KR101072834B1 - 인삼을 영지버섯 균사체로 발효시켜서 제조된 혈당강하용다당체 분획물 - Google Patents

인삼을 영지버섯 균사체로 발효시켜서 제조된 혈당강하용다당체 분획물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인삼을 영지버섯(Ganoderma lucidum KCTC 6532) 균사체로 발효시켜서 제조된 혈당강하용 다당체 분획물에 관한 것으로서, 상기 혈당강하용 다당체 분획물은 인삼을 영지버섯 균사체로 발효하는 단계; 발효물을 증류수로 열수추출한 후 여과하는 단계 및 여과액과 주정을 혼합하여 다당체 분획물의 침전물을 얻는 단계를 거쳐 제조된다. 이 다당체 분획물은 혈당강하 효과가 우수하여 공복혈당장애자, 내당능장애자, 당뇨병 전단계로 진단받은 자, 당뇨병 환자의 치료에 효과가 있다.
인삼, 영지버섯, 가노더마 루시덤 KCTC 6532, 혈당강하, 다당체 분획물, 당뇨병, 인슐린 저항성 개선 효과, 췌장 베타세포 사멸 억제 효과

Description

인삼을 영지버섯 균사체로 발효시켜서 제조된 혈당강하용 다당체 분획물{POLYSACCHARIDE FRACTIONS FOR LOWERING BLOOD GLUCOSE MANUFACTURED FROM THE FERMENTATION OF GINSENG WITH GANODERMA LUCIDUM MYCELIUM}
본 발명은 인삼을 영지버섯(Ganoderma lucidum KCTC 6532) 균사체로 발효시켜서 제조된 혈당강하용 다당체 분획물에 관한 것이다.
당뇨병은 혈중 포도당 농도가 비정상적, 지속적으로 상승되는 대사성 질환이다. 당뇨병은 인슐린의 생산 유무에 따라 인슐린 의존형(제1형 당뇨병) 및 인슐린 비의존형(제2형 당뇨병)으로 나뉜다. 제1형 당뇨병은 췌장의 자가면역질환으로, 인슐린을 생산하는 베타세포의 파괴가 그 원인이 되며, 제2형 당뇨병은 췌장 베타세포의 인슐린 분비 장애와, 간, 근육 및 지방조직과 같은, 인슐린 표적 세포의 인슐린 저항성(인슐린에 대한 반응성 손상) 등이 병인에 관계된다.
인슐린 저항성이란 인슐린의 작용세포들인 간, 근육, 지방세포에서 인슐린의 감수성(반응성)이 낮아져서 혈액중의 포도당이 작용 세포내로 이동하지 못함으로써 포도당이 대사되지 못하는 현상을 말한다. 인슐린 저항성은 어느 한 조직의 이상에 의하여 발생하는 것이 아니라, 체내의 당항상성 유지에 관여하는 뇌에서 분비되는 β-아드레날린성 화합물(β-adrenergic compounds), 지방조직에서 분비되는 아디포넥틴(adiponectin) 및 레티놀 결합 단백질 4(retinol binding protein 4; RBP4), 간에서 분비되는 HISS 및 IL-6 등과 같은 신호전달 분자들(signaling molecules)과 같이, 이러한 기관간 네트워크의 균형이 파괴됨으로써 인슐린 저항성 및 당뇨병이 발병한다는 이론이 우세하다.
췌장의 베타세포(pancreatic β-cells)는 체내의 포도당 항상성을 조절하는데 있어 중추적인 기능을 담당하고 있을 뿐 아니라, 우리 몸의 에너지 대사를 조절하는 가장 중요한 호르몬인 인슐린을 합성 및 저장하며, 필요에 따라 분비하는 역할을 담당하고 있다. 그러나 인간 수명의 연장, 생활 수준의 향상, 불균형적인 영양분의 과잉 공급, 도시화로 인한 운동량의 감소, 유전적 요인, 환경적 원인 등은 췌장 베타세포의 기능인 인슐린 분비에 이상을 유도하며 심지어 사멸(death)까지 유도한다. 일반적으로 당뇨병은 인슐린 저항성과 베타세포 기능 이상이 동시에 존재할 때에만 발생한다.
인삼(ginseng)은 우리나라의 대표적인 생약재로서, 예로부터 약용 및 건강음료로 널리 이용되어 왔다. 인삼은 탄수화물, 아미노산, 지방산, 무기질 등의 영양소와, 인삼의 주된 약리 작용 성분인 인삼사포닌을 비롯하여 항암성분으로 주목되고 있는 폴리아세틸렌 성분, 노화억제 및 항피로효과가 보고된 페놀계 성분 등을 함유하고 있다. 인삼의 주요 효능은 간 보호와 해독, 항피로, 면역증진, 항암 및 항산화작용 등이 있다.
버섯의 균사체 또한 항암작용, 면역증강 효과, 항산화 효과, 혈중 콜레스테 롤 저하작용 등이 있는 것으로 알려져 있다. 특히, 영지는 예로부터 조선시대 관료들의 흉배에 그려져 장수를 기원하는 의미로도 그려졌으며, 이로 인해 불로초라는 다른 이름으로도 불리우며 한방에서 널리 이용되어왔다. 영지의 전통 처방은 본초서나 본초강목과 같은 전통 의학서적에서도 쉽게 찾아 볼 수 있는데, 최근의 과학적인 효능 평가 결과, 면역력 증강, 항암효과, 항균 작용, 혈압 강하, 혈당 강하 효과, 혈전 억제 작용, X-선에 대한 저항력 증가 등에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다. (Park et al. Kor. J. Mycol. 1986, 14, 93-99; Zhu et al., J. of Ethnopharm, 2007, 111(2), pp 219-226; Boh et al., Biotech. Ann. Review, 2007 13 pp 265-301; Xie et al., Enz. and Microbial Tech., 2006, 40(1), 2006, pp 177-185; Russell and Paterson, Phytochemistry, 2006, 67(18), pp 1985-2001; Silva, Leukemia Res., 2006, 30(7), pp 767-768).
인삼은 제1형 및 제2형 당뇨병 모델 동물에서 혈당강하효과가 있다는 보고가 있다(Kimura et al., J. Pharmacobio-Dyn. 1981, 4, 410-417; Kimura et al., J. Pharmacobio-Dyn. 1981, 4, 402-409; Yokozawa et al., Chem. Pharm. Bull., 1985, 33, 869-872; Kimura et al., Phytotherpy Res. 1999, 13, 484-488; Kimura et al., Phytotherpy Res. 1999, 13, 484-488; Kimura et al., J. Pharmacobio-Dyn. 1981, 4, 907-915; Chung et al., Arch. Pharmacal. Res. 2001, 24, 214-218; Dey et al., Phytomedicine 2003, 10, 600-605). 또한, 인삼은 인체 실험에서 혈당강하 효과가 있다는 보고가 있다 (Sievenpiper et al., Diabetes 2003, 52(Suppl.1), A387; Vuksan et al., Diabetes 2003, 52(Suppl. 1), A137).
이에 본 발명자들은 상기와 같이 인삼의 혈당강하 작용이 보고된 바 있으나 그 혈당강하 활성이 높지 않았기 때문에, 그 활성을 강화시킬 필요가 있다고 판단하였다. 본 발명자들은 인삼을 영지버섯 균사체로 발효시킴으로써 혈당강하 활성이 증가한다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 인삼을 영지버섯 균사체로 발효시켜 제조된 혈당강하용 다당체 분획물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (1) 인삼을 영지버섯 균사체로 발효하는 단계; (2) 발효물을 증류수로 열수추출 한 후 여과하는 단계; 및 (3) 여과액과 주정을 혼합하여 다당체 분획물을 얻는 단계를 포함하는 혈당강하용 다당체 분획물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 인삼을 영지버섯 균사체로 발효시켜 제조된 혈당강하용 다당체 분획물을 제공한다.
본 발명은 또한 (1) 인삼을 영지버섯 균사체로 발효하는 단계; (2) 발효물을 증류수로 열수추출 한 후 여과하는 단계; 및 (3) 여과액과 주정을 혼합하여 다당체 분획물을 얻는 단계를 포함하는 혈당강하용 다당체 분획물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 혈당강하용 다당체 분획물은 제2형 당뇨병을 가진 포유동물 의 간, 근육, 지방세포에서 인슐린 저항성 관련 기능을 개선하고, 췌장 베타세포의 사멸을 억제하여, 인삼만을 원료로 하였을 때 보다 더욱 증가된 혈당 강하 효과를 나타낸다.
본 발명을 상세히 기술하기 전에, 특정 구체예의 변형예들이 행해질 수 있으나 첨부된 특허 청구범위의 범주 내에 포함되기 때문에, 본 발명은 이하에 기술된 본 발명의 특정한 구체예들에 의해 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 사용된 용어는 특정 구체예들을 설명하기 위한 것이지 한정하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 대신에, 본 발명의 범위는 첨부한 특허청구범위에 의해서 확립될 것이다.
본 명세서와 첨부한 특허청구범위에 사용하는 단수 형태들은 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 형태도 포함하는 것을 알아야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 모든 본 명세서에 사용된 전문 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당업자에게 보편적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
본 발명은 인삼을 영지버섯 균사체로 발효시켜 제조된 혈당강하용 다당체 분획물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 영지버섯의 균사체는 가노더마 루시덤 KCTC 6532(Ganoderma lucidum KCTC 6532; 이하 M2라 칭한다)의 균사체로써 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다. 상기 M2는 본 발명자의 예비연구에서 12종의 영지버섯 균사 중 고농도의 인삼 배지에서도 생장이 가능한 한편, 진세 노사이드(ginsenoside) Rb1을 흡수 가능한 비극성 성분인 Rd, Rh2로 대사시킬 수 있는 우수 균주로 선발되어 본 발명의 인삼 발효에 사용되었다.
본 발명에서는 잘게 썬 인삼을 건조시킨 건조상태의 인삼 분쇄물을 고체 배지로서 사용한다. 상기 고체배지는 분쇄한 인삼 : 물 = 1 : 1 ~ 3의 비율, 바람직하게는 분쇄한 인삼 : 물 = 1 : 2.1의 비율로 잘 혼합하여 수분이 고루 흡수되도록 1시간 정도 방치한 것을 배지로서 사용한다.
상기 M2 균사체를 인삼 분쇄물과 적정량의 물을 혼합한 배지에 접종하고, 균사 배양을 위해 온도와 습도가 조절되는 배양기에서 20 ~ 25℃, 습도 55 ~ 65 %의 조건으로 4주에서 8주간을 배양하였다. 그 결과, 균사체에 의한 인삼 성분의 발효로 인하여 진세노사이드의 대사가 이뤄지는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명은 또한 (1) 인삼을 영지버섯 균사체로 발효하는 단계; (2) 발효물을 증류수로 열수추출 한 후 여과하는 단계; 및 (3) 여과액과 주정을 혼합하여 다당체 분획물을 얻는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 혈당강하용 다당체 분획물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 다당체 분획물은 상기 인삼 분쇄물을 사용한 고체 배지에 M2 균사체를 접종하여 발효시킴으로써 얻어진다. 발효에 의하여 생성된 인삼-M2 균사체 발효물로부터 증류수로 열수추출 한 후 얻어진 추출물을 여과하여 여과액과 잔사로 분리한다. 여과액과 에탄올을 혼합하여 저온에서 방치, 예를 들어, 여과액 : 주정 = 1 : 1 ~ 10, 바람직하게는 여과액 : 주정 = 1 : 5로 혼합하여 8℃에서 24시간 방치하여 침전시킴으로써 본 발명의 다당체 분획물을 얻는 것이 가능하다.
본 발명의 혈당강하용 다당체 분획물은 간세포에서 세포내 당이용 대사를 증가시키는데 주요 역할을 하는 글루코카이네이즈(glucokinase; 이하 GK라 칭한다) 활성을 증가시킨다. 간에서의 인슐린 저항성은 혈당치가 높은데도 불구하고 계속 당 신생 반응에 의하여 당이 생성되는 것이다. 간에서의 당 항상성의 유지는 주로 효소에 대한 활성의 조절에 의해 달성된다. 상기 GK는 간의 당 항상성 유지에 중심이 되는 효소로서 포도당을 글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate; 이하 G-6-P라 칭한다)로 인산화시켜 해당(glycolysis)시키거나 글리코겐을 합성시켜서 혈당치를 낮춘다.
본 발명의 혈당강하용 다당체 분획물은 또한 근육세포에서 세포내 당의 흡수를 촉진시키는 인슐린 의존성 신호전달 단백질의 일종인 Akt 단백질의 인산화를 증가시킨다.
본 발명의 혈당강하용 다당체 분획물은 또한 지방세포에서 영양분의 대사 조절에 중추적 역할을 하는 인산화 효소인 AMPK(AMP-activated protein kinase)를 활성화시키는 효과가 있다. 상기 AMPK는 세포의 에너지 수준을 감지하여 활성화 되는 대표적인 단백질로서, 운동과 같은 외부의 스트레스에 의해 지방산 합성과 콜레스테롤 합성으로 대표되는 세포내의 ATP를 소모하는 경로를 차단하고, 글루코스의 흡수(Glucose uptake), 해당작용(glycolysis) 및 베타-산화(beta-oxidation)로 대표되는 세포내 ATP를 만드는 경로를 활성화 시켜, 궁극적으로는 세포의 항상성 유지에 필수적인 단백질이 된다. 특히 ATP를 만드는 경로인 포도당의 세포내 흡수 및 해당작용에 중요한 역할을 하는 단백질로, 최근의 보고에 의하면 제2형 당뇨환자에 게 처방되는 대표적인 약물인 메트포민(Metformin)과 트로클리타존(Troglitazone)이 AMPK를 활성화 시킨다는 사실이 잘 알려져 있어서 당뇨병의 개선에 있어서 중요한 타겟으로 각광받고 있다.
본 발명의 혈당강하용 다당체 분획물은 췌장 베타 세포에서 사이토카인 유도 세포사멸을 억제하여, 인삼만을 원료로 하였을 때 보다 훨씬 증가된 혈당강하 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 다당체 분획물은 제2형 당뇨병을 가진 포유동물의 인슐린 저항성을 개선하여 췌장을 보호하고, 공복시 혈당을 강하시키며 내당능(glucose tolerance)을 개선시킬 수 있다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예들이 기술되어질 것이다. 이하의 실시예들은 본 발명을 예증하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 국한시키는 것으로 이해되어져서는 안 될 것이다.
< 실시예 1> 종균의 제조
본 특허에 사용된 영지버섯 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures: KCTC)에서 분양받은 가노더마 루시덤 KCTC 6532(Ganoderma lucidum KCTC 6532)를 사용하였으며, 영지버섯 균사체의 종배양 배지는 평판감자배지(Potato Dextrose Agar, PD, Difco)를 사용하였다. 즉, 보존 균주를 종 배양용 배지(평판PD배지)에 지름 0.7 cm 균편을 접종하여, 온도 25 ℃, 습도 65 %의 항온항습기(Growth Chamber, 다솔과학)에서 10일간 배양한 것을 종균으 로 사용하였다.
< 실시예 2> 인삼 고체 배지의 제조
<2-1> 인삼 분쇄물 만들기
잘게 썬 인삼을 분쇄기에서 거친 입자감이 있는 정도로 갈아서 50 ℃ 열풍건조기에서 20시간 건조시켰다. 건조 중 뭉친 인삼 분쇄물은 흩어주는 정도로만 가볍게 분쇄기에서 덩어리를 파쇄시켜 건조상태의 인삼 분쇄물을 만들었다. 이 때 인삼 입자의 크기는 0.1 ~ 8.0 ㎤의 크기로 한다.
<2-2> 시험관 배양용
인삼 분쇄물 : 물 = 1 : 2.1의 비율로 잘 혼합해서 수분이 고루 흡수되도록 1시간 정도 방치한 것을 배지로 사용하였다. 유리 시험관 (2.0 X 150 mm)에 20g 씩(시료 높이 11 cm) 배지를 채워, 배지 한 가운데를 유리막대로 눌러 패이게 한 후, 면전으로 시험관을 봉하고 121℃에서 15분간 멸균하였다.
<2-3> 병 배양용
인삼 분쇄물 : 물 = 1 : 2.1의 비율로 잘 혼합해서 버섯 배양병에 100g 씩 채워 넣어 121℃에서 15분간 멸균한 것을 사용하였다.
< 실시예 3> 인삼 고체 배지에서 M2 균사체의 성장 특성
M2 균사 절편이 접종된 인삼 배지를 20 ~ 25℃, 습도 55 ~ 65 %의 조건으로 8주간을 배양하는 동안의 결과를 관찰하였다. 실시예 2-2에서와 같이 만들어진 시험관 배양용 인삼 고체 배지에서의 M2 균사체의 생장 특성을 표 1 및 도면 2에 나타내었다. 도면 3은 인삼 고체 배지에 M2 균사체를 접종시켜 20∼25℃, 습도 55∼65%의 조건으로 8주간 발효시켜 얻은 발효물을 동결 건조시킨 것이고, 도면 4는 이 발효 건조물을 분말화 하여 전자현미경으로 미세성상의 사진을 찍은 것이다.
인삼 배지에서 M2 균사체의 생장 특성

지표
1주 2주 3주 4주 5주 6주 7주 8주
KCTC
6532
균사길이
(cm)
0.1±0.1 0.2±0.1 1.9±1.0 4.2±0.3 4.2±0.2 6.9±0.3 7.3±0.3 7.0±1.3
균사밀도 +++ +++ ++++ +++++ +++++ +++++ +++++ +++++
< 실시예 4> 인삼- M2 균사체 발효물로부터 다당체 분획물의 제조
동결건조시킨 인삼-M2 균사체 발효물을 증류수로 100℃에서 2시간 환류 냉각하여 추출액을 만들었고, 이것을 여과지로 여과하여 여과액과 잔사를 분리하였다. 이 여과액과 주정을 1 : 5의 농도로 혼합한 것을 8℃ 냉장실에서 24시간 방치하면 첨가한 주정에 의하여 용액 중의 다당체 용해도가 변화되어 다당체가 침전하게되는데, 이와 같은 원리에 의하여 다당체 분획물을 얻을 수 있었다.
< 실험예 1> 간세포에서의 글루코카이네이즈 활성 증가 효과
인삼-M2 균사체 발효물로부터 얻어진 다당체 분획물이 간에서의 인슐린 저항성 관련 기능에 미치는 영향을 평가하기 위하여 간세포에 TNF- α로 인슐린 저항성을 유발시킨 후, GK 활성에 미치는 영향 및 인슐린 신호전달 단백질인 Akt 단백질의 발현에 미치는 영향을 검증하였다. 사이토카인의 일종인 종양괴사인자(tumor necrosis factor-α; 이하 TNF- α라 칭한다)는 GK의 활성을 낮춘다.
- 세포주 : 인간 원발성 간암 세포주(Human hepatocellular carcinomia cell line)인 HepG2 세포
- 인슐린 저항성 유도 조건 : 세포가 자라서 세포 배양 용기에 90% 정도 꽉 차면 TNF- α 10ng/mL을 배지에 첨가하고, 24시간 동안 배양한다.
- 다당체 분획물의 첨가 방법
* 인슐린 민감성 작용 : TNF- α와 동시에 첨가함
- GK 활성 측정 : 포도당이 GK에 의하여 G-6-P로 전환되어 G-6-P 디하이드로게나아제에 의하여 NAD가 NADH로 환원되는 원리를 이용함.
그 결과 본 발명의 다당체 분획물은 GK의 활성을 증가시켰으며, 이를 도 5 및 표 2에 나타내었다.
인삼의 M2 균사체 첨가에 의한 GK 활성에 대한 EC50


균사체 발효물
시료 인삼 다당체 분획물
M2 -
+
32.42μM
12.57μM
멸균 전 인삼
멸균 후 인삼
53.12μM
19.85μM
< 실험예 2> 인삼의 M2 발효물의 다당체 분획물이 골격근세포에서의 Akt 단백질의 인산화 증가 효과
- 세포주 : C2C12 (마우스 골격근 세포주 : mouse skeletal muscle cell line)
- 분화 및 인슐린 저항성 유도 : 10% FBS 대신 2% horse serum으로 교체하여 3일간 분화시킴. 이 기간 동안 인슐린 100nM을 동시에 처리하면 인슐린 저항성이 유도됨.
- 인슐린 자극에 의한 인슐린 신호전달 단백질의 인산화 분석 (인슐린 민감성 작용) : 분화시키는 마지막 24시간 동안 다당체 분획물을 첨가함.
- 면역블로팅 검정법(Immunoblotting)
: 세포의 단백질을 추출하여 인산-AKT(P-Ser 472/473)를 분석함
그 결과, 본 발명의 다당체 분획물은 인삼 추출물을 단독으로 사용한 것에 비하여 인슐린에 의한 Akt 단백질의 인산화를 증가시켰으며, 이를 도 6에 나타내었다.
< 실험예 3> 지방세포에서의 AMPK 활성화 효과
혈당 조절에 있어서 AMPK 활성화는 AMPK가 인슐린 감수성의 대표적인 신호전달경로인 PI-3 키나아제/Akt와 독립적으로 활성화 되어 혈당의 흡수를 촉진 시키기 때문에 (Kahn BB, Alquier T, Carling D, Hardie DG. AMP-activated protein kinase: ancient energy gauge provides clues to modern understanding of metabolism. Cell Metab. 2005, 1(1):15-25. Review) 중요한 의미를 가지며, 천연 식품으로부터 이러한 AMPK를 활성화 시킬 수 있는 소재를 찾는 것은 인슐린 감수성 개선 효과를 기대 할 수 있는 효과적인 연구방법이라 할 수 있다.
- 실험재료
인슐린, 덱사메타손(Dexamethasone), IBMX, (이상 Sigma)
인산-AMPK 항체, 베타 액틴 항체(beta actin antibody; 세포 신호 전달)
- 세포분화
3T3-L1-전구지방세포(preadipocyte cell)를 12-웰 플레이트에 접종하였다. 이틀 후에 1M 덱사메타손, 5g/mL 인슐린 및 0.5mM IBMX를 포함하는 호르몬 칵테일(hormone cocktail)을 사용하여 지방세포로의 분화(adipocyte differentiation)를 유도하였다. 이틀 후에, 배지를 인슐린 (5g/mL)을 포함하는 일반 배지로 바꿔주었고, 약 6일 후 80%이상의 지방 세포로의 전환을 관찰하였다.
- 웨스턴블롯팅
12-웰 플레이트에 접종된 3T3-L1 전구지방세포에 각각의 시료를 직접 100μg/ml의 농도로 3시간 처리 하였다. 3시간 후에 배지를 버린 후 얼음에 냉각시킨 인산완충식염수(Ice-cold phosphate-buffered saline PBS)로 두 번 세척하였다.
그 후 용해 완충액(lysis buffer 50Tris-HCl [pH 7.4], 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150NaCl, 1EDTA, 1PMSF, 1sodium orthovanadate, 1NaF, 1g/mL aprotinin, 1g/mL leupeptin, and 1g/mL pepstatin)을 이용하여 세포를 모은 후, SDS-PAGE로 단백질을 분리하여 겔을 니트로셀룰로오스 종이(nitrocellulose paper)에 이동시킨 후 AMPK 및 β-액틴 단백질 발현을 웨스턴 블롯(western blot)으로 확인하였다. 3T3-L1 전구지방세포에 다당체 분획물을 100μg/ml로 3시간 처리 후, AMPK의 활성화를 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다.
그 결과, AMPK의 활성은 M2 균사체와 인삼을 함께 발효시켜 얻어진 다당체 분획물의 효과가 인삼을 단독으로 처리한 군에 비해 약 2.5배 뛰어남을 확인하였다. 이때 AMPK 활성제인 AICAR (1mM)를 양성 대조군(positive control)으로 사용하였으며, 이를 도 7에 나타내었다.
상기 결과에서, M2 균사체와 인삼을 함께 발효시켜 얻어진 다당체 분획물은 세포내 포도당 흡수에 중요한 바이오 마커인 AMPK 세포전달 경로(signaling pathway)를 활성화할 수 있음을 유추할 수 있었고, 이는 또한 당뇨개선에 효과가 있을 것으로 예상된다.
< 실험예 4> 췌장 베타세포 사멸에 미치는 영향
- 세포주 : MIN6N8 세포주
- 세포사멸 유도 조건
* 사이토카인에 의한 유도 : 인터페론-γ (IFN-γ10 ng/mL), 종양괴사인자(TNF)-α (10 ng/mL), 인터루이킨-1β (10 ng/mL의 혼합물을 48시간 배지에 첨가함. 본 발명의 약제학적 조성물을 사이토카인과 동시에 처리함.
* 유리지방산에 의한 유도 : 팔미트산 50mM을 50% 에탄올에 용해하여 0.5mM이 되도록하고, 48시간 후 배지에 첨가함. 본 발명의 약제학적 조성물을 팔미트산과 동시에 처리함.
- 세포사멸 측정
사멸된 세포에서 생성되는 세포질성 히스톤단백질 관련 DNA 절편 (cytoplasmic histone associated-DNA-fragments 모노 및올리고 뉴클레오솜)을 항히스톤 항체(anti-histone-antibody) 및 항 DNA-POD(anti-DNA-POD)로접합하여 ABTS로 발색시키는 광도 효소 검정법(photometric enzyme-immunoassay)을 이용함.
- 세포독성 측정
3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide MTT)를 이용함.
그 결과, 인삼과 M2 균사체 발효물로부터 얻어진 본 발명의 다당체 분획물은 사이토카인 유도(도면 8) 및 팔미테이트 유도(도면 9)에서 나타낸 바와 같이 베타세포 사멸을 억제하는 효과를 보였다.
상기 결과를 토대로, 본 발명의 혈당조절용 조성물은 약제학적 조성물로 사용되는 경우, 공복혈당 장애자, 내당능 장애자, 당뇨병 전단계로 진단받은 자, 당뇨병 환자의 췌장 베타세포 보호제 및 인슐린 저항성 개선제로 사용될 수 있는효과가 있음을 확인하였다. 또한 인슐린 저항성은 당뇨병 뿐만 아니라 대사성 증후군 환자도 가지는 것으로 일반화 되어 있으므로 대사성 증후군 환자의 인슐린 저항성 개선제로도 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 인삼-M2 균사체의 발효로부터 다당체 분획물을 제조하는 과정을 순차적으로 도시한 공정도이다.
도 2는 인삼 고체 배지에서의 균사 생장 특성을 도시한 도면이다.
도 3은 인삼 고체 배지에 M2 균사체를 접종시켜 배양한 발효물을 동결건조시킨 것을 도시한 도면이다.
도 4는 인삼 분말, M2 균사체 분말, 인삼-M2 균사체 발효물 분말의 전자현미경(SEM, X600) 사진을 도시한 도면이다.
도 5는 인슐린 저항성이 유도된 HepG2 세포에 다당류 분획물 첨가에 의한 글루코카이네이즈 활성의 개선 효과를 나타낸 그래프이다. (모든 시료의 농도는 50, 20, 1 μg/mL의 농도로 TNF-α와 함께 24시간 배양함. 1 units/mL glucose-6-phosphate dehydrogenase, 0.5/100mM glucose, 0.5mM NAD, 2.5mM ATP의 농도로 96well에서 1/10의 세포 추출물과 함께 30분 반응시킴. Values are means±SEM, n=3)
도 6은 골격근세포에서 100 nM 인슐린을 3일간 처리하여 인슐린 저항성을 유도하면서, 마지막 24시간 동안 다당류 분획물(50μg/mL)을 처리하였을 때 인슐린 100 nM의 10분간의 자극에 의한 Akt의 인산화 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 인삼-M2 균사체 발효물로부터 얻어진 다당체 분획물이 풍부하게 포함된 본 발명의 조성물의 AMPK활성에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 인삼-M2 균사체 발효물로부터 얻어진 다당체 분획물에 의한 사이토카 인에 의한 췌장 베타세포 사멸 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 인삼-M2 균사체 발효물로부터 얻어진 다당체 분획물에 의한 팔미테이트에 의한 췌장 베타세포 사멸 억제효과를 나타낸 그래프이다.

Claims (7)

  1. (1) 분쇄한 인삼 : 물 = 1 : 1∼3의 비율로 혼합하고 1시간 동안 방치하여 얻은 인삼 배지에 영지버섯 균사체로서 인삼 배지에서도 생장이 가능하고, 진세노사이드(ginsenoside) Rb1을 흡수 가능한 비극성 성분인 Rd, Rh2로 대사시킬 수 있는 가노더마 루시덤 KCTC 6532(Ganoderma lucidum KCTC 6532)를 접종시키고 온도 20∼25℃, 습도 55∼65%, 4주∼8주 동안 발효시켜 인삼-영지버섯 균사체의 발효물을 얻는 단계;
    (2) 상기의 인삼-영지버섯 균사체의 발효물을 증류수로 100℃에서 2시간 환류 냉각 열수추출한 후 여과하여 여과액과 잔사를 얻는 단계; 및
    (3) 상기에서 얻은 여과액과 에탄올을 1:5로 혼합하고 8℃에서 24시간 동안 방치하여 침전시킴으로써 다당체 분획물의 침전물을 얻는 단계;를 포함하도록 하여 (가)간세포에서 글루코카이네이즈의 활성을 증가시키는 효과, (나)골격근세포에서 세포내 당의 흡수를 촉진시키는 인슐린 의존성 신호전달 단백질의 일종인 Akt 단백질의 인산화를 증가시키는 효과, (다)지방세포에서 영양분의 대사 조절에 중추적 역할을 하는 인산화 효소인 AMPK(AMP-activated protein kinase)를 활성화시키는 효과, 및 (라)췌장 베타세포의 사멸을 억제하는 효과 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효과를 지니는 혈당강하용 다당체 분획물의 제조방법.
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