KR101085695B1 - 항살모넬라균 항체를 포함하는 암 진단 마커를 검출하기 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항살모넬라균 항체를 포함하는 암 진단 마커를 검출하기 위한 조성물 및 키트에 관한 것이다. 상기한 본 발명은, 간편하고 경제적인 방법으로 용이하게 조기암 진단이 가능한 이점이 있고, 전이암의 예후진단 등에 유용하게 이용될 수 있다.

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Description

항살모넬라균 항체를 포함하는 암 진단 마커를 검출하기 위한 조성물{Composition for detection of tumor diagnostic marker containing Salmonella antibody}

본 발명은 항살모넬라균 항체를 포함하는 암 진단 마커를 검출하기 위한 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 간편하고 경제적인 방법으로 용이하게 조기암 진단이 가능한 항살모넬라균 항체를 포함하는 암 진단 마커를 검출하기 위한 조성물 및 검출키트에 관한 것이다.

암은 체내의 세포 일부가 돌연 이상분열을 일으켜 증식하는 질환이다. 암의 진단은 치료를 위한 가장 근본적인 대책으로 고려된다. 체내에 암이 생기면 건강할 때에는 거의 없는 특수 단백이나 효소, 호르몬 등이 혈액이나 요(尿) 중에 증가는 경우가 있다. 따라서 그것을 측정하면 암의 조기발견의 단서가 될 수 있는데 이 특수한 물질을 암 진단 마커라고 한다.

암 진단 마커는 1847년 다발성골수종 환자의 요 중에서 발견된 벤스존스 단백으로부터 시작된다. 그 후 면역, 혈청학의 발전과 더불어 종류도 증가하였다. 이러한 암 진단 마커들의 예로는, 유방암 진단에 유용한 CA27 및 CA29, 직장결장암 진단에 유용한 CEA, 췌장암 및 담즙관암에 유용한 CA19-9, 간세포암 및 비정상피종성 생식세포종 진단에 유용한 AFP, 비정상피종성 생식세포종 및 임신성융모성 질환의 진단에 유용한 b-HCG, 난소암 진단에 유용한 CA125, 및 전립선암 진단에 유용한 PSA 등이 알려져 있다.

한편 암의 진전 내지 확대 정도는, 조기암, 진행암, 말기암으로 표현된다. 이 중 조기암이란, 일반적으로 “진전이 국소에 머물러 있어 근본적인 치료의 가능성이 높은 초기의 암”을 말한다.

조기암은 기본적으로는 무증상으로 인해 조기암 진단은 어려움이 많다. 따라서 조기암을 완전에 가깝게 검출하기 위해서는 무증상의 피험자를 대상으로 하여야 하는데 간편하고 경제적인 방법이 현재 부족한 실정이다. 상술한 암 진단 마커 검사는 환자로의 침습이 적어 적합한 검사법이지만, 현시점에서는 암 진단 마커의 측정에 의해 조기암을 검출하는 것은 통상 불가능한 것으로 되어 있다.

또한 전이암의 경우 암이 발생한 부위에서 신체의 다른 부위로 퍼져나가는 암으로 혈액순환이나 림프순환을 통해 퍼져나간다. 실제 암 환자의 1/3이 진단 시에 이미 전이암도 같이 진단받는다. 암 치료 후 재발하는 전이암의 경우 발생 후 사망에 이르는 경우가 커서 효과적인 진단법의 개발이 절실한 상황이다.

따라서 조기암 또는 전이암 진단을 위해 간편하고 경제적이며 민감도가 높은 암 검출 조성물 및 키트에 대한 요구가 계속적으로 있어 왔다.

본 발명은 상기 종래기술의 문제점과 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 조기암을 간편하고 경제적인 방법으로 용이하게 진단할 수 있는 암 진단 마커를 검출하기 위한 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 암의 스테이지와 예후의 추정, 치료경과의 모니터링이 가능한 암 진단 마커를 검출하기 위한 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 항살모넬라균 항체를 포함하는 암 진단 마커를 검출하기 위한 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 항살모넬라균 항원과 반응하는 항살모넬라 항체를 포함하는 암을 검출하는 키트를 제공한다.

바람직하게는 상기 항원은 약독화된 살모넬라균을 검체에 투여하여 형성된 것이고, 뇨 중에 배출된 것이다.

나아가 본 발명은 항살모넬라균 항원과 반응하는 항살모넬라 항체를 포함하는 암의 스크리닝제를 제공한다.

또한 본 발명은 혈액 또는 뇨를 사용하여 암을 스크리닝하는 스크리닝제 또 는 키트를 제조하기 위한 항살모넬라 항원을 암 진단 마커로 사용하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명은 조기암의 검출 또는 전이암의 예후진단을 위한 항살모넬라균 항체을 포함하는 암 진단 마커를 검출하기 위한 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 항살모넬라균 항원과 반응하는 항살모넬라 항체를 포함하는 암을 검출하는 키트를 제공한다.

본 발명자는 암환자에게 있어서 정상인에 비해 세균에 대한 침착성이 높은 암세포를 갖고 있다는 점을 착안하였다. 곧 암세포에 대해 정상세포에 대비해 1000배 이상 축적되는 세균의 특성에 기인하여 암세포의 증가와 암세포에 증식되는 세균수의 증가가 비례할 것이라는 가정에서 전이암 또는 조기암에서의 암 진단의 수단으로의 가능성을 발견하였다.

특별히 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균주는 암세포에 특히 잘 부착되는 것으로 알려져 있으며 일부의 연구에 따르면 암세포의 증식 억제 및 암세포 파괴에도 관여하고 있다고 알려져 있다.

본 발명에서는 암세포에 부착되는 특성이 있는 살모넬라 균주의 특성에 착안하여 살모넬라 균주의 항원을 암 진단 마커로 활용하는 것을 제시한다. 살모넬라균은 혐기성, 호기성 호흡을 하여 인체 내에 감염되어 장내에 염증을 일으키는 것으로 알려져 있다. 그런데 특이한 것은 이런 살모넬라 균주는 암세포에도 특이적으로 번식할 수 있는 능력을 갖고 있음이 알려졌다. 이는 암세포에서 영양물질이 과다하게 발생하는 조건에 세균이 번식이 용이하여 모여드는 현상과 관련되어 있다. 또한 암세포 주위의 면역세포가 교란되어 면역공백상태의 조건이 세균이 체내 면역반응을 피해 서식하기 좋은 환경이 되어 모이는 결과라고 추리된다.

또한 살모넬라균은 세포내 기생성 균으로 일반적으로 장내에 감염되어 대식세포내로 뚫고 들어가 살 수 있는 것으로 알려져 있는데 이런 특성은 암 세포주에 대해서 암 세포주를 뚫고 들어갈 수 있는 현상을 유도하며 결과적으로 암의 억제와 관련되어 있다는 보고도 있다.

본 발명에서는 이런 특성을 이용하여 체내에서 쉽게 사라지는 약독화된 살모넬라균을 사용하였다. 즉, 약독화된 살모넬라균을 체내에 주입하고 정상인에게서는 쉽게 사라져버리지만, 암환자에서는 암세포근처에서 살모넬라가 번식하여 쉽게 죽지 않을 것이라는 가정하였다. 따라서 정상인에서 살모넬라균이 체내에서 사라질 무렵에 암환자의 경우 암세포의 근처의 살모넬라가 오래 번식하다가 체내에서 배출되어 살모넬라 항원을 뇨 중에 배출할 것으로 가정하였다. 이에 약독화된 살모넬라를 복용한 후에 체내에서 더 많은 살모넬라 균주의 항원을 배출하는 소변을 찾아서 암의 유무와의 상관관계를 측정하고 상관도가 있음을 확인하였다(도 1a 및 도 1b 참조). 즉, 암이 유도된 마우스의 뇨 중에 살모넬라균에 대한 양성반응이 정상시험군보다 높게 측정되었다. 이는 암 진단의 지표로 살모넬라균에 대한 항원검사기법이 적용될 수 있음을 나타내어 준다.

본 발명자들은 이들 사실을 토대로 암세포를 가진 환자군에서 살모넬라 균주 를 복용할 경우 살모넬라 균주가 암세포에 부착되어 서식이 증가할 것이며 이로 인해서 체내에서 대사 후에 뇨 중으로 배출되는 살모넬라 항원의 양이 증가함을 분석하여 암세포의 증식과 전이와 크기 상태를 보다 쉽게 판단 할 수 있는지 확인하였다(도 2 참조).

본 발명에 의한 조성물 및 키트는 혈액, 뇨 및 그 밖의 분비물 등 생물학적 시료를 이용할 수 있으며, 그 중 뇨는 침습성이 낮고, 용이하게 이용할 수 있어 유용하다. 다만 뇨 중 성분의 농도를 보다 정확하게 비교하기 위해서 공지의 크레아틴보정 등의 방법을 이용하여 뇨량 보정을 행할 수 있다.

본 명세서에서 암의 검출이란, 피험자의 생체 내의 암이 존재할 가능성이 높다고 판정하는 것을 의미한다. 검출에 대해서는 스크리닝이라는 용어는, 특히 임의의 집단을 대상으로 하여 암이 존재할 가능성이 높은 피험자의 대상을 좁히는 것을 목적으로 하여 행해지는 검사를 가리키는 용어이다. 한편, 스크리닝이 임의의 집단을 대상으로 하는 것에 대해, 특정 피험자를 대상으로 암을 검출하는 것을 특히 진단이라고 한다. 본 발명에 있어서는, 스크리닝과 진단은 그 대상이 다를 뿐, 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에 있어서, 항살모넬라 항원을 암 진단 마커로 이용하여 암을 검출할 때, 암의 종류에는 이에 대해 한정되는 것은 아니라, 피부암을 예로 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 항체는 살모넬라 균을 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해서 생산할 수 있다. 이러한 항체는 당업계에서 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 또한 단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다.

본 발명에 의한 키트에는 항살모넬라 항원을 인지하는 항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약이 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, 뇨 등 생물학적 시료 중 항살모넬라균의 항원 레벨은 이에 한정되는 것은 아니지만, 항원-항체 복합체를 간편한 면역효소분석법(ELISA)을 위한 도구/시약으로 검출하여 측정할 수 있다. 상기 ELISA는 직접적 ELISA, 간접적 ELISA, 직접적 샌드위치 ELISA, 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 방법을 포함되나, 샌드위치 ELISA 기법이 바람직하다. 그 이유는 뇨중이나 혈중의 지표물질의 양이 미량이어서 시료를 직접적으로 플레이트에 고정하는 직접적 ELISA나 간접적ELISA보다 시료에 대응하는 항체를 과량 플레이트에 고정하고 이에 시료가 반응한 다음에 다시 다량의 항체에 의해 미량의 시료에 반응하여 지시효과가 발생하는 샌드위치ELISA가 보다 효과적이기 때문이다.

본 명세서에서 사용된 “항원-항체 복합체”는 뇨 등에서 살모넬라균주의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 살모넬라 항원과 이를 인지하는 항체의 결합을 의미한다.

항원-항체의 결합물은 검출 표지(detection label)를 통해 그의 형성이 확인되며, 이러한 검출 표지는 효소, 형광물, 리간드, 방사선동위원소 등으로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 국한되는 것이며, 당업계에서 알 려진 표지를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, “약독화”란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고, 정상인에 투여 시 일정 기간 후 쉽게 사라져 버리게 된다.

본 발명의 구체적인 실시예에 사용된 균주(숙주)는 살모넬라 타이피뮤리움 BRD 509 균주로, 병원성이 없는 약독화된 균주이다(J Infect Dis. 1994 Dec;170(6):1508-17, Medeva사, London으로 구입가능). 상기 균주의 약독화 방법은 aro A, aro B의 유전자를 변형시켜서 균주의 대사에 비정상이 일어나게 만들 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의해 살모넬라 균주를 암 진단 마커로 이용하는 것은 전이암 및 조기암 진단에 유용하게 사용될 수 있음이 명확하게 되었다. 그리고 본 발명자 등이 개발한, 간편한 샌드위치 면역효소분석법을 사용하여, 암에 대해서, 조기에 환자의 뇨 중에 출현하는 살모넬라 항원을 고감도로 검출함으로써, 전이암, 조기암의 스크리닝 진단을 가능하게 했다.

또한 본 발명은 특별히 다른 혈액검사나 조직검사와 달리 쉽게 수행할 수 있는 소변을 대상으로 할 수 있어 그 결과 살모넬라 복용 후 뇨에 대한 면역효소분석법(ELISA)을 통해 암 진단이 가능함을 확인하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 조기암 및 전이암 진단에 유용한 암 진단 마커 를 제공한다. 나아가 본 발명에 의한 암 진단 마커를 검출하기 위한 조성물 및 키트는 조기암을 간편하고 경제적인 방법으로 용이하게 검출할 수 있는 효과를 도모할 수 있다.

또한 본 발명은, 암의 스테이지와 예후의 추정, 치료경과의 모니터링이 가능한 효과를 도모할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1. 살모넬라 균주의 배양]

약독화된 살모넬라 균주 BRD509(Salmonella typhimurium BRD509)를 루리아 벌테니(Luria Bertani) 배지에서 37 ℃ 배양하였다. 상기 살모넬라 균주를 다시 100mL의 양으로 24시간 배양한 후 파장 600nm의 광학흡광도(O.D.600) 및 0.7을 나타내는 배양농도에서 세균을 5500rpm의 속도로 원심분리하였다. 이 원심분리된 세균을 동일한 배양액 부피의 PBS로 현탁한다.

얻어진 PBS 현탁된 세균은 1ml당 1.6 x 10⁹ CFU의 농도를 갖는데 이들 세균 용액을 10⁷ 세포당 100ul 씩 첨가하여 배양 또는 경구투여 하였다.

[실시예 2. 살모넬라 균주의 암세포 부착능력측정]

본 발명에서 암 진단을 위해서 살모넬라 균주를 복용 후에 체내에서 배출되는 살모넬라 항원의 양의 변화를 측정하였다. 먼저 인체에 해가 없는 약독화된 살모넬라 균주인 살모넬라 타이피뮤리움 균주(Salmonella typhimurium BRD509)를 10⁷ /100ul의 농도로 C57bl6 마우스에 경구투여한다. 이후 메타볼릭케이지를 사용하여 마우스의 소변을 수집하였다. 이때 마우스에 암질환의 마우스와 정상마우스를 실험군으로 설정하였다. 각각의 실험군의 소변을 채취한 후 살모넬라 균주에 대한 항체를 이용하여 소변에 대한 면역효소분석법(ELISA)을 수행하여 소변 중에 살모넬라 항원의 양을 분석하였다.

살모넬라 균주의 암세포 부착능력을 확인하기 위해서 정상세포에 피부암 세포주(B16F10)를 첨가하여(도 1a) 배양 후에 살모넬라 균주를 10⁷ 개를 첨가한 후에 1시간 동안 배양한 후에 배지를 씻어내고 도 1b에서 암세포주에 부착되어 있는 살모넬라의 정도와 정상세포에 남아있는 살모넬라의 정도를 비교하였다. 곧 정상세포와 암세포와 정상 세포주와 함께 배양되는 세포들에 살모넬라 균주를 첨가 후 배지를 교환한다. 이후 첨가된 배지가운데서 세포를 모두 수거하여 이를 파쇄하였다. 이때 얻어진 파쇄물 용액을 시료로 살모넬라 항원반응 검사를 수행하였다.

시료 100ul를 첨가하여 항살모넬라 항체를 이용하여 통상의 효소면역측정법 으로 살모넬라 항원반응을 측정하였다. 도 1b를 보면 정상세포에 대비해서 암 세포주를 첨가했을 때 살모넬라의 반응도가 더 큰 것으로 나타났다. 6 x 10³ 개의 암세포까지 진단이 가능한 것으로 보이는 결과이다.

[실시예 3. 살모넬라 균주를 투약한 마우스에서의 암 진단 측정]

동물모델에서 실제로 살모넬라균을 10⁷ 경구투약한 후에 소변을 24시간 후에 채취하였다. 얻어진 소변 100ul에 대하여 마우스에서 얻은 항살모넬라 항체와 반응하여 통상의 효소면역측정법(ELISA)을 통해(ELISA and Other Solid Phase Immunoassays, D.M. Kemeny and S.J. Challacombe, JOHHN WILEY & SONS,1988) 항살모넬라 항원에 대한 반응을 살펴보았다. 그 결과 도 2에서 보듯이 암이 있는 마우스의 소변에서 암이 없는 마우스의 소변보다 항살모넬라 효소면역측정의 결과가 더 높게 나왔고 이는 암 진단의 주요할 지표로 사용될 수 있다.

따라서 본 발명에 의한 암 진단 마커 등은 민감도가 우수하고 조기암 진단을 위해 경제적이고 간편하게 사용할 수 있고, 암을 수술한 후의 경과 관찰이나 암의 재발, 전이의 발견에 대단히 유용하다 할 것이다.

도 1a는 살모넬라 균주의 암세포 부착능력을 보여주는 도면.

도 1b는 암세포주의 농도와 살모넬라 항원반응도가 상관관계가 있음을 보여주는 도면.

도 2는 효소면역분석법(ELISA)을 이용하여 정상시험군 및 살모넬라 균주를 투약한 암환자군의 항살모넬라 항원 반응 결과를 보여주는 도면.

Claims (11)

1. 약독화된 살모넬라 타이피뮤리움 BRD509 살모넬라균을 검체에 투여한 후 체외로 배출된 뇨 중의 살모넬라균 항원과 반응하는 살모넬라균 항체; 및

   상기 항원과 항체가 결합된 항원-항체 복합체를 샌드위치 면역효소분석법으로 검출하는 시약을 포함하는 암을 검출하기 위한 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 암은 피부암인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 약독화된 살모넬라 타이피뮤리움 BRD509 살모넬라균을 검체에 투여한 후 체외로 배출된 뇨 중의 살모넬라균 항원과 반응하는 살모넬라균 항체; 및

   상기 항원과 항체가 결합된 항원-항체 복합체를 샌드위치 면역효소분석법으로 검출하는 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 암을 검출하는 키트.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제3항에 있어서, 상기 암은 피부암인 것을 특징으로 하는 키트.
8. 삭제
9. 약독화된 살모넬라 타이피뮤리움 BRD509 살모넬라균을 검체에 투여한 후 체외로 배출된 뇨 중의 살모넬라균 항원과 반응하는 살모넬라균 항체; 및

   상기 항원과 항체가 결합된 항원-항체 복합체를 샌드위치 면역효소분석법으로 검출하는 시약을 포함하는 암의 스크리닝제.
10. 삭제
11. 삭제

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