KR101038532B1

KR101038532B1 - 인간 적혈구생성촉진인자(ｈＥＰＯ) 유전자를 내장하는레트로바이러스 발현벡터 및 이에 의해 형질전환된동물세포 및 가금

Info

Publication number: KR101038532B1
Application number: KR1020080063768A
Authority: KR
Inventors: 김태완; 구본철; 권모선
Original assignee: 학교법인 선목학원
Priority date: 2008-07-02
Filing date: 2008-07-02
Publication date: 2011-06-02
Also published as: KR20100003779A

Abstract

본 발명은 사람 혈액의 적혈구생성촉진인자(human erythropoietin)를 코딩하는 유전자의 전이와 발현을 위한 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 이에 의해 형질전환된 가금 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 레트로바이러스 벡터에 의하면 사람의 hEPO 유전자를 효율적으로 전이시켜 여러 동물의 세포와 가금류를 hEPO 유전자를 발현할 수 있도록 효율적으로 형질전환 할 수 있으며, 상기 가금류는 생식선으로도 hEPO 유전자가 전이되어 형질전환 가금의 품종을 확립할 수 있다.

형질전환된 동물세포나 가금류는 독시사이클린에 의해 hEPO의 발현이 조절될 수 있어 생리적인 부작용을 최소화 할 수 있으며, 이를 생체 반응기로 사용하여 hEPO를 경제적으로 대량 생산할 수 있다.

가금, 형질전환, 자기복제-결핍 레트로바이러스(replication-defective retrovirus), 사람의 적혈구생성촉진인자

Description

인간 적혈구생성촉진인자(ｈＥＰＯ) 유전자를 내장하는 레트로바이러스 발현벡터 및 이에 의해 형질전환된 동물세포 및 가금{Retrovirus expression vetor containing hEPO gene and transgenic animal cell and poultry thereby}

사람의 적혈구생성촉진인자(hEPO)는 165 내지 166개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 36kDa의 단량체 당단백질로서 단백질 부분의 분자량은 약 18kDa이다. 천연형 hEPO는 1906년 조혈조절인자의 존재 가능성에 대한 연구를 통해 처음 보고되었으며, 1957년 에리트로포이에틴(erythropoietin)이라 명명되었다. hEPO는 적혈구 조혈작용에 있어 전구세포의 마지막 성숙과 성장을 조절하는 역할을 하는 호르몬으로서 주로 태아의 간이나 성인의 신장에서 생산되며, 혈액내 hEPO량은 저산소 혈중상태에서 증가하여 활발하게 조혈작용을 유도함으로써 성숙한 산소전달 적 혈구 세포의 생산을 조절한다. 특히, 신장이식이나 정기적인 신장투석이 필요한 말기 신부전증 환자들이 신장성 빈혈을 일으키는 가장 주된 원인이 hEPO 생성 결핍임이 입증된 바 있다.

hEPO는 적혈구 세포 형성에 필수적이기 때문에, 이 호르몬은 적혈구 생성이 적거나 결핍되는 것을 특징으로 하는 혈액질환의 치료에 이용될 수 있다. hEPO는 신부전증의 치료동안 또는 이로부터 기인하는 호르몬의 결핍 또는 생산 감소가 원인인 만성 빈혈의 치료에 뛰어난 잠재력을 나타낸다. 그 밖에, HIV-감염환자의 AZT 치료와 관련된 빈혈, 화학치료중인 비골수암 환자의 빈혈 등의 치료에 EPO를 이용할 수 있다.

정상인의 경우 hEPO는 혈액 1ml 당 약 15 내지 30mU, 즉 0.01 mM 수준으로 유지되지만, 재생 불량성 빈혈 등과 같은 질병을 앓고 있는 환자에서는 정상인보다 높은 농도의 hEPO가 생성되므로 이들의 혈액이나 뇨에서 hEPO를 분리 생산하는 방법이 공지되어 있다. 그러나, 뇨로부터 얻어진 hEPO는 정제가 어렵고, 정제된 생성물의 순도가 낮으며 공급량이 제한적이라는 단점이 있어 생명공학 기술에 의해 재조합 hEPO를 제조하는 연구들이 수행되어져 왔다.

재조합 hEPO를 제조하는 기술의 하나는 형질전환 시킨 세포주의 배양을 통해 배양 상등액에서 재조합 hEPO를 얻는 것이다. 우리나라에서도 hEPO 유전자를 클로닝하여 동물세포 및 효모 또는 곤충세포에서 발현시키는 방법들이 개발되어 특허공고 제89-1011호, 제93-5917호 및 공개특허 95-5988호에서 공개된 바 있다. 그러나, 효모 또는 곤충세포는 당화능이 낮아 hEPO와 같은 복합형 당단백질을 생성하지 못하며, 이러한 방법으로 생산된 EPO는 인체내에서 항원성을 유발시킬 문제가 있다. 현재 hEPO의 생산은 주로 동물세포인 CHO(chinese hamster ovary)를 이용하여 이루어지고 있으나 만족스러울 만큼의 안정성과 대량 생산 목표를 달성하지는 못하고 있다.

이러한 목적을 달성하기 위한 또 한가지의 수단으로 EPO 형질전환 동물을 제조하여 이로부터 대량으로 EPO를 생산하고자 하는 시도가 진행되고 있다. 예를 들면, 토끼(쿠바)나 쥐(핀란드, Kuopieogkr 사)에 hEPO cDNA를 도입하여 유선에서 hEPO를 생산하는 형질전환 동물을 제조하였다고 보고한 바있다. 국내에서도 역시 유선(등록특허 358754호)이나 소변(공개특허 10-2003-9936호)을 통해 hEPO를 생산하는 형질전환 돼지와 형질전환 소(공개특허 10-2004-101793호)가 보고되었다. 그러나, 상기 복제동물이 형질전환 되었다는 것은 확인이 되었으나, 유즙 또는 소변 내 hEPO의 농도 및 생산된 hEPO의 활성에 대한 결과가 전혀 없으므로 이러한 방법으로 생산된 hEPO가 실용화될 수 있는지는 전혀 알 수 없었다. 등록특허 769291호에서는 형질전환 생쥐의 유즙 내 hEPO가 200,000~400,000 IU/ml의 고농도로 발현되는 것을 확인하였으나 이는 수유기 1~5일에 한정된 것으로 hEPO를 생산할 수 있는 기간이 짧아 실질적으로 hEPO를 대량생산하는 데 적용하기에는 아직까지 한계가 있다.

최근까지 형질전환 가축의 생산에 관한 연구의 대부분은 주로 소, 돼지, 양, 토끼 그리고 염소 등의 포유류를 대상으로 이루어졌다. 이들의 경우 시간과 비용의 방대한 투자에도 불구하고 경제적인 측면에서 성공적인 형질전환 가축의 생산에 관한 보고는 미비한 실정이다. 이러한 현상은 대부분 포유류들의 긴 세대 간격, 복잡한 생리적 형태적 특징 및 연구에 드는 천문학적인 비용에 기인한다. 한편 가금은 포유류에 비해 성숙 기간과 세대간격이 짧으며 번식능력이 대단히 높기 때문에 형질전환된 가금의 계통성립이 용이하고 비교적 적은 노력과 비용으로 많은 개체를 대상으로 하는 실험이 가능하다는 장점을 가지고 있다(Ivarie, 2003, Trends Biotechnol. 21: 14-19).

그러나, 가금의 경우 포유류와는 달리 수정 시 일어나는 일반적인 다정자침입(polyspermy) 현상(Perry, 1987, J. Anat. 150: 99-109)이나, 수정 후부터 산란 직후까지의 배발생으로 인하여 배발달 X기(stage X, Eyal-Giladi et al., 1976, Dev. Biol. 49: 321-337)에 해당하는 갓 산란한 계란의 배에는 이미 약 60,000여개의 분화전능(pluoripotent)한 세포들이 존재한다(Petitte and Mozdziak, 2002, 29-6 in: Transgenic Animal Technology (edited by C.A. Pinkert, Chapter 11, Academic Press, San Diego). 이러한 형태적, 발생적 특징으로 인해 가금에 있어 포유류의 경우와 동일한 방법으로 외래 유전자를 도입하는 것은 매우 어렵다. 또한 가금의 수란관에서 초기 수정란을 채취하기가 기술적으로 지극히 어려울 뿐만 아니라 산란된 난(卵)의 배는 두꺼운 난각으로 둘러싸여 있기 때문에 포유류에 사용되고 있는 유전자 이식 기술의 적용이 불가능하다. 이렇게 현재까지 가금류의 형질전환은 포유류에 비하여 많은 제한을 갖고 있으며, 그로 인하여 가금류의 형질전환에 의한 유효물질의 생산 또한 아직 많은 연구가 이루어지고 있지는 않다.

형질전환 닭의 생산방법은 외래 유전자를 전이시키고자 하는 표적 세포와 유전자의 전이 방법에 따라 많은 방법이 있을 수 있는데 이 중에서 X기의 배반엽 세포에 레트로바이러스 벡터 시스템을 이용하는 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있다. 상기 retrovirus vector system의 장점은 다른 외래유전자 도입방식에 비해 유전적으로 안정성을 나타내며(Temin, Genome 31:17-22, 1989), 외래 유전자가 표적세포의 genome에 삽입될 때 반복되지 않는 단일 유전자만이 진정염색질 부위 내로 선택적으로 도입될 수 있고, 다양한 종류의 세포에 다양한 종류의 외래유전자를 높은 효율로 감염시킬 수 있다는 점을 들 수 있다(Rohdewohld 등, J. Virol. 61: 336-343, 1987) 그러나 레트로바이러스의 안정적인 대량생산 및 생산된 레트로바이러스의 안전성 및 안정성 확보를 위해 해결해야 할 과제들이 산재되어 있어 아직까지 레트로바이러스를 이용한 형질전환은 극히 제한적으로 이용되고 있다.

형질전환 동물의 생산에 있어서 또 한 가지 문제점은 지속적인 활성을 나타내는 β-actin이나 CMV promoter 등을 사용하여 유전자를 발현시킬 경우 유전자의 발현 시기나 정도가 조절되지 않기 때문에 개체 전체에 걸쳐서 계속적인 외부 유전자의 발현이 이루어짐으로써 생리적인 부작용을 유발하는 경우가 많다는 것이다(Ebert et al., 1988, Mol. Endocrinol. 2: 277-283; Vize et al., 1988, J. Cell Sci. 90:295-300). 특히 EPO는 태아의 조기 사망을 유발하는 것으로 알려져 있어 형질전환 동물의 생산 효율을 저하시킬 우려가 있다. 이에 외래 hEPO 유전자의 발현을 원하는 시기에 효율적으로 발현시킬 수 있다면, 형질전환 동물의 생산 효율을 높일 수 있을 뿐 아니라 생리적인 부작용을 최소화할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명은 전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, hEPO를 고효율로 대량생산할 수 있기 위하여 생물학적 위험성이 낮고 유전자의 전이 및 발현의 조절이 용이한 레트로바이러스 벡터를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 동물세포를 이용하여 hEPO를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 이용하여 동물, 특히 가금류를 형질전환하는 방법 및 그에 의해 형질전환되어 hEPO를 고효율로 발현하는 동물, 특히 가금류를 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 서열번호 1의 재조합 hEPO 유전자를 내장하는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터인 것을 특징으로 한다.

상기 레트로바이러스 벡터로는 ALV (avian leukosis virus), REV (reticuloendotheliosis virus), SNV (spleen necrosis virus) 또는 쥐 백혈병 바이러스(MLV: murine leukemia virus) 시스템 등을 사용할 수 있으며, 감염된 세포 내에서 자유롭게 복제·재생산되어 다른 세포를 감염시키는 문제를 방지하기 위하여 입자 형성과 복제에 관여하는 gag, pol 및 env 유전자가 제거된 복제-결핍 레트로바이러스 시스템을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 가금류의 형질전환에는 동일 조류 레트로바이러스 시스템을 이용하는 경우 스스로 복제가 되지 않는 복제-결핍 바이러스 벡터를 사용한다고 할지라도 전이된 바이러스 벡터와 가금류의 세포에 내재되어 있는 내재성 레트로바이러스(endogenous retrovirus)가 서로 상동성 재조합되어 복제가 가능한 바이러스가 생산되는 생물학적 문제가 나타날 수 있으므로 MVL 유래의 복제-결핍 레트로바이러스인 것이 보다 바람직하다.

본 발명에서 "가금(poultry)"이란 조류 중에서 가축을 말하며, 닭, 오리, 칠면조, 기러기, 메추라기 및 비둘기를 포함한다.

상기 hEPO 발현용 레트로바이러스벡터는 유도물질에 의해 발현 조절이 가능한 것이 바람직하다.

상기 발현 조절을 위해서 ecdysone-regulated gene switch (Saez et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 14512-14517), lac operator-repressor system (Cronin et al., 2001, Genes Dev. 15: 1506-1517), GAL4/UAS system (Wang et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8483-8488) 또는 tetracycline-controlled inducible expression system (Gossen and Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551)을 이용할 수 있다. 상기 발현 조절은 유도물질이 가해지는 조건에서 외래 유전자의 발현이 일어나도록 하거나 혹은 유도물질이 존재하지 않는 조건에서 발현이 유도되도록 할 수 있으나, 개체의 생리적인 부작용의 발생을 최소화하면서 특정 조직과 기관에서 필요한 시기에 국한하여 외래 단백질을 생산할 수 있도록 하기 위하여 유도물질이 첨가되는 조건에 한정하여 외래 유전자가 발현되도록 하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 실시예에서는 발현시키고자 하는 서열번호 1의 hEPO 유전자를 레트로바이러스 벡터 내에서 7개의 TetO operator 서열이 반복되어 있는 부분으로 전사조절인자인 rtTA2^SM2 (Urlinger, S., et al., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 7963~7968) 단백질이 결합하는 부위인 TRE (tetracycline response element) tight와 바로 연결된 miniCMV (cytomegalo virus) promoter의 3'-에 위치하게 하였다. hEPO 유전자의 발현을 최대화하기 위해 우드척 간염 바이러스의 포스트-전사 조절 요소(WPRE: woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element) DNA조각을 hEPO cDNA의 3'-위치에 도입하였다. 또한 WPRE의 3' 위치에 PGK (phosphoglycerate kinase) promoter 및 rtTA2^SM2 유전자를 차례로 도입함으로써 전사 조절 단백질인 rtTA2^SM2와 hEPO의 발현이 한 개의 벡터 내에서 이루어질 수 있도록 하였다(도 1). 이는 기존의 목적유전자의 발현 벡터와 전사조절 유전자인 rtTA 유전자의 발현 벡터가 다른 서로 다른 2개의 플라스미드 벡터로 이루어진 시스템보다 유전자 전달의 효율 면이나 유전자가 전달된 세포나 개체를 선택하는 면 에서 훨씬 더 효율적인 벡터 시스템이라 할 수 있다.

보다 구체적으로, 플라스미드 pGEM-Teasy-hEPO을 BamH I 및 Mlu I으로 차례로 처리하여 hEPO(서열번호 1)가 포함된 DNA 조각을 획득한 후, 플라스미드 pTet2-GWPT를 BamH I과 Mlu I으로 차례로 처리하여 eGFP 조각을 제거한 플라스미드와 ligation 시켜 pTet2-hEPOWPT를 구축하였다. pTet2-hEPOWPT는 hEPO 유전자의 발현이 테트라사이클린(혹은 그 변형체인 독시사이클린)에 의해 유도되게끔 설계되었다. 즉, 외부에서 투여한 테트라사이클린(혹은 그 변형체인 독시사이클린)은 PGK promoter로부터 생산된 rtTA2^SM2와 함께 TRE 부위를 활성화하고 그 결과 miniCMV promoter를 활성화함으로써 최종적으로 EPO 유전자를 발현하게 한다. 플라스미드 pTet2-hEPOWPT의 개열지도는 도 2에 도시된 바와 같다. 이러한 본 발명에 의한 발현용 바이러스 벡터인 Tet2-hEPOWPT를 2008년 5월 28일자로 국제기탁기관인 대전시 유성구 과학로 111 소재의 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 수탁번호 KCTC 11335BP로 기탁하였다.

본 발명의 다른 일양태는 본 발명에 의한 상기 레트로바이러스 벡터에 의해 형질전환된 동물세포에 관한 것이다. 상기 동물세포는 가금류의 동물세포 뿐 아니라, 소, 돼지 또는 쥐와 같은 포유류의 동물세포 또한 포함한다. 보다 구체적으로는 실시예에 기재되어 있는 것과 같은 소의 태아섬유아세포(Bovine Fetal Fibroblast), 닭의 배아섬유아세포(Chicken Fetal Fibroblast), 사람의 세포인 HeLa 세포, 쥐의 세포인 NIH3T3 세포 또는 돼지의 태아섬유아세포(Porcine Fetal Fibroblast)인 것이 바람직하다.

상기 동물세포의 형질전환은 상기 본 발명의 레트로바이러스 벡터를 패키징 세포로 전이 및 발현시켜 수득한 레트로바이러스를 사용하여 수행된다. 본 발명의 실시에서는 레트로바이러스 벡터인 Tet2-hEPOWPT를 PT67 패키징 세포(ClonTech, USA)에 전이 및 발현시키고 형질전환 된 세포를 선별한 후 그로부터 바이러스 스톡을 회수하였다. 상기 바이러스 스톡을 사용하여 GP2-293 세포(ClonTech, USA)에 감염시킨 후 pVSV-G(ClonTech, USA)를 전이 및 발현시켜 고농도의 바이러스 스톡을 얻고, 이를 이용하여 동물세포를 감염시킨 후 형질전환된 세포를 얻었다. 그러나, 이는 동물세포의 형질전환을 위한 일 예일 뿐 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자라면 종래의 레트로바이러스 벡터를 이용한 동물세포의 형질전환 방법 중 적절한 조건을 선정하여 사용할 수 있음은 당연하다.

상기 형질전환된 동물세포의 배양액 중 hEPO의 농도를 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 측정한 결과 모든 동물세포의 배양액에서 hEPO가 발현되며 특히 독시사이클린에 의해 발현이 제어될 수 있음을 확인할 수 있었다. 특히, 형질전환된 닭세포를 독시사이클린 존재하에서 배양한 배양액에서는 약 2,220 IU/ml의 농도로 hEPO가 존재하여 발현량이 가장 높게 나왔으며, 본 발명에 의해 형질전환된 동물세포가 hEPO를 경제적으로 대량생산하는 생체반응기로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다. 상기 모든 동물세포로부터 생산된 hEPO는 모두 생물학적 활성을 가지고 있었으며, 형질전환된 쥐의 세포로부터 생산된 hEPO는 대장균 에서 생산된 것과 유사한 활성을 가졌으나, 그 외의 모든 형질전환 동물세포로부터 생산된 hEPO는 보다 탁월한 생물학적 활성을 나타내었다.

본 발명의 또 다른 일양태는 상기 레트로바이러스 벡터에 의해 형질전환되어 hEPO 유전자를 발현할 수 있으며, 발현 조절이 가능한 것을 특징으로 하는 형질전환 가금에 관한 것이다.

계란에 virus를 주입하고 부화시키는 방법으로는 ex-ovo culture 방법(Petitte and Mozdziak, 2002, Transgenic Animal Technology, second ed., Academic Press, San Diego, 2002, pp. 279-306)을 사용하였다. 닭의 배는 단계 Ⅰ에서 단계 ⅩⅣ까지를 포함하는데, 난할(cleavage) 단계(단계Ⅰ에서 단계Ⅵ), 투명대 형성(formation of the a. pellucida) 단계(단계 Ⅶ에서 단계 Ⅹ) 및 형태 발생(morphogenetic development) 단계(단계 XI에서 단계ⅩⅣ)로 이루어져 있다. 본 발명에서 "배"는 발생 초기 단계로 난생 또는 난태생을 하는 동물에서는 2세포기 부터 개체발생을 마치고 부화(수정막·난막을 가수분해하거나 파괴하고 밖으로 나오는 것)하여 유생(幼生)으로 되기 전까지의 개체를 말하며 형질전환 가금 제작을 위한 바이러스 감염이 이루어지는 시기이다. 본 발명에서 바이러스 입자로 감염시키는 단계는 바람직하게는 난할의 마지막 단계인 Ⅹ기이다. Ⅹ기는 갓 낳은 난 상태로 내배엽 형성의 처음 징후들이 나타나고 배반엽의 후부(posterior region)에서 그물 같은 층을 형성하는 작은 세포들의 무리(cluster)들이 관찰된다.

본 발명의 실시예에서는 총 101개의 계란에 동물세포의 형질전환에 사용한 것과 동일한 재조합 Tet2-hEPOWRT 바이러스를 주입하여 11마리의 병아리를 부화시켰다. 이 중 1주일 이내에 폐사한 2마리를 제외한 9마리의 Go 형질전환 병아리을 시험해 본 결과 모든 Go 병아리의 혈액에서 독시사이클린(테트라사이클린 유도체) 유도에 의해 hEPO가 발현됨을 ELISA 방법으로 확인하였다.

대한민국 등록특허 769291호는 포유동물인 생쥐를 유선특이적인 hEPO 발현 벡터로 형질전환하고 그 결과를 개시하였다. 이 경우 738개의 수정란에 현미미세주입에 의해 발현벡터를 주입하고, 700개의 수정란을 30마리의 대리모에게 이식하여 85마리의 Go 생쥐를 얻었으며, 이 중 9마리가 형질전환 된 것을 확인하였다. 본 발명의 레트로바이러스를 이용한 형질전환에서는 상기 등록특허에 비해 훨씬 효율적으로 형질전환이 이루어진 것을 확인할 수 있다.

또한 본 발명에 의해 형질전환 된 닭(Go)에 도입된 hEPO 유전자는 생식선으로도 전이된 것을 확인하여 다음 세대인 G₁ 세대의 닭에도 유전됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터에 의하면 단순히 형질전환 가금을 제조하는 것이 아니라 hEPO를 발현할 수 있는 형질전환 가금의 품종을 확립할 수 있다.

Go 세대의 형질전환 닭은 조류 고유의 번식생리에 의해 모두 mosaic이다. 즉, 동일 개체 내에서 어떤 부위 혹은 조직에는 hEPO 유전자가 존재하나 다른 부위에는 그 유전자가 존재하지 않는다. 그러나 G₁ 세대부터의 후대의 닭은 생식선을 통하여 형질전환 되기 때문에 hEPO 유전자는 동일 개체의 모든 부위 혹은 조직에 존재하게 된다. 따라서 hEPO 유전자의 발현 효율은 형질전환 된 Go 닭에서 보다 G₁ 혹은 그 후대의 닭에서 훨씬 증가되므로 본 발명의 실시예에 의한 Go 세대의 닭에서 확인된 발현량보다 G₁ 혹은 그 후대에서는 훨씬 많은 양의 hEPO를 발현할 것으로 기대된다.

앞에서 언급한 여러 동물세포에서 생산된 hEPO에서와 같이 형질전환된 닭으로부터 생산된 hEPO 역시 대장균에서 생산된 것보다 다소 높은 생물학적 활성도를 나타내었다.

본 발명의 실시 예에서는 기재하지 않았으나, 본 발명에 의해 형질전환된 가금류가 생산한 알(卵) 역시 hEPO를 함유하고 있을 것으로 기대할 수 있다. 따라서 본 발명에 의해 형질전환된 가금류의 알은 포유동물과는 달리 특유한 hEPO의 공급원으로서 보다 편리하게 이용할 수 있을 것이다.

이상과 같이 본 발명의 레트로바이러스 벡터에 의하면 사람의 hEPO 유전자를 효율적으로 전이시켜 여러 동물의 세포와 가금류를 hEPO 유전자를 발현할 수 있도록 효율적으로 형질전환 할 수 있으며, 상기 가금류는 생식선으로도 hEPO 유전자가 전이되어 형질전환 가금의 품종을 확립할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 테트라사이클린 유도하에 hEPO 단백질이 발현되는 레트로바이러스 벡터 pTet2 - hEPOWPT 의 구축

형질전환 닭의 생산에 사용된 벡터 pTet2-hEPOWPT는 도 1에 도시된 과정에 의해 본 발명자의 연구실에서 구축된 pTet2-GWPT를 기반으로 제작하였다. pTet2-GWPT는 테트라사이클린 유도에 의해 eGFP가 발현되는 벡터로서 LTR (long terminal repeat) sequence 사이에 TRE tight-miniCMV 프로모터, eGFP 유전자, WPRE sequence, PGK 프로모터 및 rtTA2^SM2의 요소들이 순서대로 배열되어 있다.

먼저 전북대학교 cytokine bank에서 구입한 pGEM-Teasy-hEPO를 BamH I과 Mlu I의 제한효소를 차례대로 처리하여 서열번호 1의 hEPO 유전자 조각을 분리하였다.

다음으로 pTet2-GWPT에 제한효소 BamH I 및 Mlu I를 차례로 처리하여 eGFP DNA 조각을 제거한 후 이전단계에서 분리한 hEPO 조각과 ligation 하여 pTet2-hEPOWPT(8949 bp)를 구축하였다. 플라스미드 pTet2-hEPOWPT의 개열지도는 도 2에 도시된 바와 같다.

상기 발현벡터인 pTet2-hEPOWPT는 2008년 5월 28일자로 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁하여 수탁번호 11335BP를 부여받았다.

실시예 2 : Tet2-hEPOWPT 레트로바이러스에 의해 유전자가 전이된 여러 동물세포에서 hEPO의 발현

레트로바이러스 벡터인 pTet2-hEPOWPT를 PT67 패키징 세포(Clontech, USA)에 전이 및 발현하고 G418 (800 ㎍/㎖)이 첨가된 선별용액으로 2주간 배양하였다. G418이 함유된 선별용액에서 살아남은 PT67 세포로부터 수확한 바이러스 스톡을 GP2-293(Clontech, USA) 세포에 감염시켜 G418 (800 ㎍/㎖)이 첨가된 선별용액으로 2주간 선별하였다. 선별된 G418-저항성 GP2-293-Tet2-hEPOWPT 세포를 인산칼슘 방법으로 20 ㎍의 pVSV-G (Clontech, USA)로 전이 및 발현하여 37℃, 5% CO₂조건에서 8시간 배양 후 새 배양액으로 갈아주었다. 48시간이 경과한 후 레트로바이러스를 포함한 배양액을 수확하였다.

수확한 배양액을 0.45 ㎛ 기공 크기의 셀룰로오스 아세테이트 필터를 이용하여 여과한 후, 바이러스가 함유된 배양액으로 소의 태아섬유아세포, 닭의 배아섬유아세포, 사람의 세포인 HeLa 세포, 쥐의 세포인 NIH3T3 세포, 그리고 돼지의 태아섬유아세포를 각각 감염시켰다.

각각의 감염된 세포를 G418 (800 ㎍/㎖)이 첨가된 선별용액으로 2주간 선별 한 다음 선별된 G418-저항성세포에 독시사이클린을 2 ㎍/㎖의 농도로 48시간 처리한 후 배양액을 취하여 배양액 중의 hEPO 농도를 ELISA(enzyme-linked imunosorbent assay) 방법으로 측정하였다. 독시사이클린에 의한 발현 조절을 확인하기 위하여 대조군으로서, 상기 선별된 G418-저항성세포를 독시사이클린이 존재하지 않는 상태에서 48시간 배양하여 hEPO 농도를 함께 측정하였다. ELISA 측정 시스템은 Quantikine^®IVD^®Erythropoietin system (R&D System, USA)을 사용하였으며, 측정한 모든 배양액에서 각각의 세포들이 발현한 hEPO 단백질이 포함되어 있음을 확인하였다(도 3). 도 3의 X 축은 레트로바이러스 벡터인 Tet2-hEPOWPT가 전이된 세포의 종류를 나타내는 것으로서, 소의 태아섬유아세포(BFF), 닭의 배아섬유아세포(CEF), 사람의 세포인 HeLa 세포, 쥐의 세포인 NIH3T3 세포, 그리고 돼지의 태아섬유아세포(PFF)를 의미한다. 도 3에서 확인할 수 있듯이, 모든 동물세포의 배양액에서 hEPO가 발현되었으며, 독시사이클린에 의해 발현이 5.1배에서 최대 73.8배까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 여러 동물 세포 중에서도 특히 닭의 세포인 CEF에서 hEPO가 가장 많이 발현되었으며, 독시사일클린에의한 발현량의 증가(fold induction으로 수치화함) 역시 가장 현저하였다.

실시예 3 : Tet2-hEPOWPT 레트로바이러스에 의해 유전자가 전이된 여러 동물세포에서 생산된 hEPO의 생물학적 활성도 비교

형질전환 여러 동물세포로부터 생산된 hEPO의 생물학적 활성도는 TF-1 세포 의 증식 정도를 측정하여 비교하였다. 먼저 2×10⁵개의 TF-1 세포를 96 well plate의 각 well에 Fetal Calf Serum이 2% 첨가된 50 ㎕의 RPMI 1640과 50 ㎕의 독시사이크린에 의해 발현이 유도된 세포 배양액 혹은 대장균에서 생산한 여러 농도의 hEPO (R&D System, USA)가 혼합된 배양액에 48시간 동안 배양한 후 MTT assay kit인 Cell Proliferation Kit I (Roche, Germany)을 이용하여 생물학적 활성도를 측정하고 그 결과를 도 4에 도시하였다.

그 결과 쥐의 세포인 NIH3T3 세포에서 생산된 hEPO("―△―△―△―"로 표시)는 대장균에서 생산된 rhEPO("●―●―●―"로 표시)와 비슷한 생물학적 활성을 나타내었으나, 이를 제외한 다른 모든 동물세포들에서 생산된 각각의 hEPO들의 생물학적 활성은 대장균에서 생산된 rhEPO에 비해 생물학적 활성도가 현저히 높음을 확인하였다. 도 4에 표시된 범례는 레트로바이러스 벡터인 Tet2-hEPOWPT가 전이된 소의 태아섬유아세포(BFF), 닭의 배아섬유아세포(CEF), 사람의 세포인 HeLa 세포, 쥐의 세포인 NIH3T3 세포, 돼지의 태아섬유아세포(PFF) 및 대조군으로서 대장균(고EPO)에서 생산된 hEPO를 의미한다.

실시예 4 : 레트로바이러스 벡터인 Tet2-hEPOWPT에 의해 hEPO 유전자를 발현하는 형질전환된 닭의 생산

레트로바이러스 벡터인 pTet2-hEPOWPT를 PT67 패키징 세포(Clontech, USA)에 전이 및 발현하여 G418 (800㎍/㎖)이 첨가된 선별용액으로 2주간 배양하였다. G418이 함유된 선별용액에서 살아남은 PT67 세포로부터 수확한 바이러스 스톡을 GP2-293(Clontech, USA) 세포에 감염시켜 G418 (800㎍/㎖)이 첨가된 선별용액으로 2주간 선별하였다. 선별된 G418-저항성 GP2-293-Tet2-hEPOWPT 세포를 인산칼슘 방법으로 20㎍의 pVSV-G (Clontech, USA)로 전이 및 발현하여 37℃, 5% CO2조건에서 8시간 배양 후 새 배양액으로 갈아주었다. 48시간이 경과한 후 레트로바이러스를 포함한 배양액을 수확하였다.

수확한 세포의 배양액 100ml를 4℃에서 16,700rpm으로 90분간 vertical rotor(Beckman 70Ti)를 이용하여 원심분리한 다음, 상등액을 완전히 제거하였다. 얻어진 침전물에 100㎕의 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 첨가하여 4℃에서 16시간 방치한 후 재부유 하였다. 그 결과 약 1,000배로 농축된 바이러스 스톡을 0.45㎛ 기공-크기의 셀룰로오스 아세테이트 필터를 이용하여 여과한 후 -70℃에 보관하여 사용하였다.

계란에 virus를 주입하고 부화시키는 방법으로는 ex-ovo culture 방법 (Petitte and Mozdziak, 2002, Transgenic Animal Technology, second ed., Academic Press, San Diego, 2002, pp. 279-306)을 사용하였다. 즉, Ⅹ기의 난의 내용물을 peptri dish에 옮긴 후 배자에 polybrene(10 ㎍/ml) 이 첨가된 농축된 virus 용액을 5 ㎕ 주입하였다. Virus가 주입 된 계란의 내용물은 다시 지름이 약 33 mm인 구멍이 뚫린 빈 난각에 모두 옮긴 후 비닐 랩으로 구멍을 밀봉하고 37.5℃의 온도와 상대습도 60%의 부화기에 입란하여 3일간 전란시키면서 발생시켰다. 발생 4일째에는 다시 계란의 내용물을 다른 빈 난각에 옮긴 다음 부화때까지 37.5℃ 의 온도와 상대습도 70% 조건하에서 발생시켰다. 발생 19일째부터는 전란은 하지 않으며, 발생 20일 째부터는 병아리가 난각에서 쉽게 나올 수 있게끔 하기 위해 난각을 밀봉하고 있는 비닐 랩을 petridish의 뚜껑으로 대체하였다.

그 결과, 총 101개의 계란에 재조합 Tet2-hEPOWPT virus를 주입하여 11마리의 G0 형질전환 병아리가 부화하였으며, 이들 중 2마리는 부화 후 1주일 경에 폐사하였다.

이들 G0 병아리들로부터 염색체내에 hEPO 유전자가 존재하는지의 여부를 혈액세포의 genome DNA를 분리한 후 PCR을 통해 확인하였다. hEPO 유전자에 특이적인 primer 쌍으로 서열번호 2의 5'-ATGGGGGTGCACGAATGTCC-3' 와 서열번호 3의 5'-TCATCTGTCCCCTGTCCTGCA-3'을 사용하였다. 총 PCR 반응 cycle 수는 35이며 각 cycle 당 혼합액(reaction mixture)을 94℃에서 30초, 54℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초로 반응시켰다. PCR 반응을 위한 혼합액(50 ㎕)은 genomic DNA 100 ng, 10 pmol의 각 primer, 5㎕의 10X PCR buffer (미국의 Promega에서 구입),1.5 mM MgCl₂,각 0.2 mM의 dNTP, 그리고 2.5U의 Taq polymerase(Promega에서 구입)를 혼합하여 준비하였다. 도 5에서 볼 수 있듯이 총 9마리의 병아리 혈액 샘플 모두에서 예정된 582 bp의 증폭된 DNA band를 확인할 수 있었다. 도 5에서 "M"은 molecular size marker, "P"와 "N"은 각각 plasmid pTet2-hEPOWPT와 비형질전환 혈액 샘플의 genomic DNA를 PCR한 것을 나타낸다. 각 lane 위의 숫자는 각 병아리의 고유번호를 의미한다. 대조군으로 닭의 GAPDH(glyceraldehydes phosphate dehydrogenase) 유전 자에 대한 primer 쌍 (5'-TGATGCCCCCATGTTTGTGA-3' (서열번호 4) 과 5'-CAAGAAGGGAACACGCAGGG-3' (서열번호 5)을 사용하였는데 모든 혈액 샘플에서 예정된 691 bp의 band가 나타났다. 이상의 결과로 9 마리 모두의 G0 형질전환 닭에 hEPO 유전자가 전이되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 5 : Go Tet2-hEPOWPT 형질전환 닭에서 독시사이클린에 의한 hEPO 단백질의 발현 제어

이들 9마리의 Go 형질전환 닭들로부터 hEPO 단백질의 발현이 테트라사이클린 유도체인 독시사이클린에 의해 제어됨을 다음과 같은 과정을 거쳐 확인하였다.

먼저 대조군으로 독시사이클린을 처리하기 전 16주가 된 Go 형질전환 닭으로부터 혈액을 채취하였다. 이후, 사료 100 g 당 독시사이클린 50 mg이 포함된 사료를 2주간 급이한 후 혈액을 채혈하였다. 2주 후, 독시사이클린이 첨가되지 않은 정상적인 사료를 급이하면서 2주 후, 그리고 4주 후 형질전환 닭으로부터 혈액을 채취하였다. 각각의 단계에서 채취한 혈액은 원심분리하여 혈액세포들을 제거한 후 혈장에 포함되어 있는 hEPO 단백질을 ELISA 방법으로 정량하여 도 6에 도시하였다. ELISA system은 Quantikine^® IVD^® Erythropoietin system (R&D System, USA)을 사용하였다. 도 6에서 확인할 수 있듯이, 독시 사이클린을 2주간 급이한 직후 hEPO의 발현은 크게 증가하였으며, 독시사이클린 급이를 중단 한 후에는 hEPO의 발현이 시간의 흐름에 따라 현저히 저하하였다. 도 6의 X축 아래의 숫자는 ELISA를 행한 Go 닭의 고유번호이고, Y축의 숫자는 hEPO의 농도(IU/ml)를 나타내며, Doxy는 독시사이클린을 의미한다.

실시예 6 : hEPO 유전자의 생식선으로의 전이 확인

Go Tet2-hEPOWPT 형질전환 닭의 생식선에 hEPO 유전자가 존재하는지의 여부를 수탉 정자의 genomic DNA를 분리한 후 PCR을 통하여 확인하였다. PCR 실험 조건은 앞에서 언급한 실시 예 4 에서 수행한 것과 동일한 조건을 사용하였다. 도 7에서 볼 수 있듯이 총 8마리의 모든 수탉의 정액 샘플 에서 예정된 582 bp의 증폭된 DNA band를 확인할 수 있었다. 도 7에서 "M"은 molecular size marker, "P"와 "N"은 각각 plasmid pTet2-hEPOWPT와 비형질전환 정액 샘플의 genomic DNA를 PCR한 것을 나타낸다. 각 lane 위의 숫자는 각 수탉의 고유번호를 의미한다. 대조군으로 닭의 GAPDH(glyceraldehydes phosphate dehydrogenase) 유전자에 대한 primer 쌍 (5'-TGATGCCCCCATGTTTGTGA-3' (서열번호 4) 과 5'-CAAGAAGGGAACACGCAGGG-3' (서열번호 5)을 사용하였는데 모든 혈액 샘플에서 예정된 691 bp의 band가 나타났다. 이상의 결과로 8 마리 모두의 Go 형질전환 수탉의 생식선에 hEPO 유전자가 전이되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 7 : 형질전환 닭에서 생산된 혈중 hEPO의 생물학적 활성도 비교

세 마리의 Go Tet2-hEPOWPT 형질전환 닭(47번 및 53번)에서 채취한 혈액내 hEPO의 생물학적 활성도는 TF-1 세포의 증식 정도를 측정하여 비교하였다. 먼저 2 ×10⁵개의 TF-1 세포를 96 well plate의 각 well에 Fetal Calf Serum이 2% 첨가된 50 ㎕의 RPMI 1640과, 여러 농도로 희석된 대장균에서 생산된 재조합 hEPO (R&D System, USA) 50 ㎕ 혹은 여러 농도의 hEPO로 희석된 동일한 양(50 ㎕)의 닭의 혈청이 혼합된 배양액에 48시간 동안 배양한 후 MTT assay kit인 Cell Proliferation Kit I (Roche, Germany)을 이용하여 생물학적 활성도를 측정하고 그 결과를 도 8에 도시하였다.

그 결과 47번 및 53번 Tet2-hEPOWPT 형질전환 닭의 혈청에 내재된 hEPO의 생물학적 활성도는 대장균에서 생산된 rhEPO("●―●―●―"로 표시)와 비슷하거나 그 이상의 생물학적 활성을 나타냄을 확인하였다.

도 1은 pTet2-hEPOWPT의 제작 과정을 보여주는 개략 흐름도이다.

도 2는 플라스미드 pTet2-hEPOWPT의 개열지도이다.

도 3은 Tet2-hEPOWPT 레트로바이러스에 의해 유전자가 전이된 여러 동물세포에서 hEPO 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.

도 4는 Tet2-hEPOWPT 레트로바이러스에 의해 유전자가 전이된 여러 동물세포에서 생산된 hEPO의 생물학적 활성도를 보여주는 그래프이다.

도 5는 형질전환 Go 닭에 hEPO 유전자가 전이되었음을 보여주는 PCR 결과 사진이다.

도 6은 형질전환된 닭의 혈중 hEPO의 농도를 보여주는 그래프이다.

도 7는 형질전환된 Go 수탉의 정액내에 hEPO 유전자가 존재함을 보여주는 PCR 결과를 보여주는 사진이다

도 8은 형질전환된 닭의 혈중 hEPO의 생물학적 활성도를 보여주는 그래프이다.

<110> SUN MOK INSTITUTE EDUCATION FOUNDATION <120> Retrovirus expression vetor containing hEPO gene and transgenic animal cell and poultry thereby <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 582 <212> DNA <213> human erythropoietin <400> 1 atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60 ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120 aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180 agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240 atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300 gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360 catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga 420 gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480 actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540 aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 582 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for hEPO <400> 2 atgggggtgc acgaatgtcc 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for hEPO <400> 3 tcatctgtcc cctgtcctgc a 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GAPDH of Gallus Domesticus <400> 4 tgatgccccc atgtttgtga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GAPDH of Gallus Domesticus <400> 5 caagaaggga acacgcaggg 20

Claims

서열번호 1의 재조합 hEPO 유전자를 내장하고, 독시사이클린에 의해 hEPO의 발현이 조절되는 것을 특징으로 하는 hEPO 발현용 레트로바이러스(retrovirus) 벡터.
제 1 항에 있어서,

상기 레트로바이러스 벡터는 쥐 백혈병 바이러스 유래의 복제-결핍 레트로바이러스인 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,

상기 레트로바이러스 벡터는 플라스미드 형태가 pTet2-hEPOWPT(KCTC 11335BP)인 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터.
제 1 항 또는 제 2 항 또는 제 5 항의 레트로바이러스 벡터에 의해 형질전환된 동물세포.
제 6 항에 있어서,

상기 동물세포는 소의 태아섬유아세포, 닭의 배아섬유아세포, HeLa 세포, 쥐의 NIH3T3세포 또는 돼지의 태아섬유아세포인 형질전환된 동물세포.
제 1 항 또는 제 2 항 또는 제 5 항의 레트로바이러스 벡터에 의해 형질전환되어 hEPO 유전자를 발현할 수 있는 형질전환 가금.
제 8 항에 있어서,

상기 가금은 닭, 오리, 칠면조, 기러기, 메추라기 또는 비둘기인 형질전환

가금.