KR101043341B1

KR101043341B1 - 생체 관능성 씨피지 또는 올리고-/폴리뉴클레오티드 및독소 또는 장독소 함유 조성물

Info

Publication number: KR101043341B1
Application number: KR1020047019864A
Authority: KR
Inventors: 쟝 홀름그렌; 알리 엠. 하란디
Original assignee: 듀오톨 에이비
Priority date: 2002-06-05
Filing date: 2003-06-05
Publication date: 2011-06-21
Also published as: US20100330101A1; JP2005538957A; JP4937511B2; KR20110042129A; WO2003103708A1; EP1549340B1; CN1674935B; DE60325492D1; CA2488366C; ATE418343T1; EP1549340A1; KR20050027218A; SE0201701D0; CA2488366A1; AU2003241251B2; CN1674935A; AU2003241251A1

Abstract

본 발명에 따라 적어도 하나의 면역 자극, 면역 억제 또는 면역 조절 모티브를 함유하는 세포 내적으로 효과적인 면역 조절 핵산 성분을 포함하는 것으로, 콜레라 독소(CT), CT의 서브 유닛 B(CTB), 대장균 열 불안정 장 독소(LT), LT의 서브 유닛 B(LTB), 및 CT 또는 LT에 대한 항혈청과 반응하거나, GM1 갱글리오사이드, ADP-리보실레이트 수용체 단백질에 결합하거나 또는 표적 세포들 중의 주기적 AMP의 누적을 상승시키는 단백질들 또는 단백질 유도체들, 및 특이적 세포 표면 성분과 결합한 후 세포 내로 내재화될 수 있는 항원들 또는 다른 단백질들로 구성된 군으로부터 선택된 포유 동물의 세포 표면들 상의 특이적 수용체들에 결합하는 단백질과 관련하여, 임의로 특이적 항원과 조합하여, 천연 포스포디에스테르 골격 또는 변형된 골격을 갖는 모노뉴클레오티드, 디뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 2 관능성 조성물이 개시된다. 이 조성물은 종양, 감염증, 조직 이식 거부, 면역 억제 상태들, 자가 면역 질환 및 알레르기의 치료에 유용하고, 추가로 특이적 항원에 의해, 이는 면역 예방, 면역 치료 또는 내성의 유도를 위해서, 및 백신 예방 주사 또는 면역 치료 목적으로 포유 동물 내로 후속 주입하기 위해 항원-제공 세포의 생체외 치료에 유용하다.

Description

생체 관능성 씨피지 또는 올리고-/폴리뉴클레오티드 및 독소 또는 장독소 함유 조성물{BIOFUNCTIONAL CpG OR OLIGO-/POLYNUCLEOTIDE AND TOXIN OR ENTEROTOXIN CONTAINING COMPOSITION}

본 발명은 면역 계통을 조절하는 2 관능성 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 특수 세포-표면 결합 단백질 성분과 관련하여, 임의로 특이 항원과 조합되는 면역 조절 핵산 성분을 포함하는 2 관능성 조성물에 관한 것이다. 이 조성물은 종양, 감염증, 조직 이식 거부, 면역 억제 상태, 자가 면역 질환 및 알레르기의 치료 뿐만 아니라 면역 예방, 면역 치료 또는 내성의 유도 및 예방 접종을 위해 포유 동물로의 후속 주입을 위한 항원-제공 세포의 생체외 치료를 위해서 또는 면역 치료 목적으로 유용하다.

세균성 DNA 또는 합성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODNs)에서 메틸화되지 않은 CpG는 면역 계통의 잠재적인 활성제들로서 및 감염성 병원균들에 대한 선천 면역성을 증진시키기에 가능한 용도를 제안하는 각종 Th1-연관된 면역 조절 사이토킨류의 유발제로서 공지되어 있다(Krieg, 2001).

최근에, 자극하는 특성들보다는 면역 억제성을 갖는 다른 핵산 서열들이 자가 면역 질환들, 알레르기 및 조직 이식 거부들을 포함하는 상이한 면역 병리학적 조건들에서와 같은 유해한 면역 반응들을 억제하는 데 잠재적으로 사용될 수 있었다고 기재하고 있다.

면역을 강화하는 CpG 모티브-함유 핵산 서열들에 대해 잘 문서화되어 있고, 이하, 이는 면역 억제 서열들에 대한 경우일 수 있는 것으로 믿어지고, 이들 서열들은 선천 면역 반응들 뿐만 아니라 특이적 항원들에 대한 순응형 면역 응답들의 크기 및 특성들 모두를 조절할 것으로 믿어진다.

특이적 핵산 서열들에 의해 증진될 수 있거나, 억제될 수 있거나 또는 그렇지 않으면 조절될 수 있는 그러한 순응형 면역 응답들은 많은 상이한 항원 군들을 포함할 수 있다. 그러한 항원들의 예는 병원균-유도 항원들, 포유 동물의 조직-유도 항원들, 알레르겐들 및 숙주-유도 항원들을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않고, 면역 조절 핵산 서열과 함께 투여되거나 또는 상기 서열을 투여하는 시점에 숙주 내에 이미 존재하고, 이는 예를 들면 진행중인 염증에서 병원균-유도된 항원들 및 진행 중인 자가 면역 질환에서 포유 동물의 조직-유도된 항원들 비-선천성 장기들에 대해서 또는 조직들 또는 세포들의 이식 후인 경우들과 같다. 일부 경우들에서, 면역 강화 핵산 서열을 특이적 항원에 결합시키는 것은 아마도 동일한 (항원-제공) 세포들에 의해 특이적 항원 및 면역 자극 핵산 서열 모두를 취할 기회를 증가시킴으로써 문제의 항원에 대한 특이적인 순응형 면역 응답을 자극하는 특히 효율적인 방식인 것으로 기재되어 있다(Shirota 등, 2001; Shirota 등, 2000).

면역 조절의 하나의 특히 중요한 국면은 비경구적 주사보다는 점막 표면에 투여된 특이적 항원들 및 면역 조절제들에 관한 것으로; 그러한 점막 투여 경로들 의 예는 경구 투여 또는 위장관 투여, 비내 투여, 직장내 투여 및 생식기 점막 투여를 포함한다. 추가의 특이적 면역 조절제들의 존재 또는 부재 하에 항원들을 투여하는 것은 점막 표면에서 면역 반응을 유도하거나(때때로 전신으로) 또는 주변 내성(점막 투여의 경구적 경로에 의해 유발될 때 종종 "경구 내성"이라 칭함)을 유도함으로써 선택된 항원들에 대한 전신의 면역 응답들을 특별히 억제할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 다양한 자가 면역, 알레르기 또는 면역 병리학적 조건들에서 면역-치료 목적으로 이러한 유형의 점막으로 유도된 면역 억제/면역 조절을 이용하려는 많은 노력들이 최근에 이루어지고 있다. 기재된 바의 그러한 주변 내성을 관리하는 특히 효율적인 수단은 콜레라 독소(CTB)의 비-독소 결합 서브유닛과 관련하여 특이적 내성 생성 항원을 투여하는 것이다(Holmgren 등, 2003). 선천 면역성 및 순응형 면역 응답들을 자극하거나, 억제하거나 또는 그렇지 않으면 조절하기 위한 면역제들의 다른 관련 용도는 피부 상으로 또는 피부 내로 도포하는 것을 통해서 이루어진다. 백신들 및 다른 항원들의 피하 및 피내 투여는 장기-확립 공정들이며, 보다 최근에는 피부 상으로의 직접적인 국소 도포(이른바 경피 면역화)가 면역 응답들을 자극하거나 또는 특이적 반응들을 억제 또는 면역 일탈시키기 위해 사용될 수도 있는 것으로 기재되어 있다.

특이적인 세포-표면 결합 단백질 성분과 연관되고, 임의로 특이적 항원과 조합된 세포 내적으로 효과적인 면역 조절 핵산 성분을 포함하는 2 관능성 면역 조절 조성물들에 기초한 산물들 또는 그 용도를 개시하는 어떠한 선행 기술도 없다는 우리의 지식으로, 여기서 후자의 성분은 다른 세포 내적으로 효과적인 면역 조절 핵 산 성분 및 임의로 특이적 항원의 섭취량 및(또는) 반응성을 특별히 증가시키도록 작용한다.

따라서, 우리의 지식으로는, 포유 동물에서 상피 종양들 또는 비호흡기 상피 감염증들의 국소 치료를 위한 특이적인 세포-표면 결합 단백질 성분과 연관되어, 단일 쇄 및 이중 쇄 DNA, 단일 및 이중 쇄 RNA 및 변형된 폴리뉴클레오티드들로부터 선택된 적어도 하나의 메틸화되지 않은 5'-시토신, 구아닌-3' 디뉴클레오티드-함유 면역 자극 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드(ISS)를 포함하는 항원-없는 제약 제제를 국소 투여함으로써 포유 동물에서 상피 종양들 또는 비호흡기 상피 감염증들의 예방 또는 치료 방법을 개시하는 어떠한 선행 기술도 없다.

본 발명은 일 국면에서 세포 내적으로 작용하는 면역 자극, 면역 억제 또는 그렇지 않으면 면역 조절 핵산 서열(앞으로, 면역 조절 서열들, IS이라 칭함)을, 임의로 상기 IS 성분 및 임의로 특이적 항원의 흡수율 및(또는) 반응성을 증가시키도록 작용하는 특이적 세포 표면 결합 단백질 성분과 관련하여 특이적 항원과 조합하여 포함하는 바람직하게는 선천적인 2 관능성 면역 조절 조성물(BIC)을 제공한다.

따라서, 본 발명은 적어도 하나의 면역 자극, 면역 억제 또는 면역 조절 모티브를 함유하는 세포 내적으로 효과적인 면역 조절 핵산 성분을 포함하는 것으로, 콜레라 독소(CT), CT의 서브 유닛 B(CTB), 대장균 열 불안정 장 독소(LT), LT의 서브 유닛 B(LTB), 및 CT 또는 LT에 대한 항혈청과 반응하거나, GM1 갱글리오사이드, ADP-리보실레이트 수용체 단백질에 결합하거나 또는 표적 세포들 중의 주기적 AMP의 누적을 상승시키는 단백질들 또는 단백질 유도체들, 및 특이적 세포 표면 성분과 결합한 후 세포 내로 내재화될 수 있는 항원들 또는 다른 단백질들로 구성된 군으로부터 선택된 포유 동물의 세포 표면들 상의 특이적 수용체들에 결합하는 단백질과 관련하여, 임의로 특이적 항원과 조합하여, 천연 포스포디에스테르 골격 또는 변형된 골격을 갖는 모노뉴클레오티드, 디뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 2 관능성 조성물에 관한 것이다.

2 관능성 조성물의 양태에서, 면역 조절 핵산 성분은 단일 쇄 및 이중 쇄 DNA, 단일 쇄 및 이중 쇄 RNA 및 변형된 폴리뉴클레오티드들로부터 선택된 메틸화되지 않은 5'-시토신, 구아닌-3' 디뉴클레오티드-함유 면역 자극 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드(ISS)로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 양태에서, ISS는 적어도 6개의 염기들 또는 염기쌍들을 갖고, 임의로 포스포로티오에이트 골격들을 포함하는 뉴클레오티드 서열들로부터 선택된다.

현재의 바람직한 양태에서, ISS는 헤르페스 단성(Herpes simplex) 바이러스 게놈 등의 미생물 게놈으로부터 유도된다.

추가의 바람직한 현행 양태에서, ISS는 5'-푸린 푸린(피리미딘) CG 피리미딘 피리미딘-3' (5'-Pu Pu(Py)CGPy Py-3'), 예를 들면, 5'-GACGTT-3' 또는 5'-GTCGTT-3'이다.

또 다른 양태에서, 임의로 제공되는 특이적 항원은 사실상 제공되고, 합성 또는 천연 병원균-유도 항원들, 포유 동물 조직-유도 항원들, 알레르겐들 및 숙주- 유도 항원들로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 다른 국면은 의약으로서 사용되는 본 발명의 2 관능성 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 국면에서, 본 발명의 2 관능성 조성물은 종양들, 감염증들, 조직 이식 거부들, 면역 억제 상태들, 자가 면역 질환들 또는 알레르기들의 예방 또는 치료를 위한 제약적 제제의 제조에 사용된다.

본 발명의 이러한 국면의 일 양태에서, 제약적 제제는 항원이 없고, 포유 동물에서 상피 종양들 또는 비호흡기 상피 감염증들의 국소 치료용이다.

본 발명의 이러한 국면의 다른 양태에서, 특이적 항원을 포함하는 본 발명의 조성물은 면역 예방, 면역 치료 또는 내성의 유도를 위한 제약 제제의 제조에 사용된다. 그러한 조성물은 또한 백신 예방 주사 또는 면역 치료 목적으로 포유 동물 내로 주입하기 위해 제약 제제의 후속 제조를 위한 항원-제공 세포의 생체외 치료에 사용되기도 한다.

본 발명은 추가로 유효량의 2 관능성 면역 조절 조성물(이후, "2 관능성 면역 조절 착물", BIC이라 칭함)을 점막, 피부-베이스, 보다 깊은 비경구적 경로, 또는 양막내 투여 경로를 통해 단독으로 또는 특이적 항원과 조합하여 또는 포유 동물에게 주입하기 전에 생체 외 BIC에 의해 치료한 세포들의 투여를 통해 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 감염증, 종양, 자가 면역 질환, 알레르기, 조직 이식 거부 및 기타 면역 병원성 또는 면역 억제 증상들의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 예방학적으로 또는 치료학적으로 효과적인 복용량의 본 발명에 따른 제약 제제를 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유 동물에서 종양, 감염증, 조직 이식 거부, 면역 억제 상태들, 자가 면역 질환들 또는 알레르기의 예방 또는 치료 방법을 포함한다.

본 발명의 이러한 국면의 일 양태에서, 제약적 제제는 항원이 없고, 그 치료는 상기 포유 동물에서 상피 종양 또는 비-호흡기 상피 감염증에 대한 것이고, 투여는 상기 포유 동물의 상피 종양 또는 비-호흡기 상피 감염증 부위에 대한 국소 투여이다.

본 발명은 특이적 항원을 포함하는 본 발명에 따른 조성물의 예방학적으로 또는 치료학적으로 유효한 복용량을 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유 동물에서 면역 예방, 면역 치료 또는 내성의 유도 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 백신 예방 주사 또는 면역 치료 목적으로 포유 동물에 후속 주입하기 위한 특이적 항원을 포함하는 본 발명에 따른 조성물에 의한 항원-제공 세포의 생체 외 치료 방법에 관한 것이다.

제약 제제들 및 그런 것으로서 2 관능성 조성물들은 예를 들면 미합중국 또는 유럽 약전에 기재된 바와 같이 불활성 희석제들, 부형제들, 및 기타 전신 또는 점막 투여를 위한 시약들을 필요로 하는 다른 성분들을 포함할 수 있음을 이해해야 한다.

"세포 내로 효과적인 면역 조절 핵산 성분"이라는 용어는 면역 조절 핵산 성분이 작동시 신호들을 통해 면역 응답 유도를 세포 내로 변경 또는 조절한다는 것 을 기재하기 위해 사용된다.

본 발명에 사용된 제약적 제제의 예방학적으로 또는 치료학적으로 효과적인 복용량은 제조업자의 지시 지침, 문제의 포유 동물, 포유 동물의 크기 및 당업계의 숙련자에게 통상적으로 공지된 기타 기준에 의거 주치 내과의사 또는 수의사가 결정해야 한다.

본 발명이 주로 CTB와 화학적으로 결합된 면역 자극 IS를 함유하는 적어도 하나의 메틸화된 5'-시토신, 구아닌-3' 디뉴클레오티드(CpG)를 함유하는 면역 자극 IS의 연구에 관한 양태들의 설명으로 예시되더라도, 요구되는 보호 범위는 다음 이유에서 지원된다.

면역 자극 DNA의 개념은 세균으로부터 정제된 DNA가 여러 동물 종양의 성장을 억제하고, 천연 킬러(NK) 세포 활성을 증대시키고, 쥐의 비장 세포들 및 인간의 말초 혈액 림프구들로부터 IFN-α/β ,및 γ를 유도할 수 있음을 개시한 때인 거의 이십여년 전에 탄생되었다. 그 이후, 많은 연구들은 적절한 플랭킹 영역들(CpG 모티브들)을 갖는 메틸화되지 않은 CpG가 척추 동물 면역 시스템들에 대한 세균성 DNA의 자극 효과에 대한 책임이 있는 것을 밝히고 있다. 톨/IL-1-수용체 시그널링 경로를 통해서 세균성 DNA에서 또는 합성 올리고뉴클레오티드들에서 메틸화되지 않은 CpG 모티브들과 수지 돌기 세포들 및 마크로파지들 등의 항원-제공 세포들(APCs)에서 톨-형 수용체-9(TLR-9) 사이의 신속한 상호 작용은 IFN-γ, IL-1-βALC 및 IL-12 등의 전염증 Th1 분극화 사이토킨들을 생산하고, APCs에 공통 자극 분자들을 상향 조절하고, 증식, 항체 생산 및 IL-6 분비를 위해 B-세포들을 활성화시키 기 위해 세포들을 자극한다(Holmgren 등, 2003; Krieg, 2001; Krieg, 2002).

항원 부재 하에 면역 자극 CpG DNA의 비경구적 전달은 여러 가지 상이한 병원균들에 의해 유발된 감염증들에 반하는 보호 특성의 비특이적 Th1-형 선천성 면역 응답들을 유도하는 것으로 나타났다. 전신 레벨에서 개념적인 프레임은 최근에 면역 자극 CpG ODN의 단일 점막-질 투여가 임의의 항원의 부재 하에, 생쥐 암컷의 생식기 관 및(또는) 생식기 림프절들에서 Th1-연관된 사이토킨들 IFN-γ, IL-12 및 IL-18의 고속 생산 및 CC 케모카인들 RANTES, MiP-1α및 MiP-1β의 고속 생산을 이끌어낸다는 발견에 의해 점막의 선천적 면역성으로 확장되었다(Harandi 등, 2003). 선천성 면역 반응들의 유도에 대한 CpG DNA의 영향 외에, 많은 연구들이 또한 CpG DNA가 백신 보조약으로서 작용하기도 함을 보여주고 있다. 보조약으로서 CpG DNA를 사용한 연구들의 대다수는 전신 투여 경로에 의해 수행되었지만; 보조약으로서 CpG DNA에 의한 점막의 면역화는 최근에 점막 및 전신 항원-특이적 면역 반응들 모두를 이끌어 내는 것으로 보여지고 있다(Holmgren 등, 2003).

원시 CpG DNA 조성물들의 여러 변형들 역시 유용한 IS를 제공하는 것으로 입증되었다. 예를 들면, 천연 포스포디에스테르 골격으로부터의 여러 변종들은 사실상 기능화되었을 뿐만 아니라 IS에 대한 추가의 효능을 제공하였다. 후자의 효과는 저하되는 것으로부터 IS를 안정화시킴으로써 아마도 주로 이루어지지만, 일부 경우들에서, 포스포티오에이트 골격을 갖는 메틸화되지 않은 DNA에 대해 나타낸 바와 같이, ODN은 APCs에 대한 화학 주성 인자로서 작용함으로써 임의의 연관된 CpG 모티브의 부재 하에 조차 고유의 면역 자극 활성을 갖는 것으로 나타나고 있다. 기재된 유용한 골격들의 예들은 상이한 포스포디에스테르 또는 포스포티오에이트 골격들로만 또한 이들 2가지 유형의 키메라들로만 제한되지 않는다.

또한, IS의 면역 자극 서열들에서 변종들은 면역 자극 활성보다는 면역 억제를 제공하는 상이한 동물 종들에서 이들의 효능을 최적화를 허용하고(하거나) Th1 유형 또는 Th2 유형의 반응을 향하여 면역 반응의 사행을 초래하는 상이한 면역 조절 활성을 갖는 것으로 기재되고 있다. 상이한 종들에 대해 최적인 상이한 서열들에 관하여, 생쥐들에서 면역 반응들을 자극하기 위한 최적의 CpG 모티브는 인간들에서의 그것과 상이하고; 인간들에서, 몇몇 상이한 활성 서열들이 식별되었고, 또한 중요 CpG 모티브들 둘레의 플랭킹 영역들은 APC의 상이한 유형들에 대한 최적의 활성을 추가로 결정하는 것으로 문헌에 잘 나타나고 있다. 면역 자극 IS 대신에, 면역 억제되게 될 때, 메틸화된 DNA 및 ODNs는 자극 활성보다는 오히려 면역 억제될 수 있는 것으로 문헌에 나타났다. 동일선을 따라, 4가지 가능한 단일-뉴클레오티드 염기들 중의 어느 것을 포함하는 ODNs가 제공된 APCs의 활성화 및 돌연변이로부터 사이토킨 생산을 억제할 수 있지만, 그 골격은 포스포티오에이트임을 보여주고 있다(Zhu 등, 2002). CG 뉴클레오티드들(3개의 인접한 구아노신) 직후 2개의 구아노신의 배치가 자극성 ODNs를 면역 억제 ODNs로 변환시킬 수 있음도 보여주고 있다(Stunz 등, 2002). 따라서, 서열 및 골격 구조 모두에 의존하여, DNA는 면역 반응들을 억제할 뿐만 아니라 자극한다. 더욱이, CpG 모티브 없이 랜덤하게 합성된 ODNs는 Th2 분화의 유도를 위한 보조약들로서 기재되고 있는 반면, CpG 모티브들 함유 ODNs는 강력한 Th1-사행 반응들을 유도한다(Sano 등, 2003).

BIC의 IS 성분에 대해 기재된 것과 유사하게, 특이적 세포-결합 성분 역시 변형 또는 변화될 수 있다. 최상으로 연구된 실시예에서, 분자의 GM1 갱글리오사이드 수용체 결합 활성 또는 그의 안정성에 현저하게 영향을 미치지 않을 임의의 구조적 변형인 CTB는 부모 CTB 분자를 대체할 수 있어야 하고, 대장균(LTB)의 열-불안정 장독소의 유사하고, 치밀하게 연관된 결합 서브유닛 단백질의 경우일 수도 있다. 유사하게, 많은 다른 미생물성 단백질들은 APC를 포함하는 포유 동물 세포들의 표면에 대해 정의된 수용체들에 대한 특이적 결합 친화성을 갖고, BIC의 제2 성분으로서 CTB를 대체할 수도 있어야 한다. 그러한 단백질들의 예들은 미생물성 독소들, 핌브리얼 또는 다른 유형의 미생물성 어드히진들, 바이러스성 부착 단백질들 및 식물-유도 레시틴들의 결합 서브유닛들 또는 영역들을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다.

명세서에서 및 본 발명의 2 관능성 조성물에서 "와 연관된" 및 "와 조합된"이라는 용어들은 성분들 사이의 모든 종류의 연결, 혼합 및 기타 연관을 포함하도록 의도된다.

주어진 실시예들에서, CpG ODN 및 CTB에 의해 예시되는 바와 같이 BIC의 2개의 성분들은 티올화를 사용한 IS에 대해서 및 CTB 말레이미드 활성화에 대해, 성분들 모두의 화학적 변형들에 기초한 결합 기술에 의해 서로 결합되었다. 상이한 유형들의 분자들을 결합시키기 위해 많은 대체 화학들이 함께 공존하고, 당업계에 잘 공지되어 있으며, 따라서 여기에 추가로 확장시키지 않는다. 마찬가지로, 스페이서 분자를 통해 2개의 분자들을 함께 연결시키는 방법들 역시 당업계에 잘 공지되 어 있고, 후자의 카테고리는 면역학적으로 활성인 단백질 또는 특이적 항원을 포함 또는 내포하는 다른 분자들을 포함하기도 한다. 당업계에 잘 공지된 또 다른 변형은 각종 비공유 수단들 중의 임의의 것을 통해 BIC의 상이한 성분들을 연합시키는 것에 관한 것으로, 이들을 함께 리포좀 또는 기타 지질-베이스 구조물 내로 유화시키고, 이들을 미립자의 표면 내로 혼입시키거나 또는 그에 부착시키거나, 또는 단순히 세포에 대한 이들의 동시 조합된 효과를 허용하기에 적절한 제형 중에 혼합하는 것을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다.

본 발명은 도한 선천적인 면역성 및(또는) 항원-특이적 후천성(순응형) 면역 반응들을 자극하거나, 억제하거나 또는 그렇지 않으면 조절하는 방법들에 관한 것이다. 이들 목적들 때문에, BIC는 많은 상이한 경로들에 의해 효과적인 양으로 포유 동물에 투여될 수 있다. 그것은 경구 경로, 위장관 경로, 직장 경로, 생식기-점막 경로, 비내 경로, 호흡기-흡입 경로, 결막의 점막 경로 또는 중이 점막 경로를 포함하지만 이들로만 제한되지 않는 임의의 많은 가능한 점막 경로들로 주어질 수 있다. BIC는 피부 표면 상의 상피하로, 경피로 또는 피하로 등의 피부-관련 경로로 주어질 수도 있다. BIC는 추가로 정맥내 주입, 근육내 주입, 복강내 주입, 인트라아미노틱 주입, 외피내 주입, 관절내 주입, 및 표적화된 림프절 주입을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 보다 깊은 비경구적 투여로 주어질 수 있다. BIC의 또 다른 투여는 APC 등의 세포들의 형태로 이루어질 수 있었으며, 이는 상기 전신 또는 점막 경로들에 의해 포유 동물에 투여되기 전에 생체외 BIC로 치료되었다.

본 발명은 또한 감염증들 또는 기타 질병들의 예방 또는 치료를 위한 BIC의 용도에 관한 것이다. 제공된 실시예들에서, BIC는 헤르페스 단성 타입 2 바이러스(HSV-2)에 의해 유발된 바이러스성 감염증의 예방학적 또는 치료학적 치료를 위해 사용되지만, 사용된 BIC의 유형 및 그의 투여 경로에 좌우되어, 예방적 또는 치료학적 처치 가능성은 바이러스들, 세균들, 진균들 또는 원생 동물들 및 기타 기생충들에 의해 유발된 매우 많은 수의 감염증들; 상이한 유형의 종양들; 상이한 유형의 자가 면역 질환들 및 알레르기들; 이식된 장기들, 조직들 또는 세포들을 포함하는 조직 이식 반응들; 및 상이한 유형의 면역 억제 상태들(예, HIV 감염증에 의해 유발된 면역 저하)을 또한 포함하는 상이한 유형의 기타 면역학적 조건들로 확장된다.

본 발명은 이하 도면들의 상세한 설명 및 실시 양태들에 의해 예시될 것이지만, 보호 범위는 기재된 세부 사항들로 제한되도록 의도되지 않음을 이해해야 한다. 더욱이, 언급된 인용 문헌들의 교시 내용들이 참고 문헌으로서 본원 명세서에 인용된다.

도면의 간단한 설명

도 1은 CTB, CpG ODN, CTB와 CpG의 혼합물 또는 CTB:CpG 콘쥬게이트들의 증가하는 농도들에 따른 시험관내 자극 후, 쥐의 비장 세포들의 증식 반응들의 2개의 다이어그램들(A) 및 (B)을 보여준다.

도 2는 증식 반응에 영향을 미치지 않는 CTB의 말레이미드-활성화 또는 CpG ODN의 티올화의 다이어그램을 보여준다. 쥐의 비장 세포들은 CTB, 말레이미드-활성화된 CTB, CpG ODN 또는 티올-변형된 CpG ODN의 증가하는 농도들의 존재 하에 72 시간 동안 배양되고, 이어서 수확되고, 증식 반응들이 재료들 및 방법들에 기재된 바와 같이 조사되었다. 데이터는 자극 지수(SI)로서 표현된다.

도 3은 CTB:CpG 1, recCTB, CpG ODN 또는 recCTB 및 CpG ODN의 혼합물에 의한 쥐의 비장 세포들의 자극 후 IP-10의 생산의 2개의 다이어그램들 (A) 및 (B)을 나타낸다. 순수한 C57bl/6의 비장 세포들은 CTB:CpG 1, recCTB, CpG ODN 또는 recCTB 및 CpG ODN의 혼합물의 상이한 농도들의 존재 하에 배양되었고, 상층액들은 IP-10 ELISA. (a) 24시간, (b) 48시간에 적용되었다(데이터는 2개의 상이한 실험들을 나타낸다).

도 4는 CTB:CpG 1[20㎍/ml], recCTB[20㎍/ml], CpG ODN[3.3㎍/ml] 또는 recCTB 및 CpG ODN의 혼합물[20㎍/ml+3.3㎍/ml]의 존재 하에 배양된 쥐의 비장 세포들에 의한 MIP-1α의 생산의 3개의 다이어그램들 (A), (B) 및 (C)을 나타낸다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차로서 (a) 24시간, (b) 48시간, (c) 72시간으로 표현된다. 데이터들은 2개의 상이한 실험들로부터 푸울된다.

도 5는 CTB:CpG 1[20㎍/ml], recCTB[20㎍/ml], CpG ODN[8.0㎍/ml] 또는 recCTB 및 CpG ODN의 혼합물[20㎍/ml+8.0㎍/ml]의 존재 하에 배양된, 푸울된 비장 세포들에 의한 증식으로부터 상층액들 중의 MIP-1α의 생산의 3개의 다이어그램들 (A), (B) 및 (C)을 나타낸다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차로서 (a) 24시간, (b) 48시간, (c) 72시간으로 표현된다. 데이터들은 2개의 상이한 실험들로부터 푸울된다.

도 6은 CTB:CpG 1[20㎍/ml], recCTB[20㎍/ml], CpG ODN[3.3㎍/ml] 또는 recCTB 및 CpG ODN의 혼합물[20㎍/ml+3.3㎍/ml]의 존재 하에 배양된 쥐의 비장 세포들에 의한 RANTES 생산의 3개의 다이어그램들 (A), (B) 및 (C)을 나타낸다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차로서 (a) 24시간, (b) 48시간, (c) 72시간으로 표현된다. 데이터들은 2개의 상이한 실험들로부터 푸울된다.

도 7은 CTB:CpG 1[20㎍/ml], recCTB[20㎍/ml], CpG ODN[8.0㎍/ml] 또는 recCTB 및 CpG ODN의 혼합물[20㎍/ml+8.0㎍/ml]의 존재 하에 배양된, 푸울된 쥐의 비장 세포들에 의한 RANTES의 생산의 3개의 다이어그램들 (A), (B) 및 (C)을 나타낸다. 데이터는 2개의 상이한 실험들로부터 푸울되고, 평균 및 평균의 표준 오차로서 (a) 24시간, (b) 48시간, (c) 72시간으로 표현된다.

도 8은 CpG ODN 또는 CTB:CpG의 질내 투여 후 생쥐의 질에서 CC 케모카인 생산 기간 과정의 3개의 다이어그램을 나타낸다. 순수한 생쥐들의 군들은 DP로 예비 처리되었다. 6일 후, 이들은 CpG ODN 또는 CTB:CpG로 질내로 전달되고, 상이한 시간에 희생되었다. 질이 절개되고, 사포닌 추출되고, 케모카인 함량들이 ELISA를 사용하여 조사되었다. 데이터는 질 10mg당 pg/ml로 나타낸다.

도 9는 CpG ODN, CTB, CpG ODN 또는 CTB:CpG의 혼합물의 상이한 농도들의 존재 하에 배양된 인간의 PBMCs의 상층액들에서 MIP-1α의 생산의 시간 과정의 3개의 다이어그램들을 나타낸다. CpG ODN 및 CTB는 콘쥬게이트에 사용된 농도들에 대응한다.

도 10은 CTB(11.25㎍/ml), CpG ODN(3㎍/ml), CpG ODN 및 CTB, CTB:CpG 또는 비-CpG 제어 ODN(3㎍/ml) 혼합물의 존재 하에 배양된 인간의 PBMCs의 상층액들에서 MIP-1α의 생산의 4개의 다이어그램들을 나타낸다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차로서 표현된다.

도 11은 CTB(11.25㎍/ml), CpG ODN(3㎍/ml), CpG ODN(3㎍/ml) 및 CTB(11.25㎍/ml), CTB:CpG(11.25㎍/ml) 또는 비-CpG 제어 ODN(3㎍/ml) 혼합물과 함께 배양된 인간의 PBMCs의 상층액들에서 MIP-1β의 생산의 4개의 다이어그램들을 나타낸다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차로서 표현된다.

도 12는 CTB(11.25㎍/ml), CpG ODN(3㎍/ml), CpG ODN(3㎍/ml) 및 CTB(11.25㎍/ml) 또는 비-CpG 제어 ODN(3㎍/ml) 혼합물의 존재 하에 배양된 인간의 PBMCs에 의한 RANTES 생산의 4개의 다이어그램들을 나타낸다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차로서 표현된다.

도 13은 CTB(11.25㎍/ml), CTB-말레이미드(11.25㎍/ml), CpG ODN(3㎍/ml) 또는 티올 CpG ODN(3㎍/ml)의 존재 하에 배양된 인간의 PBMCs의 상층액들에서 CC 케모카인들(MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES) 생산의 6개의 다이어그램들을 나타낸다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차로서 표현된다.

실시 양태들의 설명

헤르페스 단성 바이러스(HSV) 감염증에 대한 CpG 및 여성 생식기 관 점막 면역성을 포함하는 개시된 양태들에 대한 배경으로서, 이들 실체에 대한 다음 간단한 설명들이 제공된다.

상대적으로 풍요한 CpG 모티브들 및 CpG 올리고뉴클레오티드들을 갖는 세균성 DNA는 면역 반응들을 활성화시킨다. 시험관내에서 CpG ODN은 IFN-γ[Yamamoto, 1992], IL-1β[Lipford, 1997], 종양 괴사 인자-α(TNF-α)[Sarwasser, 1997], IL-12[Lipford, 1997] 및 IL-18[Roman, 1997] 등의 각종 사이토킨들을 분비하는 비세포들, 단핵구들, 수지 돌기 세포들 및 마크로파지들을 직접적으로 자극하고, IL-6 분비 및 증식[Yi, 1996]을 위해 B 세포들을 활성화시킨다. 더욱이, CpG는 주요 조직 적합성 착물(MHC) 클래스 I, MHC 클래스 II, 뿐만 아니라 CD80 및 CD86 등의 공통-자극 분자들을 상향 조절하기 위해 NK 세포들, 마크로파지들[Sarwasser, 1997], B 세포들[Krieg, 1995] 및 수지 돌기 세포들[Sarwasser, 1998]을 활성화시킨다. 생체 내에서, CpG ODN의 계통적 투여는 NK 활성을 촉진시키고[Yamamoto, 1992], 비장에서 B 세포 백분율을 증가시키고[Krieg, 1995], 조직들 내에서 IFN-γ[Yamamoto, 1992], IL-6[Yi, 1996], TNF-α[Sarwasser, 1997], 및 IL-12[Zimmermann, 1998] 플라즈마 레벨들 또는 mRNA 발현들을 증가시키는 것으로 나타났다. 질병의 동물 모델에서 말라리아 및 리스테리아 모노사이토겐 감염증을 방지하는 CpG ODN의 능력은 최근에 문서화되고 있다[Germazinski, 2001; Elkins, 1999; Krieg, 1998].

고유의 면역 반응에 대한 이들의 영향 외에, CpG ODN은 동시-투여된 항원들에 대한 특이적인 면역 반응들을 강화시키는 것으로 보였다[Ban, 2000]. 질병의 상이한 동물 모델에서 여러 가지 항원들 및 DNA 백신들에 의한 백신 예방 주사에서 CpG ODN의 잠재적인 보조약 활성에 대한 여러 가지 최근의 보고서들이 확립되었다[검토를 위해, Krieg, 2001 참조]. 역주들 중에서, 최초의 인간 임상 시험들의 보고서들은 항원과 동시-투여된 CpG ODN은 면역 자극되고 양호한 내성을 가질 수 있 는 것으로 나타났다. 전신 면역 반응에 대한 CpG ODN의 문서화된 영향에도 불구하고, 점막 표면들에서 면역성의 유도에 대한 CpG DNA의 영향에 관해서는 거의 공지되어 있지 않다. CpG ODN의 단일회 질내 투여는 쥐의 암컷의 생식기 관 점막에서 강력한 Th1-연관된 사이토킨들 및 케모카인 반응들을 이끌어내는 것으로 최근에 나타나고 있다(Harandi 등, 2003).

HSV-2는 인간의 생식기 관 점막을 감염시키는 성적으로 전송된 병원균이고, 인간들의 생식기 궤양 질환의 가장 통상적인 경우이다. HSV-2 감염증은 많은 나라들에서 우세하게 보급되고, 성인 여성 인구의 10-50%는 감염되어 있고[Kinghorn, 1994], 그 발생률은 세계적으로 증가하고 있다[Nahmias, 1990]. HSV-2 감염증의 획득은 보편적으로 생식기 접촉에 의한 결과이다. 급성 생식기 헤르페스 감염증은 질의 분비물들 내로 벗겨지는 강력한 바이러스의 짧은 기간으로 특징지워지고, 이는 바이러스의 전송을 위해 중요하다. 생식기 궤양들은 통상적이지만, 수막염 등의 유포되는 질병 및 생명을 위협하는 합병증들은 면역 타협한 개체들에서 발생할 수도 있다. 임신 초기에, HSV-2는 태반 장벽을 가로지를 수 있고, 정신 지체를 포함하여 태아의 자연 낙태 또는 태아에 대한 심각한 손상을 유도할 수 있는 태아에 영향을 미친다[Whitley, 1991]. 따라서, 생식기 궤양들은 인간의 면역 결핍 바이러스의 전염을 고무시키기 때문에 특히 생식기 헤르페스 감염증에 대한 예방적 전략들을 개발할 심각한 필요성이 남는다.

본 발명자들은 항원 동시-투여 없이, 국부 생식기 면역성의 유도에 대해서 및 성적으로 전염되는 병원균, HSV-2의 방지에 대한 CpG ODN - CTB BIC의 영향을 연구하였다. 그 결과들은 성적으로 전염되는 바이러스성 질병들에 대한 모델 시스템으로서 생식기 헤르페스 감염증에 반하는 CpG ODN - CTB BIC의 잠재적인 예방 가능성을 예시한다.

재료들 및 방법들

생쥐들

6 내지 8주령의 C57B1/6 생쥐 암컷들을 모든 실험들에 사용하였다. 생쥐들을 M&B로부터 구매하고, EBM Animal Facility, Sahlgrenska Academy, Goteborg University에서 특이적-병원균-없는 조건들 하에 환기되는 우리들 내에 둔다. 모든 실험들은 스웨덴 Goteborg에서 동물 실험 윤리 위원회로부터 승인받고 수행하였다.

ODNs

ODNs는 Cybergene AB(Novum Research Park, Sweden) 또는 Qiagen으로부터 구입하였다. 쥐 연구들에 사용된 CpG ODN은 GACGTT 모티브의 2개의 사본들을 포함하는 뉴클레아제-내성 포스포로티오에이트(PS) 골격을 갖는 20-mer인 TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(SEQ ID NO:1)였다. 쥐의 대조 ODN은 CpG 모티브를 함유하지 않는 뉴클레아제-내성 포스포로티오에이트(PS) 골격을 갖는 20-mer인 TCC AGG ACT TCT CTC AGG TT(SEQ ID NO:2)였다. 생체내 시험들에서 인간에 대해, 사용된 CpG ODN은 GTCGTT 모티브의 3개의 사본들을 함유하는 뉴클레아제-내성 포스포로티오에이트(PS) 골격을 갖는 20-mer인 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:3)였다. 사용된 인간 제어 ODN은 CpG 모티브를 함유하지 않는 뉴클레아제-내성 포스포로티오에이트 골격을 갖는 20-mer인 TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT(SEQ ID NO:4)였다.

CTB에 대한 최적의 쥐 및 인간의 CpG ODNs의 화학적 연결

쥐 또는 인간의 CpG ODN에 대한 CTB의 콘쥬게이션은 3단계로 행해졌다:

a) 티올 CpG ODN의 디설파이드 연결의 보호기 제거:

티올-변형된 CpG ODNs(Qiagen)의 연결을 분해하기 위해, ODNs는 디티오테리톨(DTT)(Sigma)와 혼합되고, 실온에서 90분 동안(생쥐 작제물 1 및 인간 콘쥬게이트) 또는 37℃에서 16시간(생쥐 작제물 II) 인큐베이션시켰다. 그 후, 보호기 제거된 티올-변형된 CpG ODNs를 세파덱스 G25를 통해 겔 여과에 의해 순차로 정제하고(DNA 등급 컬럼 0.9 x 21.6 cm Pharmacia Amersham Biosciences), 0.1M 인산염 완충액, 0.15M NaCl 및 0.01M EDTA로 pH7.2에서 순차로 용출시켰다. 정제된 티올-변형된 CpG ODN의 흡수율은 분광 광도계에 의해 260n.m에서 판독되었다.

b) CTB의 말레이미드 활성화:

CTB 분자들로의 말레이미드 기들의 유도는 과량의 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)(Pierce Chemicals)와 함께 실온에서 90분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 G25(PD 10 Pharmacia)를 통해 여과시켜 정제하고, pH7.2에서 0.1M 인산염 완충액, 0.15M NaCl 및 0.01M EDTA 2ml로 용출시켜 달성하였다.

c) CpG ODN에 대한 CTB의 콘쥬게이션:

말레이미드-활성화된 CTB 및 보호기 제거된 티올-변형된 CpG ODNs는 실온에서 철야 함께 인큐베이션시키고, 이어서 비바 스핀 5000 MWCO를 통해 농축시켰다. 농축된 물질을 수퍼덱스 200 10/20 상에서 분리하고, 고분자량 분획을 수집하고, 5000 MWCO를 통해 농축시켰다. 콘쥬게이트들을 SDS-PAGE에 적용시켰다. CTB 및 CpG ODN를 쿠마시 블루 및 SYBR GREEN 각각으로 가시화시켰다. 콘쥬게이트들의 GM1-결합 용량은 GM1-ELISA에 의해 결정되었다.

쥐의 증식 분석

순수한 C57B1/6 생쥐들로부터 비장 세포들은 나일론 네트를 통해 장기들을 통과시킴으로써 단리되었다. 적혈구들은 37℃에서 10분 동안 염화암모늄(NH₄Cl)으로 세포를 인큐베이션시킴으로써 용해되고, 이후 세포들을 세척하고, 트리판 블루로 염색하고, 생존한 세포들을 부흐너 챔버 내에서 계수하였다. 세포들을 L-글루타민, 50μM 2-메르캅토에탄올, 젠타마이신, 및 10% 송아지 태아 혈청이 보충된 이스코브 배지 중에서 96-웰 편평 바닥 플레이트(Munc) 내에 삼중으로(2 x 10⁵ 세포들/웰)으로 파종하였다. 세포들을 37℃에서 단독으로, 또는 상이한 농도의 recCTB, CTB-말레이미드, CpG ODN, CpG-티올, 대조용 ODN, recCTB 및 CpG ODN의 혼합물, CTB-말레이미드 및 CpG-티올의 혼합물 또는 CTB:CpG 콘쥬게이트들의 존재 하에 인큐베이션되었다. 사용된 recCTB, 및 CpG ODN의 농도들은 콘쥬게이트들 내의 이들의 농도들에 대응하였다. 인큐베이션후 24시간, 48시간 및 72시간 후, 배양 상층액들을 수집하고, 케모카인 함량들에 대해 평가하였다. 3일째, 세포들을 6-8시간 동안 [³H]티미딘(Amersham Pharmacia) 1 μCi로 펄스시키고, 이어서, 세포 DNA를 유리 섬유 상에서 수확하고, 이어서 방사선 활성 티미딘의 혼입을 분당 카운트들로 베타-카운터 내에서 평가하였다(cpm). 데이터는 자극 지수(SI)로 표현되고, 이는 세포 단독에 대해 평균 cpm으로 분할한 기질들에 의해 배양한 세포들의 평균 cpm에 대응한다.

질내 치료

생쥐들을 인산염-완충 염수(PBS) 150㎕ 중의 데포-프로베라(Upjohn s.a., Puurs, 벨기에)로 피하로(s.c.) 주사함으로써 전처리하였다. 6일 후, 생쥐들을 이소플루란(Baxter Medical AB)으로 마취하고, 유리된 형태 또는 CTB에 연결되거나(CTB:CpG 콘쥬게이트) 또는 미처리로 남겨진 rec CTB 또는 CpG ODN 1㎍으로 ivag. 투여하였다.

질로부터 케모카인들의 추출

질로부터 케모카인들의 추출은 PERFEXT 방법(Johansson, 1998)의 변형된 버전을 사용함으로써 수행되었다. 간단히, 생쥐들은 질내전단 후 상이한 시점에 희생되었고, 질들은 절개되고, 2Mm 페닐메틸술포닐 플루오라이드, ml당 대두 티로신 억제제(Sigma) 0.1mg, 및 0.05M EDTA를 함유하는 PBS 용액 중에서 -20℃에서 저장하기 전에 칭량하였다. 조직 시료들을 녹이고 이어서 4℃에서 PBS 중에 2%(wt/vol)의 최종 농도에서 사포닌(Sigma)으로 철야 침투시켰다. 이어서, 조직 시료들을 13000 rpm으로 5분 동안 원심 분리하고, 상층액들 및 혈청을 ELISA를 사용하여 케모카인 함량들에 대해 분석하였다.

바이러스 및 바이러스 도전

HSV-2 균주 333[Seth, 1974]을 성장시키고, 아프리카산 녹색 원숭이 신장 세 포들(GMK-AH1)의 세포 단일층들 중에서 적정하고, 냉동/용해 및 원심 분리에 의한 세포 파편의 후속 제거의 1주기로 제조하였다. HSV-2 도전에 대해, 각각의 생쥐에게 PBS 중의 DP 3.0mg으로 피하로 주사하였다. 6일 후, 생쥐들을 이소플루란(Baxter Medical AB, 스웨덴)을 사용하여 마취하고, 10㎕ 행크스 밸런스된 염 용액(HBSS) 중의 악성 HSV-2 균주 9 x 1O⁴ PFU의 질내 접종에 의해 침습받았다.

감염증의 모니터링

a. 바이러스 복제. 질내 HSV-2 감염 후, 질액들은 점막의 이산적인 클럼프가 검색될 때까지 질 내외에서 멸균 HBSS 40㎕를 피페팅함으로써 수집하고, 2차 세척을 수행하였다. 2회의 세척액들을 푸울시키고, -70℃에서 저장하였다. HSV-2 역가들을 표준 방법을 사용하여 GMK-AH1 세포 모노층들 상에서 플라크 평가로 결정하였다.

b. 염증 및 질병. 생쥐들을 HSV-2 감염 후 질 염증, 신경학적 질병 및 사망에 대해 매일 조사하였다. 질병의 심각도를 0:건강함, 1: 생식기 홍반, 2: 중간 정도의 생식기 염증, 3: 심각한 화농성 생식기 병변, 4: 후-수족 마비 및 5: 마비로 인한 사망 또는 희생으로 등급화하였다.

인간의 PBMC 증식 평가

인간의 PBMCs는 피콜-하이패크 구배 원심 분리를 사용함으로써 건강한 성인들의 혈액 시료들로부터 분리하였다. 세포들을 증가하는 농도의 CTB, CpG ODN, CTB 및 CpG ODN의 혼합물 또는 인간의 CTB-CpG 콘쥬게이트의 존재 하에 L-글루타 민, 50μM 2-메르캅토에탄올, 젠타마이신, 및 송아지 태아 혈청이 보충된 이스코브 배지 중에서 96-웰 편평 바닥 플레이트 내로 파종하였다. CTB 및 CpG ODN의 농도들은 콘쥬게이트 중의 이들의 농도들에 대응한다. 상층액들을 5시간, 24시간, 48시간 및 72시간째에 수집하고, CC 또는 CXC 케모카인들의 함량들에 대해 조사하였다. 72시간 후, 세포들을 [³H]티미딘(Amersham Pharmacia) 1 μCi로 펄스시키고, 이어서, 6-8시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 DNA를 유리 섬유 상에서 수확하고, 이어서 방사선 활성 티미딘의 혼입을 분당 카운트들(cpm)로 베타-카운터 내에서 평가하였다. 데이터는 자극 지수(SI)로 표현되고, 이는 세포 단독에 대해 평균 cpm으로 분할한 기질들에 의해 배양한 세포들의 평균 cpm에 대응한다.

케모카인 정량화

조직 추출물들 및 배양 상층액들 중의 RANTES, MIP-α, MIP-1β, MIP-2 및 IP-10의 농도들을 제조업자의 권장 사항들에 따라 Pepro Tech EC Ltd(IP-10에 대해) 또는 R&D 시스템들(Abingdon, United Kingdom)로부터 ELISA 키트들을 사용함으로써 결정하였다.

실시예 1 CTB:CpG 콘쥬게이트들의 작제

CTB에 CpG ODN을 연결시키고, CpG ODN의 면역 자극 효과를 강화시키기 위해, 티올화된 CpG ODNs는 말레이미드 활성화된 CTB에 화학적으로 콘쥬게이트되었다. 티올-변형된 CpG의 보호기 제거를 위해, 쥐의 CTB:CpG 콘쥬게이트들의 2개의 작제 물들, 즉 재료들 및 방법들에 기재된 바의 CTB:CpG I 및 CTB:CpG II의 발생을 초래하는 2개의 접근법들이 사용되었다. 인간에 대해, 단지 하나의 CTB:CpG 작제물이 제조되었다(재료들 & 방법들 참조). 콘쥬게이트들은 SDS-PAGE 상에서 수행되고 성공적인 콘쥬게이션을 확인하는 쿠마시 블루(단백질 염색) 및 SYBR GREEN II(DNA 염색)으로 염색하였다(데이터는 도시되지 않음).

2가지 쥐의 콘쥬게이트들은 CTB 및 CpG 내용에서 상이하다. 따라서, CpG에 대한 CTB의 비율은 CTB:CpG I 및 II 각각에 대해 6 및 2.5였다. 콘쥬게이트들을 GM1 ELISA에서 이들의 GM1 결합 특성에 대해 조사하였다.

실시예 2 CTB에 대한 CpG ODN의 콘쥬게이션은 쥐의 비장 세포들에서 CpG ODN-유도된 증식 반응을 강화시킨다

순수한 C57B1/6 생쥐들로부터 비장 세포들을 상이한 농도의 rec CTB, CpG ODN, 대조용 ODN, CTB:CpG I 또는 CTB:CpG II로 배양하였다.

CTB:CpG I

도 1a에 나타낸 바와 같이, 최고 농도의 콘쥬게이트(20㎍/ml)로 배양한 비장 세포들은 22.6의 SI를 초래하는 한편 대응하는 농도(3.3㎍/ml)에서 CpG ODN은 9.1의 SI를 초래하였다. 최저 농도의 콘쥬게이트(1.25㎍/ml)는 최고 농도의 CpG ODN 단독 또는 CTB 및 CpG 혼합물이 임의의 농도로 사용되는 정도까지 증식을 자극하였다(도 1a). 대조용 ODN은 CpG ODN과 동일한 농도에서 증식에 대해 어떠한 영향도 미치지 않았다(데이터는 도시되지 않음).

CTB:CpG II

콘쥬게이트 I에 대해서와 같이, 최고 농도에서 콘쥬게이트 II는 CpG ODN 단독(SI = 12.6) 또는 CTB 및 CpG의 혼합물(SI = 9.9)에 대해서보다 증식(SI = 23.3)에 대해 보다 큰 자극 효과를 가졌다. 콘쥬게이트의 농도가 2.5㎍/ml로 낮아졌을 때, 최고 농도의 CpG ODN 또는 CTB 및 CpG ODN의 혼합물과 비교한 바 동일하거나 또는 심지어 보다 강력한 증식 반응(SI = 12)이 검출되었다. CTB 단독으로는 임의의 농도로 사용되었을 때 증식에 대한 어떠한 자극 효과도 없었다(도 1b).

2개의 순수한 C57b1/6 생쥐들로부터 푸울된 비장 세포들의 72시간 증식 후 SI로 나타낸 증식물은 상이한 농도로 콘쥬게이트된 CTB:CpG I, CTB:CpG II, CpG ODN, recCTB 또는 recCTB 및 CpG ODN의 혼합물에 의해 배양되었다. 도 (a) 및 (b) 모두에서, recCTB 및 CpG ODN의 농도는 콘쥬게이트들에서 이들의 농도들에 대응한다.

(a) CTB:CpG 1. (b) CTB:CpG II

말레이미드에 의한 CTB의 활성화 또는 CpG ODN에 대한 티올의 결합이 비장 세포 증식에 대한 임의의 효과를 가질 수 있는지를 시험하기 위해, 비장 세포들은 상이한 농도의 말레이미드-활성화된 CTB 또는 티올화된 CpG ODN의 존재 하에 배양되었다.

어떠한 임의의 상이한 농도에서도, CpG ODN에 대한 티올기의 결합 또는 CTB의 말레이미드-활성화도 CpG ODN 또는 CTB 단독보다 높은 수준의 증식을 초래하지 않았다(도 2). CTB-말레이미드 및 CpG-티올의 혼합물에 의한 비장 세포들의 배양은 CpG ODN 단독과 비교한 바 증식에 대해 어떠한 추가의 영향도 미치지 않았다(데 이터는 도시되지 않음).

실시예 3 CTB에 대한 CpG ODN의 콘쥬게이션은 쥐의 비장 세포들의 CpG ODN-유도된 CXC 및 CC 케모카인 반응들을 강화시킨다

케모카인 생산의 유도에 대해 CpG ODN에 대한 CTB의 콘쥬게이션 효과를 평가하기 위해, 비장 세포들을 CTB:CpG I, CTB:CpG II, recCTB, CpG ODN 또는 recCTB 및 CpG ODN의 혼합물에 의해 배양하였다. 상이한 시점에, 상층액들을 CXC 및 CC 케모카인들의 내용들에 대해 조사하였다.

CXC 케모카인들(IP-10으로 예시됨)

CTB:CpG I. 24시간 후 수집된 상층액에서, IP-10의 완전 배지 1250pg/ml/10⁶ 세포들 중의 비장 세포들의 배양물은 48시간 후에 극적으로 감소되는 것으로 검출되었다(122.5pg/ml/10⁶ 세포들). CTB:CpG I에 의한 비장 세포들의 배양은 IP-10 생산의 유도를 초래하였다. 그 생산량은 콘쥬게이트의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 사용된 콘쥬게이트의 최고 농도(20㎍/ml)는 미처리된 세포들 각각의 농도에 비교한 바 24시간 및 48시간에 IP-10의 생산에서 20-배 및 40-배 증가를 초래하였다.

비장 세포들이 CpG ODN 단독으로 또는 CTB 및 CpG ODN의 혼합물에 의해 배양되었을 때 훨씬 더 낮은 수준의 IP-10가 검출되었다. 24시간에, CTB:CpG I(1.25㎍/ml)가 최고 농도의 CpG ODN 단독 또는 recCTB 및 CpG ODN의 혼합물보다 더 많은 생산량의 IP-10을 유도하였다.

시험된 농도의 recCTB 중의 어떠한 임의의 것도 조사된 임의의 시점에 IP-10 생산을 유도하지 않았다(도 3a & 3b).

CTB:CpG II. 단독 배양된 IP-10의 농도는 24시간 및 48시간에 1000 pg/ml/10⁶ 세포들이었다. CpG ODN 단독 또는 CTB 및 CpG ODN의 혼합물은 동일한 수준의 IP-10 생산량(7-8배 증가)을 유도하였다. 중요하게는, IP-10의 생산량은 CTB:CpG II로 치료한 후 24시간 내에 16배 증가하였다. IP-10 생산량은 48시간(18배 증가)에 추가로 증가하였다. 48시간에, CpG ODN 단독 및 CTB 및 CpG ODN의 혼합물 모두는 콘쥬게이트들에 비교한 바 훨씬 더 낮은 수준의 IP-10을 생산하였다. recCTB 단독으로는 조사된 임의의 시점에 IP-10 생산을 유도하지 않았다.

MIP-2

CpG ODN 처리된 비장 세포들의 상층액들에서 어떠한 MIP-2 생산도 검출되지 않았다.

실시예 4 CC 케모카인들(MIP-1α및 RANTES로 예시됨)

MIP-1α

낮은 수준의 MIP-1α(122.5-150 pg/ml/10⁶ 세포들)가 24시간, 48시간 및 72시간에 단독 세포들로부터 취한 상층액들에서 발견되었다. RecCTB는 임의의 시점에 MIP-1α의 어떠한 생산도 유도하지 않았다(도 4 및 도 5).

CTB:CpG I. 도 5에 나타낸 바와 같이, CTB:CpG I에 의한 비장 세포들의 배양은 MIP-1α의 생산량을 24시간에 70배, 48시간에 180배 및 추가로 72시간에 186 배로 증가시켰다. 그러나, 24시간에, recCTB 및 CpG ODN의 혼합물은 콘쥬게이트와 동일한 정도까지 MIP-1α의 생산을 유도한다. MIP-1α의 생산은 시간에 따라 감소되었지만, 72시간에 130배 증가를 보였다. CpG ODN 단독으로 처리한 세포들은 필적할만한 수준을 생산하지 않았다. 48시간에, CpG ODN는 MIP-1α의 생산량에서 73배 증가를 유도하였고, 이는 72시간에 50배로 감소되었다. RecCTB는 시험된 임의의 시점에 임의의 인지할 수 있는 수준의 MIP-1α 생산을 유도하지 않았다(도 4).

CTB:CpG II. CTB:CpG II에 의한 비장 세포들의 배양은 24시간에 MIP-1α에서 55배 증가, 48시간에 150배 증가를 유도하고, 72시간까지 이 수준으로 유지되었다. recCTB 및 CpG ODN의 혼합물은 MIP-1α의 생산을 유도하고(50배), 이러한 유도는 48시간에 120배 증가되고, 72시간까지 유지되었다. 48시간에, CpG ODN은 MIP-1α의 생산량을 50배로 증가시키고, 72시간에 40배로 감소시켰다(도 5).

RANTES

MIP-1α에 대해, 낮은 수준의 RANTES(450-600 pg/ml/10⁶ 세포들)가 24시간, 48시간 및 72시간에 세포들 단독으로부터 취한 상층액에서 발견되었다. RecCTB는 임의의 시점에 MIP-1α의 생산을 유도하지 않았다(도 6 및 7).

CTB:CpG I. 24시간에 취한 상층액들에서, CpG ODN은 높은 수준의 RANTES(11000 pg/ml/10⁶ 세포들)를 유도하였고, CTB:CpG I 단독 또는 recCTB 및 CpG ODN의 혼합물에 의해 배양된 세포들에 의해 생산된 RANTES의 양은 적었다. 48시간 및 72시간에, CpG ODN 처리된 세포들에 의해 생산된 RANTES의 수준은 감소한 한편, 콘쥬게이트로 처리된 세포들에 의해 생산된 RANTES의 레벨들은 적어도 72시간 동안 변화되지 않고 남겨졌다(도 6).

CTB:CpG II. 필적할만한 수준의 RANTES가 CTB:CpG II, CpG ODN 단독 또는 recCTB 및 CpG ODN의 혼합물 펄스된 비장 세포들의 상층액들에서 24시간에 검출되었다. 48시간에, CTB:CpG II는 동일한 수준의 RANTES를 여전히 생산하는 한편, 다른 군들에서 RANTES의 생산량은 감소하였다. 72시간 후, RANTES의 생산량은 콘쥬게이트로 배양된 세포들의 상층액들에서 최고였다(도 7).

실시예 4CTB:CpG 콘쥬게이트는 쥐 암컷의 생식기 관 점막에서 강력한 CC 케모카인 반응들을 유도한다

암컷 생식기 관 내에서 케모카인 반응들에 대해, CpG ODN에 대한 CTB의 콘쥬게이션 효과를 조사하기 위해, 생쥐들을 프로게스테론으로 처리하고, 이어서 CTB, CpG ODN, 또는 CTB:CpG 콘쥬게이트를 단일회 질내 투여하였다. 투여 후 상이한 시점들에서, 질을 취하고, 사포닌 추출 후, CC 케모카인들 MIP-1α, MIP-1β및 RANTES의 수준들을 측정하였다.

MIP-1α

MIP-1α는 순수한 생쥐들의 질에서 낮은 수준으로 검출되었다(질의 12pg/ml/10mg). CTB의 질내 투여는 조사된 임의의 시점에 MIP-1α를 유도하지 않았다. 질내 CpG ODN 투여는 MIP-1α의 레벨을 8시간 내에 5배 증가시키고, 이어서 감소시키고, 48시간 내에 기저 레벨로 되돌아 갔다. 2시간 내에 MIP-1α의 신속한 13배 증가가 CTB:CpG 콘쥬게이트로 처리한 생쥐들에서 관찰되었고, 8시간 동안 유 지되었고(12배 증가), 24시간 내에 감소되었고(4배), 48시간에 기저 레벨에 도달하였다(도 8).

MIP-1β

MIP-1β는 순수한 생쥐들의 질에서 낮은 수준으로 검출되었다(질의 30pg/ml/10mg). CTB의 질내 투여는 조사된 임의의 시점에 MIP-1β생산을 유도하지 않았다. 질내 CpG ODN 치료는 MIP-1β를 8시간 내에 4배 증가시키고, 이어서 24시간 내에 상향 진행되었다(6배 증가). MIP-1β생산량은 감소되었고, 48시간까지 기저 레벨로 되돌아 갔다. 2시간 내에 MIP-1β생산에서 고속 6-배 증가를 유발하는 질내 CTB:CpG 처리는 24시간에 피크였고(8배 증가), 이는 48시간 내에 하향 진행되었다(3배 증가)(도 2).

RANTES

순수한 생쥐들의 질에서, 낮은 수준의 RANTES가 검출되었다(질의 140pg/ml/10mg). CTB의 질내 투여는 조사된 임의의 시점에 RANTES 생산을 유도하지 않았다. 질내 CpG ODN 투여는 RANTES의 수준을 8시간 내에 6배 증가시키고, 24시간까지 감소되고(3배 증가), 48시간 내에 기저 레벨로 되돌아 갔다. CTB:CpG 투여 후 8시간 내에, RANTES의 레벨은 10배로 증가되었고, 24시간 동안 유지되었고(11배 증가), 이어서 48시간까지 감소되었다(4배 증가)(도 8).

실시예 5 CTB에 대한 CpG ODN의 콘쥬게이션은 생식기 헤르페스 감염증에 반하여 보호성 면역성을 극적으로 증가시킨다.

본 발명자들은 항원을 동시 전달함이 없이 CpG ODN을 단일회 질내 투여함으 로써 생식기 헤르페스 감염증에 반하여 쥐 암컷의 생식기 관 점막에서 강력한 점막 보호성 면역성을 이끌어내는 것을 이미 보였다. CpG ODN에 대한 CTB의 콘쥬게이션이 시험관 내에서 보다 강력한 증식성 및 케모카인 응답들을 이끌어내는 것을 보임으로서, 본 발명자들은 생식기 HSV-2 감염증에 반하는 보호성 면역의 유도에 대한 CpG ODN에 대한 CTB의 콘쥬게이션의 영향을 조사하고자 하였다. 이 때문에, DP-처리된 암컷 C57B1/6 생쥐들의 그룹들은 통상의 치사량의 HSV-2에 의한 질내 침습 24시간 전에, 1㎍의 CpG ODN 단독으로 또는 CTB와의 콘쥬게이트 형태로 질내로 투여하였다. 일군의 생쥐들은 recCTB로 치료하였다. 대조군 뿐만 아니라 CTB-치료한 생쥐들은 HSV-2 침습후 3일만에 육안으로 보이는 질병의 징후들을 보이기 시작했고, 감염 후 8일만에 신경학상의 질병의 결과로 사망하였다. 마찬가지로, CpG ODN 1mg을 질내로 투여받은 모든 생쥐들은 육안으로 보이는 질병의 징후들을 보였고, 12일 이내에 사망하였다. 다른 한편, CTB:CpG 콘쥬게이트의 질내 투여는 HSV-2-유도된 사망에 반하여 80% 보호를 제공하였다. 이러한 데이터는 소량의 CTB:CpG 콘쥬게이트를 질-점막 투여함으로써 생식기 헤르페스 감염증에 반하는 강력한 보호성 면역을 제공하는 것을 지시한다.

실시예 6 인간의 말초 혈액 단핵 세포들에 의한 증식성 및 케모카인 반응들에 대한 CpG ODN에 대한 CTB의 콘쥬게이션 효과(PBMC)

인간의 PBMCs에 의한 증식 및 케모카인 생산들에 대한 CpG ODN에 대한 CTB 콘쥬게이션의 효과를 평가하기 위해, PBMCs는 CCpG ODN, CTB, CTB:CpG 또는 CpG ODN 및 CTB의 혼합물에 의해 배양되었다. 상층액들을 상이한 시점에 수집하고, 케 모카인들의 함량에 대해 ELISA에 의해 조사하였다. 세포들을 증식을 위해 배양후 72시간 후에 수확하였다. 나타낸 데이터는 3개의 실험의 대표값이다.

a) CTB에 대한 CpG ODN의 콘쥬게이션은 인간의 PBMCs의 CpG ODN-유도된 증식성 반응에 대한 어떠한 추가의 영향도 미치지 않는다.

PBMCs는 상이한 농도의 CTB, CpG ODN, CpG ODN 및 CTB의 혼합물, 대조용 ODN 또는 CTB:CpG 콘쥬게이트에 의해 배양되었다. 인큐베이션후 3일 후에, 증식 반응은 표준 방법을 사용함으로써 조사되었다(재료 및 방법들 참조). 상이한 농도의 CTB의 존재 하에 배양된 PBMCs는 임의의 검출할 수 있는 증식성 반응을 야기하지 않았다. CpG ODN으로 PBMCs를 처리함으로써 강력한 증식 반응을 야기하였다. 증식성 반응은 PBMCs가 3개의 최고 농도의 CpG ODN(3㎕/ml, 1㎍/ml 또는 0.3㎍/ml)의 존재 하에 배양되었을 때 관찰되었다. CTB:CpG에 의한 PBMCs의 배양은 CpG ODN-유도된 증식성 응답에 대한 어떠한 임의의 추가의 영향도 미치지 않았다. 예상되는 바와 같이, 비-CpG 대조군 ODN은 약한 증식 반응을 유도하였다.

b) CC 케모카인 반응들

MIP-1α

도 10에 나타낸 바와 같이, 상이한 농도의 CpG ODN, CTB, CpG ODN 및 CTB의 혼합물 또는 대조용 ODN에 의해 배양된 PBMCs는 조사된 임의의 시점에 MIP-1α생산을 유도하지 않았다. 이와는 대조적으로, CTB:CpG는 3.75㎍/ml 농도의 CTB:CpG가 사용되었을 때 5시간 내에 증가된 수준의 MIP-1α를 보였지만, 24시간 동안 유지되고(6배 증가), 이어서 48시간에 기저 수준으로 되돌아 갔다(도 9). 11.25㎍/ml 농 도의 CTB:CpG가 사용되었을 때, MIP-1α의 레벨은 5시간에 10배로 증가되었고, 이는 24시간까지 추가로 증가하였고(29배 증가), 이어서 48시간까지 감소되었다(6배 증가)(도 9-10). 72시간에, CTB:CpG 처리된 세포들에서 MIP-1α의 레벨들은 낮았지만, 다른 군들에 비교하여 보다 높은 수준들을 보였다(데이터는 도시되지 않음).

최고 농도의 CTB:CpG가 케모카인 생산의 유도에 최적임을 보여줌으로써, 본 발명자들은 다음 실험들을 위해 최고 농도의 콘쥬게이트 또는 대응하는 시약들을 사용하였다.

MIP-1β

완전 배지에서 배양된 PBMCs의 상층액들에서, 기저 레벨의 MIP-1β가 검출되었다. CTB 또는 비 CpG 대조용 ODN에 의한 PBMCs의 처리는 조사된 임의의 시점에 MIP-1β생산을 유도하지 않았다(도 11). CpG ODN 또는 CTB 및 CpG의 혼합물에 의해 배양된 PBMCs는 5시간 내에 유사한 레벨의 MIP-1β를 생산하고(4배), 이는 24시간 내에 증가하였고(7- 및 9배 증가), 72시간까지 감소되었다(3배 증가). CTB:CpG로 인큐베이션된 세포들의 상층액들에서, MIP-1β생산의 10배 증가가 5시간에 관찰되었고, 이는 48시간에 피크였고(23배 증가), 적어도 72시간 동안 비교적 높게 유지되었다(13배 증가)(도 11).

RANTES

기저 레벨의 RANTES가 단독 배양된 PBMCs의 상층액들에서 검출되었다. 상이한 시약들의 존재 하의 PBMCs의 배양은 5시간의 임의의 증가된 수준의 RANTES를 유도하지 않았다. 24시간 내에, CpG ODN 또는 CpG 및 CTB의 혼합물에 의해 인큐베이 션된 세포들의 상층액들 중의 RANTES의 레벨은 3배만큼 증가하였고, 이는 48시간 내에 기저 수준으로 복귀하였다. CTB:CpG에 의한 세포들의 인큐베이션은 RANTES 생산에서 4배 증가를 유도하였고, 이는 48시간 동안 유지되었고(3배), 72시간까지 기저 수준으로 복귀하였다(도 12).

c) CXC 케모카인 반응들

IP-10

조사된 임의의 시점 및 농도에서 CpG ODN, CTB, CTB 및 CpG ODN의 혼합물로 인큐베이션시킨 PBMCs의 상층액들 중에서 어떠한 검출 가능한 레벨의 IP-10도 관찰되지 않았다.

CTB의 말레이미드-활성화 또는 CpG ODN의 티올화가 CTB:CpG 콘쥬게이트들에 의해 관찰된 케모카인 반응들에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해, PBMCs를 CTB, CTB-말레이미드, CpG ODN 또는 티올 CpG ODN으로 인큐베이션하고, 이어서, CC 케모카인 응답을 조사하였다. 유사한 수준의 MIP-1α, MIP-1β및 RANTES를 CTB 또는 말레이미드-활성화된 CTB로 처리한 PBMCs의 상층액들에서 검출하였다. 마찬가지로, CpG ODN 또는 티올화된 CpG ODN으로 처리된 PBMCs는 시험된 임의의 시점에 동일한 수준의 이들 케모카인들의 생산을 야기하였다(도 13). 따라서, CTB(말레이미드 활성화) 및 CpG ODN(티올화)의 화학적 변형은 CTB- 또는 CpG ODN-유도된 케모카인 반응들에 어떠한 추가의 영향들도 미치지 않았다.

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SEQUENCE LISTING <110> Gotovax AB <120> Bifunctional composition for modulating the immune system and its use <130> 110082002 <150> US 60/385,588 and SE 0201701-0 <151> 2002-06-05 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> synthetic sequence <400> 1 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Murinae gen. sp. <400> 2 tccaggactt ctatcaggtt 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> synthetic sequence <400> 3 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tgctgctttt gtgcttttgt gctt 24

Claims

2 관능성 조성물로서,

콜레라 독소 서브 유닛 B(CTB)로 구성된 포유 동물의 세포 표면 상의 특이적 수용체에 결합하는 단백질을 포함하고,

상기 단백질은 적어도 6개의 염기 또는 염기쌍을 갖고, 천연 포스포디에스테르 골격, 포스포로티오에이트 골격 또는 상기 포스포디에스테리와 포스포로티오에이트 골격의 키메라를 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 적어도 하나의 메틸화되지 않은 5'-시토신, 구아닌-3' 디뉴클레오티드(CpG)를 함유하는 세포 내적으로 효과적인 면역 조절 핵산 성분과 컨쥬게이트(conjugate)되는 것을 특징으로 하는 2 관능성 조성물.
제1항에 있어서, 상기 면역 조절 핵산 성분은 단일 쇄 및 이중 쇄 DNA, 단일 쇄 및 이중 쇄 RNA 및 변형된 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 CpG-함유 면역 자극 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드(ISS)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 2 관능성 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 특이적 항원과 조합하는 것을 특징으로 하는 2 관능성 조성물.
제2항에 있어서, 상기 ISS는 미생물 게놈으로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 2 관능성 조성물.
제4항에 있어서, 상기 미생물 게놈은 헤르페스 단성(Herpes simplex) 바이러스 게놈인 것을 특징으로 하는 2 관능성 조성물.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISS는 5'-푸린 푸린(피리미딘) CG 피리미딘 피리미딘-3' (5'-Pu Pu(Py)CGPy Py-3')인 것을 특징으로 하는 2 관능성 조성물.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISS는 5'-GACGTT-3' 및 5'-GTCGTT-3'으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 2 관능성 조성물.
제3항에 있어서, 상기 특이적 항원은 합성 또는 천연 병원균-유도 항원, 포유 동물 조직-유도 항원, 알레르겐 및 숙주-유도 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 2 관능성 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 의약으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 2 관능성 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 종양, 감염증, 조직 이식 거부, 면역 억제 상태, 자가 면역 질환 또는 알레르기의 예방 또는 치료를 위한 제약적 제제를 제조하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 2 관능성 조성물.
제10항에 있어서, 상기 제약적 제제는 항원이 없고, 포유 동물에서 상피 종양 또는 비호흡기 상피 감염증을 국소 치료하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 2 관능성 조성물.
제8항에 있어서, 면역 예방, 면역 치료 또는 내성의 유도를 위한 제약적 제제의 제조를 제조하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 2 관능성 조성물.
제8항에 있어서, 백신 예방 주사 또는 면역 치료 목적으로 포유 동물 내로 주입하기 위해 제약 제제의 후속 제조를 위한 항원-제공 세포의 생체외 처리에 사용되는 것을 특징으로 하는 2 관능성 조성물.
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백신 예방 주사 또는 면역 치료 목적으로 포유 동물에 후속 주입하기 위해 제8항에 따른 조성물로 특이적 항원-제공 세포를 생체 외 처리하는 방법.