KR101047529B1 - ＴＥＬ-ＡＭＬ1 키메릭 ｍＲＮＡ를 특이적으로 절단하는 핵산 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TEL-AML1 키메릭 mRNA를 특이적으로 절단하는 핵산 분자, 그 핵산분자를 이용한 TEL-AML1 키메릭 mRNA 불활성화 방법 및 상기 핵산분자를 포함하는 급성 림프구성 백혈병에 대한 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

Description

ＴＥＬ-ＡＭＬ1 키메릭 ｍＲＮＡ를 특이적으로 절단하는 핵산 분자{Ribozyme and DNAzyme that specifically cleave TEL-AML1 chimeric mRNA}
본 발명은 TEL-AML1 키메릭 mRNA를 특이적으로 절단하는 핵산 분자에 관한 것이다.
일반적으로 유전자 발현은 siRNA, shRNA, 안티센스 분자 및 DNAzyme의 사용을 포함하는 여러가지 다른 방법으로 조절될 수 있다. siRNA 및 shRNA는 모두 RNAi 경로를 통하여 기능하고 유전자의 발현을 억제하는데 성공적으로 사용된다.
RNAi는 먼저 벌레에서 발견되었고 dsRNA와 관련된 유전자 침묵현상이 Fire 및 Mello에 의해 식물에서 처음으로 보고되었으며 식물 세포가 RNA 바이러스의 감염을 막기 위한 방법이라고 생각되었다. 이 경로에서, 긴 dsRNA 바이러스 산물은 다이서-유사 효소에 의해 21-25 bp 길이의 더 작은 단편으로 프로세스된 다음 이중 가닥 분자가 풀리고 RISC(RNA induced silencing complex)로 적재된다. 유사한 경로가 인터페론 반응이라 불리는 유도를 막기 위하여 dsRNA 분자가 30 bp 길이보다 작아야하는 괄목할만한 차이를 갖는 포유류 세포에서 확인되었고,이는 유전자 특이적이지 않으며 세포에서 단백질 합성의 전체적 차단을 유도한다.
합성 siRNA는 하나의 유전자를 특이적으로 표적하도록 설계될 수 있고 이들은 시험관 내 또는 생체 내에서 쉽게 세포로 전달될 수 있다. shRNA는 siRNA 분자의 DNA 등가물이고 세포의 게놈으로 통합된 다음 매 유사분열 주기 동안 복제되는 이점이 있다.
DNAzyme도 또한 유전자 발현을 조절하는데 사용되어 왔다. DNAzyme은 단일 가닥 RNA를 절단하는 촉매 DNA 분자이다. 이들은 표적 RNA 서열에 대하여 매우 선택적이고 이로써 전령 RNA를 표적으로 하여 특정 유전자를 하향 조절하는데 사용될 수 있다.
해머헤드(hammerhead) 리보자임은 RNA의 서열 특이적인 절단을 수행할 수 있는 가장 작은 동정된 천연 리보자임이고(R.H. Symons,Annu. Rev. Biochem. 61 (1992) 641-671), 타겟 유전자의 기능을 저해하는데 광범위하게 사용된다(M. Amarzguioui, H. Prydz, Cell. Mol. Life Sci. 54 (1998) 1175-1202;K.R.Birikh, et al., RNA 3 (1997) 429-437; L.Q. Sun, et al., Pharmacol. Rev 52 (2000) 325-347). 기능적인 해머헤드(hammerhead) 리보자임은 기능적인 리보자임의 코어 서열을 프랭크(flank)하는 교잡 암에서 타겟 RNA에 역상보적인(reverse complementary) 서열과 RNA 분자들을 형성하여서 트랜스로 타겟 RNA를 절단하게 고안될 수 있다(O.C. Uhlenbeck, Nature 328 (1987) 596-600;J. Haseloff, W.L. Gerlach, Nature 334 (1988) 585-591). 트랜스-액팅 해머헤드 리보자임은 5'NUH-3' triplet (여기서 N은 임의의 뉴크레오타이드를 H는 A, C, 또는 U를 나타냄)을 함유하는 타겟 기질을 절단할 수 있다(M. Koizumi, S. Iwai, E. Ohtsuka, FEBS Lett. 239 (1988) 285-288;D.E. Ruffner, et al., Biochemistry 29 (1990) 10695-10702;R. Perriman, A. Delves, W.L. Gerlach, Gene 113 (1992) 157-163;T. Shimayama, et al., FEBS Lett. 368 (1995) 304-306;M. Zoumadakis, M. Tabler, Nucleic Acids Res. 23 (1995) 1192-1196).
상보적인 서열들은 일반적으로 선택된 타겟 사이트의 양 옆으로 전체적으로 14-16 뉴크레오타이드를 구성한다(T.C. Jarvis, et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 29107-29112). 이것은 촉매 사이클에서 전형적인 속도-결정단계로 그 타겟으로부터 용이한 해리를 하게하고 절단 반응에 대하여는 충분한 특이성을 주게하는 것으로 생각된다(J. Goodchild, V. Kohli, Arch. Biochem. Biophys. 284 (1991) 386-391;P. Hendry, M. McCall, Nucleic Acids Res. 24 (1996) 2679-2684). RNA-절단 디옥시리보자임은 타겟 mRNA의 서열특이적일 수도 있고, 인비트로 선택 기술을 통하여 발견되었다(S.W. Santoro, G.F. Joyce, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 94 (1997) 4262-4266). "10-23"RNA-절단 디옥시리보자임 또는 DNAzyme은 Watson-Crick 베이스-페어링을 통하여 RNA를 인식하고 짝지어지지 않은 퓨린(R) 및 피리미딘(Y) 사이에 위치한 포스포다이에스테르 결합에서 그것의 타겟을 절단한다.
종종 소아 혈액 종양에서 발견되는 급성 림프구성 백혈병(Acute lymphoblastic leukemia;ALL)은 염색체 12와 21 사이에서 염색체 전이와 관련된다(T.R. Golub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92 (1995) 4917-4921).
염색체 전이t(12;21)(p12;q22)는 조직-특이적인 전사 인자, AML1의 21-480 잔기에 융합된 ETS-유사 추정 전사인자인 TEL의 336 아미노-말단 부위를 포함하는 키메릭 단백질인 TEL-AML1를 코딩하는 TEL-AML1 융합 유전자의 형성을 야기한다(T.R. Golub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92 (1995) 4917-4921;S.P. Romana, et al.,Blood 86 (1995) 4263-4269;S.P. Romana, et al., Blood 85 (1995) 3662-3670). TEL 및 AML1가 전사인자로 추정되므로 t(12;21)의 획득은 백혈병 세포의 조절되지 아니하는 성장을 야기하는 혈액-특이적인 유전자 발현의 조절을 변화시키는 것으로 예측된다. TEL - AML1 키메릭 mRNA에 의하여 코딩되는 TEL-AML1 융합 단백질은 종양 세포 표현형에 독특하고 백혈병 유발에 주로 관여한다(T.R. Golub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92 (1995) 4917-4921;J.K. Rho, et al., Biochem. Biophys. Res Commun. 297 (2002) 91-95).
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 키메릭 TEL - AML1 mRNA를 절단하고 그 접합 서열(junction sequence)을 특이적으로 타겟하는 물질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 TEL-AML1 키메릭 mRNA를 불활성화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 급성 림프구성 백혈병 치료제를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 TEL-AML1 키메릭 mRNA를 특이적으로 절단하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기의 핵산 분자는 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 급성 림프구성 백혈병에 대한 예방 또는 치료 효과를 가지는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 급성 림프구성 백혈병 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 (a) 표적 TEL-AML1 키메릭 mRNA에 대한 촉매 활성을 가지며 이 촉매 활성은 상기 표적 RNA의 기능의 불활성화를 초래하는 본 발명에 따른 핵산 분자를 반응 혼합물을 제공하는 단계; (b) 표적 TEL-AML1 키메릭 mRNA를 상기 혼합물에 제공하는 단계; (c) 상기 핵산 분자가 상기 촉매활성을 발현하도록 하는 조건을 제공하는 단계를 포함하는 표적 TEL-AML1 키메릭 mRNA의 활성을 불활성화시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 리보자임은 단일 가닥 핵산, 예컨대, mRNA를 상보적인 영역에서 절단할 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매 RNA 분자이다. 따라서, 리보자임(예: Haselhoff 및 Gerlach (1988)Nature 334:585-591에 기재된 해머헤드 모양의 리보자임)은 mRNA 전사물을 촉매적으로 절단하여 mRNA에 의해 암호화되는 단백질의 번역을 억제하는 등에 사용될 수 있다. 본 발명의 TEL-AML1 키메릭 mRNA에 대하여 특이성을 갖는 리보자임은 본원에 개시된 도 1의 엑손 서열을 기초로 하여 설계될 수 있다.
본 발명은 또한 RNA(Breaker 및 Joyce, 1994; Santoro 및 Joyce, 1997) 또는 DNA(Carmi et al., 1996) 분자를 절단할 수 있는 DNAzyme을 포함한다. 이러한 핵산 효소의 촉매 절단 비율은 이가 금속 이온, 예컨대, Ba2+, Sr2+, Mg2+, Ca2+, Ni2+, Co2+, Mn2+, Zn2+ 및 Pb2+의 존재 및 농도에 달려있다(Santoro 및 Joyce, 1998; Brown et al., 2003).
촉매 DNAzyme, 예컨대, 10:23 및 8:17 DNAzyme은 다중 도메인을 갖는다. 이들은 두개의 비보존 기질 결합 도메인(하이브리드 팔)에 의해 플랭크되는 보존 촉매 도메인(촉매 코어)을 가지고, 이는 기질에 특이적으로 결합하는 서열의 영역이다. 10:23 및 8:17 DNAzyme은 특이적 RNA 포스포디에스테르 결합에서 핵산 기질을 절단할 수있다(Santoro 및 Joyce, 1997). 10:23 DNAzyme은 기질-인식 팔에 의해 플랭크되는 15개의 데옥시뉴클레오티드의 촉매 도메인을 갖는다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는, 예를 들어, 안정성, 하이브리드화 또는 분자의 가용성을 개선하기 위하여 염기 부위, 당 부위 또는 포스페이트 백본에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 상술한 바와 같은 뉴클레오티드 유사체는 천연 유래 뉴클레오티드에 대하여 치환될 수 있다.
본 발명은 또한 암을 치료하기 위해, 유전자 치료법에 이용하기 위해 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 것을 포함한다. 유전자 치료를 위한 목적으로, 본 발명의 구조체는 임의 생물학적 효과를 가지는 담체를 통하여 투여될 수 있는데, 예를 들면, in vivo에서 세포로 재조합 유전자를 효과적으로 운반할 수 있는 임의 조성물 또는 조성물이 될 수 있다. 방식으로는 재조합 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합된 바이러스, 허피스 심플렉스 바이러스-1, 재조합 박테리아 또는 진핵 플라스미드를 포함하는 바이러스성 벡터에 이와 같은 유전자를 삽입하는 것을 포함한다. 바이러스 벡터를 세포에 직접 트랜스펙트시키는데; 플라스미드 DNA는 양이온 고분자, 양이온 리포좀(가령, 리포펙틴, D.D.A.B.와 같은 콜레스테롤 유도체, 양이온 인지질) 또는 유도된(가령, 항체 접합된), 폴리리신 동액체, 그라미시딘 S, 인공 바이러스 외비 또는 다른 세포내 담체등의 도움뿐만 아니라 네이키드 DNA 구조의 직접 주입, 전기천공, CaPO4 침전등으로 운반할 수 있다. 암 유전자 치료법에 이용되는 발현 시스템 및 유전자 전달에 대해서는 Cooper, 1996, Seminars in Oncology 23:172-187의 것을 참고로 한다.
유전자 치료에 적절한 숙주 세포의 트랜스덕션이 중요한 첫 단계이기 때문에, 특정 유전자 운반 시스템을 선택하는 것은 원하는 표적의 표현형 및 투여 경로 (즉, 국소 또는 전신)에 따라 달라질 수 있다. 또한, 발현 구조의 in vivp 트랜스덕션을 제공하는 특정 유전자 구조체는 세포의 in vitro트랜스덕션에 유용하고, 이는 상기에서 설명한 것과 같은 ex vivo 조직 배양 시스템에도 이용할 수 있다.
세포에 핵산을 in vivo 트랜스덕션을 위한 적절한 방법은 본 발명의 핵
산을 포함하는 바이러스성 벡터를 이용하는 것이다. 세포에 바이러스 벡터를 감염시키면, 표적이 되는 서열의 상당 부분이 핵산을 수용하게 되는 장점이 있다. 또한, 바이러스 벡터내에 인코드된 분자 즉, 바이러스성 벡터에 포함된 cDNA에 의해 인코드된 분자는 바이러스성 벡터 핵산을 수용한 세포에서 효과적으로 발현된다. 현재 이용되는 방법 및 조성물을 이용하여 운반될 수 있는 적절한 벡터에는 허피스 심플렉스 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연합된 바이러스 벡터,레트로바이러스 벡터, 슈도라비스 바이러스, 알파-허피스 바이러스 벡터등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 바이러스 벡터, 비-복제 세포를 변형시키는데 적합한 특정 바이러스 벡터, 관심이 되는 폴리뉴클레오티드의 발현과 관계하여 이와 같은 벡터의 이용등에 관한 것은 "Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications" Ed. Caplitt and Loewy, Academic Press, San Diego(1995)을 참고로 한다.
본 발명에 유용한 적절한 바이러스성 유전자 운반 시스템은 아데노바이러스-유도된 벡터를 이용한다. 아데노바이러스 게놈을 조작하여, 관심이 있는 유전자 생성물을 인코드하고, 발현시키나, 정상적인 용균성 바이러스의 생명 과정에서 복제
할 수 있는 이의 능력에서는 비활성화되도록 한다(Berkner et al., 1988, BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al., 1991,Science 252:431-434; and Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155). 또한, 바이러스 입자는 정제 및 농축에 대해 상대적으로 안정적이고, 수용할 수 있는 것으로써, 이는 감염성 스펙트럼에 효과를 주기위해 변형시킬 수 있다. 또한, 도입된 아데노바이러스DNA( 및 이에 포함된 외부 DNA)는 숙주 세포의 게놈에는 통합되지 않으나, 이는 상피에서는 유지되어, 도입된 DNA는 숙주 게놈에 결합되는 상황에서 삽입 돌연변이를 발생시키는 문제를 피할 수 있다(레트로바이러스 DNA). 또한, 다른 유전자운반 벡터에 비해, 외부 DNA에 대한 아데노바이러스성 게놈의 운반 능력이 상당히 크다(최고 8kb)(Berkner et al., citedsupra, Haj-Ahmand and Graham, 1986, J. Virol.57:267).
상기에서 설명하는 바이러스 전달 방법에 추가하여, 비-바이러스성 방법을 이용하여, 동물의 조직으로 원하는 이형 유전자를 직접적으로 발현되게 한다. 유전자 전달을 위한 대부분의 비-바이러스 방법은 거대분자의 수용 및 세포내 운반을 위해 포유류 세포에 의해 이용되는 정상적인 기작에 의존한다. 적절한 구체예에서, 본 발명의 비-바이러스성 유전자 운반 시스템은 표적이 되는 세포가 발현 구조를 수용하는 세포내 취입(endocytosis) 과정에 따라 달라진다. 예를 들면, 이와 같은
형태의 유전자 운반 시스템에는 리포좀 유도된 시스템, 폴리리신 공액체, 인공 바이러스 외피 등이 포함된다.
임상적인 세팅에서, 치료요법적 구조체를 위한 유전자 운반 시스템을 당분야에 공지된 다양한 방법 중 하나를 이용하여 환자로 도입시킨다. 예를 들면, 유전자 운반 시스템을 가지는 제약학적 조성물은 정맥 조사등의 방법을 이용하여 전신으로 도입될 수 있고, 표적 세포에서 구조체의 특이적인 발현은 세포-형 또는 조직-형 발현에 의해 제공되는 트랜스펙션 특이성에 따라 발생하는데, 그 이유는 조절 서열이 이형 유전자의 발현을 조절하거나 또는 특정 세포형을 표적으로 하는 유전자 운반체와 복합된 조절 서열을 이용하기 때문이다. 다른 구체예에서, 구조체의 초기 운반은 동물내로 도입시키는 것이 상당히 제한된다. 예를 들면, 유전자 운반 담체를 카테테르(see U.S. Patent 5,328,470) 또는 입체적으로 주사( e.g.Chen et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3054-3057)하는 등의 방법으로 도입시킬 수 있다. 본 발명의 구조체는 Dev et al., 1994, Cancer Treat. Rev. 20:105-115에서 설명하는 기술을 이용하여 전기천공에 의해 유전자 요법으로 운반시킨다.
유전자 치료 구조체로 된 제약학적 조성물은 수용가능한 희석물에 있는 유전자 운반 시스템으로 구성되거나 또는 유전자 운반체가 포함된 서방형 매트릭스로 구성된다. 또는, 완전한 유전자 운반 시스템이 레트로바이러스 벡터와 같은 재조합 세포로부터 만들어지는 경우에, 제약학적 조성물은 유전자 운반 시스템을 생산하는 한 가지 이상의 세포로 구성된다.
당업자는 암과 관련된 바람직하지 못한 증상(통증, 감응성, 체중 감소등)의 예방 또는 경감을 원한다는 것을 인지할 것이다. 또한, 종양의 양 및 생장 속도의 임의 감소 뿐만 아니라 종양의 조직병리학적 모양도 개선될 것을 원한다. 따라서, 본 발명의 목적에서, "치료", "치료 용도", "의학적 용도"등은 질병 또는 증상을 치료하는 청구된 조성물을 모두 사용하는 것을 말하거나 또는 어떠한 방식으로든간에 질병 또는 다른 원하지 않는 증상의 예방, 방해, 지연, 역전시킬 수 있는 청구된 조성물을 사용하는 것을 말한다.
효과적인 약량 및 치료 프로토콜은 통상적인 수단으로 결정할 수 있는데, 이는 실험 동물에서 낮은 약량으로 시작하여,효과를 모니터하면서 약량을 증가시키고, 그 다음 약량 섭생을 다양하게 하는 것이다. 동물 연구, 적절하게는 포유류 연구를 이용하여, 최대 내성 약량을 결정하거나 또는 체중 ㎏당 생활성 물질의 MTD를 결정한다. 당업자는 사람을 포함하는 다른 종에 대해 독성을 피하면서 효과를 가지는 약량을 추정할 수 있다.
효과에 대해 사람에서 연구를 하기 전에, 정상적인 개체에서 Phase I 임상 연구를 실시하여, 안전한 약량을 확립한다. 주어진 개체에서 최적의 약량을 결정하는데 있어서, 임상의사들은 여러 가지 인자를 고려해야 한다. 이들중 주로 고려되는 것은 선택된 이형 유전자 생성물의 독성 및 반감기이다. 추가 인자에는 환자의 체구, 환자의 나이, 환자의 일반적인 상태, 치료해야할 특정 암과 관련된 질병, 질병의 심각성, 환자에 다른 약물을 사용하는지의 여부, 유전자 생성물의 in vivo 활성 등이 된다. 동물 연구 및 임상 문헌의 결과를 고려한 후에 시도할 약량을 선택할 수 있다.
예를 들면, 티미딘 카이나제와 같은 이형 유전자에 작동식으로 연결된 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 아데노바이러스성 벡터를 일반적으로 사람에 이용하는 약량은 하루에 종양에 바로 주입되는 양으로는 1 x 107pfu 내지 1 x 1010pfu가 된다. 좀 더 적절하게는 종양으로 바로 주입되는 아데노바이러스성 벡터의 매일 약량은 종양의 크기에 따라 1 x 108pfu 내지 1 x1010pfu가 된다.
특히, in vivo에서 이용하는 것을 고려할 경우에, 본 발명의 다양한 생화학적 성분은 순도가 높아야 하고, 실제 유해한 오염물질(예를 들면, 적어도 NF 등급, 일반적으로는 적어도 분석용 등급, 가장 적절하게는 제약학적 조성물로 이용할 수 있는 등급)이 없어야 한다. 주어진 화합물을 사용하기 전에 합성하는 경우에, 이와 같은 합성 또는 연속하여 정제함으로써,합성 또는 정제하는 과정 동안에 이용된 임의 독성이 있을 수 있는 물질을 제거한 생성물을 얻을 수 있다.
환자의 암 질환을 치료하는데 이용하는 경우에, 본 발명은 또한, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터 또는 벡터를 방출하는 세포를 포함하는 멸균된 바이알 또는 앰플의 형태로 된 멸균 키트 또는 포장을 제공한다. 한 구체예에서, 키트에는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 포함하는데, 이는 바로 투여할 수 있는 조제물로 단위 약형 또는 다중 약량을 포함할 수도 있고, 이때 포장에는 암을 치료하기 위한 내용물의 사용방법을 설명한 라벨을 부착한다. 또는 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 포장에는 이와 같은 벡터를 방출하는 세포 또는 세포주를 포함하는 멸균 바이알 또는 앰플을 제공한다. 저장 및 운반을 위해서, 벡터를 방출하는 세포 또는 세포주는 냉동시킬 수 있다. 선택적으로, 포장에는 벡터를 방출하는 세포 또는 세포주를 배양하기 위한 배지 또는 시약을 포함한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 본 발명자들은 키메릭 RNA의 부분을 공유하는 정상 mRNA를 파괴하지 아니하고 키메릭 TEL - AML1 mRNA를 절단하고 그 접합 서열(junction sequence)을 특이적으로 타겟하는 해머헤드 리보자임과 10-23 DNAzyme를 발명하였다. 본 발명에서는 그 고안된 해머헤드 리보자임과 10-23 DNAzyme을 인 비트로 TEL-AML1 키메릭 mRNA 절단의 효율성을 비교하였다.
급성 림프구성 백혈병을 야기하는 유전적 변이인 TEL - AML1 키메릭 RNA의 발현을 파괴하기 위한 올리고뉴크레오타이드를 개발하기 위하여, TEL - AML1 융합 RNA를 특이적으로 절단할 수 있는 해머헤드 리보자임과 디옥시올리고리보자임을 고안하였다. 비대칭 기질 결합 암을 가지는 디옥시리보자임(Dz26)과 스템 III에서 4 nt-벌지된 기질 결합 암을 가지는 해머헤드 리보자임(buRz28)의 구축은 정상 TEL(Translocation-Ets-Leukemia; ETS translocation variant 6) 및 AML1(Acute Myeloid leukemia-1; Runt-related transcription factor 1) RNA의 절단없이 인 비트로에서 그 접합에 인접한 부위들에서 특이적으로 TEL - AML1 키메릭 RNA를 절단할 수 있었다. 유전자-전달 기술의 현재 진보와 결합하여 TEL - AML1 키메릭 mRNA를 특이적으로 절단하는 본 발명의 고안된 올리고뉴크레오타이드는 급성 림프구성 백혈병의 치료제로 적용될 수 있을 것이다.
현재의 핵산 전달 기술 등의 도움을 받아서 키메릭 mRNA를 절단하는 본 발명의 고안된 올리고뉴크레오타이드들은 급성 림프구성 백혈병을 치료하는 효과적인 약제 후보물질로서 개발될 수 있다.
도 1은 TEL-AML1 키메릭 RNA에 타겟되는 고안된 DNAzyme과 해머헤드 리보자임의 뉴크레오타이드 서열을 나타낸다. 그 접합 부근의 TEL - AML1 서열을 나타낸다. 그 접합 부근의 TEL 엑손 서열을 대문자로 표시하고 AML1 엑손 서열은 소문자로 표시하였다. 고안된 DNAzyme과 리보자임에 의한 절단의 잠재적 부위를 화살표로 표시하였다.
도 2는 고안된 DNAzyme 및 해머헤드 리보자임에 의한 타겟 RNA 절단에서의 특이성을 나타낸 그림이다.
도 2a는 세 RNA 기질들을 타겟 RNA 절단의 특이성을 조사하기 위하여 사용하였다. T7 RNA 중합효소에 의한 효율적인 RNA 합성을 위하여, 두 G 뉴크레오타이드들(GG)을 TEL 및 TEL - AML1 RNAs의 5‘말단에 삽입한 것을 보여준다.
도 2b는 Dz26에 의한 TEL - AML1 기질의 절단이 24 nt의 5’절편을 생성하는 반면, buDz26는 어떠한 RNA 기질도 절단할 수 없는 것을 보여준다. Dz26에 의한 정상 RNAs의 절단이 없다는 것도 보여준다.
도 2c는 Rz28이 키메릭 TEL - AML1 뿐만 아니라 정상 AML1 RNA를 절단하는 것을 보여주는 사진. buRz28은 정상 RNA 기질들에 대한 절단없이 단지 TEL - AML1 기질만을 절단하는 것을 보여준다.
도 3은 buRz28과 Dz26을 가진 세포에서 TEL - AML1 단백질의 발현이 감소하는 것을 나타내는 그림이다. 세포들에 남아있는 TEL-AML1 단백질의 웨스턴 블럿 분석을 나타낸다. TEL - AML1 발현 플라즈미드와 여러 농도의 DNAzyme (Dz26) 또는 리보자임(buRz28)으로 트랜스팩션된 세포들을 48시간 배양하였다. 모의(Mock)는 TEL-AML1 발현 플라즈미드 없는 세포를 나타내고, T/A1은 TEL - AML1 발현 플라즈미드는 가지나 DNAzyme 또는 리보자임 처리가 없는 세포를 나타낸다. Dz*는 음성 대조군으로 부적절한 DNAzyme (5.0 μM)로 처리한 세포를 나타낸다.
실시예 1: DNAzymes , 해머헤드 리보자임 및 기질 RNAs 제조
10-23 DNAzymes (도 1) 및 RNA 합성을 위한 DNA 주형은 화학적으로 합성하였다(Cosmo Gentech, Seoul, Korea). 모든 올리고뉴크레오타이드들은 변성 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(PAGE)에 의하여 정제하였다. 해머헤드 리보자임 또한 화학합성에 의하여 제조하였다(Bioneer Co., Daejeon, Korea). TEL - AML1 기질 RNA 및 정상 TEL 및 AML1 기질 RNAs에 대한 DNA 주형은 화학적으로 합성되었다. RNAs의 인 비트로 합성에 대한 DNA 주형은 T7 프로모터와 그것의 RNA 서열의 앤티센스 서열을 포함하였다. 프로모터 서열의 다운스트림, 5' 쪽에 GG 잔기들은 전사의 높은 효율을 위하여 삽입되었다. 반응 혼합물 및 전사를 위한 어닐링 프라이머들은 D.E. Kim, G.F. Joyce, Chem Biol 11 (2004) 1505-1512에 기재된 것과 같이 제조하였다.
실시예 2: DNAzymes 및 리보자임으로 타겟 RNA 절단 실험
기질 RNA의 5'말단으로부터 트리포스페이트 그룹을 calf intestinal 알칼라인 포스페테이즈로 제거하고 그 탈인산화된 전사체를 T4 폴리뉴크레오타이드 카이네이즈와 [감마-32P]ATP(6,000 Ci/mmol, GE Healthcare)를 사용하여서 표지하였다. 5' 말단 표지된 기질 RNAs를 변성 PAGE로 정제하였다. 리보자임과 DNAzymes의 모든 타겟 RNA 절단 활성을 37℃에서 단일 턴오버(효소 포화)조건 하에서 반응버퍼(20 mM MgCl2 및 20 mM TrisHCl, pH 7.5)에서 실험하였다. 그 반응은 각 표지안된 해당 기질(최종 50nM RNA의 농도를 냄) 및 각 효소(리보자임 또는 DNAzyme, 500 nM 최종 농도)가 혼합된 미량의 32P-5'표지된 기질 RNA를 결합하여서 시작되고, 85℃에서 2분간 분리적으로 가열하고 20mM MgCl2을 함유하는 버퍼에서 반응전에 잠재적인 응집을 파괴하기 위하여 37℃에서 10분간 냉각을 수반하였다. 그 반응은 동량의 25 mM Na2EDTA 및 8 M 요소를 포함하는 젤-로딩 버퍼를 첨가하여 중지시켰다. 그 산물들을 8 M 요소를 포함하는 15 % (w/v) 변성 PAGE로 분리하였다. 그 산물 밴드들을 육안화하고 Cyclone PhosphorImager (Packard Instruments, Meriden, CT)에 대하여 정량화하였다.
본 발명의 TEL - AML1 키메릭 RNA에서 해머헤드 리보자임에 대한 한 잠재적인 타겟 사이트(AML1의 5'말단으로부터 28nt 떨어진)를 그 접합(junction)의 10nt 내에서 선택하였다(도 1); 그 Rz28는 그 접합의 3' 8nt에 위치된 AUA triplet에서 TEL-AML1 키메릭 RNA를 절단하게 고안되었다. 이 구축물에서, 비대칭 기질 어닐링 암을 야기하는 두 비-인접한 융합 서열을 포함하기 위하여 스템 III의 길이는 스템 I의 길이보다 더 길다. 한 어닐링 암(스템 III)가 TEL - AML1 키메릭 RNA 기질(buRz28)에 어닐링 시에 4nt 벌지를 생성하기 위하여 고안된 다른 버전의 리보자임 타겟팅에서 동일한 부위가 또한 구축되었다. 그 buRz28은 기질 결합에서 Rz28이 하는 것과 동일한 양의 서열을 커버하지만 각 사이드에서 그 기질의 9nt를 가지고 어닐링하는 대칭 결합 암(arm)을 가진다.
DNAzyme에 대한 두 잠재적인 RNA 절단 사이트가 선택되었다; 리보자임에 대한 절단 자리에 인접한 각각 그 접합의 6- 및 8 nt 3'에 위치한 AU 및 AC doublet. TEL - AML1 타겟 RNA를 따라 각 부위에 특이적인 교잡 암의 정해진 길이와 10-23 촉매 모티프를 포함하는 두 DNAzyme이 구축되었다(도 1). 그 DNAzyme의 교잡 암은 정상 TEL 및 AML1 mRNA로부터 타겟 TEL - AML1 키메릭 mRNA를 구별하기 위하여 TEL-AML1 접합에서 플랭킹하는 TEL 및 AML1 유전자의 양 부위(segment)를 모두 특이적으로 인식하기 위하여 고안되었다. 한 DNAzyme은 잠재적인 절단 부위가 다른 DNAzyme (Dz26)에 대한 절단 부위에 비하여 절접합으로부터 비교적 멀리 떨어졌기(8nt 떨어진) 때문에 결합 암(buDz28)에서 4 nt 벌지(bulge)를 포함하게 고안되었다.
고안된 DNAzymes 및 리보자임의 특이성 및 촉매활성
고안된 DNAzymes 및 리보자임에 의하여 촉매되는 절단의 특이성을 조사하기 위하여 본 발명자들은 키메릭 TEL - AML1 RNA 기질과 정상 TEL 및 AML1 기질에 대한 RNA-절단 활성 및 특이성을 조사하였다. 높은 특이성을 가지는 효소들은 키메릭 TEL-AML1 RNA 기질에 대해서남 절단하여야 한다. 기질 TEL - AML1 키메릭 RNA는 TEL -AML1 접합의 5' 16nt로부터 TEL - AML1 접합의 3'의 38nt 서열로 구성된다(도 2a). 중앙에 TEL - AML1 breakpoint (1033 nt의 TEL 및 58 nt의 AML1 코딩 서열)을 함유하는, 정상 TEL 기질 RNA 부위는 정상 TEL cDNA의 1019에서 1063이고 정상 AML1 기질 RNA는 AML1 cDNA의 42에서 87 위치이다(도 2a).
서열번호 1의 DNAzyme (Dz26)은 키메릭 TEL - AML1 기질에 대하여 특이적인 절단을 나타내지만, 다른 구축물(buDz28)은 어떠한 RNA 기질도 절단하지 않았다(도 2b). 이 결과는 DNAzyme-기질 복합체에서 절단 부위 근처에 삽입된 벌지는 그 효소의 촉매활성을 파괴한다는 것을 나타낸다.
반대로 양 리보자임은 그 예측되는 부위에서 그 TEL - AML1 기질을 효율적으로 절단하였지만, 그 Rz28은 키메릭 RNA 뿐만 아니라 정상 기질(AML1)을 절단하여 비특이적인 무차별 활성을 보였다(도 2c). 또한 그 Rz28 리보자임으로 정상 AML1 RNA로부터 얻은 절단 생성물의 양은 키메릭 TEL - AML1 기질로부터 얻어진 것과 비교할만하였다. 이 결과는 그들의 비교적 긴 앤티센스 암을 가지는 그 고안된 리보자임은 기질로 키메릭 TEL - AML1 RNA 뿐만 아니라 정상 AML1 RNA를 인지하였다는 것을 나타낸다. 그러나 서열번호 2의 buRz28 리보자임은 기질 특이성을 가지는 촉매 활성을 보유할 수 있었다. 본 발명자들은 스템 III에서 벌지된 구조를 가지는 buRz28의 방해받지 않는 활성에 의하여 나타낸 것과 같이 스템 III 벌지/스템 II 루우프 상호작용이 RNA-절단 활성을 보유하는 해머헤드 리보자임에 허용된다는 것을 발견하였다.
실시예 3: 세포 배양 및 트랜스팩션
인간 배아 신장 세포주 293T로부터 유래한 세포들을 10 % 소태아 혈청과 1 % 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's 배지 (DMEM, Invitrogen)에서 배양하였다. 그 세포들을 5 % CO2 분위기에서 37℃에서 배양하였다. His-tagged TEL 및 TEL-AML1 융합 단백질에 대한 포유류 발현 플라즈미드는 J.H. Kim, et al., AML1, Int. J. Biochem. Cell. Biol. 31 (1999), 933-940에 기재된 것과 같이 제조하였다. 트랜지언트 (코)-트랜스팩션을 60-70 % 컨후루언스에 도달한 세포로 6-웰 플레이트에서 수행하였다. 플레이트된 293T 세포들을 phosphate-buffered saline (PBS)로 2회 세척하고 트랜스팩션 전에 500 μl의 혈청-없는 배지(DMEM)에 위치하였다. 각 올리고 뉴크레오타이드(DNAzyme 및 리보자임; 각 올리고뉴크레오타이드들의 최종 농도는 0 ~ 5.0 μM)이고 8 μg의 타겟 발현 플라즈미드(TEL-AML1 융합 유전자 플라즈미드)가 Lipofectamine 2000 (invitrogen) (Opti-MEM 환원 배지(5　㎍/ml에 부유된)으로 혼합되고 상온에서 20분간 DMEM로 희석하였다. 배양 후에, 그 혼합물을 혈청-없는 배지의 세포들에 첨가하였다. 4시간 후에, 그 배지를 10% 소태아 혈청을 가지는 성장 배지(DMEM)로 대체하고 세포들을 또 48시간 배양하였다.
실시예 4: 웨스턴 블럿 분석
트랜스팩션 48시간 후에, 그 세포들을 라이시스 버퍼(20mM Tris-HCl, pH7.9, 20mM EDTA, 100mM KCl, 10 % 글리세롤, 0.1% Nonidet P40,)에서 부드럽게 벗겨내어서 수집하였다. 동량의 전체 세포 단백질을 5 x SDS 샘플 버퍼로 혼합하고, 95℃에서 5분간 변성하고, 8 % SDS-폴리아크릴아마이드 젤 상에서 분리하였다. 단백질을 Immobilion-P 막(MILLIPORE)에 전기영동적으로 옮기고, 단클론 Anti-polyHistidine Clone HIS-1(Sigma) 및 단클론 항-베카-액틴 항체(Sigma)로 면역블럿하였고, Enhanced chemiluminescence (Intron Biotechnology, Seoul, Korea)을 사용하여 검출하였다. 단백질 밴드들을 스캐닝하고 농도계적으로 정량화하였다. 모든 웨스턴 블럿 실험들은 적어도 3회 별도로 수행하였다.
웨스턴 블럿 분석에서 나타난 바와 같이(도 3), 세포에 삽입된 백혈병형성 T EL-AML1 유전자의 단백질 발현은 buRz28 및 Dz26에 의하여 현저하게 감소하였다는 것을 알 수 있다. 따라서 상기 RNA-절단 실험에서 나타낸 것과 같이, 그 세포에서 백혈병형성 TEL - AML1 유전자의 선택적인 불활성화를 위하여 그 선택된 DNAzyme 및 리보자임 모두를 적용할 수 있을 것이다. 치료제로서, DNAzyme 및 리보자임와 같은 앤티센스 촉매 올리고뉴크레오타이는 RNA 간섭(RNAi)-기초한 약제에비교하여 확실한 잇점을 가진다. 이들 올리고뉴크레오타이드들은 그 타겟 RNA를 파괴하는 세포 기계(cellular machinery)를 이용하지 않기 때문에, 그들은 세포 RNAi 인자들을 이용(exploit)하는 이슈들을 회피할 수 있다. 용이하게 제형화되고 화학적으로 변형될 수 있는 올리고뉴크레오타이드-기반 약제들은 숙주의 면역 반응을 회피할 수 있다. 임상적으로 이들 올리고뉴크레오타이드-기반 약제들은 바이러스 감염 및 암들에 대하여 시도되었다(L.Q. Sun, et al., Pharmacol. Rev 52 (2000) 325-347;B.A. Sullenger, E. Gilboa, Nature 418 (2002), 252-258.).
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. 서열번호 2에 기재된 핵산분자로 구성된 TEL-AML1 키메릭 mRNA를 특이적으로 절단하는 핵산 분자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 급성 림프구성 백혈병에 대한 예방 또는 치료 효과를 가지는 핵산 분자.
  3. 제 1항의 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 급성 림프구성 백혈병 예방 또는 치료용 조성물.
  4. (a) 표적 TEL-AML1 키메릭 mRNA에 대한 촉매 활성을 가지며 이 촉매 활성은 상기 표적 RNA의 기능의 불활성화를 초래하는 제1항에 따른 핵산 분자를 반응 혼합물을 제공하는 단계;
    (b) 표적 TEL-AML1 키메릭 mRNA를 상기 혼합물에 제공하는 단계;
    (c) 상기 핵산 분자가 상기 촉매활성을 발현하도록 하는 조건을 제공하는 단계를 포함하는 표적 TEL-AML1 유전자의 활성을 불활성화시키는 방법.
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Nucleic Acids Research, Vol. 31, No. 11, pp. 2883-2889 (2003.) *
Nucleoside, Nucleotides and Nucleic Acids, Vol. 25, No. 7, pp. 785-793 (2006.) *

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