JP4937511B2

JP4937511B2 - 免疫系を調節するための二官能性組成物およびその使用

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Publication number: JP4937511B2
Application number: JP2004510827A
Authority: JP
Inventors: ヤン、ホルムグレン; アリ、エム．ハランディ
Original assignee: Duotol AB
Current assignee: Duotol AB
Priority date: 2002-06-05
Filing date: 2003-06-05
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2023-06-05
Also published as: KR20110042129A; KR20050027218A; DE60325492D1; EP1549340B1; CN1674935B; CA2488366A1; WO2003103708A1; SE0201701D0; EP1549340A1; ATE418343T1; JP2005538957A; US20100330101A1; KR101043341B1; CA2488366C; AU2003241251A1; CN1674935A; AU2003241251B2

Description

発明の背景

発明の分野
本発明は、免疫系を調節するための二官能性組成物（bifunctional composition）およびその使用に関する。更に正確には、本発明は、特異的細胞表面結合タンパク質成分に関連して免疫調節核酸成分を、必要に応じて特異抗原と組み合わせて、含んでなる二官能性組成物に関する。この組成物は、腫瘍、感染症、移植拒絶、免疫抑制状態、自己免疫疾患およびアレルギーの治療、並びに免疫予防、免疫療法または耐性の誘発、および抗原提供細胞をエクス・ビボ処理した後、ワクチン接種または免疫療法の目的で哺乳類に輸液するのに有用である。

背景技術
細菌ＤＮＡまたは合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）におけるメチル化されていないＣｐＧは免疫系および多種多様なＴｈ１関連免疫調節サイトカインの誘発因子の強力なアクチベーターとして知られており、感染性病原体に対する先天性免疫を高める目的で用いる可能性を示唆している（Krieg, 2001）。

更に最近では、免疫刺激よりは抑制特性を有する他の核酸配列であって、自己免疫疾患、アレルギーおよび移植拒絶など様々な免疫病理学的状態におけるような有害な免疫反応の抑制に用いることができる可能性を有するものが報告されている。

免疫強化ＣｐＧモティーフを含む核酸配列については詳細に報告されており、これも免疫抑制配列の事例ともなり、これらの配列は先天性免疫応答並びに特異抗原に対する適応性のある免疫応答の大きさおよび特徴を調節すると思われる。特異的核酸配列によって高め、抑制し、あるいは調節することができるこのような適応性のある免疫応答は、多数の様々なグループの抗原を含んでなることがある。このような抗原の例としては、病原体由来の抗原、哺乳類の組織に由来する抗原、アレルゲン、および宿主由来の抗原であって、免疫調節核酸配列と一緒に投与されるか、または例えば進行中の感染症における病原体由来の抗原および進行中の自己免疫疾患における哺乳類組織に由来する抗原の場合のような後者の配列の投与時にまたは非同系器官、組織または細胞の移植後に既に存在しているものが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの場合には、免疫増強核酸配列の特異抗原へのカップリングは、恐らくは同一の（抗原提供）による特異抗原および免疫刺激核酸配列の取り込みの機械を増加することによる問題の抗原に対する特異的な適応性のある免疫応答を刺激する特に有効な方法であることが報告されている（Shirota et al., 2001; Shirota et al., 2000）。

免疫調節の特に重要な態様は、非経口投与によるよりは粘膜表面に投与した特異抗原および免疫調節因子に関し、このような粘膜経路の投与としては、経口または消化器投与、鼻内投与、直腸内投与、および性器粘膜への投与が挙げられる。抗原を追加の特異免疫調節因子と共にまたはなしで投与することによって、粘膜表面（および場合によっては全身性の）免疫応答を誘発し、または末梢耐性（peripheral tolerance）（経口経路の粘膜投与によって誘発されるときには「経口耐性（oral tolerance）」と表されることが多い）を誘発することによって選択した抗原に対する全身性免疫応答を特異的に抑制することができることが知られている。様々な自己免疫、アレルギーまたは免疫病理学的状態において免疫治療の目的で、この種の粘膜で誘発された免疫抑制／免疫調節を開発する多くの努力が最近見られてきた。このような報告された末梢耐性を管理する特に有効な手段は、特異的耐性原性抗原をコレラ毒素の非毒性結合サブユニット（ＣＴＢ）と共に投与することである（Holmgren et al., 2003）。先天性免疫および適応性のある免疫応答を刺激し、抑制し、あるいは調節する免疫学的因子のもう一つの関連用途は、皮膚上または中への適用によるものである。ワクチンおよび他の抗原の皮下および皮内投与は以前から確立されている処置であり、更に最近では、皮膚へ直接局所塗布（いわゆる経皮免疫）を用いて、免疫応答を刺激しまたは特異的応答を抑制または免疫偏向させることもできることも報告されている。

本発明者らの知る限りでは、特異的細胞表面結合タンパク質成分に関連して細胞内で有効な免疫調節核酸成分を、必要に応じて特異抗原と組み合わせて含んでなる二官能性組成物に基づく生成物またはその使用であって、特異的細胞表面結合タンパク質成分が他の細胞内で有効な免疫調節核酸成分および場合によっては特異抗原の取り込みおよび／または反応性を特異的に増加させる働きをするものを開示している従来技術はない。

従って、本発明者らの知る限りでは、哺乳類の上皮腫瘍または非呼吸器上皮感染症の局所治療のための特異的細胞表面結合タンパク質成分に関連して一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および修飾ポリヌクレオチドから選択された少なくとも１個のメチル化されていない５’−シトシン，グアニン−３’ジヌクレオチドを含む免疫刺激オリゴまたはポリヌクレオチド（ＩＳＳ）を含んでなる無抗原医薬製剤の局所投与による哺乳類の上皮腫瘍または非呼吸器系上皮感染症の予防または治療処置の方法を開示している従来技術もない。

発明の概要

本発明は、一つの態様において、必要に応じて特異抗原と組み合わせて、ＩＳ成分および場合によっては上記特異抗原の取り込みおよび／または反応性を増加させる働きをする特異的細胞表面結合タンパク質成分に関連して細胞内で作用する免疫刺激、免疫抑制あるいは免疫調節核酸配列（以後は、免疫調節配列、ＩＳと表す）の好適な相乗的二官能性免疫調節組成物（ＢＩＣ）を提供する。

従って、本発明は、コレラ毒素（ＣＴ）、ＣＴのサブユニットＢ（ＣＴＢ）、Escherichia coliの熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、ＬＴのサブユニットＢ（ＬＴＢ）、および、ＣＴまたはＬＴに対する抗血清と反応し、ＧＭ１ガングリオシド、受容体タンパク質であるＡＤＰ−リボシレートに結合するか、または、ターゲット細胞、および特異的細胞表面成分に結合した後に細胞中にインターナリゼーションすることができる抗体または他のタンパク質にサイクリックＡＭＰを蓄積するタンパク質またはタンパク質誘導体からなる群から選択される哺乳類細胞表面上の特異的受容体に結合するタンパク質に関連してなり、少なくとも１個の免疫刺激、免疫抑制または免疫調節モティーフを含み且つ天然のホスホジエステル主鎖または修飾した主鎖を有するモノヌクレオチド、ジヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドから選択された、細胞内で有効な免疫調節核酸成分を、必要に応じて特異抗原と組み合わせて含んでなる二官能性組成物に関する。

二官能性組成物の一態様では、免疫調節核酸成分は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡおよび修飾ポリヌクレオチドから選択されるメチル化されていない５’−シトシン，グアニン−３’ジヌクレオチドを含む免疫刺激オリゴまたはポリヌクレオチド（ＩＳＳ）からなる群から選択される。

もう一つの態様では、ＩＳＳは、少なくとも６個の塩基または塩基対を有し且つ場合によってはホスホロチオエート主鎖を含んでなるヌクレオチド配列から選択される。

現在好ましい態様では、ＩＳＳは、単純ヘルペスウイルスゲノムのような微生物ゲノムから誘導される。

もう一つの現在好ましい態様では、ＩＳＳは、５’−プリンプリン（ピリミジン）ＣＧピリミジンピリミジン−3'(5'-PuPu(Py)CGPyPy-3')、例えば、5'-GACGTT-3'または5'-GTCGTT-3'である。

更にもう一つの態様では、場合によっては存在する特異抗原が実際に存在し、且つ合成または天然の病原体由来の抗原、哺乳類の組織に由来する抗原、アレルゲンおよび宿主由来の抗原からなる群から選択される。

本発明のもう一つの態様は、医薬品として用いるための二官能性組成物に関する。

本発明のもう一つの態様では、本発明の二官能性組成物を、腫瘍、感染症、移植拒絶、免疫抑制状態、自己免疫疾患、およびアレルギーの予防または治療処置のための医薬製剤の製造に用いる。

本発明のこの側面の一態様では、医薬製剤は無抗原であり、哺乳類の上皮腫瘍または非呼吸器系上皮感染症の局所治療を目的とするものである。

本発明のこの側面の一態様では、特異抗原を含んでなる本発明の組成物を免疫予防、免疫療法または耐性の誘発のための医薬製剤の製造に用いる。このような組成物は、抗原提供細胞をエクス・ビボ処理した後、ワクチン接種または免疫療法の目的で哺乳類に輸液するための医薬製剤の製造にも用いられる。

本発明は、感染症、腫瘍、自己免疫疾患、アレルギー、移植拒絶および他の免疫病理学的または免疫抑制状態の予防または治療処置の方法であって、哺乳類に上記二官能性免疫調節組成物（以後、「二官能性免疫調節複合体」ＢＩＣと表す）の有効量を、粘膜、皮膚に基づく、深部非経口（deeper parenteral）、または羊膜内の投与経路を介して単独でまたは特異抗原と組み合わせて、または細胞であって、哺乳類への輸液前にＢＩＣをエクス・ビボ投与しておいたものの投与を介して投与することを含んでなる方法にも関する。

従って、本発明は、哺乳類の腫瘍、感染症、移植拒絶、免疫抑制状態、自己免疫疾患またはアレルギーの予防または治療処置の方法であって、本発明による医薬製剤の予防上または治療上有効用量を上記哺乳類に投与する段階を含んでなる方法からなる。

本発明のこの側面の一態様では、医薬製剤は無抗原であり且つ処置は上皮腫瘍または非呼吸器系上皮感染症に対するものであり、投与は上記哺乳類の上皮腫瘍または非呼吸器系上皮感染症の部位への局所投与である。

本発明は、特異抗原を含んでなる本発明による組成物の予防上または治療上有効用量を哺乳類に投与する段階を含んでなる、上記哺乳類における免疫予防、免疫療法または耐性の誘発の方法にも関する。

本発明は、抗原提供細胞に特異抗原を含んでなる本発明による組成物をエクス・ビボ投与した後、ワクチン接種または免疫療法の目的で哺乳類に輸液する方法にも関する。

医薬製剤および二官能性組成物それ自体は不活性な希釈剤、賦形剤、および例えば、米国または欧州薬局方に記載されているような全身または粘膜投与に必要な薬剤である他の成分を含んでなることがあることを理解すべきである。

「細胞内で有効な免疫調節核酸成分」という用語は、免疫調節核酸成分が細胞内でエフェクターシグナルを介して免疫応答誘発を変更または調節することを記載するのに用いられる。

本発明で用いられる医薬製剤の予防上または治療上有効用量は、製造業者の使用説明書の指示、問題の哺乳類、哺乳類の大きさ、および当業者によって一般に知られている他の基準により、担当医師または獣医師が決定すべきである。

本発明を、主としてＣＴＢに化学的に連結した少なくとも１個のメチル化した５’−シトシン，グアニン−３’ジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含む免疫刺激ＩＳを含む免疫刺激ＩＳの検討に関する態様の記載によって説明しているが、保護の請求範囲は下記の理由によって支持される。

免疫刺激ＤＮＡの概念は、細菌から精製したＤＮＡが様々な動物腫瘍の増殖を抑制し、天然キラー（ＮＫ）細胞活性を増加し、マウス脾臓細胞およびヒト末梢血リンパ球からＩＦＮ−α／βおよび−γを誘導することができることが報告されたほぼ０年前に生まれた。それ以来、多くの研究により、適当なフランキング配列を有するメチル化されていないＣｐＧ（ＣｐＧモティーフ）が脊椎動物の免疫系に対する細菌ＤＮＡの刺激効果に関与していることが明らかにされてきた。細菌ＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）のメチル化されていないＣｐＧモティーフと樹状細胞およびマクロファージのような抗原提供細胞（ＡＰＣ）のトール（ｔｏｌｌ）様受容体−９（ＴＬＲ−９）受容体との相互作用により、トール（ｔｏｌｌ）／ＩＬ−１−受容体シグナル形成経路を介して速やかに細胞が刺激され、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１−βおよびＩＬ−１２のような炎症促進（proinflammatory）Ｔｈ１分極サイトカインを産生し、ＡＰＣ上の同時刺激分子をアップレギュレーションし、Ｂ−細胞を活性化して、増殖、抗体産生およびＩＬ−６分泌が行われる（Holmgren et al., 2003; Krieg, 2001; Krieg, 2002）。

抗原の非存在下における免疫刺激ＣｐＧＤＮＡの非経口投与は、幾つかの異なる病原体によって引き起こされる感染症に対して防御的性質の非特異的Ｔｈ１様の先天性免疫応答を誘発することが証明されている。全身的レベルでのこの概念構成は、最近、抗原の非存在下における免疫刺激ＣｐＧＯＤＮの粘膜−膣への単回投与によって、マウス生殖管および／または生殖器リンパ節にＴｈ１関連サイトカインであるＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８、およびＣＣケモカインであるＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの速やかな産生が誘発されるという知見によって粘膜の先天性免疫にまで拡張された（Harandi et al., 2003）。先天性免疫応答の誘導に対するＣｐＧＤＮＡの衝撃に加えて、多くの研究により、ＣｐＧＤＮＡがワクチンアジュバントとしても働いていることも示された。ＣｐＧＤＮＡをアジュバントとして用いる研究の多くは、全身的投与経路を用いて行われてきたが、ＣｐＧＤＮＡをアジュバントとして用いる粘膜免疫化が粘膜および全身的抗原特異的免疫応答を誘発することも最近になり示された（Holmgren et al., 2003）。

最初のＣｐＧＤＮＡ組成物の幾つかの変形物も、有用なＩＳを提供することが明らかになっている。例えば、天然のホスホジエステル主鎖から誘導される幾つかの変形物は、実際に機能するだけでなくＩＳに対する特別な有効性を提供した。後者の効果は恐らくは主としてＩＳを分解から安定化することによるものであるが、幾つかの場合には、ホスホチオレート主鎖を有するメチル化されていないＤＮＡについて示されるように、ＯＤＮは化学誘引物質としてＡＰＣに作用することによって任意の関連ＣｐＧモティーフの非存在下であっても固有の免疫刺激活性を有することが示されている（Baek et al., 2001）。報告されている有用な主鎖の例としては、様々なホスホジエステルまたはホスホチオレート主鎖、およびこれら２種類のキメラ体が挙げられるが、これらに限定されない。

また、ＩＳの免疫刺激配列の変形物は、様々な動物種におけるそれらの効力を最適化し、免疫刺激活性よりは免疫抑制活性を提供し、および／または特異な免疫調節活性を有し、Ｔｈ１型またはＴｈ２型の応答に対して免疫応答を歪曲する（ｓｋｅｗｉｎｇ）ことができることも報告されている。様々な種に対して最適である様々な配列に関して、マウスでの免疫応答を刺激するための最適ＣｐＧモティーフはヒトでのものと異なっており、ヒトでは少数の異なる活性配列が同定されており、また臨界ＣｐＧモティーフの周りのフランキング領域が様々な種類のＡＰＣに対する最適活性も決定することが詳細に報告されている。免疫刺激ＩＳの代わりに免疫抑制ＩＳに関係するときには、メチル化ＤＮＡおよびＯＤＮは免疫刺激活性よりは免疫抑制活性を有することができることが詳細に報告されている。同様に、４個の可能な単一ヌクレオチド塩基のいずれかを含むＯＤＮは提供されたＡＰＣからのサイトカイン産生、およびＡＰＣの活性化および成熟を抑制することができるが、主鎖はホスホチオレートであることも示されている（Zhu et al., 2002）。ＣＧジヌクレオチドの直後に２個のグアノシンを配置することにより（三連続グアノシン(three consecutive Guanosine)）、刺激ＯＤＮが免疫抑制ＯＤＮに転換されることも明らかにされている（Stunz etaL, 2002）。従って、配列および主鎖構造によって、ＤＮＡは免疫応答を刺激することも、抑制することもできる。更に、ＣｐＧモティーフを持たない無作為に合成されたＯＤＮは、Ｔｈ２分化の誘発のためのアジュバントとしても報告されているが、ＣｐＧモティーフを含むＯＤＮは強力なＴｈ１で歪曲された応答を誘発することも記載されている（Sano et al., 2003）。

ＢＩＣのＩＳ成分について報告されていることと同様に、特異的細胞結合成分を修飾または変更することもできる。最良の検討例であるＣＴＢでは、分子のＧＭ１ガングリオシド受容体結合活性またはその安定性に有意な影響を及ぼさない任意の構造上の修飾は、E. coliの熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴＢ）の類似の緊密に関連した結合サブユニットタンパク質の場合にも見られるように、親ＣＴＢ分子を置き換えることができるものである。同様に、多くの他の微生物タンパク質はＡＰＣなどの哺乳類細胞の表面の画定された受容体に特異結合親和性を有し、ＢＩＣの第二成分としてＣＴＢを置き換えることもできるものである。このようなタンパク質の例としては、微生物毒素の結合サブユニットまたは領域、フィムブリエまたは他の種類の微生物アドヘシン、ウイルス付着タンパク質、および植物由来のレクチンが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の二官能性組成物の説明に用いられる「に関連して」および「と組み合わせて」という用語は、あらゆる種類の結合、混合、および他の成分間の関連を含んでなるものと解釈される。

示した実施例において、ＣｐＧＯＤＮおよびＣＴＢのようなＢＩＣの２成分は、これらの成分の療法の化学修飾に基づくカップリング手法によって互いに連結し、ＩＳを用いるチオール化およびＣＴＢのマレイミド活性化が行われた。異なる種類の分子を互いに連結するための多数の代替化学が存在し、当該技術分野で周知であるので、本明細書ではこれ以上詳述しない。同様に、スペーサー分子であってこの範疇に免疫活性タンパク質、または特異抗原を含んでなるまたは含む他の分子も包含することができるものを介して２分子を互いに連結する方法は当該技術分野で周知である。当該技術分野で周知の更にもう一つの変更は、ＢＩＣの様々な成分を互いに乳化してリポソームまたは他の脂質を基剤とする構造とする、これらの成分を微小球の表面に組込む、またはこれらの成分を微小球の表面に接着する、または細胞に対する同時組合せ効果を行うのに適する処方物中でこれらの成分を単に混合するなどこれらに限定されない様々な非共有的手段のいずれかによってこれらの成分を関連させることである。

本発明は、先天性免疫および／または抗原特異的後天性（適応）免疫応答を刺激し、抑制し、あるいは調節する方法にも関する。これらの目的に対して、ＢＩＣを多数の様々な経路のいずれかによって有効量を哺乳類に投与することができる。これは、経口、消化器経路、直腸経路、性器粘膜経路、鼻内経路、呼吸器吸入経路、結膜粘膜経路、または中耳粘膜経路などこれらに限定されない多数の可能な粘膜経路のいずれによって投与することもできる。ＢＩＣは、皮膚表面での上皮、皮内または皮下などの皮膚関連経路によって投与することもできる。ＢＩＣは、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、羊膜内注射（intraaminotic injection）、関節腔内注射、およびターゲット設定したリンパ節注射などこれらに限定されない深部非経口投与によって投与することもできる。ＢＩＣの更にもう一つの投与は、上記のように全身または粘膜経路のいずれかによって哺乳類投与する前にＢＩＣでエクス・ビボ処理したＡＰＣのような細胞の形態であることができる。

本発明は、感染症または他の疾患の予防または治療処置のためのＢＩＣの使用にも関する。提供される例では、ＢＩＣは単純疱疹２型ウイルス（ＨＳＶ−２）によって引き起こされるウイルス感染症の治療に予防的または治療的に用いられるが、用いるＢＩＣの種類およびその投与経路によっては、予防および治療処置の可能性はウイルス、細菌、真菌または原生動物、および他の寄生生物によって引き起こされる極めて多数の感染症、様々な種類の腫瘍、様々な種類の自己免疫疾患およびアレルギー、移植臓器、組織または細胞を含む移植反応、および様々な種類の免疫抑制状態（例えば、ＨＩＶ感染によって引き起こされる免疫抑制）などの様々な種類の他の免疫学的状態にも及ぶ。

本発明を下記の図面および態様の説明によって例示するが、保護の範囲を記載される詳細な説明に限定しようとするものではないことを理解すべきである。更に、引用される文献の教示内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。

発明の具体的説明

単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）感染症に対するＣｐＧおよび雌性生殖管粘膜免疫を包含する開示態様の背景として、これらの存在を下記に簡単に説明する。

ＣｐＧモティーフおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドを比較的多量に有する細菌性ＤＮＡは、免疫応答を活性化することができる。イン・ビトロでは、ＣｐＧＯＤＮが脾臓細胞、単球、樹状細胞、およびマクロファージを直接刺激して、ＩＦＮ−γ[Yamamoto, 1992]、II−１β[Lipford, 1997]、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）[Sparwasser, 1997]、ＩＬ−１２[Lipford, 1997]およびＩＬ−１８[Roman, 1997]のような様々なサイトカインを分泌し、ＩＬ−６分泌および増殖[Yi, 1996]のためのＢ細胞を活性化する。更に、ＣｐＧはＮＫ細胞、マクロファージ[Sparwasser, 1997]、Ｂ細胞[Krieg, 1995]および樹状細胞[Sparwasser, 1998]を活性化して、主要組織適合遺伝複合体（ＭＨＣ）クラスＩ、ＭＨＣクラスII、並びにＣＤ８０およびＣＤ８６のような補助刺激分子をアップレギュレーションする。イン・ビボでは、ＣｐＧＯＤＮの全身投与により、ＮＫ活性が促進され[Yamamoto, 1992]、脾臓のＢ細胞の比率が増加し[Krieg, 1995]、ＩＦＮ−γ[Yamamoto, 1992]、ＩＬ−６[Yi, 1996]、ＴＮＦ−α[Sparwasser, 1997]およびＩＬ−１２[Zimmermann, 1998]の血漿濃度または組織のｍＲＮＡ発現が増加することが明らかになった。疾患の動物モデルにおけるマラリアおよびListeria Monocytogenes感染症を予防するＣｐＧＯＤＮの能力が、最近報告された[Germazinski, 2001; Elkins, 1999; Krieg, 1998]。

先天性免疫応答に対する効果に加えて、ＣｐＧＯＤＮは同時投与した抗原に対する特異的免疫応答を強化することが示された[Ban, 2000]。幾つかの最近の報告は、様々な動物モデルの疾患において様々な抗原やＤＮＡワクチンを用いるワクチン接種におけるＣｐＧＯＤＮの強力なアジュバント活性を立証している［総説については、Krieg, 2001を参照されたい］。特に、最初のヒト臨床試験の報告は、抗原とのＣｐＧＯＤＮの同時投与は免疫刺激性であり且つ十分に耐性であることができるが示された。ＣｐＧＯＤＮの全身的免疫応答に対する衝撃が報告されているにも拘わらず、粘膜表面での免疫の誘導についてのＣｐＧＤＮＡの効果についてはほとんど知られていない。ＣｐＧＯＤＮを膣に単回投与することによって、ネズミの雌性生殖管粘膜における強力なＴｈ−１に関連したサイトカインおよびケモカイン応答が誘導されることが最近示されている（Harandi, et al., 2003）。

ＨＳＶ−２は、ヒト生殖管粘膜に感染する性行為によって伝染する病原体であり、ヒトの陰部潰瘍の最もよく見られる症例である。ＨＳＶ−２感染症の罹患率は多くの国で高く、成人女性人口の１０−５０％が感染しており[Kinghorn, 1994]、発病率は世界的に増加してきている[Nahmias, 1990]。ＨＳＶ−２感染症は、通常は性的接触による伝染の結果として獲得される。急性陰部疱疹感染症は、短期間の膣分泌物への集中的なウイルス剥落を特徴としており、これはウイルスの伝染に重要である。陰部潰瘍はよく見られるが、伝播性疾患および髄膜炎のような生命の危険のある合併症が免疫無防備状態の患者で起こることもある。妊娠初期には、ＨＳＶ−２は胎盤関門を通過し、胎児に影響を及ぼし、自然流産や、精神遅滞など胎児に重大な損傷を生じる可能性がある[Whitley, 1991]。従って、特に陰部潰瘍はヒト免疫不全ウイルスの伝染を促進するので、陰部疱疹感染症の予防法の開発が強くの求められている。

本発明者らは、抗原同時投与なしでのＣｐＧＯＤＮ−ＣＴＢＢＩＣの局所性器免疫の誘導および性行為によって伝染する病原体であるＨＳＶ−２の予防に対する衝撃を検討した。これらの結果は、性行為によって伝染するウイルス性疾患のモデル系としての陰部疱疹感染症に対するＣｐＧＯＤＮ−ＣＴＢＢＩＣの強力な予防能力を示している。

材料および方法
マウス
雌の６−８週齢Ｃ５７ＢＩ／６マウスを総ての実験に用いた。マウスはＭ＆Ｂから購入し、EBM Animal Facility, Sahlgrenska Academy, Goeteborg Universityで特異的病原体のない状態で換気装置付きケージで飼育した。総ての実験は、動物実験倫理委員会（Goeteborg，スウェーデン）の承認の下に行った。

ＯＤＮ
ＯＤＮは、Cybergene AB (Novum Research Park，スウェーデン）またはQiagenから購入した。ネズミでの検討に用いたＣｐＧＯＤＮは、TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT（配列番号：１）、すなわち、GACGTTモティーフを２コピー含むヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート（ＰＳ）主鎖を有する２０マーであった。ネズミのコントロールＯＤＮは、TCC AGG ACT TCT CTC AGG TT（配列番号：２）、すなわちＣｐＧモティーフを含まないヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート主鎖を有する２０マーであった。イン・ビトロ試験でのヒトに対しては、用いたＣｐＧＯＤＮは、TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT（配列番号：３）、すなわち、GTCGTTモティーフを３コピー含むヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート（ＰＳ）主鎖を有する２４マーであった。用いたヒトコントロールＯＤＮは、TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT（配列番号：４）、すなわち、ＣｐＧモティーフを含まないヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート主鎖を有する２４マーであった。

最適ネズミおよびヒトＣｐＧＯＤＮのＣＴＢへの化学結合
ＣＴＢネズミまたはヒトＣｐＧＯＤＮへの接合は、３段階で行った。

ａ）チオールＣｐＧＯＤＮのジスルフィド結合の脱保護
チオールで修飾したＣｐＧＯＤＮ（Ｑｉａｇｅｎ）の結合を開裂するため、ＯＤＮをジチオテリトール（ＤＴＴ）（Ｓｉｇｍａ）と混合し、室温で９０分間（マウス構築物Ｉおよびヒト接合体）または３７℃で１６時間（マウス構築物II）インキュベーションした。この後、脱保護したチオールで修飾したＣｐＧＯＤＮを次にSephandex G25（ＤＮＡ級カラム0.9 x 21.6 cm Pharmacia Amersham Biosciences）を用いるゲル濾過によって精製した後、０．１Ｍリン酸緩衝液、０．１５ＭＮａＣｌおよび０．０１ＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．２で溶出した。精製したチオールで修飾したＣｐＧＯＤＮの吸光度を、分光光度計で２６０ｎｍで読み取った。

ｂ）ＣＴＢのマレイミド活性化
ＣＴＢ分子マレイミド基は、過剰量のスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）(Pierce Chemicals)と共に室温にて９０分間インキュベーションした後、G 25(PD 10 Pharmacia)を用いる濾過および２ｍｌ０．１Ｍリン酸緩衝液、０．１５ＭＮａＣｌおよび０．０１ＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．２を用いる溶出によって精製することによって導入した。

ｃ）ＣＴＢのＣｐＧＯＤＮの接合
マレイミド活性化したＣＴＢと脱保護したチオールで修飾したＣｐＧＯＤＮを一緒に一晩室温にてインキュベーションした後、Viva spin 5000 MWCOにより濃縮した。濃縮した材料をSuperdex 200 10/30上で分離し、高分子量画分を集め、5000 MWCOにより更に濃縮した。接合体にＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理を施した。ＣＴＢとＣｐＧＯＤＮを、それぞれCoomassie BlueおよびSYBR GREENで可視化した。接合体のＧＭ１結合容量を、ＧＭ１−ＥＬＩＳＡによって決定した。

ネズミの増殖分析法
投薬を受けたことのないＣ５７ＢＩ／６マウス由来の脾臓細胞を、この臓器をナイロンネットを通過させることによって単離した。赤血球は、この細胞を塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）と３７℃で１０分間インキュベーションすることによってリーシスした後、この細胞を洗浄し、トリパンブルーで染色し、生育能力のある細胞数をブッフナーチャンバーで計数した。細胞を、９６穴平底プレート（Ｎｕｎｃ）にＬ−グルタミン、５０μＭ２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を補足したＩｓｃｏｖｅ培地中で（２ｘ１０^５個の細胞／ウェル）３回播種した。細胞を、単独、または様々な濃度のｒｅｃＣＴＢ、ＣＴＢ−マレイミド、ＣｐＧＯＤＮ、ＣｐＧ−チオール、コントロールＯＤＮ、ｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物、ＣＴＢ−マレイミドとＣｐＧ−チオールの混合物、またはＣＴＢ：ＣｐＧ接合体の存在下で、３７℃でインキュベーションした。用いたｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの濃度は、接合体でのそれらの濃度に相当していた。２４、４８および７２時間インキュベーションした後、培養上清を集めて、ケモカイン含量について分析した。３日目に、細胞を［^３Ｈ］チミジン（Amersham Pharmacia）１μＣｉで６−８時間パルス標識した後、細胞ＤＮＡをガラス繊維フィルター上に採取した後、放射性チミジンの取り込みをベーターカウンターで１分当たりのカウント数（ｃｐｍ）で測定した。データは、物質と共に培養した細胞の平均ｃｐｍを細胞のみの平均ｃｐｍで割ったものに相当する賦活指数（stimulation index, SI）として表す。

膣内投与
マウスに、Depo-Provera (Upjohn s.a., Puurs, ベルギー）３．０ｍｇをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１５０μｌに加えたものを皮下（ｓ．ｃ）注射注射により前投与した。６日後、マウスをイソフルラン（Baxter Medical AB）により麻酔し、ｒｅｃＣＴＢまたはＣｐＧＯＤＮであって、遊離形態またはＣＴＢに結合したもの（ＣＴＢ：ＣｐＧ接合体）１μｇを膣内投与し、または未処理のままとした。

膣からのケモカインの抽出
膣からのケモカインの抽出は、ＰＥＲＦＥＸＴ法の変法を用いて行った（Johansson, 1998）。簡単に説明すれば、マウスを膣内投与後の様々な時点で屠殺し、膣を摘出し、秤量した後、２ｍＭフェニルメチルスルホニルクロリド、大豆トリプシン阻害薬（Ｓｉｇｍａ）０．１ｍｇ／ｍｌおよび０．０５ＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液中で−２０℃で保管した。ＰＧＥ_２分析のため、インドメタシン（Ｓｉｇｍａ）を組織試料に添加した。組織試料を融解した後、ＰＢＳ中２％（重量／容量）の最終濃度でサポニンで４℃で一晩浸透性にした。次に、組織試料を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清および血清をケモカインについてＥＬＩＳＡを用いて分析した。

ウイルスおよびウイルス投与
ＨＳＶ−２株３３３[Seth, 1974]をアフリカ緑ザル腎臓細胞（ＧＭＫ−ＡＨ１）の細胞を増殖させて、滴定し、１サイクルの凍結／融解によって調製した後、細胞破片を遠心分離によって除去した。ＨＳＶ−２投与のため、それぞれのマウスにＤＰ３．０ｍｇをＰＢＳに加えたものを皮下投与した。６日後、マウスをイソフルラン（Baxter Medical AB, スウェーデン）を用いて麻酔し、毒性の強いＨＳＶ−２株９ｘ１０^４ＰＦＵを１０μｌのＨａｎｋｓのバランス調整した塩溶液（ＨＢＳＳ）を膣内に接種した。

感染症の観察
ａ．ウイルス複製
膣内にＨＳＶ−２を感染させた後、粘液の不連続な集塊が得られるまで滅菌ＨＢＳＳ４０μｌを膣に加えてこれから採取することによって膣液を集めた後、第二の洗浄を行った。２回洗浄液は、−７０℃でプールして保管した。ＨＳＶ−２力価は、標準的方法を用いてＧＭＫ−ＡＨ１細胞単層上でのプラーク分析によって決定した。
ｂ．炎症および疾患
マウスを、ＨＳＶ−２感染後の膣炎症、神経学的疾患および死亡について毎日検査した。疾患の重篤度を、０：健康、１：性器紅斑、２：軽度性器炎症、３：重度の化膿性性器病変、４：後肢麻痺、および５：麻痺による死亡または犠牲に等級付けした。

ヒトＰＢＭＣ増殖分析
ヒトＰＢＭＣを、健康な成人血液試料からFicoll-Hypaqueグラディエント遠心分離を用いて分離した。細胞を、９６穴平底プレート（Ｎｕｎｃ）にＬ−グルタミン、５０μＭ２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシンおよびウシ胎児血清を補足したＩｓｃｏｖｅ培地中に、増加濃度のＣＴＢ、ＣｐＧＯＤＮ、ＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物、またはヒトＣＴＢ：ＣｐＧ接合体の存在下で播種した。ＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの濃度は、接合体におけるそれらの濃度に相当する。上清を５、２４、４８および７２時間後に集めて、ＣＣまたはＣＸＣケモカインの含量を検討した。７２時間後に、細胞を［^３Ｈ］チミジン（Amersham Pharmacia）１μＣｉでパルス標識し、６−８時間インキュベーションした。細胞ＤＮＡをガラス繊維上に採取した後、放射性チミジンの取り込みをベーターカウンターで１分当たりのカウント数（ｃｐｍ）で測定した。データは、物質と共に培養した細胞の平均ｃｐｍを細胞のみの平均ｃｐｍで割ったものに相当する賦活指数（stimulation index, SI）として表す。

ケモカイン定量
組織抽出物および培養上清中のＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２およびＩＰ−１０の濃度を、R & D Systems (Abingdon, 英国）またはPeproTech EC Ltd (IP-10)製のＥＬＩＳＡキットを用いて、製造業者の推奨に従って決定した。

例１：ＣＴＢ：ＣｐＧ接合体の構築
ＣｐＧＯＤＮをＣＴＢに連結してＣｐＧＯＤＮの免疫刺激効果を増すために、チオール化ＣｐＧＯＤＮをマレイミド活性化ＣＴＢに化学的に接合した。チオールで修飾したＣｐＧの脱保護のため、２つの方法を用い、これにより材料および方法に記載されている２種類のネズミＣＴＢ：ＣｐＧ接合体の構築物、すなわちＣＴＢ：ＣｐＧＩおよびＣＴＢ：ＣｐＧ IIを生成した。ヒトについては、１種類のＣＴＢ：ＣｐＧ構築物のみを作製した（材料および方法を参照されたい）。接合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理し、Coomassie Blue（タンパク質の染色）およびSYBR GREEN II（ＤＮＡの染色）で染色し、接合が成功したことを確認した（データは示さず）。

２種類のネズミ接合体ＣＴＢおよびＣｐＧ含量が異なる。従って、ＣＴＢ対ＣｐＧの比は、ＣＴＢ：ＣｐＧＩおよびIIについてそれぞれ６および２．５であった。接合体を、GM1 ELISAでそれらのＧＭ１結合特性について検討した。

例２：ＣｐＧＯＤＮをＣＴＢに接合することにより、ネズミ脾臓細胞のＣｐＧＯＤＮによって誘導される増殖応答が増す
投薬を受けたことのないＣ５７ＢＩ／６マウス由来の脾臓細胞を、様々な濃度のｒｅｃＣＴＢ、ＣｐＧＯＤＮ、コントロールＯＤＮ、ＣＴＢ：ＣｐＧＩ、またはＣＴＢ：ＣｐＧ IIと培養した。

ＣＴＢ：ＣｐＧＩ
図１ａに示されるように、最高濃度の接合体（２０μｇ／ｍｌ）と共に培養した脾臓細胞はＳＩが２２．６となるが、相当する濃度のＣｐＧＯＤＮ（３．３μｇ／ｍｌ）では、ＳＩが９．１に過ぎない。最低濃度の接合体（１．２５μｇ／ｍｌ）は、最高濃度のＣｐＧＯＤＮ単独またはＣＴＢとＣｐＧとの混合物と同じ程度まで増殖を刺激する。ＲｅｃＣＴＢは、いかなる濃度で用いたときにも増殖の刺激効果を持たない（図１ａ）。ＣｐＧＯＤＮと同じ濃度のコントロールＯＤＮは、増殖に効果を示さない（データは示さず）。

ＣＴＢ：ＣｐＧ II
接合体Ｉについては、最高濃度の接合体IIは、ＣｐＧＯＤＮ単独（ＳＩ＝１２．６）またはＣＴＢとＣｐＧとの混合物（ＳＩ＝９．９）より大きな増殖の刺激効果（ＳＩ＝２３．３）を有した。接合体の濃度を２．５μｇ／ｍｌまで低下させると、最高濃度のＣｐＧＯＤＮまたはＣＴＢとＣｐＧＯＤＮとの混合物と比較して同一またはそれ以上の増殖効果（ＳＩ＝１２）を検出した。ＣＴＢ単独は、任意の濃度で用いたときには増殖刺激効果を示さなかった（図１ｂ）。

様々な濃度の接合したＣＴＢ：ＣｐＧＩ、ＣＴＢ：ＣｐＧ II、ＣｐＧＯＤＮ、ｒｅｃＣＴＢ、またはｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮとの混合物と共に培養した２匹の投薬を受けたことのないＣ５７ＢＩ／６マウス由来のプールした脾臓細胞の７２時間増殖後にＳＩとして示される増殖。図（ａ）および（ｂ）のいずれにおいても、ｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの濃度は接合体のそれらの濃度に相当する。
（ａ）ＣＴＢ：ＣｐＧＩ．（ｂ）ＣＴＢ：ＣｐＧ II．

マレイミドによるＣＴＢの活性化またはチオールのＣｐＧＯＤＮへのカップリングが脾臓細胞増殖に何らかの効果を有することがあるかどうかを試験するため、脾臓細胞を様々な濃度のマレイミドで活性化したＣＴＢまたはチオール化したＣｐＧＯＤＮの存在下で培養した。

様々な濃度のいずれにおいても、チオール基のＣｐＧＯＤＮへのカップリングまたはＣＴＢのマレイミド活性化により、ＣｐＧＯＤＮまたはＣＴＢ単独より増殖は高水準とならなかった（図２）。ＣＴＢマレイミドおよびＣｐＧチオールの混合物を用いる脾臓細胞の培養では、ＣｐＧＯＤＮ単独と比較して増殖に付加的効果が見られなかった（データは示さず）。

例３：ＣｐＧＯＤＮのＣＴＢへの接合によって、ネズミ脾臓細胞のＣｐＧＯＤＮによって誘導されるＣＸＣおよびＣＣケモカイン応答が増す
ケモカイン産生に対するｒｅｃＣＴＢのＣｐＧＯＤＮへの接合の効果を評価するため、脾臓細胞をＣＴＢ：ＣｐＧＩ、ＣＴＢ：ＣｐＧ II、ｒｅｃＣＴＢ、ＣｐＧＯＤＮ、またはｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮとの混合物を用いて培養した。様々な時点に、上清をＣＸＣおよびＣＣケモカインの含量について検討した。

ＣＸＣケモカイン（ＩＰ−１０によって例示）
ＣＴＢ：ＣｐＧＩ
完全培地中で脾臓細胞を２４時間培養した後に回収した上清では、ＩＰ−１０は１２５０ｐｇ／ｍｌ／１０^６個の細胞が検出されたが、４８時間後には劇的に減少した（１２２．５ｐｇ／ｍｌ／１０^６個の細胞）。脾臓細胞をＣＴＢ：ＣｐＧＩと共に培養したところ、ＩＰ−１０の産生が誘導された。この産生は、接合体の増加濃度と共に増加した。用いた接合体の最高濃度（２０μｇ／ｍｌ）では、未処理細胞の場合と比較してそれぞれ２４時間および４８時間後のＩＰ−１０の産生が２０倍および４０倍に増加した。

脾臓細胞をＣｐＧＯＤＮ単独またはＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物と共に培養したときには、ずっと低濃度のＩＰ−１０が検出された。

２４時間では、最低濃度のＣＴＢ：ＣｐＧＩ（１．２５μｇ／ｍｌ）は、ＣｐＧＯＤＮ単独またはｒｅｃＣＴＢおよびＣｐＧＯＤＮの混合物の最高濃度よりも多量のＩＰ−１０の産生を誘導した。

試験した濃度のｒｅｃＣＴＢは、検討を行ったいずれの時点でもＩＰ−１０を誘導しなかった（図３ａおよび３ｂ）。

ＣＴＢ：ＣｐＧ II
単独で培養した細胞でのＩＰ−１０の濃度は、２４および４８時間のいずれにおいても１０００ｐｇ／ｍｌ／１０^６個の細胞であった。２４時間では、ＣｐＧＯＤＮ単独またはＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物は、同じ濃度のＩＰ−１０産生を誘導した（７−８倍に増加）。重要なことには、ＩＰ−１０の産生は、ＣＴＢ：ＣｐＧ IIで処理した後には２４時間以内に１６倍まで増加した。ＩＰ−１０産生は、４８時間では更に増加した（１８倍に増加）。４８時間後には、ＣｐＧＯＤＮ単独およびＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物は、接合体と比較して遙かに低濃度のＩＰ−１０を産生した。ＲｅｃＣＴＢ単独は、検討を行ったいずれの時点でもＩＰ−１０産生を誘導しなかった。

ＭＩＰ−２
ＭＩＰ−２の産生は、ＣｐＧＯＤＮを投与した脾臓細胞の上清では検出されなかった。

例４：ＣＣケモカイン（ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳによって例示）
ＭＩＰ−１α
２４時間、４８時間、および７２時間後に細胞単独から採取した上清には、低濃度のＭＩＰ−１α（１２２．５−１５０ｐｇ／ｍｌ／１０^６個の細胞）を検出した。ｒｅｃＣＴＢは、いずれの時点でもＭＩＰ−１αの産生を全く誘導しなかった（図４および５）。

ＣＴＢ：ＣｐＧＩ
図５に示されるように、脾臓細胞をＣＴＢ：ＣｐＧＩと共に培養したところ、ＭＩＰ−１αの産生を２４時間で７０倍までおよび４８時間で１８０倍まで増加し、７２時間では１８６倍まで増加した。２４時間では、ｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物は、ＭＩＰ−１αの産生を接合体と同じ程度まで誘導した。ＭＩＰ−１αの産生は時間と共に減少したが、それでも７２時間で１３０倍の増加を示した。ＣｐＧＯＤＮ単独を投与した細胞は、比較できる濃度のものを産生しなかった。４８時間では、ＣｐＧＯＤＮはＭＩＰ−１αの産生を誘導し、７３倍まで増加したが、これは７２時間以内に５０倍まで減少した。ｒｅｃＣＴＢは、試験を行ったいずれの時点でも評価し得る濃度のＭＩＰ−１αの産生を誘導しなかった（図４）。

ＣＴＢ：ＣｐＧ II
脾臓細胞をＣＴＢ：ＣｐＧ IIと共に培養したところ、ＭＩＰ−１αが２４時間で５５倍に増加し、４８時間では１５０倍に増加して、このレベルに７２時間まで留まった。ｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物はＭｌＰ−１αの産生を誘導し（５０倍）、この誘導は４８時間で１２０倍まで増加し、７２時間まで持続された。４８時間では、ＣｐＧＯＤＮはＭＩＰ−１α産生の増加が５０倍まで誘導され、これは７２時間では４０倍まで減少した（図５）。

ＲＡＮＴＥＳ
ＭＩＰ−１αに関しては、２４時間、４８時間および７２時間で細胞のみから採取した上清では、低濃度のＲＡＮＴＥＳ（４５０−６００ｐｇ／ｍｌ／１０^６個の細胞）が見出された。ｒｅｃＣＴＢは、いずれの時点でもＭＩＰ−１αの産生を誘導しなかった（図６および７）。

ＣＴＢ：ＣｐＧＩ
２４時間で採取した上清では、ＣｐＧＯＤＮは高濃度のＲＡＮＴＥＳ（１１０００ｐｇ／ｍｌ／１０^６個の細胞）を誘導したが、ＣＴＢ：ＣｐＧＩまたはｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物と共に培養した細胞によって産生されるＲＡＮＴＥＳの量は低かった。４８および７２時間では、ＣｐＧＯＤＮを投与した細胞によって産生されるＲＡＮＴＥＳの濃度は減少したが、接合体を投与した細胞によって産生されるＲＡＮＴＥＳの濃度は少なくとも７２時間変化しないままであった（図６）。

ＣＴＢ：ＣｐＧ II
ＣＴＢ：ＣｐＧ II、ＣｐＧＯＤＮ単独、またはｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮパルス標識した脾臓細胞の混合物の上清では２４時間で類似の濃度のＲＡＮＴＥＳが検出された。４８時間後には、ＣＴＢ：ＣｐＧ IIはまだ同濃度のＲＡＮＴＥＳを産生したが、多野郡でのＲＡＮＴＥＳの産生は減少した。７２時間後には、ＲＡＮＴＥＳの産生は、接合体と共に培養した細胞の上清で最高となった（図７）。

例４：ＣＴＢ：ＣｐＧ接合体はネズミ雌性生殖管粘膜において強いＣＣケモカイン応答を誘導する
ＣＴＢのＣｐＧＯＤＮへの接合の雌性生殖管でのケモカイン応答に対する効果を検討するため、数群のマウスにプロゲステロンを投与した後、ＣＴＢ、ＣｐＧＯＤＮ、またはＣＴＢ：ＣｐＧ接合体を膣内に単回投与した。投与後の様々な時点で、膣を採取してサポニン抽出した後、ＣＣケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳの濃度を決定した。

ＭＩＰ−１α
ＭＩＰ−１αを、投薬を受けたことのないマウスの膣で低濃度検出した（１２ｐｇ／ｍｌ／１０ｍｇ膣）。ＣＴＢの膣内投与では、検討を行ったいずれの時点でもＭｌＰ−１α産生が誘導されなかった。ＣｐＧＯＤＮを膣内投与したところ、８時間以内にＭＩＰ−１αの濃度は５倍まで増加し、これは次いで減少して４８時間以内に基準レベルに戻った。ＣＴＢ：ＣｐＧ接合体を投与したマウスでは、ＭＩＰ−１αが２時間以内に速やかに１３倍に増加し、これは８時間そのままであり（１２倍増加）、２４時間以内に減少し（４倍）、４８時間までに基準レベルに到達した（図８）。

ＭＩＰ−１β
ＭＩＰ−βは、投薬を受けたことのないマウスの膣に低濃度で検出された（３０ｐｇ／ｍｌ／１０ｍｇ膣）。ＣＴＢの膣内投与では、検討を行ったいずれの時点でもＭｌＰ−１β産生が誘導されなかった。ＣｐＧＯＤＮを膣内投与したところ、８時間以内にＭＩＰ−１βの濃度は４倍まで増加し、これは２４時間以内では増加した（６倍増加）。ＭＩＰ−１βの産生は減少して、４８時間までに基準レベルに戻った。ＣＴＢ：ＣｐＧを膣内投与したところ、ＭＩＰ−１β産生が２時間以内に速やかに６倍に増加した後、２４時間でピークに達し（８倍増加）、４８時間以内に減少した（３倍増加）（図２）。

ＲＡＮＴＥＳ
投薬を受けたことのないマウスの膣では、低濃度のＲＡＮＴＥＳが検出された（１４０ｐｇ／ｍｌ／１０ｍｇ膣）。ＣＴＢの膣内投与では、検討を行ったいずれの時点でもＲＡＮＴＥＳの産生は誘導されなかった。ＣｐＧＯＤＮの膣内投与では、８時間以内にＲＡＮＴＥＳの濃度が６倍まで増加し、これは２４時間までに減少し（３倍増加）、４８時間以内に基準レベルまで戻った。ＣＴＢ：ＣｐＧ投与後８時間以内に、ＲＡＮＴＥＳの濃度は１０倍まで増加し、２４時間そのレベルに留まった後（１１倍増加）、４８時間までに減少した（４倍増加）（図８）。

例５：ＣｐＧＯＤＮがＣＴＢに接合することによって陰部疱疹感染症に対する防御免疫が劇的に増加する
本発明者らは、以前に、ＣｐＧＯＤＮ（６０μｇ／マウス）を抗原同時投与なしに膣に単回投与することによって、陰部疱疹感染症に対するネズミの雌性生殖管粘膜における強力な粘膜防御免疫が誘発されることを示した。ＣＴＢのＣｐＧＯＤＮへの接合により、一層強い増殖およびケモカイン応答がイン・ビトロで誘発されることを示した後、本発明者らはＣＴＢのＣｐＧＯＤＮへの接合の陰部ＨＳＶ−２感染症に対する防御免疫の誘発に対する影響を検討しようとした。この目的のため、ＤＰを投与した雌性Ｃ５７ＢＩ／６マウスの群に、ＨＳＶ−２の通常の致死用量を膣投与する２４時間前に、ＣｐＧＯＤＮ１μｇを単独でまたはＣＴＢとの接合体の形態で膣内投与した。１群のマウスには、ｒｅｃＣＴＢを投与した。コントロール並びにＣＴＢ投与マウスは、ＨＳＶ−２投与後の３日目には疾患の全般的症状を示し始め、感染から８日以内に神経学的疾患の結果として死亡した。同様に、ＣｐＧＯＤＮ１ｍｇを膣内投与した総てのマウスは、疾患の全般的症状を示し、１２日以内に死亡した。一方、ＣＴＢ：ＣｐＧ接合体を膣内投与したものは、ＨＳＶ−２によって引き起こされる死亡に対して８０％の防御を示した。このデータは、微量のＣＴＢ：ＣｐＧ接合体を膣粘膜に投与することにより、陰部疱疹感染症に対する強い防御免疫が得られることを示している。

例６ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による増殖およびケモカイン応答に対するＣＴＢのＣｐＧＯＤＮへの接合の効果
ヒトＰＢＭＣによる増殖およびケモカイン産生に対するＣＴＢのＣｐＧＯＤＮへの接合の影響を評価するため、ＰＢＭＣをＣｐＧＯＤＮ、ＣＴＢ、ＣＴＢ：ＣｐＧ、またはＣｐＧＯＤＮとＣＴＢの混合物と共に培養した。上清を様々な時点で集め、それらのケモカインの含量についてＥＬＩＳＡによって検討を行った。細胞は、増殖のための培養の７２時間後に回収した。示されているデータは、３回の実験の典型的なものである。

ａ）ＣｐＧＯＤＮのＣＴＢへの接合では、ヒトＰＢＭＣのＣｐＧＯＤＮによって誘発される増殖応答に対する付加的効果はない
ＰＢＭＣを、様々な濃度のＣＴＢ、ＣｐＧＯＤＮ、ＣｐＧＯＤＮとＣＴＢの混合物、コントロールＯＤＮ、またはＣＴＢ：ＣｐＧ接合体と共に培養した。３日間インキュベーションした後、増殖応答を標準的方法を用いて検討した（材料および方法を参照されたい）。様々な濃度のＣＴＢの存在下で培養したＰＢＭＣでは、検出可能な増殖応答は生じなかった。ＰＢＭＣをＣｐＧＯＤＮと共に処理したところ、強い増殖応答が得られた。ＰＢＭＣを３種類の最高濃度（３μｌ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌまたは０．３μｇ／ｍｌ）のＣｐＧＯＤＮの存在下で培養したときには、増殖応答が観察された。ＰＢＭＣをＣＴＢ：ＣｐＧと共に培養しても、ＣｐＧＯＤＮによって誘発される増殖応答には何ら付加的効果はなかった。予想されたように、非ＣｐＧコントロールＯＤＮは、弱い増殖応答を誘発した。

ｂ）ＣＣケモカイン応答
ＭＩＰ−１α
図１０に示されるように、様々な濃度のＣｐＧＯＤＮ、ＣＴＢ、ＣｐＧＯＤＮとＣＴＢの混合物、またはコントロールＯＤＮと共に培養したＰＢＭＣは、検討を行ったいずれの時点でもＭＩＰ−１α産生を誘発しなかった。対照的に、ＣＴＢ：ＣｐＧは、３．７５μｇ／ｍｌの濃度のＣＴＢ：ＣｐＧを用いたときには５時間以内にＭＩＰ−１αの濃度が増加し（４倍増加）、これは２４時間そのレベルに留まった後（６倍増加）４８時間には基準レベルに戻った（図９）。１１．２５μｇ／ｍｌの濃度のＣＴＢ：ＣｐＧを用いたときには、ＭＩＰ−１αの濃度は５時間で１０倍まで増加し、２４時間まで更に増加し（２９倍増加）、次いで４８時間までに減少した（６倍増加）（図９−１０）。７２時間では、ＣＴＢ：ＣｐＧを投与した細胞でのＭＩＰ−１αの濃度は低かったが、それでもなお他の群と比較して高いレベルを示していた（データは示さず）。

最高濃度のＣＴＢ：ＣｐＧがケモカインの産生に最適であることを示した後、本発明者らは次に実験に最高濃度の接合体または相当する試薬を用いた。

ＭＩＰ−１β
完全培地で培養したＰＢＭＣの上清では、基準レベルのＭＩＰ−１βが検出された。ＰＢＭＣにＣＴＢまたは非ＣｐＧコントロールＯＤＮを投与したところ、検討を行ったいずれの時点でもＭＩＰ−１β産生が誘発されなかった（図１１）。ＣｐＧＯＤＮまたはＣＴＢとＣｐＧの混合物を投与したＰＢＭＣは５時間以内に同レベルのＭＩＰ−１を産生し（４倍）これは２４時間以内で増加し（７および９倍増加）、７２時間までに減少した（３倍増加）。ＣＴＢ：ＣｐＧと共にインキュベーションした細胞の上清では、５時間ではＭＩＰ−１β産生が１０倍に増加し、４８時間にピークに達し（２３倍増加）少なくとも７２時間比較的高いレベルに保持された（１３倍増加）（図１１）。

ＲＡＮＴＥＳ
単独で培養したＰＢＭＣの上清では、基準レベルのＲＡＮＴＥＳが検出された。異なる試薬の存在下でのＰＢＭＣの培養では、５時間ではＲＡＮＴＥＳの濃度は増加しなかった。２４時間以内に、ＣｐＧＯＤＮ、またはＣｐＧとＣＴＢの混合物と共にインキュベーションした細胞の上清におけるＲＡＮＴＥＳの濃度は３倍まで増加したが、これは４８時間以内に基準レベルに戻った。細胞をＣＴＢ：ＣｐＧと共にインキュベーションしたところ、ＲＡＮＴＥＳの産生が４倍に増加し、４８時間保持され（３倍）、７２時間までに基準レベルに戻った（図１２）。
ｃ）ＣＸＣケモカイン応答
ＩＰ−１０
ＣｐＧＯＤＮ、ＣＴＢ、ＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物、またはＣＴＢ：ＣｐＧと共にインキュベーションしたＰＢＭＣの上清では、検討を行ったいずれの時点および濃度でも検出可能なレベルのＩＰ−１０は見られなかった。

ＣＴＢのマレイミド活性化またはＣｐＧＯＤＮのチオール化がＣＴＢ：ＣｐＧ接合体による観察されたケモカイン応答に対して何らかの効果を有するかどうかを検討するため、ＰＢＭＣをＣＴＢ、ＣＴＢ−マレイミド、ＣｐＧＯＤＮ、またはチオールＣｐＧＯＤＮと共にインキュベーションした後、ＣＣケモカイン応答を検討した。ＣＴＢまたはマレイミドで活性化したＣＴＢを投与したＰＢＭＣの上清では、同様な濃度のＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳが検出された。同様に、ＣｐＧＯＤＮまたはチオール化したＣｐＧＯＤＮを投与したＰＢＭＣでは、試験したいずれの時点でもこれらのケモカインを同じ濃度で産生した（図１３）。従って、ＣＴＢ（マレイミド活性化）およびＣｐＧＯＤＮ（チオール化）の化学修飾は、ＣＴＢまたはＣｐＧＯＤＮによって誘導されるケモカイン応答に付加的効果を持たなかった。

文献
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増加濃度のＣＴＢ、ＣｐＧＯＤＮ、ＣＴＢとＣｐＧの混合物、またはＣＴＢ：ＣｐＧ接合体でイン・ビトロ刺激した後のネズミ脾臓細胞の増殖応答の２種類の線図。ＣＴＢのマレイミド活性化またはＣｐＧＯＤＮのチオール化は増殖応答に影響を与えないことを示す。ネズミ脾臓細胞を増加濃度のＣＴＢ、マレイミドで活性化したＣＴＢ、ＣｐＧＯＤＮ、またはチオールで修飾したＣｐＧＯＤＮの存在下で７２時間培養した後、細胞を回収し、増殖応答を材料および方法に記載の方法で検討した。データは、賦活指数（ＳＩ）として表す。ネズミ脾臓細胞のＣＴＢ：ＣｐＧＩ、ｒｅｃＣＴＢ、ＣｐＧＯＤＮ、またはｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物で刺激した後のＩＰ−１０の産生を示す図（Ａ）および（Ｂ）。投薬を受けたことのないＣ５７ｂｌ／６マウス由来の脾臓細胞を様々な濃度のＣＴＢ：ＣｐＧＩ、ｒｅｃＣＴＢ、ＣｐＧＯＤＮ、またはｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物の存在下で培養し、上清をＩＰ−１０ＥＬＩＳＡを施した。（ａ）２４時間。（ｂ）４８時間。（データは、２種類の実験の典型的なものである）。ＣＴＢ：ＣｐＧＩ［２０μｇ／ｍｌ］、ｒｅｃＣＴＢ［２０μｇ／ｍｌ］、ＣｐＧＯＤＮ［３．３μｇ／ｍｌ］、またはｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物［２０μｇ／ｍｌ＋３．３μｇ／ｍｌ］の存在下で培養したネズミ脾臓細胞によるＭＩＰ−１αの産生を示す図（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）。データは、平均値と平均値の標準誤差として表す。（ａ）２４時間、（ｂ）４８時間、（ｃ）７２時間。データは、２種類の実験からプールしたものである。ＣＴＢ：ＣｐＧ II［２０μｇ／ｍｌ］、ｒｅｃＣＴＢ［２０μｇ／ｍｌ］、ＣｐＧＯＤＮ［８．０μｇ／ｍｌ］、またはｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物［２０μｇ／ｍｌ＋８．０μｇ／ｍｌ］の存在下で培養したプールした脾臓細胞の増殖からの上清におけるＭＩＰ−１αの産生を示す図（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）。データは、平均値と平均値の標準誤差として表す。（ａ）２４時間、（ｂ）４８時間、（ｃ）７２時間。データは、２種類の実験からプールしたものである。ＣＴＢ：ＣｐＧＩ［２０μｇ／ｍｌ］、ｒｅｃＣＴＢ［２０μｇ／ｍｌ］、ＣｐＧＯＤＮ［３．３μｇ／ｍｌ］、またはｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物［２０μｇ／ｍｌ＋３．３μｇ／ｍｌ］の存在下で培養したネズミ脾臓細胞によるＲＡＮＴＥＳの産生を示す図（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）。データは、平均値と平均値の標準誤差として表す。（ａ）２４時間、（ｂ）４８時間、（ｃ）７２時間。データは、２種類の実験からプールしたものである。ＣＴＢ：ＣｐＧ II［２０μｇ／ｍｌ］、ｒｅｃＣＴＢ［２０μｇ／ｍｌ］、ＣｐＧＯＤＮ［８．０μｇ／ｍｌ］、またはｒｅｃＣＴＢとＣｐＧＯＤＮの混合物［２０μｇ／ｍｌ＋８．０μｇ／ｍｌ］の存在下で培養したネズミ脾臓細胞によるＲＡＮＴＥＳの産生を示す図（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）。データは２種類の実験からプールしたものであり、平均値と平均値の標準誤差として表す。（ａ）２４時間、（ｂ）４８時間、（ｃ）７２時間。ＣｐＧＯＤＮまたはＣＴＢ：ＣｐＧの膣内投与後のマウス膣におけるＣＣケモカイン産生の時間経過を示す３種類の図。投薬を受けたことのないマウスの群には、ＤＰを前投与した。６日後、ＣｐＧＯＤＮまたはＣＴＢ：ＣｐＧを膣内投与し、異なる時点で屠殺した。膣を摘出してサポニン抽出し、ケモカイン含量をＥＬＩＳＡを用いて検討した。データは、ｐｇ／ｍｌ／１０ｍｇ膣として示す。様々な濃度のＣｐＧＯＤＮ、ＣＴＢ、ＣｐＧＯＤＮの混合物、またはＣＴＢ：ＣｐＧの存在下で培養したヒトＰＢＭＣの上清におけるＭＩＰ−１αの産生の時間経過を示す３種類の図。ＣｐＧＯＤＮとＣＴＢの濃度は、接合体で用いた濃度に相当する。ＣＴＢ（１１．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧＯＤＮ（３μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧＯＤＮとＣＴＢの混合物、ＣＴＢ：ＣｐＧ、または非ＣｐＧコントロールＯＤＮ（３μｇ／ｍｌ）の存在下で培養したヒトＰＢＭＣの上清におけるＭＩＰ−１α産生の４種類の図。データは、平均値および平均値の標準誤差として表されている。ＣＴＢ（１１．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧＯＤＮ（３μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧＯＤＮ（３μｇ／ｍｌ）とＣＴＢ（１１．２５μｇ／ｍｌ）の混合物、ＣＴＢ：ＣｐＧ（１１．２５μｇ／ｍｌ）、または非ＣｐＧコントロールＯＤＮ（３μｇ／ｍｌ）と共に培養したヒトＰＢＭＣからの上清のＭＩＰ−１β産生の４種類の図。データは、平均値および平均値の標準誤差として表されている。ＣＴＢ（１１．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧＯＤＮ（３μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧＯＤＮ（３μｇ／ｍｌ）とＣＴＢ（１１．２５μｇ／ｍｌ）の混合物、または非ＣｐＧコントロールＯＤＮ（３μｇ／ｍｌ）の存在下で培養したヒトＰＢＭＣによるＲＡＮＴＥＳ産生の４種類の図。データは、平均値および平均値の標準誤差として表されている。ＣＴＢ（１１．２５μｇ／ｍｌ）、ＣＴＢ−マレイミド（１１．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧＯＤＮ（３μｇ／ｍｌ）、またはチオールＣｐＧＯＤＮ（３μｇ／ｍｌ）の存在下で培養したヒトＰＢＭＣの上清におけるＣＣケモカイン（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳ）の産生の６種類の図。データは、平均値および平均値の標準誤差として表されている。

Claims

コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴＢ）、Escherichia coli熱不安定性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ）、および、分子のＧＭ１ガングリオシド受容体結合活性またはその安定性に有意な影響を及ぼさない構造上の修飾を有するＣＴＢまたはＬＴＢからなる群から選択される哺乳類細胞表面上の特異的受容体に結合するタンパク質に接合した、
少なくとも６個の塩基もしくは塩基対を有し、かつ、天然のホスホジエステル主鎖、ホスホチオエート主鎖、もしくはホスホジエステルおよびはホスホチオエート主鎖のキメラ体を有する、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドから選択された、少なくとも１個のメチル化されていない５’−シトシン，グアニン−３’ジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含む、細胞内で有効な免疫調節核酸成分を含んでなる、二官能性組成物。
哺乳類細胞表面上の特異的受容体に結合するタンパク質が、ＣＴＢまたはＬＴＢである、請求項１に記載の二官能性組成物。
免疫調節核酸成分を、特異抗原と組み合わせて含んでなる、請求項１または２に記載の二官能性組成物。
免疫調節核酸成分が、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および修飾ポリヌクレオチドから選択される、メチル化されていない５’−シトシン，グアニン−３’ジヌクレオチド含有免疫刺激オリゴ−またはポリヌクレオチド（ＩＳＳ）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
ＩＳＳが微生物ゲノムから誘導される、請求項４に記載の組成物。
微生物ゲノムが単純ヘルペスウイルスゲノムである、請求項５に記載の組成物。
ＩＳＳが、５’−プリンプリン（ピリミジン）ＣＧピリミジンピリミジン−3'(5'-PuPu(Py)CGPyPy-3')である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。
ＩＳＳが、5'-GACGTT-3'および5'-GTCGTT-3'から選択される、請求項７に記載の組成物。
特異抗原が合成または天然の病原体由来の抗原、哺乳類の組織に由来する抗原、アレルゲンおよび宿主由来の抗原からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
医薬品として使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二官能性組成物。
腫瘍、感染症、移植拒絶、免疫抑制状態、自己免疫疾患、およびアレルギーの予防または治療処置のための医薬製剤を製造するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の二官能性組成物の使用。
医薬製剤が無抗原であり、且つ哺乳類の上皮腫瘍または非呼吸器系上皮感染症の局所治療を目的とする、請求項１１に記載の使用。
免疫予防、免疫療法、または耐性の誘発のための医薬製剤を製造するための、請求項９に記載の組成物の使用。
請求項９に記載の組成物による抗原提示細胞のエクス・ビボ処理における、請求項９に記載の組成物の使用。
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物を含んでなる医薬製剤であって、哺乳類の腫瘍、感染症、移植拒絶、免疫抑制状態、自己免疫疾患またはアレルギーの予防または治療のための、医薬製剤。
医薬製剤が無抗原であり、治療が哺乳類の上皮腫瘍または非呼吸器系上皮感染症に対するものであり、投与が上記哺乳類の上皮腫瘍または非呼吸器系上皮感染症の部位への局所投与である、請求項１５に記載の医薬製剤。
請求項９に記載の組成物を含んでなる医薬製剤であって、哺乳類における免疫予防、免疫療法または耐性の誘発のための、医薬製剤。
請求項９に記載の組成物を含んでなる、医薬製剤であって、
抗原提示細胞を請求項９に記載の組成物でエクス・ビボ処理した後、ワクチン接種または免疫療法の目的で哺乳類に輸液する方法において用いられる、医薬製剤。