 돌연변이유발이다(문헌[참조: Cunningham et al., 1989]).
특정 아미노산을 표적화할 수 있기 때문에, 부위-특이적 돌연변이유발은 DNA를 기초로 한 특이적 돌연변이를 통한 개별 펩타이드 또는 생물학적 기능이 동등한 단백질 또는 펩타이드의 제조에 유용한 기법이다. 당해 기법은 추가로 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 변화를 DNA로 도입함으로써 하나 이상의 전술한 고려사항을 포함하는 서열 변형체를 제조 및 시험하는데 용이한 능력을 제공한다. 부위-특이적 돌연변이유발은 목적하는 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특이적 올리고뉴클레오타이드 서열 및 충분한 수의 인접한 뉴클레오타이드의 사용을 통해 돌연변이체를 제조하여 돌연변이 부위를 가로지르는 양면상에 안정한 이중쇄를 형성할 있는 충분한 크기 및 서열 복잡성의 프라이머 서열을 제공할 수 있게 한다. 통상, 변형시킬 서열의 이음부의 양면상에 약 약 5개 내지 약 10개의 잔기를 갖는 길이가 약 17 내지 25뉴클레오타이드인 프라이머가 바람직하다.
일반적으로, 부위-특이적 돌연변이유발 기법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 인식하게 될 바와 같이, 당해 기법은 통상 단쇄 및 이중쇄 형태 둘 다로 존재하는 박테리오파아지 벡터를 사용한다. 부위-지시적 돌연변이유발에 유용한 통상의 벡터는 M13 파아지와 같은 벡터를 포함한다. 이들 파아지 벡터는 시판되고 있으며 이들의 용도는 일반적으로 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 이중쇄 플라스미드 또한 부위 지시적 돌연변이유발에 흔히 사용되며, 이는 파아지로부터 플라스미드로 대상 유전자를 전달하는 단계를 제외한다.
일반적으로, 부위-지시적 돌연변이는 우선 단쇄 벡터를 수득하거나 목적하는 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 자체 서열 내에 포함하는 이본쇄 벡터의 2가닥의 쇄를 풀음으로써 수행한다. 목적하는 돌연변이된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성적으로 제조한다. 이어서 당해 프라이머를 단쇄 DNA 제제에 연결하고 이.콜라이 폴리머라제 I 클레노우(Klenow) 단편과 같은 DNA 중합 효소에 적용시켜 돌연변이-함유 쇄의 합성을 완료한다. 이와 같이, 하나의 쇄는 원래의 돌연변이되지 않은 서열을 암호화하고 제2의 쇄는 목적하는 돌연변이를 포함하는 이종이중쇄를 형성한다. 이어서 이러한 이종이중쇄 벡터를 이.콜라이 세포와 같은 적합한 세포를 형질전환시키기 위해 사용하고, 돌연변이 서열 정렬을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선별한다. 대안적으로, 한쌍의 프라이머를 이본쇄 벡터의 두가닥의 개별 쇄에 연결시켜 PCRTM 반응으로 목적하는 돌연변이(들)을 갖는 상응하는 상보적 쇄 둘 다를 동시에 합성할 수 있다.
부위-지시적 돌연변이를 사용하는 선택된 유전자의 서열 변형체의 제조는 잠정적으로 유용한 종을 생산하는 수단으로서 제공될 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 유전자의 서열 변형체를 수득할 수 있는 다른 방법으로서 제공될 수 있다. 예를 들면, 목적하는 유전자를 암호화하는 재조합 벡터를 하이드록실아민과 같은 돌연변이유발 제제로 처리하여 서열 변형체를 수득할 수 있다.
2. 재조합 벡터, 숙주 세포 및 발현
용어 "발현 벡터 또는 작제물"는 서열을 암호화하는 핵산 중 일부 또는 모두가 전사될 수 있는 유전자 생성물을 암호화하는 핵산을 함유하는 임의의 유형의 유전자 작제물을 의미한다. 전사체가 단백질로 해독될 수 있지만, 이는 필요하지 않을 수도 있다. 따라서, 특정 양태에서, 발현은 유전자의 전사 및 RNA의 유전자 생성물로의 해독 둘 다를 포함한다. 다른 양태에서, 발현은 오직 핵산의 전사(예를 들면, 안티센스(antisense) 작제물을 제조하기 위한)만을 포함한다.
특히 유용한 벡터는 전체 길이 단백질, 폴리펩타이드 또는 보다 작은 펩타이드 중 어느 것을 암호화하던지간에 DNA 단편의 암호화 부위가 프로모터의 전사 조절하에 위치한 이들 벡터인 것으로 사료된다. "프로모터"는 세포의 합성 기작에 의해 인식되거나 합성 기작을 도입하고, 유전자의 특이적 전사를 개시하는데 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 구 "작동적으로 위치한", "조절 하" 또는 "전사 조절 하"는 당해 프로모터가 유전자 생성물을 암호화하는 핵산과 관련되어 RNA 폴리머라제 개시 및 당해 유전자의 발현을 조절하기에 올바른 위치 및 방향에 있음을 의미한다.
당해 프로모터는 유전자와 천연적으로 연관된 프로모터의 형태일 수 있으며, 본원에 개시한 조성물과 관련된, 암호화 단편 또는 엑손의 상부에 위치한 5' 비암호화 서열을 분리함으로써(예를 들면, 재조합 복제 및/또는 PCRTM 기법을 사용하여)수득할 수 있다(PCRTM 기법은 각각 본원에 참조로서 인용된, 미국 특허 제4,683,202호 및 미국 특허 제4,682,195호에 개시되어 있다).
다른 양태에서, 재조합체 또는 이종성 프로모터의 제어하에 암호화 DNA 단편을 위치시킴으로써 특정한 이점을 얻을 수 있을 것으로 사료된다. 본원에 사용된 바와 같은 재조합체 또는 이종성 프로모터는 정상적으로는 이의 자연 환경에서 유전자와 연관되지 않은 프로모터를 지칭하고자 하는 것이다. 이러한 프로모터는 다른 유전자와 정상적으로 연관된 프로모터, 및/또는 임의의 세균, 바이러스, 진핵세포 또는 포유동물 세포로부터 분리된 프로모터, 및/또는 "천연적으로 발생"되지 않은, 사람에 의해 제조된 프로모터(즉, 상이한 프로모터로부터의 상이한 요소 또는 발현을 증가, 감소 또는 변형시키는 돌연변이를 함유하는)를 포함할 수 있다.
천연적으로, 발현용으로 선택된, 세포 유형, 개체 또는 심지어 동물에서 DNA 단편의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터를 사용하는 것이 중요할 것이다. 단백질 발현을 위한 프로모터 및 세포 유형 배합의 용도가 분자 생물학 분야의 숙련가에게 일반적으로 공지되어 있다(예를 들면, 본원에 참조로서 인용되어 있는 문헌[참조: Smbrook et al., (1989)]. 사용된 프로모터는 항상성이거나 유도성일 수 있으며 도입된 DNA 단편의 고수준의 발현을 지시하는 적합한 조건하에서 사용될 수 있으며, 이는 재조합 단백질 또는 펩타이드의 대규모 생산에 유리하다.
일반적으로 프로모터 내의 하나 이상의 분자가 RNA 합성을 위한 개시 부위에 위치하도록 작용한다. 이의 가장 널리 공지된 예는 TATA 박스이지만, TATA 박스가 결핍된 일부 프로모터(예를 들면, 포유동물 말단 디옥시뉴클레오타이드 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 후기발현 유전자(SV40 late gene)에 대한 프로모터)에서 개시 위치 그 자체를 덮는 분산 요소가 개시 위치를 고정시키는데 도움을 준다.
추가의 프로모터 원소가 전사 개시의 빈도를 조절한다. 통상, 이들은 개시 위치의 30 내지 110bp 상부 영역내에 위치하지만, 다수의 프로모터가 개시 위치의 하부에 또한 기능적 요소를 포함하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소 사이의 공간은 흔히 유연하여, 요소가 다른 요소에 비하여 역전되거나 이동되는 경우, 프로모터의 기능이 유지될 수 있다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 공간은 활성이 감소되기 시작하기 전 50bp 떨어지도록 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성화시키기 위해 동시 작동적으로 또는 독립적으로 작용할 수 있다.
핵산의 발현을 제어하기 위해 사용되는 특정한 프로모터는 표적 세포에서 핵산을 발현시킬 수 있는 한, 결정적이지 않은 것으로 사료된다. 따라서, 사람 세포를 표적으로 하는 경우, 이는 사람 세포에서 발현될 수 있는 프로모터에 인접하거나 이의 제어 하에 있는 핵산 암호화 영역에 위치하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 이러한 프로모터는 사람 또는 바이러스 프로모터를 포함할 수 있다.
발현에는 통상 전사체의 적합한 폴리아데닐화를 초래하는 폴리아데닐화 시그날이 포함될 것이다. 폴리아데닐화 시그날의 특성은 본 발명의 성공적 실행에 중요하지 않은 것으로 사료되며, 임의의 이러한 서열을 사용할 수 있다. 바람직한 양태는 SV40 폴리아데닐화 시그날 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그날을 포함하며, 각종 표적 세포에서 사용하기에 편리하며 잘 작용하는 것으로 공지되어 있다. 또한 발현 카세트(cassette)의 요소로서 터미네이터가 고려된다. 이들 요소는 제공되어 메세지 수준을 증가시키고 카세트로부터 다른 서열로의 판독을 최소화시킬 수 있다.
특이적 개시 시그날이 또한 암호화 서열의 효율적인 해독을 위해 필요할 수 있다. 이들 시그날은 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 해독 조절 시그날이 제공될 필요가 있을 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 이를 용이하게 판단하여 필요한 시그날을 제공할 수 있다. 개시 코돈은 목적하는 암호화 서열의 판독 프레임과 함께 프레임내("in-frame")위치하여 전체 삽입물의 해독을 보장할 수 있어야 하는 것으로 공지되어 있다. 외인성 해독 조절 시그날 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 발현 효율은 적합한 전사 인핸서 요소의 포함에 의해 증진될 수 있다.
단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 다른 선택된 단백질과 함께 동시 발현될 수 있으며, 여기서 당해 단백질은 동일한 세포 내에서 동시 발현될 수 있으며 유전자(들)은 이미 다른 선택된 단백질을 갖는 세포에 제공될 수 있다. 동시 발현은 2개의 구별되는 재조합 벡터(각각은 각각의 DNA 중 하나의 복사체를 포함한다)를 사용하여 세포를 동시-형질감염시킴으로써 수행할 수 있다. 대안적으로, 단일 재조합 벡터를 단백질 둘 다에 대한 암호화 영역을 포함하도록 작제한 후, 이를 단일 벡터로 형질감염시킨 세포내에서 발현시킬 수 있다. 어떠한 상황에서도, 본원에 사용된 용어 "동시 발현"은 유전자(들) 및 동일한 재조합체 세포내의 다른 선택된 단백질 둘 다의 발현을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조작된" 및 "재조합" 세포 또는 숙주 세포는 cDNA 또는 단백질을 암호화하는 유전자와 같은 외인성 DNA 단편 또는 유전자가 도입된 세포를 지칭하고자 하는 것이다. 따라서, 조작된 세포를 재조합적으로 도입된 외인성 DNA 단편 또는 유전자를 함유하지 않는 천연적으로 발생된 세포와 구분할 수 있다. 따라서 조작된 세포는 인공적으로 도입된 유전자를 갖는 세포이다. 재조합 세포는 도입된 cDNA 또는 유전체 유전자를 갖는 세포를 포함하며, 또한 특정한 도입 유전자와 천연적으로 연관되지 않은 프로모터에 인접하게 위치한 유전자를 포함한다.
재조합 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 발현시키기 위해, 돌연변이체이던 야생형이던간에, 본 발명에 따라 하나 이상의 프로모터의 제어하에 야생형 또는 돌연변이체 단백질-암호화 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제조해야 한다. 프로모터의 "제어 하에" 암호화 서열을 두기 위해, 하나는 일반적으로 선택된 프로모터의 약 1 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 "하부"(즉, 3')에 위치한 전사 판독 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단에 위치시킨다. "상부" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하며 암호화된 재조합 단백질의 발현을 촉진시킨다. 이는 본원에서 "재조합체 발현"을 의미한다.
많은 표준 기법을 사용하여 적합한 핵산 및 전사/해독 조절 서열을 함유하는 발현 벡터를 작제하여 각종 숙주-발현 시스템에서 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 발현시킬 수 있다. 발현을 가능하게 하는 세포 유형에는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 이.콜라이 및 비.서브틸리스(B. subtilis)와 같은 세균이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
원핵 숙주의 특정한 예는 이. 콜라이 균주 RR1, 이. 콜라이 LE392, 이. 콜라이 B, 이 콜라이 X 1776(ATCC 제31537호) 및 이. 콜라이 W3110(F-, 람다-, 자가영향체, ATCC 제273325호); 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리; 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)와 같은 기타 장내세균 및 각종 슈도모나스(Pseudomonas) 종이다.
일반적으로, 숙주 세포와 화합성인 종으로부터 유래한 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터를 이들 숙주와 함께 사용한다. 보통, 당해 벡터는 복제 부위 및 형질전환 세포에 표현형적 선별을 제공할 수 있는 표지 서열을 수반한다. 예를 들면, 이. 콜라이는 흔히 이. 콜라이 종으로부터 유래한 플라스미드인 pBR322의 유도체를 사용하여 형질전환시킨다. pBR322는 암피실린 및 테트라사이클린 내성을 위한 유전자를 함유하며 따라서 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR 플라스미드 또는 기타 미생물 플라스미드 또는 파아지는 또한 그 자체의 단백질의 발현을 위한 미생물 개체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 함유하도록 변형시킬 수 있다.
추가로, 숙주 미생물과 화합성인 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 파아지 벡터를 이들 숙주와 함께 형질전환 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 파아지 람다 GEMTM-11은 이. 콜라이 LE392와 같은 숙주 세포를 형질전환시키기 위해 사용할 수 있는 재조합 파아지 벡터를 제조하는 데 사용될 수 있다.
추가의 유용한 벡터는 이후의 정제 및 분리 또는 절단을 위한 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 가용성 융합 단백질을 생산하는 데 사용하기 위한 pIN 벡터(문헌[참조: Inouye et al., 1985]); 및 pGEX 벡터를 포함한다. 다른 적합한 융합 단백질은 β-갈락토시다제, 유비퀴틴 등을 갖는 것들이다.
재조합 DNA 작제에 가장 흔하게 사용되는 프로모터는 β-락타마제(페니실리나제), 락토스 및 트립토판(trp) 프로모터계를 포함한다. 이들이 가장 흔하게 사용되는 반면, 다른 미생물 프로모터가 발견 및 사용되어 왔으며, 이들의 뉴클레오타이드 서열에 관한 세부사항이 공보되어 당해 분야의 숙련가는 이들을 플라스미드 벡터와 기능적으로 연결할 수 있게 되었다.
이. 콜라이와 같은 세균성 세포에서의 재조합 단백질 제조에 관한 다음의 세부사항은 일반적인 재조합 단백질 제조에 대한 예시적 정보로서 제공되며, 특정 재조합 발현 시스템에 대한 조정이 당해 분야의 숙련가에게 공지될 것이다.
발현 벡터를 함유하는 세균성 세포(예를 들면, 이. 콜라이)를 많은 적합한 배지 중 임의의 배지(예를 들면, LB)에서 배양한다. 재조합 단백질의 발현은 예를 들면, 배지에 IPTG를 첨가하거나 항온처리 온도를 고온으로 교환함으로써 유도될 수 있다. 추가의 시간, 일반적으로 2 내지 24시간 동안 세균을 배양 한 후, 세포를 원심분리에 의해 수집하고 세척하여 잔여 배지를 제거한다.
이어서 세균성 세포를 용해(예를 들면, 세포 파쇄기에서 파쇄시켜)하고 원심분리하여 밀집된 봉입체 및 세포 막을 가용성 세포 성분으로부터 분리한다. 당해 원심분리는 밀집된 봉입체가 당(예를 들면, 슈크로스)의 완충액으로의 혼입에 의해 선택적으로 강화되어 있는 환경 하에서 선택적 속도로 수행할 수 있다.
많은 예 중 한 경우로서, 재조합 단백질이 봉입체 내에서 발현되는 경우, 이들을 몇가지 용액 중 임의의 용액으로 세척하여 일부 오염된 숙주 단백질을 제거한 후, 환원제(예를 들면, β-머캅토에탄올 또는 DTT(디티오트레이톨))의 존재 하에 고농도의 요소(예를 들면, 8M) 또는 구아니딘 하이드로클로라이드와 같은 무질서유발제(chaotropic agent)를 함유하는 용액에 용해시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 "과발현", 즉, 세포내에서의 이의 고유 발현에 비하여 증가된 수준으로 발현될 수 있다. 이러한 과발현은 방사선-표지 및/또는 단백질 정제를 포함하는 각종 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 단순하고 직접적인 방법이 바람직하며, 예로는, SDS/PAGE 및 단백질 염색 또는 웨스턴 블롯팅 후 수득한 겔 또는 블롯의 농도계측 스캐닝과 같은 정량 분석을 포함하는 방법이 있다. 천연 세포에서의 수준과 비교하여 재조합 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 수준의 특이적 증가는 과발현을 나타내는 것이며, 숙주 세포에 의해 생산되고 예를 들면, 겔 상에 가시화되어 있는 다른 단백질에 비해 특정 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 상대적으로 풍부하다는 것이다.
3. 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드
본 발명은 또한 정제된, 그리고 바람직한 양태에서는 실질적으로 정제된 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "정제된 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드"는 포유동물 세포 또는 재조합 숙주 세포로부터 분리될 수 있는 단백질성 조성물을 지칭하며, 여기서, 하나 이상의 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 이의 천연적으로 수득가능한 상태에 비한(즉, 세포 추출물 내의 이의 순도에 비한) 임의의 정도로 정제된다. 따라서 정제된 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 야생형 또는 천연적으로 발생한 환경에는 없는 돌연변이 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 또한 지칭한다.
각종 유전자에 대한 뉴클레오타이드 및 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드 서열은 이미 공개되어 있으며 당해 분야의 숙련가에게 공지된 컴퓨터 처리된 데이타베이스에서 찾을 수 있다. 이러한 데이타베이스 중 하나는 기관[National Center for Biotechnology Information's Genbank and GenPept databases(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)]이다. 이들 공지된 유전자에 대한 암호화 영역을 본원에 개시된 기법 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 기법을 사용하여 증폭시키고/거나 발현시킬 수 있다. 추가로, 펩타이드 서열을 자동화 펩타이드 합성 기계{예를 들면, 제조원[Applied Biosystems(Foster City, CA)]으로부터 구입할 수 있는}를 사용한 펩타이드 합성과 같은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 합성할 수 있다.
일반적으로, "정제된"은 각종 다른 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 제거하기 위해 분획화시킨 특정한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 조성물을 지칭할 것이며, 여기서 조성물은 측정될 수 있는 바와 같이(예를 들면, 단백질 검정에 의해), 하기한 바와 같이 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 실질적으로 목적하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대한 이의 활성을 유지한다.
용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이는 특정한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 당해 조성물의 주요 성분을 형성하는(예를 들면, 당해 조성물 중 약 50% 또는 그 이상의 단백질을 구성) 조성물을 지칭한다. 바람직한 양태에서, 실질적으로 정제된 단백질은 당해 조성물 내의 단백질의 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상을 구성할 것이다.
본 발명에 적용된 바와 같은, "균질화되도록 정제된" 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 당해 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이 다른 단백질 및 생물학적 성분이 실질적으로 없는 수준의 순도를 가짐을 의미한다. 예를 들면, 정제된 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 흔히 다른 단백질 성분이 충분히 제거되었기 때문에 분해적 서열화가 성공적으로 수행될 수 있다.
단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 정제 정도를 정량하는 각종 방법이 본원을 고려하여 당해 분야의 숙련가에게 공지될 것이다. 이들은 예를 들면, 분획의 특정 단백질 활성의 측정 또는 겔 전기영동에 의한 분획 내의 다수의 폴리펩타이드의 측정을 포함한다.
목적하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 정제하기 위해, 최소한 일부 특정한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 천연 또는 재조합 조성물을 분획화시켜 당해 조성물로부터 각종 다른 성분을 제거할 것이다. 아래에 상세히 기술한 이들 기법 외에, 단백질 정제에 사용하기에 적합한 각종 다른 기법이 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지될 것이다. 이들은 예를 들면, 황산암모늄, PEG, 항체 등을 사용한 침전 또는 가열 변성 후의 원심분리에 의한 침전; 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록실아파타이트, 렉틴 친화성 및 기타 친화성 크로마토그래피 단계와 같은 크로마토그래피 단계; 등전 집속; 겔 전기영동; 및 이러한 기법 및 다른 기법의 조합을 포함한다.
다른 예는 특이적 결합 상대자를 사용한 특이 융합 단백질의 정제이다. 이러한 정제 방법은 당해 분야에 통상적인 것이다. 본 발명이 특정 단백질에 대한 DNA 서열을 제공하기 때문에, 임의의 융합 단백질 정제 방법을 현재 실행할 수 있다. 이는 특정 단백질-글루타티온 S-트랜스퍼라제 융합 단백질의 제조, 이. 콜라이에서의 발현 및 글루타티온-아가로스 상에서의 친화성 크로마토그래피를 사용한 균질화를 위한 분리 또는 당해 단백질의 N- 또는 C-말단 상의 폴리히스티딘 표지의 제조 및 Ni-친화성 크로마토그래피를 사용한 연속한 정제로 예시된다. 그러나, 주어진 많은 DNA 및 단백질이 공지되어 있거나 본원에 기술한 방법을 사용하여 동정 및 증폭시킬 수 있으며, 임의의 정제 방법이 현재 사용될 수 있다.
특정 양태에 사용하기에 바람직하더라도 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 항상 이들의 최대 정제 상태로 제공될 필요는 없다. 사실, 보다 덜 실질적으로 정제된 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드(그럼에도 불구하고 자연 상태에 비교하여 목적하는 단백질 조성물 내에 풍부한)가 특정 양태에서 유용성을 가질 것으로 사료된다.
보다 낮은 정도의 상대적 정제를 나타내는 방법은 단백질 생성물의 총 회수 또는 발현된 단백질의 활성 유지에 이점을 가질 수 있다. 또한 불활성 생성물도 특정 양태(예를 들면, 항체 생성을 통한 면역원성 측정)에서 유용성을 갖는다.
4. 항체
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 임의의 면역학적 결합제를 폭넓게 지칭한다. 일반적으로, IgG 및/또는 IgM이 바람직한데, 이들이 생리학적 상태에서 가장 흔한 항체이며 실험 설비 중 가장 용이하게 제조될 수 있기 때문이다.
용어 "항체"는 항원 결합 영역을 갖는 임의의 항체-유사 분자를 지칭하기 위해 사용되며, Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체(DABs), Fv, scFv(단일쇄 Fv) 등과 같은 항체 단편을 포함한다. 각종 항체-기초 작제물 및 단편의 제조 및 사용 기법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 항체의 제조 및 특성화 방법도 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다(본원에 참조로서 인용되어 있는 문헌[참조: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]).
모노클로날 항체(MAb)는 특정한 이점(예를 들면, 생산성 및 대량 생산)을 가지는 것으로 인식되어 있으며, 이들의 사용이 일반적으로 바람직하다. 따라서 본 발명은 사람, 쥐, 원숭이, 랫트, 햄스터, 토끼 및 심지어 닭 기원의 모노클로날 항체를 제공한다. 시약 제조의 용이성 및 용이한 사용가능성에 기인하여, 흔히 쥐 모노클로날 항체가 바람직할 것이다.
그러나, 사람 불변 및/또는 가변영역 도메인을 포함하는, 마우스, 랫트 또는 다른 종으로부터의 키메라 항체, 양특이성 항체, 재조합 및 조작 항체 및 이의 단편과 같은 "사람화된" 항체가 또한 고려된다. 환자의 질병에 대해 "개인 맞춤"(custom-tailored)된 항체의 개발 방법이 또한 공지되어 있으며 이러한 개인 맞춤 항체가 또한 고려된다.
모노클로날 항체(MAb)의 제조방법은 일반적으로 폴리클로날 항체의 제조 방법과 동일한 선상에서 시작된다. 간단히, 폴리클로날 항체는 동물을 면역원성 단백질 조성물을 사용하여 면역화시키거나 본 발명에 따른 표적 항원결정인자를 포함시키고 면역화된 동물로부터 항혈청을 수집함으로써 제조된다.
또한 당해 분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 특정 면역원 조성물의 면역원성은 보조제로 공지된 면역 반응의 비특이적 자극제의 사용에 의해 증강시킬 수 있다. 적합한 보조제는 모든 허용가능한 면역자극성 화합물(예를 들면, 사이토킨, 독소 또는 합성 조성물)을 포함한다.
사용될 수 있는 보조제는 IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, γ-인터페론, GMCSP, BCG, 수산화알루미늄, MDP 화합물(예를 들면, thur-MDP 및 nor-MDP), CGP(MTP-PE), 지질 A, 및 모노포스포릴 지질 A(MPL)을 포함한다. 2% 스쿠알렌/Tween 80 유제 중 세균으로부터 추출된 3가지 성분, MPL, 트레할로스 디미콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS)을 함유하는 RIBI가 또한 고려된다. MHC 항원도 사용될 수 있다. 예시적으로, 흔히 바람직한 보조제는 완전 프로인트 보조제(치사된 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 함유하는 비특이적 면역 반응 자극제), 불완전 프로인트 보조제 및 수산화알루미늄 보조제를 포함한다.
보조제 외에, T 세포 면역을 상향조절하거나 억제 세포 활성을 하향조절하는 것으로 알려진 생물학적 반응 변형제(BRM)을 동시투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 BRM은 시메티딘(CIM; 1200mg/d)(Smith/Kline, PA); 저용량 사이클로포스파미드(CYP; 300mg/m2)(Jhonson/Mead, NJ), 사이토킨(예를 들면, γ-인터페론, IL-2 또는 IL-12) 또는 B-7과 같은 면역 보조 기능을 수행하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
MAb는 본원에 참조로서 인용되어 있는 미국 특허 제4196,265호에 예시되어 있는 바와 같은 널리 공지된 기법을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 통상, 당해 기법은 야생형 또는 돌연변이체 조성물인 선택된 면역원 조성물(예를 들면, 정제되거나 부분적으로 정제된 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 도메인)을 사용하여 적합한 동물을 면역화시킴을 포함한다. 면역화 조성물을 항체 생산 세포를 자극하는 데 효과적인 방법으로 투여한다.
모노클로날 항체(MAb)를 제조하는 방법은 일반적으로 폴리클로날 항체의 제조방법과 동일한 선상에서 시작한다. 마우스 및 랫트와 같은 쥐가 바람직한 동물이지만, 토끼, 양 또는 개구리 세포도 또한 사용 가능하다. 랫트의 사용은 특정한 이점을 제공하지만(문헌[참조: Goding, 1986, pp. 60-61]), 마우스가 바람직하며, BALB/c 마우스가 가장 통상적으로 사용되어 일반적으로 높은 퍼센트의 적합한 융합을 제공하기 때문에 가장 바람직하다.
일반적으로 당해 동물에 상기한 바와 같은 항원을 주사한다. 필요에 따라, 항원을 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌과 같은 담체 분자에 커플링시킬 수 있다. 통상 당해 항원을 프로인트 완전 또는 불완전 보조제와 같은 보조제와 혼합시킨다. 동일한 항원을 사용한 추가접종을 대략 2주 간격으로 수행한다.
면역화 후, MAb 생산 프로토콜에 사용하기 위해 항체 생산 잠재능을 갖는 체세포, 특히 B 림프구(B 세포)를 선별한다. 이들 세포는 생체조직검사된 비장, 편도 또는 림프 결절로부터 또는 말초 혈액 샘플로부터 수득할 수 있다. 비장 세포 및 말초 혈액 세포가 바람직한데, 이는 비장 세포는 분할중인 형질모세포 단계인 항체-생산 세포의 풍부한 원료이기 때문이며, 말초 혈액세포는 용이하게 수득할 수 있기 때문이다.
흔히, 동물의 패널을 면역화시키고 최고 항체 역가를 갖는 동물의 비장을 제거하여 주사기로 비장을 균질화시켜 비장 림프구를 수득한다. 통상, 면역화된 마우스로부터의 비장은 대략 5 ×107 내지 2 ×108개의 림프구를 포함한다.
이어서 면역화된 동물로부터의 항체-생산 B 림프구를 일반적으로 면역화시킨 동물과 동일한 종의 불멸 골수종 세포와 융합시킨다. 하이브리도마-생산 융합 과정에 사용하기에 적합한 골수종 세포주는 바람직하게는 항체를 생산하지 않으며, 고도의 융합 효율을 가지며, 오직 목적하는 융합 세포(하이브리도마)의 성장만을 지지하는 특정한 선택 배지에서 성장할 수 없게 하는 효소 결함을 갖는다.
다수의 골수종 세포 중 임의의 하나를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 사용할 수 있다(문헌[참조: Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp.75-83, 1984]). 예를 들면, 면역화된 동물이 마우스인 경우, P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp2/0-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XXO Bul를 사용할 수 있으며; 랫트인 경우, R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210을 사용할 수 있고; U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6은 사람 세포 융합과 관련되어 모두 유용하다.
한가지 바람직한 쥐 골수종 세포는 NS-1 골수종 세포주(또한 P3-NS-1-Ag4-1로 지칭됨)이며, 세포주 보관번호 제GM3573호를 요청하여 NIGMS 사람 유전자 돌연변이체 세포 보관소(Human Genetic Mutant Cell Reposiotry)에서 용이하게 구입할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 마우스 골수종 세포주는 8-아자구아닌-내성 마우스 쥐 골수종 SP2/0 비생산자 세포주이다.
항체-생산 비장 또는 림프 결절 세포와 골수종 세포의 하이브리드를 제조하는 방법은 일반적으로 세포막의 융합을 촉진시키는 제제(화학적 또는 전기적)의 존재하에 체세포와 골수종 세포를 2:1 비율(당해 비율은 각각 약 20:1 내지 약 1:1로 다양할 수 있다)로 혼합함을 포함한다. 센다이(Sendai) 바이러스를 사용하는 융합 방법이 Kohler와 Milstein(1975; 1976)에 의해 기술되어 있으며, 37%(v/v) PEG와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용한 방법은 Gefter 등(1997)에 의해 기술되어 있다. 전기적으로 유도된 융합 방법의 사용이 또한 적합하다(문헌[참조: Goding pp. 71-74, 1986]).
일반적으로 융합 과정은 약 1 ×10-6 내지 1 × 10-8의 낮은 빈도로 생존가능한 하이브리드를 생산한다. 그러나, 이는 생존가능한 융합 하이브리드가 선택 배지에서 배양됨으로써 모세포인 비융합 세포(특히 일반적으로 비한정적으로 분열을 계속하는 비융합 골수종 세포)로부터 분화되기 때문에 난제가 아니다. 선택 배지는 일반적으로 조직 배양 배지내에서의 뉴클레오타이드의 신생(de novo) 합성을 막는 제제를 함유하는 것이다. 예시적인 바람직한 제제는 아미노프테린, 메토트렉세이트 및 아자세린이다. 아미노프테린 및 메토트렉세이트는 퓨린 및 피리미딘 둘 다의 신생 합성을 막는 반면, 아자세린은 오직 퓨린의 합성만을 막는다. 아미노프테린 또는 메토트렉세이트를 사용하는 경우, 당해 배지에는 뉴클레오타이드의 원료로서 하이포크산틴 및 티미딘을 보충한다(HAT 배지). 아자세린을 사용하는 경우, 당해 비지에는 하이포크산틴을 보충한다.
바람직한 선택 배지는 HAT이다. 오직 뉴클레오타이드 구제(salvage) 경로를 작동시킬 수 있는 세포만이 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 골수종 세포는 구제 경로의 주요 효소, 예를 들면, 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT)에 결함이 있기 때문에 생존할 수 없다. B 세포는 이러한 경로를 작동시킬 수 있지만, 이들은 배양 중 제한된 생존 수명을 가지며 일반적으로 약 2주 내에 치사된다. 따라서, 선택 배지에서 생존할 수 있는 유일한 세포는 골수종 및 B 세포로부터 형성된 이들 하이브리드이다.
이러한 배양은 특정한 하이브리드가 선택되는 하이브리도마 집단을 제공한다. 통상, 미세역가 플레이트에서 단일-클론 희석에 의해 세포를 배양한 후, 개별 클론 상층액을 목적하는 반응성에 대해 시험(약 2주 내지 3주 후)함으로써 하이브리도마를 선택한다. 방사선면역검정, 효소 면역검정, 세포독성 검정, 플라크 검정, 돗트 면역결합 검정 등과 같은 검정은 민감하며 간단하고 빠르다.
이어서 선택된 하이브리도마를 연속적으로 희석하고 개별 항체-생산 세포주 내로 클로닝시키는데, 이어서 당해 클론들을 비제한적으로 증식시켜 MAb를 생산할 수 있다. 당해 세포주를 2가지 기본적 방법으로 MAb 제조를 위해 사용할 수 있다. 첫째, 하이브리도마의 샘플을 본 융합(예를 들면, 동계 마우스)을 위한 체세포 및 골수종세포를 제공하기 위해 사용한 유형의 조직적합 동물에 주사(흔히 복강으로)할 수 있다. 대안적으로, 당해 동물을 탄화수소, 특히 프리스탄(테트라메틸펜타데칸)과 같은 오일로 초회감작시킨 후 주사한다. 주사된 동물은 융합 세포 하이브리드에 의해 제조된 특이적 모노클로날 항체를 분비하는 종양을 발달시킨다. 이어서 혈청 또는 복수와 같은 동물의 체액을 빼내어 고농도의 Mab를 수득한다. 둘째, 개별 세포주를 시험관내에서 배양할 수 있는데, 여기서 MAb가 천연적으로 배양 배지로 분비되어 이들을 고농도로 용이하게 수득할 수 있다.
어느 방법으로 생산된 MAb든지 필요에 따라, 여과, 원심분리 및 각종 크로마토그래피 방법(예를 들면, HPLC 또는 친화성 크로마토그래피)을 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체의 단편을 펩신 또는 파파인과 같은 효소를 사용한 분해를 포함한 방법 및/또는 화학적 환원에 의한 디설파이드 결합의 절단에 의해 생산된 모노클로날 항체로부터 수득할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 포함되는 모노클로날 항체 단편은 자동화 펩타이드 합성기를 사용하여 합성할 수 있다.
또한 분자적 클로닝 방법을 사용하여 모노클로날 항체를 생산할 수 있다고 사료된다. 이를 위해, 조합 면역글로불린 파지미드 라이브러리를 면역화된 동물의 비장으로부터 분리된 RNA로부터 제조하고, 적합한 항체를 발현하는 파지미드를 항원 및 제어 세포를 발현하는 세포를 사용하여 패닝(panning)시킴으로써 선별한다. 이러한 방법의 이점은 통상적인 하이브리도마 기법 이상으로, 1회에 약 104배의 항체가 생산되어 스크리닝될 수 있으며, H 및 L쇄 조합에 의해 적합한 항체의 발견 기회를 추가로 증가시키는 신규한 특이성이 초래될 수 있다는 것이다.
대안적으로, 본 발명에 포함되는 모노클로날 항체 단편은 자동화 펩타이드 합성기를 사용하거나 이. 콜라이의 전체-길이 유전자 또는 유전자 단편의 발현에 의해 합성될 수 있다.
C. IT
독소 및/또는 MAb는 천연 원료로부터 유래하거나 재조합 DNA 기법을 사용하여 생산할 수 있다. 하나 이상의 독소 및 하나 이상의 항체를 배합하여 면역독소(IT)를 형성할 수 있다. IT를 단일 분자, 정밀한 특이성의 리간드 및 특별한 독성의 독소에 결합시킨다. 이들의 개념적 단순성에도 불구하고, IT의 각각 공통된 성분, 예를 들면, 하나 이상의 결합 잔기, 하나 이상의 가교 링커 및 하나 이상의 독소가 IT가 생체내에서 최적으로 작용하도록 하기 위해 검토되어야만 하는 상이한 문제들을 유도하기 때문에, IT는 생체내 활성이 최적이 되도록 지속적으로 개선시켜야 하는 크고 복잡한 분자이다.
충분한 선택성, 특이성 또는 친화성의 임의의 항체를 IT의 기초로 사용할 수 있다. 이러한 특성은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 통상의 면역학적 스크리닝 방법학을 사용하여 측정할 수 있다. 정준의(canonical) 항원 결합 위치 외에, 항체 분자 내의 생물학적 활성 분자에 대한 결합 위치는 병원체, B-세포 초항원, T 세포 공동 수용체 CD4 및 HIV-1 외피를 결합시킬 수 있는 가변적 도메인에 존재하는 부위를 포함한다(문헌[참조; Sasso et al., 1989; Shorki et al., 1991; Silvermann et al., 1995; Cleary et al., 1994; Lenert et al., 1990; Berberian et al., 1993; Kreier et al., 1991]). 추가로, 가변적 도메인은 항체 자가-결합을 수행하며(문헌[참조: Kang et al., 1988]), 항-항체에 의해 인지되는 항원결정인자(유전인자)를 함유한다[참조: kohler et al. 1989].
본 발명에 사용하기 위한 항체 또는 항체 단편의 기원 또는 유래(예를 들면, Fab', Fab 또는 F(ab')2)는 사용된 항체 또는 단편이 궁극적으로 IT의 의도된 용도를 사용하기 위한 목적하는 특성을 가지는 한, 본 발명의 실행에 중대한 것은 아니다. 따라서, 모노클로날 항체가 사용되는 경우, 이들은 사람, 쥐, 원숭이, 랫트, 햄스터, 닭 또는 심지어 토끼 기원일 수 있다. 본 발명은 또한 사람 불변 및/또는 가변 영역 도메인을 포함하는 사람 항체, 마우스, 랫트 또는 다른 종으로부터의 "사람화된" 또는 키메라 항체, 단일 쇄 항체, Fv 도메인 및 재조합 항체 및 이의 단편의 사용을 고려한다. 물론, 시약의 제조 및 구입의 용이함 때문에, 통상적으로 쥐 Mab가 바람직할 것이다.
특정 치료 양태에서, 고형종양에 대한 높은 선택성을 갖는 항체(예를 들면, B72.3), 직장결장암에 대한 PRBC5 또는 PR4D2; 유방암에 대한 HMFG-2, TAG 72, SM-3 또는 항-p185Her2; 폐암에 대한 항-p185Her2; 흑색종에 대한 9.2.27; 난소암에 대한 MO v18 및 OV-TL3 및 림프종 및 백혈병에 대한 항-Id, CD19, CD22, CD25, CD7 및 CD5와 같은 공지된 항체를 사용할 수 있다. 항-CD2, 항-CD25, 항-CD4 및 항-CD45R°IT를 본 발명에 따라 정제하여 악성 T 세포 또는 HIV-감염 세포를 치사시키기 위해 사용할 수 있다. 또한, CD3-특이적 IT 및 CD4 및 CD25 특이적 IT를 정제하여 골수 이식 후 급성 GVHD를 예방하기 위해 사용할 수 있다.
다른 양태에서, 다른 면역원을 사용하여 신규한 MAb를 제조할 수 있다. MAb의 제조기법은 매우 간단하며 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기법을 사용하여 용이하게 수행할 수 있다(예를 들면, Kohler & Milstein(1975)의 기법). 일반적으로, 면역원을 복강내로 마우스에 주사한다. 이러한 과정을 2주 간격으로 3회 반복하고, 최종 면역화는 정맥내 경로에 의해 수행한다. 3일 후 비장 세포를 수집하고 표준 프로토콜에 의해 SP2/0 골수종 세포와 융합시킨다(문헌[참조: Kohler & Milstein(1975)]). 이어서 적합한 반응성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마를 제한적 희석으로 클로닝시킨다.
IT를 형성하기 위해 사용되어 온 독소는 세균 또는 식물로부터 유래한 것이며 단백질 합성의 억제제이다. 이들은 공지된 가장 강력한 세포 독소 중 하나이다. 이들이 세포질로 투입된 경우 10개 미만의 분자가 세포를 치사시킬 것이다 (비록 투입 경로가 비효율적이기 때문에 이의 몇배수가 세포 표면에 결합해야 하지만). 이러한 특별한 효능은 초기에 이러한 독소가 너무 강력해서 제어할 수 없다는 염려를 초래하였다. 그러나, 당해 독소는 이들의 세포-결합 도메인 또는 아단위를 제거하거나 변형시킴으로써 간단하게 해독시킬 수 있다(표적 세포에 지시된 경우를 제외하고). 이어서 당해 독소의 잔여 부위(세포-결합 도메인이 결핍된)를 표적 세포로 독소 부위를 표적화시키는 리간드(예를 들면, 항체)에 커플링시킨다. 원치않는 교차-반응성이 없는 항체를 선택함으로써, IT는 보다 더 안전해지고 가장 통상적인 항암 약물보다 비특이적 세포독성 효과가 적게 된다. 독소의 다른 주요한 매력은 이들이 단백질 합성의 억제제이기 때문에, 분열중인 세포만큼 효율적으로 휴지기의 세포를 치사시킨다는 것이다. 따라서, 치료시에 주기에 있지 않은 종양 또는 감염 세포도 IT의 세포독성 효과를 피할 수 없다.
본원에서 "독소"는 임의의 항세포성 제제를 의미하기 위해 사용되었으며, 세포독소 및 임의의 항세포성 제제의 배합물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 화학치료제의 경우, 호르몬과 같은 제제(예를 들면, 스테로이드); 항대사제(예를 들면, 사이토신 아라비노시드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트 또는 아미노프테린); 안트라사이클린; 미토마이신 C; 빈카 알칼로이드; 데메콜신; 에토포시드; 미트라마이신; 또는 항종양 알킬화제(예를 들면, 클로르암부실 또는 멜팔란)가 사용될 수 있다.
그러나, 바람직한 독소는 식물-, 진균- 또는 세균-유래 독소이며, 예를 들면, 일부 명명된 각종 A쇄 독소, 특히 RTA; RIP(예를 들면, 사포린 또는 겔로닌), α-사르신, 아스퍼겔린 또는 레스트릭토신; 리보뉴클레아제(예를 들면, 태반 리보뉴클레아제); 안지오제닌, 디프테리아 독소 및 슈도모나스 외독소를 포함한다. 예시적 독소를 VLS를 유발하는 서열의 배치(예를 들면, 표 1에 나열된 이들 잔기, 본원에 기술된 이들 잔기 및 다른 단백질 내의 동등한 잔기)를 제거 또는 변형시키기 위해 돌연변이시킬 수 있다.
흔히 식물 홀로톡신은 2개의 디설파이드 결합된 쇄, A 및 B쇄를 포함한다. B쇄는 세포-결합 영역(이들의 수용체는 보통 특징화되어있지 않다) 및 A쇄의 산 세포내 구획의 막을 통한 세포질내로의 삽입을 촉진시키는 전위 영역 둘 다를 수반한다. 이어서 A쇄는 혼입된 후 세포를 치사시킨다. 생체내에서 이들을 사용하기 위해, 리간드 및 독소는, 혈류 및 조직을 통해 통과되는 동안 안정성이 유지되는 반면 표적 세포 내에서는 불안정하여 독성 부위가 세포질내로 방출될 수 있도록 하는 방법으로 커플링시켜야 한다.
본 발명과 관련되어 사용하기에 가장 바람직한 독소 잔기는 RTA 및 특히, 소위 dgRTA인 탄수화물 잔기를 변형 또는 제거하도록 처리된 독소 A쇄이다. 이. 콜라이에서 발현되며 또한 탄수화물이 부족한 재조합 A쇄를 사용할 수 있다. 특정 양태에서, RTA는 본원의 실시예 3에 하기한 바와 같이 제조할 수 있다.
그러나, 약리학적 관점에서는 크기가 작아도 적합한 생물학적 반응을 제공할 수 있는 최소 분자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서 적합한 항세포 반응을 제공하는 보다 작은 A쇄 펩타이드 또는 기타 독소를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 나가라제(Sigma)로 30개의 N-말단 아미노산을 제거함으로써 RTA를 "절단"할 수 있음이 다른 발명자에 의해 발견되었다. 필요에 따라, 이러한 절단된 A쇄를 본 발명에 따르는 접합에 사용할 수 있음을 제안한다.
대안적으로, 독소 잔기에 대한 재조합 DNA 기법의 적용이 본 발명에 따라 추가의 현저한 이점을 제공함을 알 수 있다. 현재 생물학적 활성 RTA 및 다른 VLS-유도 독소의 클로닝 및 발현은 다른 발명자의 출원을 통해 가능하게 되었으며(문헌[참조: O'Hare et al., 1987; Lamb et al., 1985; Halling et al., 1985]), 본원에 이르러 보다 작거나 변형되었지만, 그럼에도 불구하고 적합한 독성 활성을 나타내는 펩타이드를 동정 및 제조할 수 있게 되었다. 추가로, 현재 RTA 및 다른 VLS-유발 독소가 클로닝되었다는 사실은 A쇄 및 기타 VLS-유발 독소, 독소-유래 펩타이드를 용이하게 제조 및 스크리닝하고 본 발명에 관련되어 사용하기에 유용한 추가의 잔기를 수득함으로써 부위-지시적 돌연변이의 적용을 가능하게 한다. 일단 동정되면, 이들 잔기를 돌연변이시켜 VLS, 아폽토시스, 디스인테그린-유사 활성, EC 손상 활성 및 본원에 기술되거나 당해 분야의 숙련가에게 공지된 이러한 서열의 기타 효과를 촉진시키는 능력이 감소된 독소를 제조할 수 있다.
어떠한 조합으로든, PE, DT-A 등을 갖는 융합-IT가 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기법에 의해 제조된다. 항체, 사이토킨 또는 가용성 수용체 DNA가 이러한 제조에 사용될 수 있다.
결합제 영역을 갖는 접합체와 다수의 독소(그러나 모든 독소는 아님)의 가교 결합이 본 발명의 중요한 측면이다. RTA의 경우, 생물학적 활성을 갖는 접합체가 필요한 경우, 이황화물 작용을 나타내는 가교 링커가 필요한 것으로 사료된다. 이에 대한 이유는 불분명하지만, 일단 당해 제제가 당해 독소를 표적 세포 내로 "운반"시키면 독소 잔기가 결합제로부터 용이하게 방출될 필요가 있기 때문인 것으로 예상된다. 가교 링커의 각각의 유형 및 가교 결합의 수행 방법은 수득된 접합체의 약역학을 변화시키는 경향이 있을 것이다. 궁극적으로 작용 의도 부위(이 점에서는 당해 접합체가 우수한 "방출" 특성을 갖는 것이 바람직하다)를 제외한 신체의 모든 곳에서 발견되는 조건하에서 손상되지 않은 채로 유지되는 접합체를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 특히 사용된 특정 가교 결합 시약 및 가교 결합된 구조를 포함한 특정 가교 결합 도식이 임의의 의미를 갖게 될 것이다.
가교 결합 시약은 2개의 상이한 단백질(예를 들면, 독소 및 결합제)의 작용 그룹을 함께 연결하는 분자 다리를 형성하기 위해 사용된다. 2개의 상이한 단백질을 단계적 방식으로 연결시키기 위해, 이종이중작용성 가교 링커를 사용하여 기대하지 않은 동종중합체 형성을 제거할 수 있다. 예시적 이종이중작용성 가교 링커는 2가지의 반응성 그룹을 함유한다: 1급 아민 그룹과 반응하는 그룹(예를 들면, N-하이드록시 석신이미드) 및 티올 그룹과 반응하는 다른 그룹(예를 들면, 이황화피리딜, 말레이미드, 할로겐 등). 1급 아민 반응성 그룹을 통해 가교 링커가 한 단백질(예를 들면, 선택된 항체 또는 단편)의 리신 잔기(들)과 반응할 수 있고, 티올 반응성 그룹을 통해, 제1 단백질에 이미 연결된 교차연결자가 다른 단백질(예를 들면, dgRTA)의 시스테인 잔기(설프하이드릴 그룹이 없는)와 반응할 수 있다.
임의의 가교 링커의 이들 2가지 반응성 그룹 사이의 스페이서 암(spacer arm)은 다양한 길이 및 화학적 조성물을 가질 수 있다. 보다 긴 스페이서 암은 접합체 성분을 보다 유연하게 하는 반면, 다리의 일부 특정한 성분(예를 들면, 벤젠 그룹)은 반응성 그룹에 특별한 안정성을 주거나 다양한 측면의 작용에 대한 화학적 결합의 내성을 증가시킨다(예를 들면, 디설파이드 결합의 환원제에 대한 내성).
가장 바람직한 가교결합 시약은 SMPT이며, 이는 인접한 벤젠 환 및 메틸 그룹에 의해 "입체적으로 방해받은" 디설파이드 결합을 함유하는 이중작용성 가교 링커가다. 디설파이드 결합의 입체 방해는 조직 및 혈액내에 존재할 수 있는 글루타티온과 같은 티올레이트 음이온에 의한 공격으로부터 당해 결합을 보호하는 기능을 제공하여, 이에 따라 결합제에 의한 작용 부위로 운반되기 전 당해 접합체의 탈커플링을 예방하는데 도움을 준다고 사료된다. 많은 다른 공지된 가교결합 시약과 같이, SMPT 가교결합 시약은 시스테인의 SH 또는 1급 아민(예를 들면, 라이신의 엡실론 아미노 그룹)의 작용기를 가교 결합시키는 능력을 부여한다. 가교 링커의 다른 가능한 유형은 설포석신이미딜-2-(p-아지도 살리실아미도) 에틸-1,3'-디티오프로피오네이트와 같은 절단가능한 디설파이드 결합을 함유하는 이종이중작용적 광반응성 페닐아지드를 포함한다. N-하이드록시-석신이미딜 그룹은 1급 아미노 그룹과 반응하며 페닐아지드(광분해에 따라)는 임의의 아미노산 잔기와 비선택적으로 반응한다.
비록 "방해된" 가교 링커가 일반적으로 본 발명의 실행에 바람직하지만, 방해되지 않은 링커를 사용할 수 있으며 실현되지 않더라도 이에 따라 이득을 얻을 수 있다. 보호된 이황화물을 함유하거나 생산한다고 간주되지 않은 다른 유용한 가교 링커에는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올란이 포함된다. 이러한 가교 링커의 사용은 당해 분야에서 널리 이해되고 있다.
1. IT 접합체
본 발명은 질병에 걸린 조직 또는 질병 유발 세포상에 발현된 항원결정인자와 같은 표적 항원결정인자에 대항하는 IT를 제공한다. 특정 양태에서, IT는 본원에 기술된 하나 이상의 독소를 포함한다. 다른 양태에서, IT 또는 독소는 추가로 하나 이상의 제2의 제제를 포함한다. 이러한 제제는 분자 또는 잔기일 수 있다. 이러한 분자 또는 잔기는 하나 이상의 효능인자 또는 정보전달 분자를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 효능인자 분자는 목적하는 활성, 예를 들면, 세포독성 활성을 갖는 분자를 포함한다. 항체에 부착된 효능인자 분자의 비제한적 예는 독소, 항종양제, 치료학적 효소, 방사선-표지된 뉴클레오타이드, 항바이러스제제, 킬레이트화제, 사이토킨, 성장 인자 및 올리고- 또는 폴리-뉴클레오타이드를 포함한다. 대조적으로, 정보전달 분자는 검정을 사용하여 검출할 수 있는 임의의 잔기로서 정의된다. 항체에 접합된 정보전달 분자의 비제한적 예는 효소, 방사선표지, 합텐, 형광 표지, 인광성 분자, 화학발광 분자, 발색단, 발광 분자, 광친화성 분자, 유색 입자 또는 비오틴과 같은 리간드를 포함한다.
하나 이상의 제2의 제제의 특정한 예는 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함한다. "검출가능한 표지"는 이들의 특이한 작용 특성 및/또는 화학적 특성에 기인하여 검출될 수 있는 화합물 및/또는 요소이며, 이를 사용하여 이들이 부착된 항체를 검출하고/거나 필요에 따라 추가로 정량할 수 있다.
많은 적합한 영상화제가 항체에 이들을 결합시키는 방법과 같은 당해 분야의 문헌에 공지되어 있다(각각 본원에 참조로서 인용되어 있는 문헌[미국 특허 제5,021,236호; 제4,938,948호 및 제4,472.509호]을 참조한다). 사용된 영상화 잔기는 상자성 이온; 방사선 동위원소; 형광색소; NMR-검출성 물질; X-선 영상화 물질일 수 있다.
아지도 그룹을 함유하는 분자도 또한 저강도 자외선에 의해 방출된 반응성 니트렌 중간체를 통한 단백질에 대한 공유 결합을 형성하기 위해 사용될 수 있다(문헌[참조: Potter & Haley, 1983]). 특히, 퓨린 뉴클레오타이드의 2- 및 8-아지도 유사체가 조 세포 추출물내의 뉴클레오타이드 결합 단백질을 동정하기 위한 부위-지시적 광프로브로 사용되어 왔다(문헌[참조: Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985]). 또한 2- 및 8-아지도 뉴클레오타이드가 정제된 단백질의 뉴클레오타이드 결합 도메인을 맵핑(mapping)하기 위해 사용되어 왔으며(문헌[참조: Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; and Dholakia et al., 1989]), 항체 결합 제제로서 사용될 수 있다.
항체의 이의 접합체 잔기에 대한 부착 또는 접합을 위한 몇가지 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 부착 방법은 금속 킬레이트 복합체(예를 들면, 항체에 부착된 디에틸렌트리아민펜타아세트산 안하이드리드(DPTA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔설폰아미드; 및/또는 테트라클로로-3α-6α-디페닐글리코우리-3)와 같은 유기 킬레이트화제를 사용하는 금속 킬레이트 복합체의 용도를 포함한다(각각 본원에 참조로서 인용되어 있는 미국 특허 제4,472,509호 및 제4,938,948호). 또한 모노클로날 항체를 글루타르알데하이드 또는 페리오데이트와 같은 커플링 제제의 존재하에 효소와 반응시킬 수 있다. 플루오레세인 표지와의 접합체는 이들 커플링 제제의 존재하에 또는 이소티오시아네이트와 반응시켜 제조한다. 미국 특허 제4,938,948호에서, 유방암의 영상화는 모노클로날 항체를 사용하여 수행하며 검출가능한 영상 잔기는 메틸-p-하이드록시벤즈이미데이트 또는 N-석신이미딜-3-(4-하이드록시페닐)프로피오네이트와 같은 링커를 사용하여 항체에 결합시킨다.
다른 양태에서, 항체 결합 부위를 변형시키지 않는 반응 조건을 사용하여, 면역글로불린의 Fc 영역 내의 설프하이드릴 그룹을 선택적으로 도입함에 의한 면역글로불린의 유도를 고려한다. 이러한 방법학에 따라 생산된 항체 접합체는 개선된 수명, 특이성 및 감작성을 나타내는 것으로 알려져 있다(본원에 참조로서 인용되어 있는 미국 특허 제5,196,066호). 효능인자 또는 리포터 분자의 부위-특이적 부착(여기서, 리포터 분자 또는 효능인자 분자는 Fc 영역 내의 탄수화물 잔기에 접합된다)이 또한 당해 문헌에 개시되어 있다(문헌[참조: O'Shannessy et al., 1987]). 이러한 방법은 현재 임상 평가 중인 진단학적 및 치료학적으로 유망한 항체를 생산하는 것으로 보고되어 있다.
2. IT 제조 방법
IT의 생산 및 제조방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이러한 방법은 각각 본원에 참조로서 인용되어 있는 미국 특허 제5,686,072호, 미국 특허 제5,578,706호, 미국 특허 제4,792,447호, 미국 특허 제5,045,451호, 미국 특허 제 4,664,911호, 및 미국 특허 제5,767,072호에 개시되어 있다. IT의 독소 잔기는 당해 분야에 흔히 사용되는 각종 독소 중 임의의 하나일 수 있다. 이는 미처리 독소, 독소 A쇄 또는 천연적으로 발생된 단쇄 RIP일 수 있다. 본 발명에 포함되는 독소는 디프테리아 독소(DT) 및 DT(CRM-45); PE38로부터 유래한 슈도모나스 내독소; RTA 및 아브린 및 이들 둘 다의 차단된 형태; 겔로닌 및 사포린을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
방해된 디설파이드 링커에 의해 dgRTA에 공유결합된 Mab를 포함하는 IT가 최근 비-호지킨(B 세포) 림프종, 호지킨 림프종 신생물 또는 GVHD의 치료를 위한 임상 시험에 도입되었다. 이들 "2세대" IT는 안정하고, 수명이 길며 표적 세포에 대한 유효한 세포독성을 나타낸다. 이들 IT의 높은 수율의 신속한 제조를 위한 표준화된 과정이 개발되어 있다(문헌[참조: Ghetie etal., 1991]).
예를 들면, dgRTA를 사용한 IT의 제조 과정은 SMPT를 사용한 MAb의 유도 및 디티오트레이톨(DTT)를 사용한 dgRTA의 환원 및 이에 이은 2가지 성분의 반응에 의한 방해된 쇄내 디설파이드 결합의 형성을 포함한다. 화학적 가교 결합 반응으로 항체, 독소 및 IT의 혼합물을 형성한 후, 정제시키고, 초기에 유리 항체 및 유리 독소 분자를 제거하고 이어서 각각 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 독소 문자와 접합시킨 하나의 항체 분자를 포함하는 상이한 IT 종을 분리한다. 가교 결합 반응의 비반응 성분을 친화성 크로마토그래피 칼럼(예를 들면, 활성화된 염료/아가로스) 상에서 연속 크로마토그래피에 의해 제거한 후, 겔 여과에 의해 유리 항체를 제거하고 고분자량 물질 및 유리 독소를 제거할 수 있다.
이들 과정의 결과는 다양한 독소/항체 비율의 접합체의 혼합물이다. 본 발명의 중요한 양태는 당해 혼합물을 추가로 정제하여 상이한 독소/항체 비율의 IT로부터 분리된 단일 독소/항체 비율의 IT를 필수적으로 포함하는 제제를 수득하는 것이다. 이러한 정제는 예를 들면, 염 구배를 사용하여 다양한 종의 IT를 용출시키고 겔 여과시켜 대분자로부터 IT를 분리하는 친화성 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있는 추가의 크로마토그래피 분리에 의해 수행된다.
본 발명의 다른 중요한 양태는 어떠한 독소/IgG 비율의 제제가 약리학적 제제에 사용하기 위한 가장 효과적인 세포독성 제제인지 판단하는 능력이다. 본 발명에 의해 제조될 수 있는 단일 종의 IT 각각의 분리 및 특성화가 임상 적용에 특히 유리한데, 이는 전문가가 특정 상황에서 투여되는 IT의 유효량을 보다 정밀하게 제어할 수 있게 하기 때문이다.
3. 겔 여과
본 발명의 과정에 사용되는 겔은 무작위적 구조를 갖는 3차원 망상조직이다. 분자체 겔은 분석되거나 분리되어야 할 물질과 결합하거나 반응하지 않는 가교 결합 중합체를 포함한다. 겔 여과 목적을 위한, 당해 겔 물질은 일반적으로 전하를 띄지 않는다. 겔 내의 공간은 겔 용적의 대부분을 구성하는 액체 및 액체 상으로 충전되어 있다. 일반적으로 겔 여과 칼럼에 사용되는 물질은 덱스트란, 아가로스 및 폴리아크릴아미드를 포함한다.
덱스트란은 글루코스 잔기로 이루어진 다당류이며 제품명 SEPHADEX(Phamacia Fine Chemicals, Inc)로 시판되고 있다. 다양한 구멍 크기로 제공되는 상이한 크기의 분자를 분리하기 위해 다양한 정도의 가교 결합을 사용하여 비드를 제조한다. 알킬 덱스트란을 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드와 가교 결합시켜 SEPHACRYL-S100을 형성하여 SEPHADEX가 성취할 수 있는 것보다 큰 범위로 분획화시킬 수 있는 강한 비드인 S1000이 제조되게 한다.
또한 폴리아크릴아미드가 겔 여과 매질로서 사용될 수 있다. 폴라아크릴아미드는 가교 결합제로서 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드롤 사용하여 제조된 가교 결합된 아크릴아미드의 중합체이다. 폴리아크릴아미드는 제조원[Bio-Rad Laboratories(USA)]로부터 다양한 구멍 크기로 구입하여 다양한 크기 입자의 분리를 위해 사용할 수 있다.
당해 겔 물질은 물 및 일부 유기 용매에서 팽윤된다. 팽윤은 구멍이 용출제로서 사용되는 액체로 충전되게 하는 과정이다. 소분자가 구멍에 투입됨에 따라, 겔을 통한 이들의 진행이 구멍에 투입되지 않은 대분자에 비하여 지연된다. 이것이 분리의 원리이다. 당해 비드는 다양한 정도의 정교함으로 다양한 적용에 사용될 수 있다. 보다 조악한 비드일수록 보다 빠르게 흐르며 분해능이 불량하다. 최대의 분해능을 위해 초미세 비드를 사용하지만, 흐름이 매우 느리다. 미세 비드는 보다 빠른 유속을 요하는 대칼럼에서 예비 작동을 위해 미세 비드가 사용된다. 보다 조악한 등급은 분해능이 시간에 비해 덜 중요한 대량 제조 또는 분자량에 큰 차이가 있는 분자의 분리를 위해 사용된다. 겔 크로마토그래피에 대한 논의는 본원에 참조로서 인용되어 있는 문헌[Freifelder, Physical Biochemistry, Second Edition, pages 238-246]을 참조한다.
본 발명에 사용하기 위한 겔 여과의 가장 바람직한 방법은 SEPHADEX와 같은 덱스트란 겔을 사용한 것들이며, 분자를 180 내지 240 킬로달톤 범위로 분리할 수 있는 SEPHACRYL과 같은 덱스트란-폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 것들이다.
4. 친화성 크로마토그래피
친화성 크로마토그래피는 일반적으로 리간드 또는 항체와 같은 물질에 의한 단백질의 인지를 기초로 한다. 칼럼 물질은 활성화된 염료와 같은 결합 분자을 예를 들면, 불용성 기질에 공유적으로 커플링시킴으로써 합성할 수 있다. 이어서 당해 칼럼 물질이 용액으로부터 목적하는 물질을 흡수할 수 있게 한다. 이어서, 조건을 결합이 일어나지 않는 조건으로 변경하고 기질을 용출시킨다. 성공적인 친화성 크로마토그래피를 위한 필요조건은 기질이 분자를 흡수해야만 하며, 리간드는 이의 결합 활성을 변화시키지 않으면서 커플링되어야 하고, 결합이 충분히 견고한 리간드를 선택해야 하며, 이를 파괴시키지 않으면서 당해 물질을 용출시킬 수 있어야 한다는 것이다.
본 발명의 바람직한 양태는 당해 기질이 반응성 염료-아가소르 기질인 친화성 크로마토그래피 방법이다. 블루-세파로스, 시바크론 블루(Cibacron Blue) 3GA 및 아가로스로 이루어진 칼럼 기질 또는 세파로스를 친화성 크로마토그래피 기질로서 사용할 수 있다. 가장 바람직한 기질은 제조원[Sigma Chemical Company]로부터 카탈로그 번호 제R 8752호로 반응성 블루 2(Reactive Blue 2)로서 입수할 수 있는 세파로스 CL-6B이다. 당해 기질은 본 발명의 IT에 직접적으로 결합하며 염 구배를 사용한 용출에 의해 이들을 분리시킬 수 있다.
5. ELISA
ELISA를 본 발명과 함께 사용할 수 있다. ELISA 검정에서, 독소 A쇄 서열이 혼입된 단백질 또는 펩타이드를 선택된 표면, 바람직하게는 폴리스티렌 미세역가 플레이트의 웰과 같은 단백질 친화성을 나타내는 표면 상에 고정시킨다. 불완전하게 흡수된 물질을 제거하기 위해 세척한 후, 검정 플레이트 웰을 소혈청 알부민(BSA), 카세인 또는 분유 용액과 같은 시험 항혈청을 고려하여 항원적으로 중성인 것으로 공지된 비특이적 단백질과 결합시키거나 이를 피복시키는 것이 바람직하다. 이는 고정된 표면 상의 비특이적 흡수 부위를 차단하여 이에 따라 표면 상의 항혈청의 비특이적 결합에 의해 유발된 배경을 감소시킨다.
항원성 물질을 웰에 결합시키고, 비반응성 물질로 피복시켜 배경을 감소시키고, 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거한 후, 고정된 표면을 면역 복합체(항원/항체) 형성에 기여하는 방식으로 시험된 항혈청 또는 임상 또는 생물학적 추출물과 접촉시킨다. 이러한 조건은 바람직하게는 BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 및 인산완충염(PBS)/TWEEN과 같은 희석제로 항혈청을 희석시킴을 포함한다. 이들 첨가된 제제도 또한 비특이적 배경의 감소를 조장하는 경향이 있다. 이어서 도포된 항혈청을 바람직하게는 약 25℃ 내지 37℃의 온도에서 2 내지 4시간 동안 항온처리한다. 항온처리 후, 항혈청-접촉 표면을 세척하여, 면역복합체화되지 않은 물질을 제거한다. 바람직한 세척 단계는 PBS/TWEEN과 같은 용액 또는 붕산염 완충액을 사용한 세척을 포함한다.
시험 샘플 및 결합된 항원 사이의 특이적 면역복합체의 형성 및 이에 이은 세척 후, 우선 특이성을 갖는 제2의 항체에 동일하게 적용함으로써 면역복합체 형성의 발생 및 양까지 측정할 수 있다. 검출 방법을 제공하기 위해, 바람직하게는 제2 항체는 적합한 색원성 기질과 함께 항온처리함에 따라 발색되는 관련 효소를 갖게 될 것이다. 따라서, 예를 들면, 항혈청-결합 표면과 우레아제 또는 퍼옥시다제-접합 항-사람 IgG를 일정한 시간 동안 면역복합체 형성의 발달에 유리한 조건하에서 접촉 및 항온처리하는 것이 바람직할 것이다(예를 들면, PBS-Tween과 같은 PBS-함유 용액 중 실온에서 2시간 동안 항온처리).
제2 효소 태그된 항체와 함께 항온처리한 후, 이어서 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하고, 효소 표지가 퍼옥시다제인 경우, 요소 및 브로모크레졸 퍼플과 같은 색원성 기질 또는 2,2'-아지도-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산[ABTS]) 및 H2O2와 항온처리하여 표지량을 정량한다. 이어서 예를 들면, 가시 스펙트럼 분광광도계를 사용하여 발색 정도를 측정하여 정량화를 수행한다.
D. 백신접종
본 발명은 면역화 양태에 사용하기 위한 백신을 고려한다. 하나 이상의 (x)D(y), (x)D(y)T 및/또는 측면 영역 서열 내의 변형에 의한 VLS 또는 기타 독성 효과를 촉진하는데 덜 효과적인 단백질성 조성물이 항원으로서 유용할 수 있다고 예상된다. 특정 양태에서, 하나 이상의 (x)D(y), (x)D(y)T 및/또는 측면 영역 서열을 포함하는 펩타이드가 유용한 항원으로서 고려된다. 바람직하게는 항원성 물질을 광범위하게 투석하여 목적하지 않은 소분자량 분자를 제거하고/거나 목적하는 비히클내로 보다 용이하게 제형될 수 있도록 냉동건조시킨다. 다른 양태에서, 또한 백신으로서 하나 이상의 활성 부위 잔기(즉, 변성독소)가 결핍된 독소를 사용할 수 있다.
1. 면역조절제
환자의 반응을 증대시키기 위해 백신에 면역조절제를 포함시킬 수 있을 것으로 예상된다. 세포가 당해 조성물의 일부인 경우, 면역조절제를 정제 단백질로서 포함시키거나 세포 내에서의 이들의 발현을 조작할 수 있다. 다음 부분은 흥미있는 면역조절제의 예를 나열한다.
a. 사이토킨
인터류킨 및 사이토킨, 및 인터류킨 및 사이토킨을 발현하는 벡터가 가능한 백신 성분으로 고려된다. 인터류킨 및 사이토킨에는 인터류킨 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, β -인터페론, α-인터페론, γ -인터페론, 안지오텐신, 트롬보스폰딘, 엔도스타틴, METH-1, METH-2, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 종양괴사인자, TGFβ, LT 및 이의 배합물이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
b. 키모킨
키모킨 또는 키모킨을 암호화하는 유전자도 또한 백신 성분으로서 사용될 수 있다. 일반적으로 키모킨은 화학유인물질로서 작용하여 면역 효과 세포를 키모킨 발현 부위로 모집한다. 예를 들면, 사이토킨 유전자와 함께 특정 키모킨 유전자를 발현시키는 것이 치료 부위로의 다른 면역계 성분의 모집을 증진시키는 데 이로울 수 있다. 이러한 키모킨에는 RANTES, MCAF, MIPl-알파, MIPl-베타, 및 IP-10이 포함된다. 숙련가는 특정 사이토킨이 또한 화학유인물질 효과를 갖는 것으로 공지되었고 명칭 키모킨하에 분류될 수 있음을 인지할 것이다.
다가 백신의 제조는 일반적으로 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들면, 모두 본원에 참조로서 인용되어 있는 미국 특허 제4,608,251호; 제4,601,903호; 제4,599,231호; 제4,599,230호; 제4,596,792호; 및 제4,578,770호). 통상, 이러한 백신은 주사용으로 제조한다. 액체 용액 또는 현탁액으로서: 또한 주사 전 액체에 용해시키거나 현탁시키기에 적합한 고체 형태로 제조할 수 있다. 당해 제제를 또한 유화시킬 수 있다. 활성 면역원성 성분을 흔히 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 화합성인 부형제와 함께 혼합한다. 적합한 부형제는 예를 들면, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이의 배합물이다. 추가로, 필요에 따라, 당해 백신은 소량의 부가 물질(예를 들면, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 또는 백신의 효능을 증강시키는 보조제)을 함유할 수 있다.
통상 백신은 주사에 의해 비경구적으로(예를 들면, 피하, 진피내 또는 근육내로) 투여할 수 있다. 다른 투여 방식에 적합한 추가의 제형은 좌제 및 일부 경우, 경구 또는 비강 제형을 포함한다. 좌제용으로, 통상의 결합제 및 담체(예를 들면, 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세리드)를 포함시킬 수 있으며, 이러한 좌제는 약 0.5% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 1 내지 약 2%의 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구 제형은 예를 들면, 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 서방형 제형 또는 산제의 형태를 취하며 약 10 내지 약 95%의 활성 성분, 바람직하게는 약 25 내지 약 70%의 활성 성분을 함유한다.
투여 제형과 화합성 방식으로 치료학적으로 유효하고 면역원성일 수 있는 양의 백신을 투여한다. 투여량은 예를 들면, 개인 면역계의 항체 합성 능력, 및 목적되는 보호 정도를 포함하여, 치료받을 피검체에 따른다. 투여되어야 하는 활성 성분의 정확한 양은 전문가의 판단에 따른다. 그러나, 적합한 투여 범위는 백신접종당 활성 성분 수백㎍ 정도이다. 초기 투여 및 추가 접종에 적합한 처방 또한 다양할 수 있지만, 초기 투여 후에 이은 접종 또는 다른 투여에 의해 유형화된다. 생체내에서 단기 수명을 갖는 독소의 경우 근육내 경로가 바람직할 수 있다.
백신에 대한 보조제 효과를 달성하기 위한 각종 방법은 흔히 인산완충염 중 약 0.05 내지 약 0.1% 용액으로서 사용되는 수산화알루미늄 또는 포스페이트(알루미늄)과 같은 제제, 약 0.25% 용액으로서 사용되는 당의 합성 중합체와의 혼합물(CarbopolR)의 사용, 각각 30초 내지 2분동안 약 70℃ 내지 약 101℃ 사이의 온도 범위에서 가열 처리함에 의한 백신내의 단백질의 응집을 포함한다. 펩신 처리된(Fab) 항체를 알부민에 반응시킴에 의한 응집물, 씨. 파르붐(C. parvum)과 같은 세균성 세포 또는 내독소의 혼합물 또는 그람-음성 세균의 지질다당류 성분, 만니드 모노올레이트(아레셀 A)와 같은 생리학적으로 허용가능한 오일 비히클 내의 유제 또는 차단 치환체로 사용되는 퍼플루오로카본(Fluosol-DAR)의 20% 용액을 갖는 유제를 또한 사용할 수 있다.
많은 예에서, 백신을 다회 투여하는 것이 바람직하다(일반적으로, 6회를 초과하지 않고, 보다 일반적으로는 4회를 초과하지 않고 바람직하게는 1회 이상, 일반적으로 약 3회 이상 백신접종한다). 이들 기법은 널리 공지되어 있고 이들 검정 유형을 예시하는 다양한 특허 문헌(예를 들면, 미국 특허 제3,791,932호; 제4,174,384호 및 제3,949,064호)에서 찾을 수 있다.
2. 보조제
면역화 프로토콜은 여러 해 동안 반응을 자극하기 위해 보조제를 사용한다. 일부 보조제는 항원이 제시되는 방법에 영향을 준다. 예를 들면, 단백질 항원이 알루미늄에 의해 침전된 경우, 면역 반응이 증가된다. 또한 항원의 유화는 항원 지시 기간을 연장시킨다. 다른 보조제(예를 들면, 세균으로부터 수득한 특정 유기 분자)는 항원보다는 숙주에 작용한다. 한 예는 무라밀 디펩타이드(N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민[MDP]), 세균성 펩티도글리칸이다. 대부분의 보조제와 같이, MDP의 효과도 충분히 이해되어 있지 않다. MDP는 대식세포를 자극하지만, 또한 B 세포를 직접적으로 자극하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 보조제의 효과는 항원-특이적이지 않다. 그러나 이들을 정제된 항원과 함께 투여하는 경우, 이들을 항원에 대한 반응을 선택적으로 촉진시키는데 사용할 수 있다.
보조제를 실험적으로 사용하여 비공지된 항원에 대한 면역원성에 대한 일반화된 증가를 촉진시켜왔다(예를 들면, 미국 특허 제4,877,611호). 이는 특히 암의 치료에 시도되었다. 많은 암에 대해, 면역계가 종양 세포에 대한 숙주 방어에 참여한다는 증거가 강제되어 왔지만, 총 종양-특이적 항원 중 오직 일부만이 오늘날까지 밝혀진 것으로 사료된다.
본 발명은 각종 보조제를 종양 세포와 같은 세포의 막에 사용하여 개선된 면역원성 조성물을 수득할 수 있음을 고려한다. 일반적으로 유일한 필요조건은 보조제가 문제의 세포의 세포막과 물리적으로 연관되거나 이에 접합되어 혼입되어야 한다는 것이다.
당해 분야의 숙련가는 본 발명에 따른 세포성 백신에 접합될 수 있는 상이한 종류의 보조제를 알고 있을 것이며, 이들은 다른 것들 중 알킬 리소인지질(ALP); BCG; 및 비오틴(비오티닐화된 유도체 포함)을 포함한다. 특히 사용이 고려된 특정한 보조제는 그람 세포로부터의 테이콘산이다. 이들은 지질테이콘산(LTA), 리비톨 테이콘산(RTA) 및 글리세롤 테이콘산(GTA)를 포함한다. 이들의 합성 상대물의 활성 형태를 또한 본 발명과 연관지어 사용할 수 있다(문헌[참조: Takada et al., 1995]).
헤모시아닌 및 헤모에리트린 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 다른 연체동물 및 절지동물 헤모시아닌 및 헤모에리트린을 사용할 수 있지만, 키홀 림펫(KLH)로부터의 헤모시아닌의 사용이 특히 바람직하다.
각종 다당류 보조제를 또한 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Yin et al., (1989])은 마우스의 항체 반응에 대한 각종 폐렴쌍구균의 다당류의 용도를 기술한다. 탈아세틸화된 키틴을 포함한 키틴 및 키토산과 같은 다양한 다당류의 폴리아민이 특히 바람직하다.
보조제의 추가의 바람직한 그룹은 세균성 펩티도글리칸의 무라밀 디펩타이드(MDP, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민) 그룹이다. 아미노산 유도체 트레오닐-MDP와 같은 무라밀 디펩타이드의 유도체 및 지방산 유도체 MTPPE가 또한 고려된다.
미국 특허 제4,950,645호는 포스파티딜 콜린 및 포스파티딜 글리세롤로부터 형성된 인공 리포좀에 사용하기 위한 무라밀 디펩타이드의 친유성 이당류-트리펩타이드 유도체를 기술한다. 이전에는 세포성 담체와 함께 사용되도록 제안되지 않았던, 미국 특허 제4,950,645호 및 PCT 공개공보 제WO 91/16347호의 화합물이 본원에 이르러 본 발명에 사용되도록 제안된다.
본 발명의 바람직한 보조제는 BCG이다. BCG{바실러스 칼메테-구에린(bacillus Calmette-Guerin), 미코박테리움의 약독화된 균주) 및 BCG-세포벽 골격(CWS) 또한 트레할로스 디미콜레이트의 유무하에 본 발명에 보조제로서 사용될 수 있다. 트레할로스 디미콜레이트를 미국 특허 제4,579,945호에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
BCG의 세포벽 추출물이 우수한 면역 보조제 활성을 가짐이 입증되었다. 최근 개발된 미코박테리아에 대한 분자 유전학적 도구 및 방법이 BCG로의 외래 유전자의 도입 방법을 제공하였다(문헌[참조: Jacobs et al., 1987; Snapper et al., 1988; Husson et al., 1990; Martin et al, 1990]). BCG 및 기타 미코박테리아는 매우 효과적인 보조제이며, 미코박테리아에 대한 면역 반응이 광범위하게 연구되어 왔다(문헌[참조: Luelmo, 1982; Lotte et al., 1984]). 예시적 BCG 백신이 TICERBCG(Organon Inc., West Orange, NJ)로서 시판되고 있다. 본 발명의 전형적 실행에서, 미코박테리움 보비스(bovis)-BCG의 세포를 당해 분야에 공지된 방법으로 배양 및 수거한다(예를 들면, 문헌[참조; Dubos et al., 1947; Rosenthal, 1937]).
양쪽성 계면활성제(예를 들면, 사포닌) 및 QS21(Cambridge Biotech)과 같은 유도체는 여전히 본 발명의 면역원과 함께 사용하기에 바람직한 다른 그룹의 보조제를 형성한다. 비이온성 단위 공중합체 계면활성제(문헌[참조: Rabinovich et al., 1994; Hunter et al., 1991])를 또한 사용할 수 있다. Yamamoto 등(1988)에 의해 기술된 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드는 보조제의 다른 유용한 그룹이다. 쿠일 A 및 렌티넨은 보조제의 최신의 바람직한 목록을 완성한다. 각각의 시약 및 하기한 내독소가 보조제로서 널리 공지되어 있지만, 이들 화합물은 본원에 나타낸 바와 같이, 이전에는 표적 세포의 막내에 혼입시키지 않았다.
본 발명에 사용하기에 특히 바람직한 보조제의 한 그룹은 미국 특허 제4,866,034호의 정련된 해독화 내독소와 같은 해독화 내독소이다. 이들 정련된 해독화된 내독소는 포유동물에서 보조제 반응을 유발하는데 효과적이다.
해독화된 내독소를 다른 보조제와 결합하여 다중-보조제-혼입 세포를 제조할 수 있다. 미국 특허 제4,435,386호에 기술된 바와 같은 트레할로스 디미콜레이트와 해독화된 내독소의 배합이 고려된다. 트레할로스 디미콜레이트 및 내독성 당지질과 해독화된 내독소의 배합(미국 특허 제4,505,899호), 미국 특허 제4,436,727호, 제4,436,728호 및 제4,505,900호에 기술된 바와 같은 해독화된 내독소와 세포벽 골격(CWS) 또는 CWS 및 트레할로스 디미콜레이트의 배합이 또한 고려된다. 미국 특허 제4,520,019호에 기술된 바와 같은, 해독화된 내독소가 없는 단지 CWS와 트레할로스 디미콜레이트만의 배합이 또한 유용한 것으로 사료된다.
각종 보조제(사람에 통상 사용되지 않는 것이더라도)가 여전히 항체를 증가시키거나 연속적으로 활성화된 T 세포를 수득하는 것이 바람직한 동물에 사용될 수 있다. 보조제 또는 세포로부터 초래될 수 있는 독성 또는 기타 부작용(예를 들면, 방사선 처리하지 않은 종양 세포를 사용하여 발생시킬 수 있는)은 이러한 상황에 부적절하다.
E. 약제학적 제제
본 발명의 약제학적 수성 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산된 하나 이상의 IT, VLS 억제성 펩타이드 또는 폴리펩타이드, VLS 자극성 펩타이드 또는 폴리펩타이드 및/또는 사이토킨의 유효량을 포함한다. 구 "약제학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"은 사람에게 투여될 시, 불리한 알러지 또는 기타 불리한 반응을 초래하지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 항세균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 용도가 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상의 매질 또는 제제가 활성 성분과 혼용가능하지 않은 경우를 제외한, 치료학적 조성물에서의 이의 용도가 고려된다.
다음의 완충액 및 시약이 본 발명의 약제학적 제제의 제조에 사용하기 위해 특히 고려된다: dgRTA, 탈당화 리신 A쇄; DMF, 디메틸포름아미드(Pierce, Rockford, I11.); DTT(Pierce); 1mM EDTA를 사용하여 pH 7.5로 조정한 PBE, 0.05M 인산나트륨; 다양한 농도의 NaCl(예를 들면, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M 및 0. 5M NaCl) 및 1 mM EDTA를 사용하여 pH 7.5로 조정한 PBES, 0.05M 인산나트륨 및; 0.17M NaCl 및 1 mM EDTA를 사용하여 pH 7.5로 조정한 PBSE, 0.01M 인산나트륨; SMPT, N-석신이미딜-옥시카보닐-α-메틸-α(2-피리딜디티오)톨루엔(Pierce). 효소 구배 염을 사용한 내독소가 없는 증류수를 사용하여 모든 완충액을 제조할 수 있다(문헌[참조: Fisher Biotec, Springfield, N. J.]).
IT, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 및/또는 사이토킨을 비경구 투여용으로 제형화(예를 들면, 정맥내, 근육내 또는 피하내 경로를 통한 주사용으로 제형화)할 수 있지만, 에어로졸 투여와 같은 다른 경로를 사용할 수 있다. 활성 성분으로서 하나 이상의 IT, 단백질성 물질 및/또는 사이토킨을 함유하는 수성 조성물의 제조가 본원을 고려한 당해 분야의 숙련가에게 공지될 것이다(예를 들면, 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences,16th Ed. Mack Publishing Company, 1980]에 예시된 바와 같은). 추가로, 사람 투여를 위해, 제제가 FDA 사무국의 생물학적 기준에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열성, 일반적 안정성 및 순도 기준을 충족시켜야 함을 이해하게 될 것이다.
통상, 이러한 조성물은 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있으며; 주사 전 액체의 첨가에 따라 용액 또는 현탁액을 제조하는 데 적합한 고체 형태로서 또한 제조될 수 있으며; 당해 제제는 또한 유화될 수 있다. 당해 조성물을 멸균시키고, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유동적이 되게 하고, 제조 및 저장 조건하에서 안정하며 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존될 수 있게 할 것이다. 내독소 오염은 안전 수위(예를 들면, 단백질 mg당 0.5ng)에서 최소한으로 유지될 수 있을 것으로 사료된다.
IT, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 및/또는 기타 비활성 성분을 함유하는 멸균수에서 제조된 사이토킨의 용액을 주사용으로 적합하도록 제조하는 것이 가장 바람직하지만, 이러한 활성 성분의 용액은 또한 필요에 따라, 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 함께 적합하게 혼합하여 제조할 수도 있다. 분산액은 또한 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 및 오일중에서 제조될 수 있다. 담체는 또한 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 피복물을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지시킴으로써 그리고 계면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다.
각종 항세균 및 항진균제(예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등)에 의해 미생물의 작용을 예방할 수 있다. 많은 경우, 등장제(예를 들면, 당 또는 염화나트륨)을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 제제(예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)를 사용하여 주사용 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
제형화시, 치료학적 유효량의 용액을 용량 제형과 화합성 방식으로 투여할 것이다. 예를 들면, 수용액의 비경구 투여를 위해, 필요에 따라 당해 용액을 적합하게 완충시키고 액체 희석제를 우선 충분한 염수 또는 포도당을 사용하여 등장액이 되게 할 것이다. 이들 특정한 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하내 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질이 본원을 고려한 당해 분야의 숙련가에게 공지될 것이다. 용량에의 일부 변형이 치료받을 피검체의 조건에 따라 필수적으로 발생할 것이다. 임의의 경우에, 투여를 담당한 사람은 개별 피검체에 적합한 용량을 판단할 것이다.
특히, 적합한 약제학적 IT, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 조성물은 일반적으로 접합체를 고려하여 최종 농도 약 0.25 내지 약 2.5mg/ml을 수득하기 위해 예를 들면, pH 7.5 내지 9.0에서 0.15M NaCl 수용액에서, 허용가능한 약제학적 희석제 또는 부형제(예를 들면, 멸균 수성용액)와 혼합시킨 약 10 내지 약 100mg의 목적하는 IT 접합체, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않음이 고려된다. 당해 제제는 최소한 1년 동안 -10℃ 내지 -70℃에서 동결 저장될 수 있다.
F. 킷트
추가의 양태에서, 본 발명은 IT 또는 상기한 백신접종 방법으로 사용하기 위한 킷트에 관한 것이다. VLS 촉진 또는 독성 효과가 감소된 독소, 사이토킨 또는 항원성 조성물을 킷트에 제공할 수 있다. 이러한 킷트는, 독소를 특정 항체와 결합하여 IT를 생산하고, 독성이 감소된 사이토킨을 제공하거나 사용하기에 용이하고 저장가능한 용기에 백신접종용 항체를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, VLS 유발 서열의 펩타이드 억제제 또는 일혈의 단백질성 증강제를 킷트에 포함시킬 수 있다. 그러나, 이러한 성분의 배합을 포함하는 킷트를 제공할 수 있다. 따라서 당해 킷트는 적합한 용기 매체에, 감소되거나 증진된 VLS 촉진 활성을 갖는 단백질성 조성물을 포함할 것이다. 당해 킷트는 적합한 용기 매체내에 항체 또는 IT를 포함할 것이다.
킷트의 용기 매체는 일반적으로 하나 이상의 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 위치할 수 있고/거나 바람직하고 적합하게는 분취될 수 있는, 하나 이상의 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 병, 주사기 및/또는 기타 용기 매체를 포함할 것이다. 본 발명의 킷트는 시판용으로 밀폐된 하나 이상의 항체, IT 및/또는 임의의 기타 시약 용기를 함유하는 매체를 포함할 수 있다. 이러한 용기는 바람직한 바이알이 보존된 주입식 및/또는 취입식으로 주조된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 입증하기 위해 포함시켰다. 당해 분야의 숙련가는 다음의 실시예에 개시된 기법이 본 발명의 실행에서 잘 작용하 도록 본 발명자에 의해 개발된 기법을 나타내며, 따라서 이의 실행을 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 당해 분야의 숙련가들은 본원을 고려하여, 개시된 특정 양태에 많은 변화가 있을 수 있으며 본 발명의 영역 및 정신을 벗어나지 않으면서 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1
혈관누출증후군을 개시하기 위한 구조 모티프
당해 실시예는 독소 및 IL-2 내의 3개의 아미노산 서열 모티프, (x)D(y)가 혈관 EC를 손상시킴을 입증한다. 측면 글라이신 및 시스테인을 함유하는 RTA 또는 IL-2로부터의 짧은(<20개 아미노산) (x)D(y) 모티프 함유 펩타이드 및 결실 또는 돌연변이된 서열을 갖는 펩타이드를 제조하였다. 이들 펩타이드를 시스테인을 통해 HUVEC와 반응하지 않는 마우스 IgG1 MAb(RFB4)에 부착시켰다. 3개의 VLS 모형 시스템에서 당해 IgG-펩타이드 접합체(IgG-RTA)의 VLS-유발 능력을 비교하였다. 제1은 사람 제대 내피세포(HUVEC)에 대한 시험관내 손상이었으며(문헌[참조: Soler-Rodriguez et al., 1993]); 제2는 마우스 폐에서의 생체내 체액 축적이었으며(문헌[참조: Baluna and Vitetta, 1996]); 제3은 SCID 마우스 내에서의 생체내 사람 피부 이종이식체였다(문헌[참조: Baluna and Vitetta, 1999]).
펩타이드 합성. 가용성을 향상시키기 위해 첨가한 N- 및 C- 말단 글라이신 잔기를 갖는, RTA로부터의 13개의 아미노산을 나타내는 펩타이드(잔기 69-81, 서열번호 1)을 합성하였다. (x)D(y) 모티프를 함유한 펩타이드는 당해 펩타이드의 각 각의 끝에 추가로 3개의 측면 글라이신을 갖는 것이라도 가용화시키기 어렵다. 이러한 이유로, 이들을 가용성 담체 단백질에 접합시켰다. RFB4-dgRTA가 원형 IT이기 때문에 MAb RFB4를 선택하였으며, 따라서 RFB4-펩타이드는 IT를 "모방"해야 한다.
N-말단 시스테인을 첨가하여 RFB4 MAb에 펩타이드를 커플링시켰다. 2개의 RTA 대조군 펩타이드(표 6)를 합성하였다. IL-2로부터의 잔기 15 내지 23을 나타내는 9개의 아미노산의 펩타이드 및 대조군 펩타이드(표 6)를 또한 합성하였다. 다시, 측면 글라이신 및 시스테인을 첨가하였다. 모든 펩타이드를 기구[Applied Biosystems Model 430A Solid-phase Peptide Synthesizer] 상에서 합성하였다.
RFB4에 대한 펩타이드의 접합. 모든 펩타이드는 말레이미드-유래 RFB4와의 접합을 촉진시키기 위한 N-말단 시스테인 잔기를 함유한다. RFB4를 25몰 과량의 석신이미딜 4-(N-말레이미드메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트로 처리하고 과량의 시약을 겔 여과에 의해 제거하였다. RFB4의 각각의 분자에 도입된 다수의 말레이미드 그룹을 엘만(Ellman) 시약을 사용한 2-머캅토에틸아민의 역적정에 의해 측정하였다(문헌[참조: Husain and Bieniarz, 1994]). 유도된 RFB4를 10배 과량의 SH-펩타이드로 실온에서 4시간 동안 반응시키고 과량의 펩타이드를 PBS에 대한 투석에 의해 제거하였다. 말레이미드 반응은 다수의 펩타이드 그룹이 부착된 IgG1-C-S-펩타이드 접합체의 형성이 말레이미드 그룹이 없는 것과 유사하게 하였다.
Figure 112005022871818-pct00008
HPLC 및 방사선표지 둘 다에 의해 측정된 바와 같이, RFB4-펩타이드 접합체(표 6)은 IgG1 분자 당 6개 내지 9개의 말레이미드 그룹을 함유하였으며 이들 그룹은 시스테인-함유 펩타이드와의 반응에 의해 안정한 티오에테르 결합을 형성하였다.
HUVEC 단일층의 형태에 대한 RFB4-펩타이드의 효과. RTA 내의 LDV 서열 및 IL-2내의 LDL 서열이 HUVEC를 손상시키는지의 여부를 판단하기 위해, 단일층을 상이한 농도의 RFB4-RTA-펩타이드, RFB4-IL-2-펩타이드 또는 대조군과 함께 항온처리하였다. HUVEC를 분리하고, 배양하고 미시적으로 연구하였다(문헌[참조; Baluna et al., 1996; Soler-Rodriguez et al, 1993]).
HUVEC 단일층을 37℃에서 18시간 동안 10-6M RFB4-LDV+, RFB4-LDV-, RFB4-GOT, RFB4-LDL+, RFB4-LDL-와 함께 또는 배지만으로 항온처리한 후 상-대조 현미경(배율 20x)으로 조사하였다. 손상된 세포는 둥글고 플레이트로부터 탈착되어 있는 반면, 정상 단일층은 신장된 형태를 갖는 고도로 밀집된 세포로 이루어져 있었다. 처리되지 않은 HUVEC는 치밀하게 밀집된 신장된 세포로 이루어져 있었다. 10-6M RFB4-LDV+ 또는 항온처리 2시간 후에 세포 환형화를 유발하였으며 18시간 후에 단일층 내에 틈을 형성하였다. HUVEC에 대한 독성 효과는 RFB4-LDV-, RFB4-GOT 또는 RFB4-LDL-를 사용하여서는 관찰되지 않았다. LDV 또는 LDL을 함유하는 RFB4-펩타이드의 독성 효과는 용량-의존적이었으며 RFB4-dgRTA를 사용하여 관찰된 효과에 필적하였다(표 7). 이들 결과는 RTA 내의 LDV 서열 및 IL-2 내의 이의 LDL 동족체가 이들 제제의 EC에 관여되어 있음을 나타낸다.
Figure 112005022871818-pct00009
1HUVEC를 96웰 조직 배양 플레이트에서 합류점까지 배양시켰으며 세포를 2% FCS를 갖는 M199에서 18시간 동안 상이한 농도의 RTA-유래 펩타이드-작제물로 처리하였다.
2형태학적 변화는 "-" 변화 없음, "+" 세포의 환형화 및 "++" 파쇄 및 세포 단일층으로부터의 세포의 탈착으로 기록하였다.
RFB4-펩타이드의 생체내 효과. IL-2의 혈관 독성이 실험 동물에서 관찰되었지만(문헌[참조: Orucevic and Lala, 1995; Puri et al., 1989; Puri and Rosenberg, 1989; Rosenstein et al., 1986]), 이것이 마우스, 랫트 또는 원숭이에서 VLS의 dgRTA-IT-매개된 전신계적 전이를 유도하기는 어렵다(문헌[참조: Soler-Rodriguez, 1992]). SCID 마우스에 도관성 사람 세포를 이식하고, 마우스에 dgRTA-IT를 주사하고 습윤/무수 중량비로서 당해 이식체의 체액 축적을 측정함으로써 생체내에서 사람 내피에 대한 IT의 효과를 연구하기 위한 모델이 개발되어 왔다(문헌[참조: Baluna et al., 1998]). 사람 피부내의 체액 축적을 동결 건조 전후에 피부 이식체의 천공 생체조직절편을 칭량함으로써 측정하였다. 당해 모델을 사용하여 생체 내에서 RFB4-LDV+, RFB4-GQT+, 및 RFB4-dgRTA의 효과를 측정하였다(도 1A).
IL-2가 마우스의 폐내의 체액 축적을 유도하기 때문에 정상 SCID 마우스의 폐내의 체액 축적을 또한 측정하였다(문헌[참조: Orucevic and Lala, 1995]). 폐 또는 피부 이종이식체의 수분 함량을 습윤/무수 중량비로 계산하였다.
RTA-IT를 주사한 마우스 내에서의 VLS의 전신계적 전이를 입증하는 것은 어렵지만, 혈관 누출은 SCID 마우스내의 사람 피부 이종이식체에서 발생한다. RFB4-LDV+ 및 RFB4-dgRTA의 주사 후의 사람 피부 이식체의 습윤/무수 중량비의 증가가 나타났지만, RFB4-GOT+의 주사 후에는 나타나지 않았다. 이들 이종이식체에서의 체액 축적을 RFB4-dgRTA 또는 RFB4-LDV+를 사용하여 대조하였다. SCID 마우스 폐를 사용하여 필적할만한 결과를 수득하였다(도 1B). 비록 당해 도면에는 작은 차이가 나타날 수 있지만, 이들은 통계학적으로 현저하며 IL-2를 사용한 결과와 일치한다(문헌[참조: Orucevic and Lala, 1995]).
HUVEC에 대한 dgRTA 및 RFB4-펩타이드의 결합의 유동 세포계수 분석. RFB4-LCV+ 및 RFB4-LDL+ 손상 HUVEC은 사실은 비록 미처리 IL-2 또는 RTA 분자 내에서, (x)D(y) 모티프가 EC에 대한 주요한 결합 위치는 아닐 수 있지만, 이들 펩타이드가 HUVEC 상의 결합 위치와 상호작용함을 나타낸다. 독소를 이용하여 이들 주제를 검토하기 위해, 일련의 결합 및 결합/억제 연구를 수행하였다.
단백질을 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)(Sigma, St. Louis, MO)에 커플링시켰다. 105개의 HUVEC를 1% 소혈청 알부민(BSA) 및 0.01% 나트륨 아지드를 함유하는 냉 PBS(PBS/BSA/AZ)로 2회 세척하고, 동일한 완충액 100㎕에 재현탁시키고 암실에서 빙상에서 30분 동안 FITC-시약과 함께 항온처리하고, PBS/BSA/AZ로 3회 세척하고, 1% 파라포름알데하이드 PBS/AZ 0.5㎖에 고정시키고 기구[FACScan(Becton Dickinson, Mountain View, CA)] 및 CytoQuest 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
HUVEC에 대한 dgRTA, PE38-lys 및 RFB4-펩타이드의 결합을 조사하였다. 105개의 HUVEC를 다양한 농도의 PBS/BSA/AZ 100㎕ 중 FITC-시약으로 30분 동안 빙상에서 항온처리하고, 세척하고, 1% 파라포름알데하이드에 고정시키고 유동 세포계수법으로 분석하였다. 당해 값은 대조군으로서 FITC-dgRTA, FITC-PE38-lys 및 FITC-탄산탈수효소를 사용한 3회의 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. dgRTA, PE38-lys 및 탄산탈수효소의 HUVEC에 대한 결합의 유동 세포계수 분석의 도수분포표를 제조하였다. FITC-RFB4-LDV+(▲), FITC-RFB4-LDV-, FITC-RFB4-GQT+, FITC-RFB4, FITC-RFB4-LDL+ 및 FITC-RFB4-LDL-의 결합을 또한 측정하였다. RFB4-LDV+, RFB4-LDL+ 및 RFB4의 도수분포표를 또한 제조하였다. 이러한 연구 결과는 FITC-dgRTA 및 FITC-PE38-lys의 최대 결합 중 50%가 각각 105개의 세포 당 0.035㎍및 100㎍ 이상을 필요로 함을 증명하였고, 이는 dgRTA는 HUVEC에 대해 PE38-lys보다 3로그 초과 높은 상대 결합 친화성을 가짐을 입증하는 것이었다. 이는 HUVEC에 대한 LDV 리포터 유전자가 PE38-lys내의 상동성 서열에 대한 저친화성을 가지고/거나 RTA내의 LDV가 보다 노출되어 있다는 사실에서 기인할 수 있다. 또한 RTA내의(PE38-lys내에서는 아님) 다른 비상동성 서열이 HUVEC에 결합할 수 있다. FITC-dgRTA(0.035㎍/105개 세포/100㎕) 및 FITC-RFB4-LDV+(0.5㎍/105개 세포/100㎕)의 상대 결합 친화성 사이의 차이는 몰 기준으로 계산한 경우, 단지 2배였다. 결실되거나 돌연변이된 LDV 서열을 갖는 RFB4-펩타이드 접합체는 HUVEC에 결합하지 않았지만, (x)D(y) 모티프는 명백하게 당해 결합에 관련되어 있다.
dgRTA 및 RFB4-펩타이드의 HUVEC에 대한 결합 억제. RTA의 HUVEC에 대한 결합에서 (x)D(y) 모티프의 역할에 대한 추가의 증거를 제공하기 위해, 일련의 결합 억제 연구를 수행하였다. 20 내지 25%의 최대 결합을 나타내는 농도의 FITC-dgRTA 또는 FITC-RFB4-LDV+(dgRTA용으로는 0.035㎍/105개 세포 및 RFB4-LDV+용으로는 0.5㎍/105개 세포)를 100배 과량의 dgRTA(Inland Laboratories, Austin, Texas), RFB4-LDV+, RFB4, Fn(GIBCO Laboratories, Grand Island, NY) 또는 PE38-lys(NCI, Bothesda)의 존재 또는 부재하에 HUVEC와 함께 30분 동안 암실에서 빙상에서 항온처리하였다. 세척된 세포를 1% 파라포름알데하이드에 고정시키고 FACS 상에서 분석하였다.
HUVEC에 대한 FITC-dgRTA의 결합이 dgRTA에 의해 90% 초과 및 RFB4-LDV+에 의해 60% 초과로 억제되었으며, 이는 dgRTA의 결합이 특이적이며 이것이 최소한 부분적으로 LDV 서열에 포함됨을 나타낸다(도 2A). PE38-lys를 함유하는 상동체가 dgRTA의 결합을 억제할 수 없다는 사실은(도 2A) HUVEC에 대한 이의 상대적 친화성이 3로그 이상 낮다는 사실에 기인할 수 있다. 추가로, dgRTA는 RFB4-LDV+가 이의 결합을 100%는 아니지만 60% 억제하였다는 사실에 의해 제안된 바와 같이, HUVEC에 대한 추가의 비상동성 결합 부위를 가질 수 있다. 추가로, 역연구에서는, dgRTA 및 RFB4-LDV+ 둘 다 HUVEC에 대한 FITC-RFB4-LDV+의 결합을 유사한 정도로 억제하였으며(도 2B), 이는 RTA내의 LDV 서열이 HUVEC에 대한 결합에 관련되어 있음을 나타낸다. 놀랍게도, PE38-lys는 매우 효과적으로 HUVEC에 대한 FITC-LDV+의 결합을 억제하였으며, 이는 이의 LDV 상동성 서열 중 하나 이상이 LDV-함유 펩타이드의 결합을 위해 LDV 모티프와 경쟁할 수 있음을 나타낸다. PE38-lys 내의 하나 이상의 상동성 서열(GDL-348-350; GDV-430-432; 또는 GDL-605-607)이 HUVEC에 결합하여 이를 손상시킬 수 있다고 사료된다. Fn 또한 FITC-dgRTA(도 2A) 및 FITC-RFB4-LDV+(도 2B) 둘 다의 HUVEC에 대한 결합을 억제하지만, 덜 효과적이었다. 이와 관련하여, 비록 Fn도 또한 LDV 모티프를 함유하지만, 이는 LDV 모티프의 가용성에 관여할 수 있는 상이한 측면 잔기를 갖는다.
상기한 데이터는 RTA내의 LDV 모티프 및 IL-2내의 LDL 모티프를 함유하는 펩타이드가 RFB4 MAb에 부착될 시에 시험관내에서 HUVEC에 특이적으로 결합하여 이를 손상시킴을 입증한다. IgG-펩타이드 접합체 및 IgG-RTA IT는 내피 세포 손상 유도에 동등한 효과를 가졌으며 3종류의 모형 모두에서 혈관 침투성을 증가시켰다.
RTA 내의 LDV 서열은 생체내에서 VLS-유사 징후를 초래하는 사건의 개시를 담당할 수 있기 때문에, 천연(돌연변이되거나 결실되지 않은) LDV 서열을 함유하는 RFB4-RTA-펩타이드의 주사가 폐 및 사람 피부 이종이식체 내에서 RFB4-dgRTA IT와 유사한 방식으로 혈관 누출을 유발한다. dgRTA는 HUVEC에 결합하기 위해 이의 LDV 서열을 사용하기 때문에(최소한 부분적으로), 이의 모티프를 함유하는 펩타이드 또는 단백질이 HUVEC에 대한 RTA의 용량-의존적 포화가능 결합을 억제하였다.
RTA 내의 LDV 및 IL-2 내의 LDL의 입체도는 이들 모티프가 부분적으로 노출되어 있으며 세포와 상호작용 할 것임을 나타낸다. RTA에 대하여, 이는 시험관 내에서의 HUVEC에 대한 이의 용량 의존성 포화가능 결합에 의해 지지된다. HUVEC에 대한 RFB4-LDV+의 결합은 dgRTA 뿐만 아니라 LDV 또는 LDV-상동체(즉, Fn 및 PE38-lys)를 함유하는 단백질에 의해서도 억제될 수 있기 때문에, 이는 추가로 몇몇 분지 분자 내의 (x)D(y) 모티프 내의 작용적 보존을 나타낸다. 이러한 서열 내의 결실 또는 돌연변이 또는 비-손상 차단 펩타이드의 사용은 각종 식물 또는 세균성 독소를 사용하여 제조한 IL-2 및 IT 둘 다의 치료학적 지수를 증가시킬 수 있다.
실시예 2
dgRTA의 제조 및 정제
제조원[Inland Laboratories]이 dgRTA를 제조하여 왔다. 그러나, 다음의 실시예는 본 발명에 사용하기 위한 dgRTA의 생산 과정을 기술한다.
미분시킨 아주까리 아세톤 추출물이 출발 물질이다. 리신을 당해 분말로부터 추출하고, 당해 리신을 탈당화시키고, A 및 B 쇄로 분리하고, dgRTA를 정제한다.
벌크 원료인 미분시킨 아주까리 아세톤 추출물을 제조원[Sigma Bulk Chemical Sales]으로부터 구입할 수 있다. 분말 200그람을 함유하는 1.0L 용량의 플라스틱병에 당해 물질을 담는다. 당해 병을 과정이 개시될 때까지 밀폐 캐비넷에 보관한다.
표 8은 당해 과정에 필요한 완충액 및 용액의 조성물을 나열하며 표 9는 완충액 및 용액에 대한 명세 사항을 나열한다. 표 10은 dgRTA의 제조 및 정제에 사용된 장비를 나열하며 표 11은 당해 과정에 사용된 단계 및 칼럼의 요약을 제공한다.
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Figure 112005022871818-pct00011
Figure 112005022871818-pct00012
Figure 112005022871818-pct00013
* 모든 칼럼은 음성 압력 냉장고에서 4℃에 보관한다
벌크 리신의 추출: 각각의 추출물 배치는 아주까리 분말의 2개의 병으로 이루어질 수 있다. 이들을 생물안전캐비넷(후드)에서 열고, PBS 1.0L를 각각의 병에 첨가한다. 각각의 병을 원래의 마개로 밀봉하고, 후드 안의 회전식 교반기에 두고, 실온에서 1시간 동안 분당 200주기의 속도로 교반한다. 당해 병을 4℃에서 30분 동안 둔 후 미립자군을 침전시킨다. 각각의 병으로부터의 상층액을 덮개 또는 홈통이 있는 중간 용기에 붓고, 당해 용기로부터 액체를 750㎖들이 플라스틱 원심분리 병에 붓는다(단계 둘 다 후드 안에서 수행한다). 이들을 후드에서 꺼내기 전에 원심분리 병을 밀봉하고 젖은 종이 타올로 닦아낸다. 당해 원심분리 병을 원심분리기의 운반체에 넣고 4℃에서 20분 동안 3,700rpm의 속도로 원심분리한다. 원심분리 병을 제거하고, 후드로 옮겨 상층액을 제거하고 Technicloth TX609 종이를 통해 6L들이 삼각플라스크로 여과시킨다.
제2의 추출을 수행한다. 2개의 팩토리(factory) 병내의 침전물을 1.0L들이 PBS로 재현탁시키고 실온에서 1시간 동안 교반시킨 후 원심분리 및 여과하는 단계를 포함하는 추출 과정을 반복한다.
리신의 정제: 다음의 모든 과정을 4℃에서 음압 크로마토그래피 박스에서 수행한다.
제1 및 제2의 추출물 둘 다를 모으고 Whatman 90377A(1.0pm) 캡슐 여과기를 통해 여과한다. 280nm에서 흡광도를 측정하고 당해 분말로부터 추출된 총 단백질을 계산하고 기록한다.
이어서 청정한 상층액을 플라스크로부터 산-처리된 세파로스 4B 칼럼 상으로 펌핑(pumping)시킨다. 결합되지 않은 분획을 수집하고, 오토클레이빙하여 제거한다. 결합된 분획은 BB + 0.2M 갈락토스로 용출시킨다(도 3). 당해 용출액을 CH2 Amicon 농축기내에 직접적으로 수집하여 1.5L로 농축시킨다. 당해 농축액을 플라스크로 옮기고 용적을 측정한다. 분취액을 사용하여 280nM에서 흡광도를 측정하고 ODU 내의 총 단백질을 기록한다.
당해 단백질을 플라스크로부터 AA로 평형화시킨 Sephacryl S-200 칼럼 상으로 펌핑시킨다. 피크 1(RCA1 = 리신 아글루티닌) 및 피크 2(RCA = 리신 독소)의 분리는 피크 1 및 피크 2 사이의 280nm에서의 최저 흡광도로 측정한다(도 4 참조).
제1 피크는 리신 아글루티닌을 함유하며 이는 제거한다. 제2 피크는 리신을 함유하며, 이를 Amicon 농축기내로 직접적으로 수집하여 2.5mg/㎖로 농축시킨다. 용적, DO 280 및 mg 단위의 단백질의 총량을 기록한다. 리신을 농축기로부터, 젖은 종이 타올로 닦아낸 후 크로마토그래피 냉각기에서 꺼낸 밀폐된 용기내로 펌핑한다.
리신의 탈당화: 리신 용액을 함유하는 용기를 후드 안에서 개봉한다. 동량의 탈당화 완충액을 첨가한다. 당해 용기를 밀봉하고, 닦아내어 크로마토그래피 냉각기에서 4℃에서 4시간 동안 항온처리한다. 이어서 당해 용기를 후드 안에 두고, 개봉하여 반응을 중단시키기 위해 글리세롤을 최종 농도 1%가 되도록 첨가한다. 당해 용기를 다시 밀봉하고, 닦아내어 크로마토그래피 냉각기에 두고 밤새 4℃에서 보관한다.
리신 A 및 B쇄의 분리 및 dgRTA의 정제: 밤새 항온처리한 후, 당해 용기를 냉각기에서 꺼내어 후드안에 둔다. 당해 용기를 개봉하고 트리스를 pH가 8.0이 될 때까지 첨가한다. 중화된 리신 용액을 크로마토그래피 냉각기 내에 일렬로 함께 연결시킨 2개의 칼럼 내로 펌핑한다. 제1 칼럼은 DEAF-세파로스를 함유하며 제2 칼럼은 산-처리된 세파로스 4B를 함유한다. 칼럼 둘 다를 BB를 사용하여 평형화시킨다. DEAE-세파로스 칼럼의 목적은 내독소를 결합시키는 것이다. 일단 산-처리된 세파로스 413 칼럼으로부터의 방류액의 280nm에서의 흡광도가 0.05 ODU(피크 1의 말단, 도 5)로 떨어지면, 리신을 DEAE 세파로스 칼럼으로부터 산-처리된 세파로스 4B 칼럼(여기에서 결합된다)으로 통과시킨다.
피크 1은 산-처리된 세파로스 4B에 결합되지 않은 소량의 dgRTA를 나타낸다. 이어서 당해 칼럼을 분리하고 환원성 BB를 280nm에서의 흡광도가 환원성 BB의 흡광도(0.12 ODU)와 동일해질 때까지 산-처리된 세파로스 4B 칼럼 내로 펌핑한다. 이어서 펌핑을 중단하고 당해 칼럼을 4℃에서 4시간 동안 항온처리한다. 이 시간 동안, 리신 A 및 B쇄 사이의 S-S 결합이 감소되어 2개의 쇄가 분리된다.
리신 B쇄는 산-처리된 세파로스 413 칼럼에 결합된 채이다. 이어서 당해 칼럼을 환원성 BB로 세척하고 유리 dgRTA를 수집한다(피크 2, 도 5). 280nm에서의 흡광도가 환원성 BB의 흡광도로 회귀되었을 때 수집을 중단한다. 수집된 방류액(dgRTA 용액)의 OD 280을 측정하고 당해 용적 및 ODU 단위의 단백질 농도를 기록한다.
산-처리된 세파로스 4B 칼럼을 BB + 0.2M 갈락토스로 용출시키고 용출된 리신 B쇄를 제거한다.
이어서 환원성 BB 중 dgRTA 용액을 BB로 평형화시킨 블루-세파로스 CL-4B의 칼럼 상에 펌핑시키고 4℃에서 유지시킨다. 당해 칼럼을 280nm에서의 흡광도가 기저로 떨어질 때까지 BB로 세척한다. 이어서 당해 칼럼을 작은 피크가 용출되고(피크 2) 280nm에서의 흡광도가 기저값으로 회귀될 때까지 BB + 0.2M로 세척한다. 당해 과정을 적용하여 세파로스 기질과 상호작용 할 수 있는 모든 미량의 전체 리신 독소(RCA2) 또는 B쇄를 제거한다. dgRTA를 도 6, 피크 3에 나타낸 바와 같이 BB + 1M NaCl를 사용하여 블루-세파로스 칼럼으로부터 용출시키고 용적 및 280nm에서의 흡광도를 측정 및 기록한다.
이어서 당해 용출액을 BB로 평형화시킨 아시알로페투인(Asialofetuin)-세파로스 칼럼 상에 펌핑시키고 4℃에서 유지시킨다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 결합되지 않은 분획을 Amicon 농축기에서 여과시켜(흡광도가 0.05 ODU 초과일 때 시작하고 이 값이 0.05 ODU로 회귀될 때 종결시킴), NaCl 농도를 0.25M로 감소시키고 단백질 농도를 2mg/㎖로 증가시킨다. 이어서 DTT를 최종 농도 10mM이 되도록 첨가하고 당해 용액을 0.22μm 여과기를 통해 여과한다. 환원된 dgRTA 용액을 동량의 글리세롤과 혼합하고 -20℃에서 저장한다. 당해 칼럼을 BB + 0.2M 갈락토스로 용출시키고 용출액을 제거한다.
시험 및 명세사항: 표 12는 dgRTA에 대한 시험 및 명세사항을 나열한다.
Figure 112005022871818-pct00014
실시예 3
VLS를 감소시키거나 제거하는 측면 영역내의 변화
3차원 구조에서 LDV 서열 또는 당해 서열에 인접한 2개의 잔기 중 하나에 단일 잔기 변화를 갖는 재조합 (r)RTA 돌연변이체의 패널(예를 들면, R48 또는 N97)을 제조하였다. 통상 당해 후보자들은 다음의 기준을 충족시켜야 한다: 1) 높은 수율의 제조 및 장기 안정성; 2) 무세포 검정에서의 전체 효소 활성; 3) IT와 같은 우수한 세포독성; 4) SCID 마우스 내에서 IT로서 사용된 경우, 폐혈관누출(PVL)에 대한 유도 불능; 5) 야생형(wt) rRTA 보다 높은 LD50; 6) wt rRTA를 함유하는 IT의 약역학과 유사한 마우스 내에서의 약역학(PK); 및 7) 본 발명의 SCID/다우디 종양 모델에서의 RFB4-rRTA IT의 효능. 일반적으로, 당해 실시예에 사용된 물질 및 방법은 아래에 기술되어 있는 바와 같다.
플라스미드 및 돌연변이유발. IPTG-유도성 제어하의 wt rRTA를 갖는 pKK223 플라스미드는 영국 컨벤트리의 워릭 대학, 생명과학부의 J. Michael Lord가 쾌척하였다(문헌[참조: O'Hare et al., 1987 and Simpson et al., 1995]). 모든 DNA 조작은 표준 기법(문헌[참조: Sambrook et al., 1989])을 사용하여 수행하였다. 기구 [QuikChangeR (Stratagene, LaJolla, California)]를 사용하여 돌연변이를 유도하였고 돌연변이 프라이머의 쌍은 다음과 같다(상보적 쌍당 오직 하나의 프라이머만 나타내었으며, 돌연변이(들)은 밑줄이 그어져 있다):
Figure 112005022871818-pct00015
폐혈관누출. SCID 마우스(Taconic, Germantown, New York)에 3일에 걸쳐 체중g당 총 15㎍의 IT를 복강내 주사하였다. 최종 IT 주사 후, 이들에 마우스당 5-7μCi의 125I-표지된 알부민을 주사하였고 24시간 후, 오른쪽 폐의 125I 함량을 측정하고 염수-처리된 대조군과 비교하였다. 전신 및 혈액에서의 방사선 수준을 측정한 후 치사시켰다(데이타는 나타내지 않음).
치료학적 프로토콜. 파종된 다우디 림프종을 갖는 SCID 마우스를 상기한 바와 같이 마우스 당 100㎍의 각각의 IT, MAb 또는 PBS로 처리하였다. 마우스를 관찰하고 뒷다리 마비가 발생할 시에 치사시켰다. 로그-등급 및 Wilcoxon 검정을 사용하여 생존 곡선을 수행하였다(문헌[참조: Shah et al., 1993]). 마우스의 중간 생존 시간을 5% 유의미 수준에서 로그-등급 시험으로 계산하였다.
약역학. 실험을 통해 가당 음용수 중 0.05% 루골(Lugol) 용액을 18 내지 22g의 SCID 마우스에 제공하였다. 1 내지 5 x 107 cpm의 방사선 부하를 갖는 최대 용적 100㎕ 및 용량 5㎍의 방사선표지된 단백질을 꼬리 정맥에 정맥내 주사하였다. 전신 방사능을 주사 직후 AtomLab 100 용량 눈금측정기를 사용하여 6일 동안 일일 기준으로 계수하였다(문헌[참조: Atomic Products Corporation, Shirley, New York]). 결과는 초기 전신 방사능에 비교하여 나타내었다(%). 약역학 매개변수는 PKCALC 프로그램으로 비구분 모델을 사용하여 측정하였다(문헌[참조: Schumaker, 1986]).
돌연변이체 rRTA를 사용하여 제조한 rRTA 및 IT의 시험관내 활성. wt rRTA를 함유하는 플라스미드(벡터 pKK233내의)를 출발 물질로 사용하였다. LDV 서열에 보존적 변화를 갖는 몇몇의 돌연변이체(L74A, L74M, D75N, D75A, D75E, V76A 및 V76M을 포함) 및 LDV 서열에 인접한 표면 잔기 및 활성 부위로부터 멀리 위치한 표면 잔기에 보존적 변화를 갖는 몇몇의 돌연변이체(R48A 및 N97A)를 제조하였다(도 8). 정제된 rRTA 제제는 90% 초과의 순도였다(데이타는 나타내지 않음). 이어서 이들 돌연변이체 rRTA, wt rRTA 및 dgRTA의 효소 활성을 무세포 토끼 망상적혈구 검정에서 분석하였다(문헌[참조: Press et al., 1986]). 이들을 또한 마우스 IgG1 항-사람 CD22 MAb, RFB4(문헌[참조: Shen et al., 1988])에 접합시키고 환원시킨 후 무세포 망상적혈구 검정에서 다시 평가하였다. 최종적으로, IT를 본원에 기술한 바와 같이, 표준 시험관내 세포독성 검정으로 CD22-양성 다우디 세포 상에서 시험하였다.
표 14에 나타낸 바와 같이, 망상적혈구 검정에서 시험한 경우, wt rRTA가 조금 더 활성이긴 하지만, wt rRTA 및 dgRTA는 매우 유사한 활성을 가졌다. RFB4 MAb에 대해 커플링시킨 후, 둘 다 망상적혈구 검정에서 이들의 활성을 유지하였으며 이들은 다우디 세포 세포독성 검정에서 유사한 상대 활성을 가졌다. 6개의 RTA 돌연변이체, R48A, L74A, L74M, V76A, V76M 및 N97A는 망상적혈구 검정에서 활성이거나 dgRTA보다 더 활성이었다. 이들은 이들이 RFB4에 커플링되어, 환원 및 재시험된 후에도 이들의 활성을 유지하였다. L74A를 제외하고, 동일한 IT가 다우디 세포 세포독성 검정에서 고도의 활성을 가졌다.
Figure 112005022871818-pct00016
a12회 실험
b6회 실험
c20회 초과 실험
d1 미만이 활성 증가를 나타낸다
e돌연변이체당 3 내지 12회 실험
이들 6개의 돌연변이체와 대조적으로, D75A, D75E 및 D75N을 함유하는 rRTA 돌연변이체는 망상적혈구 검정에서 2 내지 9배 덜 활성적이었으며 다우디 세포 세포독성 검정에서 IT보다 200배 미만 덜 활성적이었다. 이들 결과를 기준으로 하여, R48A, L74M, V76A, V76M 및 N97A 돌연변이체를 추가의 시험을 위해 선택하였다.
RTA를 함유하는 IT의 생체내 PVL 유도 능력. 사람과 달리, RTA-함유 IT를 주사한 마우스는 전신계적 VLS를 전이시키지 않았지만, 이들은 PVL을 나타내었다(문헌[참조: Baluna et al., 1999 and Soler-Rodriguez et al., 1992]). 따라서 SCID 마우스에, 다우디 세포 스크리닝 검정을 "통과"하고 PVL을 관찰한 돌연변이체 rRTA로 제조한 IT를 주사하였다(문헌[참조: Rosenstein et al., 1986]). 마우스에 체중당 15㎍의, wt rRTA, dgRTA, L74M, V76A 또는 V76M을 함유하는 IT를 주사한 경우, PVL가 관찰되었다(도 9). 대조적으로, R48A 또는 N97A를 함유하는 IT는 PVL을 유도하지 않았다. 선행 방사선치료가 환자에게서 VLS를 악화시킬 수 있다는 본 발명의 이전의 관찰을 고려하여, 마우스를 IT 치료 전 150cGy로 예비-방사선처리하였지만, R48A 또는 N97A를 사용하여 제조한 IT에 대해서 어떠한 PVL도 관찰되지 않았다(데이타는 나타내지 않음).
RFB4-IT의 LD50. 2개의 RFB4-커플링된 돌연변이체 rRTA, R48A 및 N97A가 마우스에 독성인지의 여부를 판단하였다. 10마리의 마우스 그룹에 상이한 용량의 각각의 IT를 복강내로 주사하였다. 당해 동물들을 1주일 동안 매일 칭량하였다. 동물의 체중이 20% 감소되었을 때, 이들을 치사시켰는데, 이는 이러한 체중 손실이 항상 죽음을 초래하기 때문이다. RFB4-dgRTA 및 RFB4-wt rRTA의 LD50는 10㎍/g인 반면, RFB4-R48A 또는 RFB4-N97A의 LD50는 100㎍/g 초과였다(시험된 최고 용량). 따라서, R48A 및 N97A IT는 시험관내 다우디 세포 상에서 RFB4-dgRTA만큼 활성적이었지만, 마우스에 대해서는 10배 이상 덜 독성이었으며 RFB4-dgRTA와 동일한 용량에서 PVL을 유발하지 않았다.
돌연변이체 rRTA의 PK. RFB4-커플링된 돌연변이체 및 wt rRTA-IT 둘 다의 PK 및 생체내 안정성을 조사하였다. N97A 및 R48A를 사용하여 제조한 IT에 대한 각종 PK 매개변수를 wt rRTA를 함유하는 IT에 대해 관찰된 PK 매개변수들과 비교하였다(표 15). 이들 동물로부터의 혈청을 실험 마지막에 수집하여, SDS-PAGE로 조사하고 방사선사진촬영하였다. IT는 마우스에서 7일 후 뚜렷한 응집 없이 그대로였다(데이타는 나타내지 않음).
Figure 112005022871818-pct00017
1 곡선이하의 면적; 2 분획 이화율; 3 평균 체류 시간
생체내 돌연변이체 rRTA. N97A 및 R48A를 함유하는 IT가 실질적으로 전체 활성, 우수한 PK, 낮은 생체내 독성을 가지며 PVL을 유발하지 않기 때문에, 이들을 파종된 SCID/다우디 모델에서 RFB4-IT와 같이 생체내에서 평가하였다(문헌[참조: Ghetie et al., 1990]). R48A 또는 N97A를 사용하여 제조한 IT를 주사한 SCID/다우디 마우스는 각각 60 및 72일의 평균 마비 시간(MPT)을 가졌다(도 10). 따라서 RFB4-N97A는 선행 연구(MPT 73일)(문헌[참조: O'Hare et al., 1987])에서 사용된 RFB4-dgRTA만큼 효과적이었고, RFB4-R48A는 RFB4보다 통계적으로 유의한 개선을 나타내었다. 그러나, 둘 다 RFB4-wt rRTA(MPT 90일)보다 덜 효과적이다(도 10). N97A 및 R48A를 사용하여 제조한 IT의 LD50이 10배 초과 높기 때문에, 이들은 보다 높은 용량에서 dgRTA-IT(및 wt rRTA-IT)보다 효능이 뛰어나야 한다.
본원에 개시 및 청구한 모든 조성물 및/또는 방법은 본원을 고려하여 불필요한 실험 없이 제조 및 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태로 기술되었지만, 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 개념, 정신 및 영역을 벗어나지 않으면서 본원에 기술된 조성물 및/또는 방법 및 방법의 단계 또는 방법의 단계 순서에 변형이 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 보다 특히, 동일하거나 유사한 결과를 수득하면서 화학적 및 생리학적으로 관련된 특정 제제로 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음을 이해할 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 명백한 이러한 모든 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 정신, 영역 및 개념 내에 속하는 것으로 간주된다.
참조문헌
다음의 참조문헌이 본원에 기술된 사항에 대해 예시적 과정 또는 기타 상세한 보충을 제공하는 범위로 명확히 본원에 참조로서 인용되어 있다.
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Figure 112005022871818-pct00021
Figure 112005022871818-pct00022
<110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING TOXIC EFFECTS OF PROTEINACEOUS COMPOUNDS <130> UTFD:884WO <150> US 10/282,935 <151> 2002-10-29 <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 1 Met Val Pro Lys Gln Tyr Pro Ile Ile Asn Phe Thr Thr Ala Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Gln Ser Tyr Thr Asn Phe Ile Arg Ala Val Arg Gly Arg Leu 20 25 30 Thr Thr Gly Ala Asp Val Arg His Glu Ile Pro Val Leu Pro Asn Arg 35 40 45 Val Gly Leu Pro Ile Asn Gln Arg Phe Ile Leu Val Glu Leu Ser Asn 50 55 60 His Ala Glu Leu Ser Val Thr Leu Ala Leu Asp Val Thr Asn Ala Tyr 65 70 75 80 Val Val Gly Tyr Arg Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Phe Phe His Pro Asp 85 90 95 Asn Gln Glu Asp Ala Glu Ala Ile Thr His Leu Phe Thr Asp Val Gln 100 105 110 Asn Arg Tyr Thr Phe Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Asp Arg Leu Glu Gln 115 120 125 Leu Ala Gly Asn Leu Arg Glu Asn Ile Glu Leu Gly Asn Gly Pro Leu 130 135 140 Glu Glu Ala Ile Ser Ala Leu Tyr Tyr Tyr Ser Thr Gly Gly Thr Gln 145 150 155 160 Leu Pro Thr Leu Ala Arg Ser Phe Ile Ile Cys Ile Gln Met Ile Ser 165 170 175 Glu Ala Ala Arg Phe Gln Tyr Ile Glu Gly Glu Met Arg Thr Arg Ile 180 185 190 Arg Tyr Asn Arg Arg Ser Ala Pro Asp Pro Ser Val Ile Thr Leu Glu 195 200 205 Asn Ser Trp Gly Arg Leu Ser Thr Ala Ile Gln Glu Ser Asn Gln Gly 210 215 220 Ala Phe Ala Ser Pro Ile Gln Leu Gln Arg Arg Asn Gly Ser Lys Phe 225 230 235 240 Ser Val Tyr Asp Val Ser Ile Leu Ile Pro Ile Ile Ala Leu Met Val 245 250 255 Tyr Arg Cys Ala Pro Pro Pro Ser Ser Gln Phe 260 265 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 3 <211> 251 <212> PRT <213> Abrus precatorius <400> 3 Glu Asp Arg Pro Ile Lys Phe Ser Thr Glu Gly Ala Thr Ser Gln Ser 1 5 10 15 Tyr Lys Gln Phe Ile Glu Ala Leu Arg Glu Arg Leu Arg Gly Gly Leu 20 25 30 Ile His Asp Ile Pro Val Leu Pro Asp Pro Thr Thr Leu Gln Glu Arg 35 40 45 Asn Arg Tyr Ile Thr Val Glu Leu Ser Asn Ser Asp Thr Glu Ser Ile 50 55 60 Glu Val Gly Ile Asp Val Thr Asn Ala Tyr Val Val Ala Tyr Arg Ala 65 70 75 80 Gly Thr Gln Ser Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Pro Ser Ser Ala Ser Asp 85 90 95 Tyr Leu Phe Thr Gly Thr Asp Gln His Ser Leu Pro Phe Tyr Gly Thr 100 105 110 Tyr Gly Asp Leu Glu Arg Trp Ala His Gln Ser Arg Gln Gln Ile Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Gln Ala Leu Thr His Gly Ile Ser Phe Phe Arg Ser Gly 130 135 140 Gly Asn Asp Asn Glu Glu Lys Ala Arg Thr Leu Ile Val Ile Ile Gln 145 150 155 160 Met Val Ala Ala Ala Ala Arg Phe Arg Tyr Ile Ser Asn Arg Val Arg 165 170 175 Val Ser Ile Gln Thr Gly Thr Ala Phe Gln Pro Asp Ala Ala Met Ile 180 185 190 Ser Leu Glu Asn Asn Trp Asp Asn Leu Ser Arg Gly Val Gln Glu Ser 195 200 205 Val Gln Asp Thr Phe Pro Asn Gln Val Thr Leu Thr Asn Ile Arg Asn 210 215 220 Glu Pro Val Ile Val Asp Ser Leu Ser His Pro Thr Val Ala Val Leu 225 230 235 240 Ala Leu Met Leu Phe Val Cys Asn Pro Pro Asn 245 250 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 4 Cys Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Ala Leu Asp Val Thr Asn Ala Tyr 1 5 10 15 Val Gly Gly Gly 20 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 5 Cys Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Ala Thr Asn Ala Tyr Val Gly Gly 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> 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Claims (79)

  1. 약제학적으로 허용되는 담체; 및 서열번호 1에 제시된 천연 리신 A쇄 독소 아미노산 서열의 R48 또는 N97에서 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 리신 A쇄 독소를 포함하는 약제학적 조성물로서, 돌연변이된 리신 A쇄 독소가 피검체에서 서열번호 1에 제시된 서열을 갖는 천연 리신 A쇄 독소에 비해 혈관누출증후군 (VLS)을 촉진하는 능력이 감소된, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 독소가 효소적으로 활성인 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 독소가 효소적으로 활성이지 않은 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 독소가 R48에서 돌연변이를 포함하는 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, R48이 알라닌 잔기로 돌연변이된 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 독소가 N97에서 돌연변이를 포함하는 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, N97이 알라닌 잔기로 돌연변이된 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, R48과 N97이 모두 돌연변이된 약제학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 독소가 서열번호 1에 제시된 서열을 갖는 천연 리신 A쇄 독소의 위치 74, 75 및 76에서 발견되는 LDV 서열에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
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  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 서열번호 1에 제시된 천연 리신 A쇄 독소 아미노산 서열의 위치 97에 있는 아스파라긴 잔기에 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 리신 A쇄 독소로서, 돌연변이된 리신 A쇄 독소가 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 천연 리신 A쇄 독소에 비해 피검체에서 혈관누출증후군 (VLS)을 유도하는 능력이 감소된, 돌연변이된 리신 A쇄 독소.
  36. 제35항에 있어서, 돌연변이된 리신 A쇄 독소가 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 위치 48에 있는 아르기닌에서 돌연변이를 추가로 포함하는 돌연변이된 리신 A쇄 독소.
  37. 제36항에 있어서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 위치 48에 있는 아르기닌이 알라닌 잔기로 돌연변이된 리신 A쇄 독소.
  38. 제35항에 있어서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 위치 97에 있는 아스파라긴 잔기가 알라닌 잔기로 돌연변이된 리신 A쇄 독소.
  39. 제36항에 있어서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 위치 48에 있는 아르기닌이 알라닌 잔기로 돌연변이되고, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 위치 97에 있는 아스파라긴 잔기가 알라닌 잔기로 돌연변이된 리신 A쇄 독소.
  40. 제35항에 있어서, 돌연변이된 리신 A쇄 독소가 서열번호 1에 제시된 천연 리신 A쇄 독소의 위치 74에 있는 루이신 잔기, 위치 75에 있는 아스파테이트 잔기, 또는 위치 76에 있는 발린 잔기에서 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 돌연변이된 리신 A쇄 독소.
  41. 제35항에 있어서, 돌연변이된 리신 A쇄 독소가 리신 A쇄 독소의 효소적 활성을 갖는 돌연변이된 리신 A쇄 독소.
  42. 제35항에 있어서, 돌연변이된 리신 A쇄 독소가 리신 A쇄 독소의 효소적 활성을 갖지 않는 돌연변이된 리신 A쇄 독소.
  43. 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 변형된 리신 A쇄 독소를 포함하는 면역독소로서, 변형된 독소가, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 천연 독소에 비해 혈관누출증후군을 유도하는 독소 능력을 감소시키는, 서열번호 1에 제시된 R48 또는 N97 중 하나 이상에서 아미노산 돌연변이를 갖는 면역독소.
  44. 제43항에 있어서, 변형된 독소가 LDV 서열에서 돌연변이를 추가로 포함하는 면역독소.
  45. 제43항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 R48인 면역독소.
  46. 제45항에 있어서, R48이 알라닌 잔기로 치환되는 면역독소.
  47. 제43항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 N97인 면역독소.
  48. 제47항에 있어서, N97이 알라닌 잔기로 치환되는 면역독소.
  49. 서열번호 1에 제시된 리신 A쇄 독소 아미노산 서열의 R48 또는 N97에 있는 아미노산을 돌연변이시켜 돌연변이된 리신 A쇄 독소가 감소된 혈관누출증후군 (VLS) 유도 능력을 갖는 단계를 포함하여, VLS를 유발하는 리신 A쇄의 능력을 감소시키는 방법.
  50. 제49항에 있어서, R48이 알라닌 잔기로 돌연변이되는 방법.
  51. 제49항에 있어서, N97이 알라닌 잔기로 치환되는 방법.
  52. 제49항에 있어서, R48과 N97이 모두 돌연변이되는 방법.
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  59. a) 서열번호 1에 제시된 리신 A쇄 독소 아미노산 서열의 R48 또는 N97에 있는 아미노산을 돌연변이시켜 돌연변이된 리신 A쇄 독소가 감소된 혈관누출증후군 (VLS) 유도 능력을 갖는 단계; 및
    b) 상기 리신 A쇄 독소를 하나 이상의 항체 또는 항체 단편에 접합시켜 면역독소를 제조하는 단계를 포함하고, 상기 제조된 면역독소가 R48 및 N97에 있는 아미노산이 돌연변이되지 않은 유사 면역독소와 비교하여 감소된 VLS 촉진 능력을 갖는, VLS를 유도하는 능력이 감소된 면역독소를 제조하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 돌연변이된 리신 A쇄 독소가 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 위치 48에 있는 아르기닌에서 돌연변이를 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 위치 48에 있는 아르기닌이 알라닌 잔기로 돌연변이되는 방법.
  62. 제59항에 있어서, 돌연변이된 리신 A쇄 독소가 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 위치 97에 있는 아스파라긴에서 돌연변이를 포함하는 방법.
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  68. 제62항에 있어서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 위치 97에 있는 아스파라긴 잔기가 알라닌 잔기로 돌연변이되는 방법.
  69. 제59항에 있어서, 돌연변이된 리신 A쇄 독소가 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 위치 48에 있는 아르기닌 및 위치 97에 있는 아스파라긴 잔기 모두에서 돌연변이를 포함하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 위치 48에 있는 아르기닌이 알라닌 잔기로 돌연변이되고 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 위치 97에 있는 아스파라긴 잔기가 알라닌 잔기로 돌연변이되는 방법.
  71. 제59항에 있어서, 돌연변이된 리신 A쇄 독소가 서열번호 1에 제시된 천연 리신 A쇄 독소의 위치 74에 있는 루이신 잔기, 위치 75에 있는 아스파테이트 잔기, 또는 위치 76에 있는 발린 잔기에서 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 방법.
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  74. 제43항에 있어서, 아미노산 돌연변이가 R48 및 N97인 면역독소.
  75. 제43항에 있어서, 면역독소가 항체 단편을 포함하는 면역독소.
  76. 제43항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 면역독소.
  77. 제43항에 있어서, 항체가 암 세포, HIV-감염된 세포 또는 악성 T 세포에 대해 선택적인 면역독소.
  78. 제77항에 있어서, 암이 직장결장암, 유방암, 폐암, 흑색종, 난소암, 림프종 또는 백혈병으로 추가로 정의되는 면역독소.
  79. 제43항의 면역독소 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
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