KR101052565B1 - 신규 ｒｎａ 헬리카제 유전자 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 RNA 헬리카제, 이를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자로 형질전환된 환경 스트레스 저항성 식물세포 또는 식물체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 RNA 헬리카제 유전자로 식물세포 또는 식물체를 형질전환시켰을 경우, 환경 스트레스에 의해 RNA 헬리카제가 고발현됨에 따라 식물체가 환경 스트레스에 대한 저항성을 갖도록 할 수 있기 때문에, 환경 스트레스 저항성 작물 제조에 유용하다.

콩, 스트레스, RNA 헬리카제

Description

신규 ＲＮＡ 헬리카제 유전자 및 그 용도 {Novel Gene Encoding RNA Helicase and Use Thereof}

본 발명은 RNA 헬리카제, 이를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자로 형질전환된 환경 스트레스 저항성 식물세포 또는 식물체에 관한 것이다.

NTP(nucleotide triphosphate)를 분해하여 얻어지는 에너지를 이용하여 RNA 이차구조를 풀어주는 역할을 하는 RNA helicase는 전사(transcription), Pre-mRNA splicing, ribosome biosynthsis, Nucleocytoplasmic transport, translation, RNA decay 및 세포내 소기관 내 유전자 발현을 포함하는 RNA metabolism에 관여하는 효소이다(de la Cruz et al ., Trends Biochem . Sci ., 24:192, 1999; Tanner NK et al ., Mol . Cell ., 8:251, 2001; Lorsch JR, Cell , 109:797, 2002; Fuller-Pace, 2006, Nucleic Acids Research, 34, 4206-4215). 단백질 합성 효율을 높여준다고 알려진 RNA helicase는 바이러스, 원핵생물, archaea 그리고 대부분의 효모, 동물, 식물세포에 존재한다 (Owttrim, 2006, Nucleic Acids Research, 34, 3220-3230).

환경 스트레스와 관련된 RNA 헬리카제(helicase)의 기전은 최근에서야 알려지기 시작하였다. 연구에 따르면, RNA 헬리카제의 효소 활성에 의하여 하우스 키핑 유전자 및 환경 스트레스의 영향으로 발현변화를 일으키는 유전자의 발현 조절에 관여함으로써 변화된 환경 조건에 대해 세포 적응과정에서 관여할 것으로 파악되고 있다 (Vashisht and Tuteja, J Photochem . Photobiol ., 84, 150-160, 2006; Owttrim, Nucleic Acids Res ., 34(11):3220, 2006). 지금까지 RNA helicase는 주로 미생물에 대해 그 기능이 연구되어 왔으며, Synechosystis sp., E. coli, M. Burtonii, P. syringase, S. pombe, S serevisiae 등을 포함하는 미생물에서 저온 스트레스, 강광 스트레스, 염 스트레스 등의 스트레스에 대한 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다(Chamot et al ., J. Bacteriol ., 181:1728, 1999; Chamot et al ., J. Bacteriol ., 182:1251, 2000; Jones et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 93:76, 1996; Lim et al ., J. Mol . Biol ., 297:553. 2000; Vinnemier et al ., Arch . Microbiol ., 172: 377,1999; Montero-Lomeli et al ., J. Biol . Chem ., 277:21542, 2002; Purusharth et al ., J. Biol. Chem ., 280:14572, 2005).

반면, 식물에서의 스트레스 저항성에 대한 RNA 헬리카제의 역할은 정확하게 밝혀져 있지 않으나, 최근에 들어서야 애기장대(Arabidopsis)에 대해 활발한 연구가 이루어지고 있으며, 애기 장대 외에 보리, 콩(Pisum sativum) 등에서의 저온, 건조 및 염 스트레스에 대한 RNA 헬리카제의 작용이 알려져 있다(Owttrim, Nucleic Acids Res ., 34(11):3220, 2006; Gong, et al., The Plant Cell , 17:256, 2005; Gong, et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 99:11507, 2002; Seki et al ., Plant Cell , 13:61, 2001; Seki et al ., Plant J., 31:279, 2002; Kreps et al ., Plant Physiol ., 130:2129, 2002; Nakamura et al ., Plant Sci ., 167:63, 2004; Vashisht et al ., Plant J., 44:76, 2005; Sanan-Mishra et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 102:509, 2005).

스트레스와 관련된 RNA 헬리카제의 염기서열은 많이 알려져 있지 않으나, 일반적으로 염기서열 내에서 번역개시부위 및 RNA turnover의 작용을 하는 부위가 정상조건 일 때와 스트레스 조건일 때 각각 다르게 작용하는 것으로 파악되고 있다. 그러나 이러한 생화학적 정보 외에 스트레스 조건에서의 RNA 헬리카제의 생리학적 기전은 확실히 밝혀진 바가 없으며, 따라서 향후 풀어야 할 숙제로 남아 있다.

본 발명자들은 식물에서의 환경 스트레스 저항성 반응에 대한 생화학적 기전을 파악하고자 예의 노력한 결과, 스트레스 조건하에서 콩(Glycine max L.)에서 발현이 증가하는 유전자를 선별하고, 여기서 얻어진 유전자의 염기서열 분석을 통해 신규 유전자를 분리하였으며, 상기 신규 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 RNA 헬리카제의 활성을 갖으며, 스트레스 환경에서 고발현됨으로써 환경 스트레스 저항성 반응에 관여한다는 사실을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 RNA 헬리카제, 이를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자로 형질전환된 환경 스트레스 저항성 식물세포 또는 식물체를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 RNA 헬리카제 및 상기 효소를 코딩하는 서열번호 1의 유전자를 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 환경 스트레스 저항성 식물세포 또는 식물체를 제공한다.

본 발명에 따른 콩 유래의 RNA 헬리카제 유전자로 식물세포 또는 식물체를 형질전환시켰을 경우, 환경 스트레스에 의해 RNA 헬리카제가 고발현됨에 따라 식물체가 환경 스트레스에 대한 저항성을 갖도록 할 수 있기 때문에, 환경 스트레스 저항성 작물 제조에 유용하다.

본 발명은 콩에서 저온 스트레스에 의해 발현 유도된 단편의 cDNA 유전자 라이브러리를 바탕으로 RACE PCR 기법을 사용하여 신규의 유전자를 분리하였다. 상기 유전자의 염기서열 및 유사도 분석에 의해, 서열 내에 RNA 헬리카제 도메인이 존재하며, 포도(V. vinifera), 애기장대 (Arabidopsis Thaliana) 및 이끼(Physcomitrella patens)과 근연관계가 높은 것으로 분석되였으며, 효소활성 검증을 통하여 신규의 유전자는 콩 유래 RNA 헬리카제(LT28)임을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 2로 표시되는 RNA 헬리카제에 관한 것이다.

본 발명에서는 환경 스트레스에 의해 고발현하는 신규 유전자의 염기서열 분석을 수행한 결과, 서열 내 C-말단 부위에 RNA 헬리카제 도메인이 존재하는 것으로 확인되었으며, 효소활성 분석 결과, RNA의 센스 및 안티센스 이중쇄를 단일가닥으로 풀어주는 헬리카제 활성이 있음을 확인하였다.

본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 1로 표시되는 상기 RNA 헬리카제를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서 본 발명의 RNA 헬리카제 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

'재조합' 핵산 또는 DNA 또는 RNA 분자는 두 개의 다른 분리된 서열 단편들의 인공적 조합에 의해, 예를 들면, 화학적 합성에 의해 또는 유전공학적 기술에 의해 분리된 핵산 단편들의 조작에 의해 제조될 수 있다. 핵산 조작을 위한 기술은 예를 들면, [Sambrook et al ., Molecular Cloning ;A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989] 등을 참고 할 수 있으며, 핵산의 화학합성은 [Beaucage and Carruthers, Tetra Letts, 22:1859~1862, 1981] 및 [Matteucci et al., J. Am ., Chem . Soc . 103:3185, 1985]에서 설명하고 있다.

본 발명에서 벡터(vector)는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명에서 '벡터 (vector)는 플라스미드(plasmid)와 때로 상호 교환적으로 사용할 수 있다.

형질전환의 목적으로 사용될 수 있는 벡터는 전형적으로 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점; (b) 벡터로 형질전환된 숙주세포를 효율적으로 선별하는데 필요한 항생제 내성 유전자; (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위 및 (d) 외래 유전자를 발현할 수 있는 전사개시에 관여하는 조절부위를 포함하는 프로모터의 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 외래 DNA를 용이하게 벡터의 제한효소 절단부위에 삽입할 수 있다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 미생물, 식물 및 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다.

본 발명의 RNA 헬라카제 유전자가 벡터에 성공적으로 삽입된 후에 상기 유전자로부터 정상적으로 단백질이 발현되도록 하기 위해서는 상기의 벡터를 적절한 숙주세포에 도입하여야한다.

본 발명의 벡터가 도입된 숙주세포는 미생물 또는 식물세포일 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물에 관한 것이다.

상기 미생물은 원핵세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 대장균 또는 아그로박테리움일 수 있다. 대장균은 E. coli DH5α, E. col JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene, USA), E. coli B 및 E. coli B21 등을 포함하며, FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera) 등이 또한 사용될 수 있다. 또한 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주를 숙주세포로 이용할 수 있다. 또한, 상기 박테리아 외에 효모 및 곰팡이를 숙주세포로 이용할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 발현벡터에 의해 형질전환된 환경 스트레스 저항성 식물세포 및 식물체에 관한 것이다.

상기 식물세포 또는 식물체는 따라서, 본 발명의 서열번호 2로 표시되는 RNA 헬리카제 유전자에 의해 형질전환된 식물세포 또는 식물체이다.

스트레스 환경 하에서 유전자 발현을 용이하도록 하기 위해 식물 형질전환용 벡터는 플라스미드, 코스미드, YACs(yeast artificial chromosoems), BACs(bacterial artificial chrmosomes) 또는 다른 클로닝 시스템일 수 있다. 이러한 벡터들은 공통적으로 발현 카세트를 포함하고 있으며, 여기에는 발현을 관장하 는 본 발명의 유전자 혹은 DNA 단편, 폴리링커, 발현 종결코드, 발현 외에 필요한 조절 유전자 및 형질전환체를 선별할 수 있는 마커 등을 포함할 수 있다. 벡터에 유전자 및 조절 유전자 단편 등을 삽입하기 위해서는 당업계에서 알려진 기술을 사용하여 용이하게 이루어질 수 있다.

식물 형질전환에 있어서 형질전환체 선별 마커로는 일반적으로 hygromycin phophotransferase(hpt), phosphinothricin acetyl transferase gene(bar), 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase(EPSPS), neomycin 3'-O-phosphotransferase(NPT) 또는 acetolactate synthase(ALS) 등이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에는 본 발명의 콩 유래 RNA 헬리카제 유전자 외에 스트레스에 대한 저항력을 상승시키는 구조 유전자 또는 조절 유전자를 추가적으로 삽입할 수 있다.

스트레스 저항성을 상승시키는 구조 유전자는 식물에서 발현되어 환경 스트레스에 직접적으로 저항성을 부여하는 단백질을 발현하는 유전자로서, 예를 들면, LEA; 워터채널 단백질(water channel proteins); 전해질 합성효소; 담배 해독효소; 삼투조절 기질 합성효소(예를 들면, 당, 프롤린 또는 글리신베타인); 세포막의 지질을 변환시키는 효소로서 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)유래의 ω-3 지방산 불포화효소 발현 유전자 및 D9-불포화효소; 프롤린 합성효소인 P5CS 및 갈락티놀 합성요소인 AtGolS3 유전자를 포함할 수 있다.

또한, 스트레스를 상승시키는 조절 유전자는 스트레스 유도 프로모터나 저항 성유도 유전자에 작용하여 활성을 조절하는 단백질을 발현하는 유전자로서 예를 들면, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유래 전사활성인자인 DREB1A, DREB1A, DREBIB 및 EREBIC 유전자; 벼 유래 전사활성인자인 OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D 및 OsDREB2A; 식물 호르몬인 ABA(absicisic acid)를 합성하는 주요 유전자인 NCED(9-cis epoxicarotenoid는 9-cis epoxicarotenoid dioxygenase)를 포함할 수 있다. 상기의 환경 스트레스에 저항력을 증강시키기 위한 목적유전자 외에 식물 및 종자에 유리한 유전자 특성을 부여하기 위한 각종 유전자를 삽입할 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.

상기 벡터를 사용하여 형질전환 혹은 유전자의 재생 방법은 당해 분야에 숙지되어 있다. 예를 들면, 본 발명의 유전자를 포함하는 벡터는 직접적으로 DNA를 세포에 삽입하는 수단으로서는 열화학처리에 의한 직접적인 DNA 흡수방법, 리포홈, 일렉트로포레이션, 미세주입법 또는 입자피폭법 등을 이용하며, 또한, 간접적인 벡터 전달방법으로는 아그로박테리움(Agrobacterium) 속과 같은 세균을 이용하여 식물세포를 형질전환 시킬 수 있다.

형질전환은 원형질체에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 이용한 방법이나 일렉트로포레이션에 의해 DNA 벡터를 전달하거나 또는 입자 피폭법을 이용하는 등의 직접적인 유전자 전달 기술에 의해 수행할 수 있다. 원형질을 이용한 형질전환은 자포니카(Japonica)-타입 및 인디카(Indica)-타입에 대해 기재 되어 있다 (Zhang et al ., Plant Cell Rep ., 7:379, 1988; Shimamoto et al ., Nature , 338:274, 1989; Datta et al ., Biotechnology , 8:726, 1990). 상기 두 가지 방법 외에 입자 피폭법을 사용하여 통상적으로 형질전환 시킬 수 있다 (Christou et al ., Biotechnology, 9:957, 1991).

식물의 형질전환을 목적으로 하는 간접적인 DNA 벡터 전달방법으로는 아그로박테리움 속의 미생물을 사용할 수 있다. 상기 박테리아에는 아그로박테리움 튜메판시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)을 포함하며, 아그로박테리움 투메판시엔스(예를 들면, LBA4404 또는 EHA105)가 식물의 형질 전환에 가장 널리 사용되기 때문에 특히 유용하다.

아그로박테리움에 벡터를 삽입시키는 방법은 화학 또는 열처리에 의한 직접적인 DNA 전달방법(Holsters et al ., Mol . Gen . Genet ., 163:181, 1978), 일렉트로포레이션에 의한 전달방법(S. Wen-jun and B. Forde, Nucleic Acids Res ., 17:8385, 1989), Tra+인 E. coli로부터 벡터를 전이 받는 삼조접합전달(triparental conjugational transfer)방법 (Ditta et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . U S A., 77:7347, 1980) 또는 직접접합전달(direct conjugational transfer)방법을 통상적으로 사용할 수 있다.

상기의 방법으로 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환대상 식물의 조직 등에 감염시키는데 사용하여 형질전환된 식물을 수득할 수 있다. 보다 구체적으로, (a) 대상 식물의 외식체(explant)를 전 배양(pre-culture)한 다음, 이를 상기 형질전환된 아그로박테리움과 공동 배양하여 형질감염 시키는 단계 (b) 형질감염된 외식체를 캘러스 유도배지에서 배양하여, 캘러스를 수득하는 단계 및 (c) 수득된 캘러스를 절단하고, 이를 신초 유도배지에서 배양하여 신초를 형성시키는 단계를 거쳐 형질감염된 식물을 제조할 수 있다.

본 발명에서 '외식체(explant)'라 함은 식물체에서 잘라낸 조직의 절편을 말하는 것으로, 자엽(cotyledon) 또는 하배축(hypocotyl)을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 식물의 외식체로는 자엽 또는 하배축을 사용할 수 있으며, 식물의 종자를 소독하고 세척한 후, MS 배지에서 발아시켜 얻은 자엽을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명에서 이용 가능한 형질감염 대상 식물로는 담배, 토마토, 고추, 콩, 벼, 옥수수 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 식물세포 및 식물체는 환경 스트레스 저항성을 가진다.

상기 환경 스트레스는 식물체에 가해지는 외부적인 스트레스이며, 저온 스트레스, 고염 스트레스, 가뭄 스트레스 및 앱시스산(ABA) 호르몬에 의해 유발되는 스트레스 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 가뭄 스트레스이다.

이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 콩의 저온 스트레스에 의해 유도되는 RNA 헬리카제 유전자 분석

생육상에서 4주 이상 재배한 콩(Glycine max L.)에 대해 4℃에서의 저온 스트레스를 가하고 스트레스의 조건에 대해 설명해주시기 바랍니다), 스트레스 및 스트레스를 가하지 않은 콩잎에서 poly(A+) mRNA를 추출하여 PCR-Select cDNA Subtraction(Clontech, 미국)에 제조회사가 권장하는 방법에 따라 저온 스트레스에 의해서만 발현되는 콩유래 cDNA를 확보하였다.

확보된 cDNA를 subcloning 벡터인 pCR2.1(invitrogen, 미국)에 클로닝하여, 대장균에서 증폭하였으며, Plasmid purification kit(NucleoGen, 미국)를 이용하여 다량 획득하였다. 증폭된 각각의 cDNA는 마크로젠(한국)에 의뢰하여 염기분석을 수행하였으며, 얻어진 염기서열은 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov), GenBank(www.clcbio.com), EMBL(www.ebi.ac.kr/embl/) 및 SwissProt databases(www.ebi.ac.kr/swissprot)에서 제공된 DNASIS 및 BLAST 프로그램에 의해 비교분석하였다. 염기서열 분석결과를 토대로 5RACE-LT28 primer(서열번호 3) 및 3RACE-LT28 primer(서열번호 4)를 사용하여 95°C,℃ 5 분간 denaturation; 95°C, 1분간 denaturation, 55°C, 1분간 annealing; 72°C, 2분간 extension을 30 cycle 반복하였으며, 최종적으로 72°C, 7분간 final extension 반응으로 RACE PCR수행하였다.

5RACE-LT28 primer(서열번호 3): 5'-ATCCTCGTGCGGCCACATCAGTAGCAAT-3'

3RACE-LT28 primer(서열번호 4): 5'-ACAAAGCCCAACATGATCGCACAAAGGA-3'

그 결과, 저온 스트레스에 의하여 유도되는 RNA 헬리카제 유전자의 cDNA는 전체 1,617 bp의 염기서열(서열번호 1) 및 이로부터 538 개의 아미노산(서열번호 2)로 연역되는 것으로 분석되었으며, 상기 유전자를 LT28로 명명하였다.

LT28 유전자가 암호화하는 아미노산 서열을 데이터베이스 검색에 의해 유사도 분석을 한 결과, 상기 유전자와 가장 유사한 단백질 서열은 포도(Vitis vinifera)의 유전자(유전자은행 ID: CAO67062)와 73%의 유사도를 가지는 것으로 나타났으며, 상기 유전자로부터 얻어진 아미노산 서열 분석을 통하여, N-terminal 부분은 핵으로 타겟팅하는 nuclear localization site (NLS)가 존재하며, 특히 이 부분에서 두 아미노산 서열 간에 상당히 차이가 있음을 확인하였다(도 1). 또한 ATP 및 Mg^{2 +}이 결합하여 ATPase 활성을 갖는 도메인뿐만 아니라, C-terminal 부분에 RNA 헬리카제 도메인이 존재하는 것으로 분석되었다.

따라서, 본 LT28 유전자는 저온 스트레스에 의해 유도되는 신규의 콩(Glycine max L.) 유래 RNA 헬리카제를 발현하는 유전자인 것으로 확인되었다.

LT28 유전자가 암호화하는 아미노산 서열과 유사도가 높은 다른 종의 RNA helicase 아미노산 서열 분석을 통하여, 콩유래 헬리카제 LT28 유래 단백질은 포도(V. vinifera), 애기장대(Arabidopsis thaliana), 이끼(Physcomitrella patens)와 근연관계가 높았으며, 반면에 74% 아미노산 서열의 유사도를 보이는 벼(Oryza sativa)은 LT28와 근연관계의 거리가 먼 것으로, 또한 녹조류, 효모 등의 순서로 유사도가 낮고, 포유류 RNA 헬리카제와 43% 유사도를 나타내었다 (도 2).

실시예 2 : Southern blot 을 통한 콩 게놈상 LT28 유전자 개수 검정

콩 잎의 조직으로부터 genomic DNA를 추출하여(Shure et al ., 1983) EcoRI, XbaI, 또는 HindIII 제한효소로 반응시킨 후 0.8 % 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하고, 겔을 denaturation 용액(0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl)에, 그 후 neutralization 용액(0.5 M Tris-Cl, 1.5 M NaCl, pH 7.5)에 차례로 침지하였다. 상기 단계를 거친 겔은 10× SSC 용액(1.5 M NaCl, 0.15 M Sodium citrate)을 사용하여 나일론 막(AP Biotech, 미국)에 전이시키고, 이를 방사성 동위원소 [α-³²P] dCTP 로 표식된 LT28 유전자의 단편 1,617 bp의 PCR 산물을 프로브로 사용하여 Southern blot 분석을 수행하는데 사용하였다.

그 결과, 모든 제한효소 반응에서는 두 개의 밴드가 검출되었으며, RNA 헬리카제 cDNA 내에 EcoRI, XbaI, 또는 HindIII 제한효소가 없으므로 콩의 게놈상에 LT28 유전자가 2 카피 존재하는 것을 알 수 있었다 (도 3).

실시예 3: 신규 RNA 헬리카제 유전자의 환경 스트레스에 의한 발현유도 검정

생육 상 4주 이상 재배한 콩에 저온(4℃), 고염(0.1 M NaCl), 가뭄 스트레스(콩잎을 상온에서 말림) 및 0.1 M ABA 호르몬을 각각 시간별로 가한 잎으로부터 전체 RNA를 RNA extraction kit(Ambion, 미국)를 이용하여 분리하였다. 분리한 전 체 RNA를 1.0% 포름알데히드 겔(formaldehyde gel)에 전기영동한 후, 겔을 20 × SSC 용액(3 M NaCl, 0.3 M Sodium citrate)으로 나일론 막(Schleicher & Schuell 사 구입)에 전이시키고 방사성 동위원소 [α-³²P] dCTP로 표식된 RNA 헬리카제 유전자의 단편 1,617 bp cDNA를 탐침으로 하여 Northern blot 분석을 수행하였다.

그 결과, 잎에서 각각 저온(LT)과 상처 스트레스 처리 중 저온(5 ℃), 0.1 M NaCl, 0.1 M ABA 호르몬 처리 후 6시간 및 24시간 경과 후에도 LT28 전사체가 강하게 발현되었으며, 가뭄 스트레스(DR)에 의해서는 6시간 경과 후에는 LT28 전사체가 강하게 발현하다가, 24시간 경과 뒤엔 전사체 양이 감소한 것으로 관찰되었다 (도 4). 결론적으로, 콩 유래 RNA 헬리카제(LT28) 유전자는 저온(LT), 고염(NaCl), 가뭄 스트레스(DR) 및 ABA 호르몬(ABA)에 의해서 발현이 유도되는 유전자임을 확인하였다.

실시예 4: 대장균 발현 벡터계를 이용하여 재조합 융합 단백질 발현

대장균에서 LT28을 발현시켰을 겨우, RNA 헬리카제의 효소활성을 유지하는지를 알아보기 위해서, 실시예 1에서 분리된 LT28의 cDNA를 주형으로 5'-LT28 primer(서열번호 5) 및 3`-LT248 primer(서열번호 6)를 사용하여 95°C,℃ 5 분간 denaturation; 95°C, 1분간 denaturation, 55°C, 1분간 annealing; 72°C, 2분간 extension을 30 cycle 반복하였으며, 최종적으로 72°C, 7분간 final extension 반응으로 PCR을 수행하여 유전자를 분리하였다.

5'-LT28 primer(서열번호 5) : 5'-GAATTCATGGGTCGGAAACACG-3'

3'-LT28 primer(서열번호 6) : 5'-GTCGACTTAGTCTTCATCAGAGTCGTC-3'

상기 PCR로 얻어진 PCR 단편은 pGEMT-Easy vector(Promega, 미국)의 멀티 클로닝 부위에 삽입하여 pGEMT-LT28을 제조하고, 제노텍(한국)에 의뢰하여 삽입된 유전자의 염기 서열을 확인하였다. 상기 pGEMT-LT28에 대해 EcoRI과 SalI 제한효소 처리를 하여 LT28 DNA를 분리하고, 이를 pGEX4T-1(Promega, 미국)의 EcoRI과 SalI 사이트에 삽입하여 pGEX-28을 제조하였다.

콩 유래 RNA 헬리카제 유전자를 대장균에서 발현하기 위하여, LT28이 삽입되어 있는 pGEX-28을 사용하여 대장균(BL21)을 온도충격방법(42 ℃)으로 형질전환시키고, 상기 형질전환 대장균을 75 ㎍/ml ampicillin(Duchafa, 미국)이 함유된 LB(Luria-Bertani, 미국) 액체 배지에서 1시간 배양한 후, LB-Ampicillin 고체배지에 도말하여 37℃에서 16시간 이상 배양하였다. 고체 배지에서 얻어진 대장균 콜로니를 LB-Amp 50 ml 액체배지에 접종하여, OD 0.6 (1.0 × 10⁶ cell)까지 배양 후에 0.1 mM IPTG를 첨가하고, 28℃에서 3시간 동안 재배양하였다. 그리고나서 배양물을 3,000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 균체를 모은 후 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액을 1.7 ml 첨가하고 세포 파쇄기를 이용하여 세포를 파괴한 후 5,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액만을 12,000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하여 수용성 단백질과 비수용성 단백질을 분리하고, 12% SDS-단백질 전기영동(Laemmli, Nature, vol 227, p680-685, 1970)을 수행하여 재조합 융합 RNA 헬 리카제 단백질 발현을 분석하였다.

그 결과, 벡터만을 함유한 음성 대조군(control)에서는 GST 단백질 (30 kDa)이 IPTG에의해 잘 발현되는 것을 알 수 있었고, 융합단백질은 28℃ 배양조건에서 3시간째 가장 많이 발현하는 것을 알 수 있었다 (도 5). 또한 GST 단일클론항체(Invitrogen, 미국)를 사용한 웨스턴 블롯팅으로써, GST 및 LT28의 융합단백질(GST-28)의 발현을 확인할 수 있었다 (도 6). 따라서, GST-LT28 융합단백질 발현 체계를 통하여 대장균에서 GST-28 단백질이 효율적으로 유도되는 것을 알 수 있었다.

실시예 5: 융합 단백질 GST -28 분리 및 RNA 헬리카제 활성 측정

대장균에서 발현시킨 융합단백질이 RNA 헬리카제 효소활성을 갖는 지를 확인하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다.

대장균(BL21)에서 GST-28 융합단백질을 분리하기 위하여 ampicillin (Duchafa , 미국) 75 ㎍/ml이 들어있는 LB(Luria-Bertani) 액체 배지에 37℃에 16시간 이상 배양하고, LB-Amp 500 ml 액체배지로 옮겨 OD 0.6 (1.0 × 10⁶ cell)에 도달하면, 0.1 mM IPTG를 첨가하고, 28℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후 3,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 세포 펠렛을 얻어, 여기에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액을 20 ml 첨가하여 세포 파쇄기로 세포를 파괴한 후 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 얻어진 상층액으로부터 GST column을 사용하여 GST 융합단 백질을 분리하였다. GST 융합단백질은 centricone(Milipore, 미국)을 이용하여 농축하였으며, 12% SDS-단백질 전기영동(Laemmli, Nature , vol 227, p680-685, 1970)에 의해 BSA(0.1 mg/ml) 농도의 샘플과 비교하여 융합단백질 농도를 분석하였다.

그 결과, 상기 융합단백질인 GST-28 재조합 단백질(80 kDa)은 BSA 농도와 비교하여, 약 1㎍/㎕의 농도인 것으로 확인되었다 (도 7).

상기 융합단백질 GST-28의 RNA 헬리카제 활성을 확인하기 위해, pGEMT-Easy 벡터에 NcoI 처리 또는 SalI 처리 후, 제한효소 처리된 벡터를 주형으로 SP6 RNA polymerase 또는 T7 RNA polymerase를 사용하여 sense 또는 antisense RNA를 각각 합성하여 RNA 기질을 각각 준비하였다(Tai et al ., 1996, J. Virol . Vol. 70, 8477-8484). 반응 용액은 20 mM HEPES-KOH (pH 7.0), 2 mM dithiothreitol, 1.5 mM MnCl₂, 2 mM ATP, BSA(0.1 mg/ml), RNasin 2U, 200 ng RNA로 구성되었고, 10 GST, 1, 5 GST-28 단백질을 첨가하여 37°C에서 1시간 반응시켜 2% 아가로스 젤에 전기영동한 후 EtBr로 염색으로 RNA 상태를 비교하였다. 이때, 95°C에서 10분간 RNA를 denationation시키거나, proteinase K를 처리하여 생성되는 ssRNA도 함께 관찰하였다.

그 결과, GST-28 융합단백질이 첨가되었을 때 이중 나선의 RNA(dsRNA)가 단일 가닥으로 RNA(ssRNA)로 풀려진 것을 확인할 수 있었으며, GST-28의 양이증가할수록 ssRNA가 많이 생성되는 것으로 나타났다. 그리고 이러한 현상은 Proteinase K 를 처리함으로써 저해되는 것으로 보아, 상기 융합단백질의 RNA 헬리카제 활성에 의한 것임을 확인할 수 있었다 (도 8).

도 1는 콩의 RNA 헬리카제 유전자(LT28)의 cDNA 염기서열로부터 연역된 아미노산 서열과 포도의 RNA helicase 단백질 서열을 비교 분석한 것이다.

도 2는 콩의 RNA 헬리카제 유전자(LT28)의 cDNA 염기서열로부터 연역된 아미노산 서열과 이와 유사한 다른 종류의 식물, 동물 및 곰팡이의 RNA helicase 단백질과의 근연관계를 보여주는 생명나무를 나타낸 것이다.

도 3은 콩으로부터 분리한 RNA 헬리카제 유전자(LT28)의 갯수를 콩 게놈에서 알아보기 위하여 Southern blot 분석을 수행한 결과이다.

도 4는 콩으로부터 분리한 RNA 헬리카제 유전자(LT28)의 발현양상을 알아보기 위하여 저온, 고염, 가뭄 스트레스 및 ABA 호르몬 처리한 콩으로부터 전체 RNA를 분리하고 Northern blot 분석을 수행한 결과이다.

도 5는 콩으로부터 분리한 RNA 헬리카제 유전자(LT28) 전체를 포함하고 있는 GST 융합 단백질을 대장균에서 IPTG에 의해 유도시켜 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 통하여 분석한 그림이다.

도 6는 콩으로부터 분리한 헬리카제 유전자(LT28) 전체를 포함하고 있는 GST 융합 단백질을 대장균에서 IPTG에 의해 유도시켜 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 및 GST 항체를 이용하여 western blot을 통하여 분석한 그림이다.

도 7는 콩으로부터 분리한 RNA 헬리카제 유전자(LT28) 전체를 포함하고 있는 GST 융합 단백질을 대장균에서 발현시켜 GST 칼럼을 이용하여 분리, 농축하여 BSA 단백질 농도와 비교하기 위하여 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 통하여 분석한 그림이다.

도 8은 콩으로부터 분리한 RNA 헬리카제 유전자(LT28) 전체를 포함하고 있는 GST 융합 단백질을 이용하여 double strand RNA를 single strand RNA로 변환시키는 RNA helicase 활성을 분석하기 위하여 2% agarose gel에 전기영동한 후 분석한 그림이다.

<110> Dong-A University Research Foundation for Industry-Academy Cooperation <120> Novel Gene Encoding RNA Helicase and Use Thereof <130> P08-B113 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1617 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> CDS <222> (1)..(1614) <400> 1 atg ggt cgg aaa cac gac gcc gtt ttg gcc agc gaa cct gtc gcc gaa 48 Met Gly Arg Lys His Asp Ala Val Leu Ala Ser Glu Pro Val Ala Glu 1 5 10 15 gaa gcc ccc tgc agc cct gag ctc gat tcc gag aag aag aag aag aag 96 Glu Ala Pro Cys Ser Pro Glu Leu Asp Ser Glu Lys Lys Lys Lys Lys 20 25 30 aag aaa aag aag aac aaa aac aaa gac aag cac caa acc gaa agc agc 144 Lys Lys Lys Lys Asn Lys Asn Lys Asp Lys His Gln Thr Glu Ser Ser 35 40 45 ccc aaa cga aag ctc gac gaa cac gac ccc caa aac ggc acc gaa tcg 192 Pro Lys Arg Lys Leu Asp Glu His Asp Pro Gln Asn Gly Thr Glu Ser 50 55 60 aag aag aaa aag aag aag cac cac gag tcc aag ggg aac gcc gag gaa 240 Lys Lys Lys Lys Lys Lys His His Glu Ser Lys Gly Asn Ala Glu Glu 65 70 75 80 acc aac ggc gat agc aac aac aac aac ggc aat ggt gct aat cgc gag 288 Thr Asn Gly Asp Ser Asn Asn Asn Asn Gly Asn Gly Ala Asn Arg Glu 85 90 95 gaa acg gcg acg gat ggg tct gtt gtg gtc acc ggt aac aat gcg gga 336 Glu Thr Ala Thr Asp Gly Ser Val Val Val Thr Gly Asn Asn Ala Gly 100 105 110 gag gcg aaa tac gcc gcg gtg aag agc ttc gcg gat tcg ggg ctg ccg 384 Glu Ala Lys Tyr Ala Ala Val Lys Ser Phe Ala Asp Ser Gly Leu Pro 115 120 125 gag aac gtg ctg gag tgc tgc aag ggt ttc gag aag cct tct ccg att 432 Glu Asn Val Leu Glu Cys Cys Lys Gly Phe Glu Lys Pro Ser Pro Ile 130 135 140 cag tcc cgg gcg tgg cct ttc tta ttg gac ggt cgt gat ttg att gga 480 Gln Ser Arg Ala Trp Pro Phe Leu Leu Asp Gly Arg Asp Leu Ile Gly 145 150 155 160 att gct gcc act ggc tca ggg aag acg ttg gcg ttc ggc ata ccg gcg 528 Ile Ala Ala Thr Gly Ser Gly Lys Thr Leu Ala Phe Gly Ile Pro Ala 165 170 175 gtt atg cat gtt ttg ggg aag cgg aag ggg aaa agt tcc aag gga cga 576 Val Met His Val Leu Gly Lys Arg Lys Gly Lys Ser Ser Lys Gly Arg 180 185 190 aac cct ctc ggc ctc gtg ctc tca ccc act aga gag cta gct caa cag 624 Asn Pro Leu Gly Leu Val Leu Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Gln Gln 195 200 205 ata tca gat gtc atg tgt gat gct ggt agg tct tgt ggt gtg caa tca 672 Ile Ser Asp Val Met Cys Asp Ala Gly Arg Ser Cys Gly Val Gln Ser 210 215 220 atc tgt ttg tat ggt gga acc tcc aaa ggg cca caa atc tcc tca cta 720 Ile Cys Leu Tyr Gly Gly Thr Ser Lys Gly Pro Gln Ile Ser Ser Leu 225 230 235 240 aaa tct ggc att gac att gtc att gga acc cct ggt cgt atc cag gat 768 Lys Ser Gly Ile Asp Ile Val Ile Gly Thr Pro Gly Arg Ile Gln Asp 245 250 255 ctg att gaa atg ggt atc tgt tgc cta aaa gaa gta tct ttt gtg gta 816 Leu Ile Glu Met Gly Ile Cys Cys Leu Lys Glu Val Ser Phe Val Val 260 265 270 ctt gat gaa gct gat cgg atg ctt gac atg ggt ttt gaa caa ata gtt 864 Leu Asp Glu Ala Asp Arg Met Leu Asp Met Gly Phe Glu Gln Ile Val 275 280 285 cgc tct ata ctg ggt cag acg tgt tct gat cgt caa atg gtt atg ttc 912 Arg Ser Ile Leu Gly Gln Thr Cys Ser Asp Arg Gln Met Val Met Phe 290 295 300 agt gct aca tgg cct ttg cca gtt cat tac ttg gcg cag gag ttt atg 960 Ser Ala Thr Trp Pro Leu Pro Val His Tyr Leu Ala Gln Glu Phe Met 305 310 315 320 gat cct aat cct gta aaa gtt gtt gta ggc tca gaa gac tta gct gcc 1008 Asp Pro Asn Pro Val Lys Val Val Val Gly Ser Glu Asp Leu Ala Ala 325 330 335 aat cat gat gtc atg cag ata gtt gag gtc ttg gat gac cgt tct cgt 1056 Asn His Asp Val Met Gln Ile Val Glu Val Leu Asp Asp Arg Ser Arg 340 345 350 gat aag cgc cta gtt gct tta ctg gaa aag tac cac aaa tct cag agg 1104 Asp Lys Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Lys Tyr His Lys Ser Gln Arg 355 360 365 aat cga gta ttg gtt ttt gtt ttg tac aaa ttg gaa gcc aaa cga gtt 1152 Asn Arg Val Leu Val Phe Val Leu Tyr Lys Leu Glu Ala Lys Arg Val 370 375 380 gaa aat atg ctt caa gaa ggg ggt tgg aag gtt gta tca ata cac ggg 1200 Glu Asn Met Leu Gln Glu Gly Gly Trp Lys Val Val Ser Ile His Gly 385 390 395 400 gac aaa gcc caa cat gat cgc aca aag gca ctc tca ttg ttt aag aat 1248 Asp Lys Ala Gln His Asp Arg Thr Lys Ala Leu Ser Leu Phe Lys Asn 405 410 415 gca agc tgt cct ttg atg att gct act gat gtg gcc gcg cga gga ttg 1296 Ala Ser Cys Pro Leu Met Ile Ala Thr Asp Val Ala Ala Arg Gly Leu 420 425 430 gat att cca gat gtt gaa gta gtg atc aac tat agt ttt cct ctg act 1344 Asp Ile Pro Asp Val Glu Val Val Ile Asn Tyr Ser Phe Pro Leu Thr 435 440 445 aca gaa gat tat gtt cat aga att ggg cga act gga cga gct ggt aaa 1392 Thr Glu Asp Tyr Val His Arg Ile Gly Arg Thr Gly Arg Ala Gly Lys 450 455 460 aaa ggt gtt gcc cat aca ttc ttt atg cag cag aat aag gga ctt gct 1440 Lys Gly Val Ala His Thr Phe Phe Met Gln Gln Asn Lys Gly Leu Ala 465 470 475 480 ggg gag ctg gtg aat gtt tta aga gaa gca ggg caa act gta ccg gat 1488 Gly Glu Leu Val Asn Val Leu Arg Glu Ala Gly Gln Thr Val Pro Asp 485 490 495 gcc ctc cta aaa ttt ggc aca cat gta aag aaa aag gag tcc aaa ctt 1536 Ala Leu Leu Lys Phe Gly Thr His Val Lys Lys Lys Glu Ser Lys Leu 500 505 510 tat ggg gca cac ttc aag gaa att cct gtt gat gct cca aag tct caa 1584 Tyr Gly Ala His Phe Lys Glu Ile Pro Val Asp Ala Pro Lys Ser Gln 515 520 525 aag aaa aca ttt gac gac tct gat gaa gac taa 1617 Lys Lys Thr Phe Asp Asp Ser Asp Glu Asp 530 535 <210> 2 <211> 538 <212> PRT <213> Glycine max <400> 2 Met Gly Arg Lys His Asp Ala Val Leu Ala Ser Glu Pro Val Ala Glu 1 5 10 15 Glu Ala Pro Cys Ser Pro Glu Leu Asp Ser Glu Lys Lys Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys Lys Asn Lys Asn Lys Asp Lys His Gln Thr Glu Ser Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Lys Leu Asp Glu His Asp Pro Gln Asn Gly Thr Glu Ser 50 55 60 Lys Lys Lys Lys Lys Lys His His Glu Ser Lys Gly Asn Ala Glu Glu 65 70 75 80 Thr Asn Gly Asp Ser Asn Asn Asn Asn Gly Asn Gly Ala Asn Arg Glu 85 90 95 Glu Thr Ala Thr Asp Gly Ser Val Val Val Thr Gly Asn Asn Ala Gly 100 105 110 Glu Ala Lys Tyr Ala Ala Val Lys Ser Phe Ala Asp Ser Gly Leu Pro 115 120 125 Glu Asn Val Leu Glu Cys Cys Lys Gly Phe Glu Lys Pro Ser Pro Ile 130 135 140 Gln Ser Arg Ala Trp Pro Phe Leu Leu Asp Gly Arg Asp Leu Ile Gly 145 150 155 160 Ile Ala Ala Thr Gly Ser Gly Lys Thr Leu Ala Phe Gly Ile Pro Ala 165 170 175 Val Met His Val Leu Gly Lys Arg Lys Gly Lys Ser Ser Lys Gly Arg 180 185 190 Asn Pro Leu Gly Leu Val Leu Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Gln Gln 195 200 205 Ile Ser Asp Val Met Cys Asp Ala Gly Arg Ser Cys Gly Val Gln Ser 210 215 220 Ile Cys Leu Tyr Gly Gly Thr Ser Lys Gly Pro Gln Ile Ser Ser Leu 225 230 235 240 Lys Ser Gly Ile Asp Ile Val Ile Gly Thr Pro Gly Arg Ile Gln Asp 245 250 255 Leu Ile Glu Met Gly Ile Cys Cys Leu Lys Glu Val Ser Phe Val Val 260 265 270 Leu Asp Glu Ala Asp Arg Met Leu Asp Met Gly Phe Glu Gln Ile Val 275 280 285 Arg Ser Ile Leu Gly Gln Thr Cys Ser Asp Arg Gln Met Val Met Phe 290 295 300 Ser Ala Thr Trp Pro Leu Pro Val His Tyr Leu Ala Gln Glu Phe Met 305 310 315 320 Asp Pro Asn Pro Val Lys Val Val Val Gly Ser Glu Asp Leu Ala Ala 325 330 335 Asn His Asp Val Met Gln Ile Val Glu Val Leu Asp Asp Arg Ser Arg 340 345 350 Asp Lys Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Lys Tyr His Lys Ser Gln Arg 355 360 365 Asn Arg Val Leu Val Phe Val Leu Tyr Lys Leu Glu Ala Lys Arg Val 370 375 380 Glu Asn Met Leu Gln Glu Gly Gly Trp Lys Val Val Ser Ile His Gly 385 390 395 400 Asp Lys Ala Gln His Asp Arg Thr Lys Ala Leu Ser Leu Phe Lys Asn 405 410 415 Ala Ser Cys Pro Leu Met Ile Ala Thr Asp Val Ala Ala Arg Gly Leu 420 425 430 Asp Ile Pro Asp Val Glu Val Val Ile Asn Tyr Ser Phe Pro Leu Thr 435 440 445 Thr Glu Asp Tyr Val His Arg Ile Gly Arg Thr Gly Arg Ala Gly Lys 450 455 460 Lys Gly Val Ala His Thr Phe Phe Met Gln Gln Asn Lys Gly Leu Ala 465 470 475 480 Gly Glu Leu Val Asn Val Leu Arg Glu Ala Gly Gln Thr Val Pro Asp 485 490 495 Ala Leu Leu Lys Phe Gly Thr His Val Lys Lys Lys Glu Ser Lys Leu 500 505 510 Tyr Gly Ala His Phe Lys Glu Ile Pro Val Asp Ala Pro Lys Ser Gln 515 520 525 Lys Lys Thr Phe Asp Asp Ser Asp Glu Asp 530 535 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5RACE-LT28 primer <400> 3 atcctcgtgc ggccacatca gtagcaat 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3RACE-LT28 primer <400> 4 acaaagccca acatgatcgc acaaagga 28 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-LT28 primer <400> 5 gaattcatgg gtcggaaaca cg 22 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-LT28 primer <400> 6 gtcgacttag tcttcatcag agtcgtc 27

Claims (9)

1. 서열번호 2로 표시되는 RNA 헬리카제.
2. 제1항의 RNA 헬리카제를 코딩하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
5. 제4항의 재조합 발현벡터에 의해 형질전환된 미생물
6. 제4항의 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 환경 스트레스 저항성 식물세포.
7. 제4항의 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 환경 스트레스 저항성 식물체.
8. 제6항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 저온 스트레스, 가뭄 스트레스, 고염 스트레스 또는 앱시스산(ABA, abscisic acid) 유발 스트레스인 것을 특징으로 하는 식물세포.
9. 제7항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 저온 스트레스, 가뭄 스트레스, 고염 스트레스 또는 앱시스산(ABA, abscisic acid) 유발 스트레스인 것을 특징으로 하는 식물체.

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