KR101028168B1

KR101028168B1 - 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐

Info

Publication number: KR101028168B1
Application number: KR1020100046165A
Authority: KR
Inventors: 홍운표; 강위수; 선주호
Original assignee: 주식회사엠엠엘바이오테크; 강원대학교산학협력단
Priority date: 2010-05-17
Filing date: 2010-05-17
Publication date: 2011-04-08

Abstract

본 발명은 미세 혈전분해효소 입자가 다당류 및 단백질 중 하나 이상의 피복물질로 피복된 것을 특징으로 하는 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐에 관한 것으로, 경구투여시 위산 및 소화효소에 매우 안정하고 매우 신속하게 장내 흡수가 효과적으로 이루어질 수 있고, 장용성 거동을 나타냄으로서 동일 활성범위에서 더욱 개선된 생체 내 효능효과를 나타낼 수 있으며, 저농도로 경구투여량을 산정할 수 있어 고가인 종래의 경구투여용 혈전용해효소에 비하여 경제적인 효과가 있다.

Description

혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐{NANO-MICROCAPSUL OF FIBRINASE}

본 발명은 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐에 관한 것으로, 경구투여시 위산 및 소화효소에 안정하고 장내 흡수가 신속하여 효능이 강화된 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐에 관한 것이다.

혈전분해효소제의 경우 현재 상용화된 것으로 의약용으로는 주사제 및 경구제로서 유로키나제, 스트렙토키나제, tPA가 있는데 이들은 생체 내 혈전분해효소인 플라스민의 전구체인 플라스미노겐을 활성화시키는 간접적 활성으로서 급성 심근경색, 뇌경색 환자의 혈관을 재개통시키거나 타박에 의한 혈전을 제거시키는 전문의약품 용도로 사용되고 있으며 전신출혈 발생의 위험이 있으므로 의사의 전문적 처방 없이는 상시적 경구투여나 섭취에 의한 혈행관련 질환의 관리에 사용되지는 못한다. 한편, 식품용으로는 일본이나 한국에서 개발된 바실러스 서브틸리스 균 유래의 나토키나제와 대두발효추출 효소, 담자균 유래의 혈전분해효소가 있는데 이들은 모두 혈소판 응집 억제에 의한 혈전 생성 방지 활성과 직접적인 혈전 용해 활성을 동시에 보유하고 있으므로, 급성환자의 혈관재개통 용도와 같은 전문의약품 보다는 예방의학적 관점이나 혈행개선 및 관리 용도의 경구제로서 주로 기능식품 형태로 사용되고 있다.

여러 장점이 있음에도 불구하고 일반적인 경구용 혈전용해효소제가 갖는 가장 큰 단점은 경구투여 시 생체 내에서의 효능 및 생리활성이 미약할 수 있다는 것인데 이는 위액 내 위산 및 소화 효소의 영향으로 혈전분해능이 약화되는 경향이 발생할 수 있기 때문이다. 따라서, 이를 보충하기 위하여 10,000~20,000Fu/g의 고활성 제제를 제조(발효액 대비 0.1% 이하의 농축 효소 분말 획득)해야 하므로 매우 취약한 생산성 및 고가의 가격구조를 지니게 되므로 일반적인 상용화에 따른 시장창출 및 확대가 어렵다는 문제가 있다. 그러나, 현재 국내나 국외에서는 단순히 분리 농축시킨 고농도의 효소분말을 고가에 유통시키는 수준에 머물고 있으며 생체 내 송달 시스템을 안정화시키거나 장용성 코팅을 하거나 하여 생체 내 효능 효과를 극대화시킨 기술은 아직까지 없는 실정이다.

이에 동일 활성 범위 내에서 혈전분해효소의 생체 내 효능을 향상시키기 위해서는 위액 조건에서 비교적 효소활성이 안정하고 장내 용출이 신속한 장용성 미세 캡슐화 기술의 개발이 필요하다.

캡슐화(encapsulation) 기술은 향료, 영양성분, 생리활성 기능물질 등의 불안정한 물질을 빛, 산소, 수분, 온도 등의 외부요인으로부터 보호하여 손실을 줄이고 나아가 식품산업에서 식품첨가물 또는 식품 유용성분을 캡슐화함으로서 식품소재의 산화방지 및 보존성의 향상, 변화하기 쉬운 식품 소재의 안정화, 불필요한 냄새의 차단, 기능성분의 방출속도 조절, 제조공정의 개선 및 물성 향상 등의 장점을 지니고 있다.

미세 캡슐화된 혈전분해효소는 저장 및 유통 시에 물리적, 화학적 안정성을 보유하고 있으며, 생체 내에서 전달시 타겟 전달(target delivery)이나 방출 속도 조절 등을 통하여 우리 몸에 효율적으로 이용되어질 수 있다.

이에 본 발명의 발명자들은 저농도로 경구투여시 인체 내 효능효과가 뛰어나 혈전분해효소의 마이크로 캡슐화에 대하여 예의연구한 결과, 혈전분해효소를 초미분화시키고, 말토덱스트린, 분리 유청 단백질 등의 피복물질을 사용하여 마이크로캡슐화함으로써 인체 내 효능효과가 뛰어난 본 발명을 완성하게 된 것이다.

본 발명은 경구투여시 위산 및 소화효소에 매우 안정하고 신속한 장내 흡수가 효과적으로 이루어지는 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 장용성 거동을 나타냄으로서 동일 활성범위에서 보다 개선된 생체 내 효능효과를 가지는 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 저농도로 경구투여량을 산정할 수 있어 고가인 종래의 경구투여용 혈전용해효소에 비하여 경제적인 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 미세 혈전분해효소 입자가 다당류 및 단백질 중 하나 이상의 피복물질로 피복된 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 미세 혈전분해효소 입자가 목이버섯 유래의 혈전분해효소인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 목이버섯 유래의 혈전분해효소가 목이버섯(Auricularia auricula) 균사체로부터 분리되고, 분자량이 15 ~ 17 KDa이며, 최적 활성 pH가 6.0 ~ 8.0이며, 최적 활성 온도가 20 ~ 40이며, Fe² ⁺에 의해 활성이 증가하고 Ca² ⁺, Co² ⁺, Zn² ⁺, Cu² ⁺, Mg² ⁺, Hg² ⁺ 및 EDTA에 의해 활성이 감소하며, 피브린 및 피브리노겐 분해 활성을 가진 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 미세 혈전분해효소 입자가 분쇄기 자체 냉각 또는 드라이 아이스 냉각하여 미분화된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 다당류가 말토덱스트린인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질이 분리유청단백질(whey protein isolate, WPI)인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 피복물질이 tween 80을 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 산성조건에서는 용해도가 감소하는 반면 중성 조건에서는 용해도가 증가하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 경구투여시 장용성 거동을 나타내는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐 및 그 제조방법에 대하여 자세히 설명하겠다.

본 발명의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐은, 도 1에 도시된 바와 같이, 미세 혈전분해효소 입자가 다당류 및 단백질 중 하나 이상의 피복물질로 피복된 구성을 가지며, 또한, 도 2에 도시된 바와 같은 단계를 거쳐 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 혈전분해효소는 담자균 유래의 혈전분해효소로, 바람직하게는 목이버섯(Auricularia auricula) 균사체 유래의 혈전분해효소이다.

본 발명의 혈전분해효소는 분자량이 15 ~ 17 KDa인 것이 바람직하고 16 kDa인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 혈전분해효소는 최적 활성 pH가 6.0 ~ 9.0의 범위인 것이 바람직하고 pH가 7.0 ~ 8.0의 범위인 것이 더욱 바람직하며, 최적 활성 온도가 15 ~ 45℃의 범위인 것이 바람직하고 온도가 20 ~ 40℃의 범위인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 혈전분해효소는 인공위액에서 비교적 안정하고 Fe² ⁺에 의해 활성이 증가하고 Ca² ⁺, Co² ⁺, Zn² ⁺, Cu²⁺, Mg² ⁺및 Hg² ⁺에 의해 활성이 감소하며, EDTA에 의해 활성이 감소하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 혈전분해효소는 피브리노겐 및 피브린 분해 활성을 가지고, 피브리노겐의 분해에 있어서 a 사슬은 10분 이내에 분해하고, β사슬은 90분 이내 분해하며, γ사슬은 4시간까지 계속 분해하며, 피브린의 분해에 있어서 a와 γ- γ사슬은 10분 이내에 분해하고, β사슬은 120분 이내에 분해하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 혈전분해효소는 시험관내(In Vitro)에서 혈전용해 활성을 가지고, 혈소판 응집 억제능을 가지며, 혈압조절능을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 혈전분해효소는 생체내(In Vivo)에서 혈전용해능, 혈액응집 억제능, 항혈전 효능, 뇌경색 보호효능 및 면역증강 활성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 혈전분해효소는 하기와 같은 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 목이버섯 균사체를 고체 배지에 배양하는 단계;

2) 상기 수득한 효소제 원물을 미분화하는 단계; 및

2) 상기 미분화된 효소제 원물을 분리, 여과, 농축 및 동결건조하는 단계.

상기 목이버섯은 Auricularia auricula MML 118, Auricularia auricula MML 105 및 Auricularia auricula MML-북으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 균주인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 Auricularia auricula MML 118이나, 이에 한정되지 않으며 모든 목이버섯 균주가 사용가능하다.

또한, 본 발명의 혈전분해효소를 고체 배지에서 배양하는 경우, 상기 목이버섯 균사체를 가식성 곡류 배지로서 백미(또는 현미)에 질소원으로서 효모추출물(yeast extract), 카세인 펩톤(casein pepton), 소이 펩톤(soy pepton)을, 이온류로서 MgSO₄7H₂O, K₂HPO₄, KH₂PO₄를, 첨가물로서 분리대두단백(ISP), 탈지분유(Skim milk), 대두, 대두분 등을 일정농도 첨가하여 배양하여 얻을 수 있다. 이때, 배양 조건은 24℃, pH 비조절, 정치 배양, 70% 상대습도 조건을 사용하고, 배양기는 1.2L 균사 배양병을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 이와 같이 얻어진 고상의 혈전분해효소 원물을 미분쇄기를 사용하여 미분화한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 혈전분해효소의 미분쇄시 입자 크기의 축소 및 분쇄 효율을 증대시키기 위하여 분쇄기 자체 냉각, 드라이 아이스 냉각 등의 냉각기술을 적용하여 미분화하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 이와 같이 얻어진 고상의 미분화된 혈전분해효소 원물을 2배량의 무균수에 24시간 저온실에서 침지시킨 후 균질화 시키고 원심분리 또는 감압여과로 고형분을 제거하는 방식으로 수추출물을 얻은 후 한외여과 농축 후 동결건조하여 사용하는 것이 바람직하며, 이때, 한외여과는 먼저 배제분자량 10KDa 막으로 투과액을 얻은 후 다시 1KDa 막으로 농축하는 2단계로 실시하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 4℃ 조건에서 2배량의 무균수에 균질화시키고, 24시간 정치한 후에 원심분리하여 불용성 침전물을 제거하고 얻은 여액을 동결건조하여 수추출 농축된 것을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에서는 이와 같이 제조된 농축 나노화 혈전분해효소를 핵물질로 하여 피복물질과 균일하게 혼합하여 마이크로 캡슐화 제제를 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서 마이크로 캡슐화 방법은 특히 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상 사용되는 방법을 모두 사용할 수 있다. 예를 들면, 압출기(extruder), 분무건조기(spray dryer), 분무형 유동층 건조기(spray typed fluid bed dryer), 과립기, 타정기, 환제조기 등을 사용하여 마이크로 캡슐화 제제를 제조할 수 있다. 구체적으로는, 핵물질인 농축 나노화 혈전분해효소와 피복물질을 혼합한 후, 이 고상의 혼합 물질에 물을 첨가하여 캡슐화 용액을 만든 후 초음파분산기(VCX 750, Sonics&materials, inc., Newtown, USA)를 이용하여 균질화하고, 동결건조를 통해 최종적으로 나노화 혈전 분해효소를 마이크로캡슐화할 수 있다. 이때, 핵물질인 농축 나노화 혈전분해효소와 피복물질은 1:9 또는 9:1의 범위에서 다양한 비율로 혼합하는 것이 바람직하고, 상기 혼합물질과 물은 3:7의 비율로 혼합하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 있어서 상기 피복물질로는 다당류, 단백질 등을 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 기능성 다당류인 말토덱스트린(maltodextrin)과 기능성 단백질인 분리 유청 단백질(whey protein isolate)을 사용할 수 있다. 말토덱스트린은 경제적이며 코팅 효과가 좋아 핵물질의 보호가 뛰어나며 흡습을 방지하는 효과가 좋고 식품에 첨가시 식품의 노화 방지 기능이 있다. 분리 유청 단백질은 단백질의 일종으로 이를 이용하여 캡슐을 만들 시 핵물질을 효과적으로 보호하고 수용액 상에서 잘 분산되는 특징을 가지고 있다. 또한, 피복물질에는 계면활성제 용도로 탄화수소의 소수성 그룹이 섞여 있는 유화제로서 tween을 더욱 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 본 발명의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐은 위액에 매우 안정하면서 장내에서는 신속하게 흡수가 이루어져 저농도로도 인체 내에서 효과적인 효능효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐은 경구투여시 위산 및 소화효소에 매우 안정하고 매우 신속하게 장내 흡수가 효과적으로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐은 장용성 거동을 나타냄으로서 동일 활성범위에서 더욱 개선된 생체 내 효능효과를 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐은 저농도로 경구투여량을 산정할 수 있어 고가인 종래의 경구투여용 혈전용해효소에 비하여 경제적인 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐의 마이크로 코팅공정을 나타내는 개략도이다.
도 3은 본 발명의 혈전분해효소제 원물의 형상을 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명의 혈전분해효소제 원물을 미분화하는 저온 초미분말 미분쇄기((Turbo Mill, Korea Energy Technology, Korea,2)를 나타내는 도이다.
도 5는 본 발명의 혈전분해효소제 원물을 본쇄기 자체 냉각하여 미분화하는 경우를 나타내는 도이다.
도 6은 본 발명의 혈전분해효소제 원물을 드라이 아이스 냉각하여 미분화하는 경우를 나타내는 도이다.
도 7은 본 발명의 혈전분해효소제 원물을 분쇄기 자체냉각하여 미분화한 경우의 입자분포를 나타내는 도이다.
도 8은 본 발명의 혈전분해효소제 원물을 드라이 아이스 냉각하여 미분화한 경우의 입자분포를 나타내는 도이다.
도 9는 본 발명의 혈전분해효소제 원물을 분쇄기 자체냉각 또는 드라이 아이스 냉각하여 미분화한 초미분 입자의 형상을 나타내는 도이다.
도 10은 본 발명의 혈전분해효소제 원물을 분쇄기 자체냉각 또는 드라이 아이스 냉각하여 미분화한 초미분 입자의 전자현미경 사진이다.
도 11은 본 발명의 실시예 1 내지 7의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 조분쇄한 경우의 형상을 나타내는 도이다.
도 12는 본 발명의 혈전분해효소를 입자크기 100㎛로 조분쇄한 경우의 전자현미경 사진이다.
도 13은 본 발명의 혈전분해효소를 입자크기 10㎛로 조분쇄한 경우의 전자현미경 사진이다.
도 14는 본 발명의 실시예 1의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 입자크기 100㎛로 조분쇄한 경우의 전자현미경 사진이다.
도 15는 본 발명의 실시예 1의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 입자크기 10㎛로 조분쇄한 경우 전자현미경 사진이다.
도 16은 본 발명의 실시예 2의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 입자크기 100㎛로 조분쇄한 경우 전자현미경 사진이다.
도 17은 본 발명의 실시예 2의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 입자크기 10㎛로 조분쇄한 경우 전자현미경 사진이다.
도 18은 본 발명의 실시예 3의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 입자크기 100㎛로 조분쇄한 경우 전자현미경 사진이다.
도 19는 본 발명의 실시예 3의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 입자크기 10㎛로 조분쇄한 경우 전자현미경 사진이다.
도 20는 본 발명의 실시예 4의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 입자크기 100㎛로 조분쇄한 경우 전자현미경 사진이다.
도 21은 본 발명의 실시예 4의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 입자크기 10㎛로 조분쇄한 경우 전자현미경 사진이다.
도 22는 본 발명의 실시예 5의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 입자크기 100㎛로 조분쇄한 경우 전자현미경 사진이다.
도 23은 본 발명의 실시예 5의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 입자크기 10㎛로 조분쇄한 경우 전자현미경 사진이다.
도 24는 본 발명의 실시예 6의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 입자크기 100㎛로 조분쇄한 경우 전자현미경 사진이다.
도 25는 본 발명의 실시예 6의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 입자크기 10㎛로 조분쇄한 경우 전자현미경 사진이다.
도 26는 본 발명의 실시예 7의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 입자크기 100㎛로 조분쇄한 경우 전자현미경 사진이다.
도 27는 본 발명의 실시예 7의 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐을 입자크기 10㎛로 조분쇄한 경우 전자현미경 사진이다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시 예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시 예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

제조예 1: 혈전분해효소제 원물의 제조

목이버섯(Auricularia auricula) 균사체를 백미(또는 현미) 99.75%, MgSO₄7H₂O 0.05%, K₂HPO₄ 0.05%, KH₂PO₄0.05%, 분리대두단백(ISP) 0.1%로 이루어진 고체 배양용 배지에서 4주간 배양하여 고상의 혈전분해효소제 원물을 수득하였다. 이때, 배양 조건은 24℃, pH 비조절, 정치 배양, 70% 상대습도 조건을 사용하였으며, 배양기는 1.2L 균사 배양병을 사용하였다. 또한, 살균 및 호화조건은 12시간 침지, 121℃, 60분이었다. 본 제조예에서 수득한 혈전분해효소제 원물의 형상은 도 3에 나타내었다.

제조예 2: 혈전분해효소의 미분화

상기 제조예 1에서 수득한 고상의 혈전분해효소제 원물을 도 4에 도시된 저온 초미분말 미분쇄기(Turbo Mill, Korea Energy Technology, Korea,2)로 미분화하였다. 혈전분해효소 분쇄시 분쇄속도 변화에 따른 최적의 분말을 생산하기 위하여 분쇄기 선속도를 100m/s로 하였으며, 혈전분해 효소 분쇄시 입자 크기의 축소 및 분쇄 효율을 증대시키기 위하여 분쇄기 자체 냉각 및 드라이 아이스 냉각을 적용하여 분쇄하였다.

-분쇄기 자체냉각 : R-22 냉매를 이용하여 분쇄기의 외부온도를 -25~-35℃유지(도 5)

-드라이 아이스 냉각 : 드라이 아이스 입자크기를 0.5~2cm(승화시간=투입시간: 15분)로 파쇄하고, 경제성을 고려하여 효소시료와 1:1로 혼합하여 투입(도 6)

미분쇄 후 분쇄생성물의 입도분포는 입도분석기(Particle Size Analyzer; Malvern Ins. Ltd, Mastersiser - 2000, U. K)를 이용하여 분석하였다(도 7, 8).

분쇄기의 냉각 방법 변화에 따른 입자크기의 변화를 표 1에 나타내었는데, 표 1에 나타난 바와 같이, 분쇄기 자체 냉매를 이용하여 분쇄시 d_(0.1), d_(0.9)의 값이 각각 0.533㎛, 2.325㎛이었으며, 드라이아이스를 이용하여 분쇄하였을 경우 d_(0.1), d_(0.9)의 값이 각각 0.662㎛, 2.103㎛로 나타났다. 이로부터 온도 차이가 미세 입자의 분쇄에 크게 영향을 주지 못하지만 드라이아이스의 사용으로 인하여 내부온도 감소로 인해 경도 차이가 생겨 d_(0.9)에서 분쇄 입자가 다소 줄어든 것으로 판단되었다.

	냉각 방법
	자체냉각	드라이 아이스 냉각
d_(0.1)(㎛)	0.533	0.662
d_(0.5)(㎛)	0.810	0.819
d_(0.9)(㎛)	2.325	2.103

또한, 초미분말 미분쇄기로 분쇄한 혈전분해 효소의 형태는 도 9에 나타난 바와 같으며, 분쇄된 공시재료에 전계방사형주사전자현미경(Field Emission Scanning Electron Microscope, S4300, HITACHI, Japan)을 사용하여 관찰한 결과는 도 10에 나타난 바와 같다.

실시예 1 내지 7 : 미세 혈전분해효소의 장용성 마이크로 캡슐화

상기 제조예 2에서 제조된 미분화된 혈전분해효소를 4℃ 조건에서 2배량의 무균수에 균질화시키고, 24시간 정치한 후에 원심분리하여 불용성 침전물을 제거하고 얻은 여액을 동결건조하여, 마이크로 코팅에 사용할 수추출 농축 혈전분해효소를 제조하였다. 코팅에 사용될 농축 나노화 혈전분해효소는 약 16,000 fu/g 정도의 활성을 나타내었다.

피복물질로는 기능성 다당류인 말토덱스트린(maltodextrin, MD), 기능성 단백질인 분리유청단백질(whey protein isolate, WPI) 및 tween 80을 사용하였다.

핵 물질인 농축 나노화 혈전 분해효소와 피복 물질의 비율은 1:9로 혼합하였으며, 이때 피복물질은 하기 표 2에 기재된 혼합비대로 제조한 것을 사용하였다. 이 고상의 혼합 물질에 물을 3 : 7의 비율로 첨가하여 캡슐화 용액을 만든 후, 초음파분산기(VCX 750, Sonics&materials, inc., Newtown, USA)를 이용하여 균질화하였으며, 동결건조를 통해 최종적으로 나노화 혈전분해효소를 마이크로 캡슐화하였다.

	피복물질	혼합비
실시예 1	MD	10 : 0
실시예 2	MD : Tween 80	8 : 2
실시예 3	MD : Tween 80	9 : 1
실시예 4	MD : WPI	8 : 2
실시예 5	MD : WPI	9 : 1
실시예 6	MD : WPI : Tween 80	8 : 1 : 1
실시예 7	MD : WPI : Tween 80	7 : 2 : 1

실험예 1 : 나노화 혈전분해효소 마이크로캡슐제제의 형상

본 발명의 실시예 1 내지 7에서 제조한 마이크로 혈전분해효소를 조분쇄하여 그 형상을 관찰하였다(도 11). 또한, 상기 조분쇄한 마이크로캡슐화 혈전분해효소 제제의 성상 확인을 위하여 전계방사형 주사전자현미경(Field Emission Scanning Electron Microscope, S4300, HITACHI, Japan)을 사용하여 형태를 관찰하였다(도 12 내지 도 27).

도 12 내지 도 27에 의하면, 피복물질에 따라 생성된 입자의 모양이 다르게 관찰되었다. 이로부터 MD, WPI, tween과 같은 물질이 코팅역할을 하고 있으며, 이로 인하여 혈전분해효소 제제의 물성에도 변화가 발생할 수 있음을 보여준다고 판단되었다. 또한, 미세코팅의 재료로 사용된 MD나 WPI 매트릭스 내부에는 미세 혈전분해효소 물질이 결합 및 분산되어 있을 것으로 추정되었으며, 이러한 미세코팅 상태는 공기 중에서의 함습을 방지하여 주고, 생체 내 위액 조건에서는 효소물질의 활성을 안정하게 유지시켜 주는 작용을 할 수 있을 것으로 판단되었다.

한편, 코팅 소재가 다당류와 단백질 성분임을 고려할 때, 방출 특성에 있어서는 극산성의 조건에서는 코팅기제의 용해도가 감소되어 제제의 형태를 그대로 유지하고 중성 근처의 조건에서는 용해도가 증가하여 장내 용출의 방출특성을 지니게 되는 것을 기대할 수 있다고 판단되었다.

실험예 2: 나노화 혈전분해효소 마이크로캡슐제제의 제타-포텐셜( zeta - potential )

본 발명의 실시예 1 내지 7의 마이크로 코팅제제의 수용액 상에서의 제타-포텐셜을 pH를 달리하여 가면서 측정하였다.

수용액 상에서 입자 표면은 + 또는 - 전하로 하전되어 있는데, 반대전하를 띤 이온들이 고농도로 결합하는 고정층과, 같은 전하와 반대전하의 이온들이 균형을 이루고 함께 존재하는 이온확산층의 2중층 구조를 형성하게 된다. 이때 입자에 가까운 쪽의 고정층은 입자와 함께 거동하는 특성을 나타내고, 이온확산층은 용매와 함께 거동하는 특성을 나타내게 된다. 고정층과 이온확산층 사이에 존재하고 있는 미끄러지는 경계면 근처의 전하를 측정한 것이 제타-포텐셜인데, 같은 전하로 하전된 입자사이의 척력 또는 반발력의 척도가 되고 있다. 일반적으로, + 또는 - 전하와 관계없이 제타-포텐셜의 절대값이 클수록 입자간 반발력이 커지고 분산성이 좋아지는 반면에, 제타-포텐셜의 절대값이 낮아질수록 입자간의 응집 및 침전현상이 발생할 수 있다.

본 발명의 실시예 1 내지 7의 마이크로코팅된 혈전분해효소제의 pH변화에 따른 제타-포텐셜값을 도 28에 나타내었다.

도 28에 의하면, 본 발명의 실시예 1 내지 7은 모두 산성의 조건에서는 제타-포텐셜의 절대값이 낮은 반면 중성 및 알칼리 조건에서는 제타-포텐셜의 절대값이 증가하는 경향을 나타내고 있었다. 이것은 산성의 조건에서는 - 전하를 띤 이온량이 적으므로 코팅체 입자의 제타-포텐셜값이 낮아 코팅입자는 응집된 상태로 존재하지만, pH가 증가할수록 2중층의 경계면에 OH^-이온의 하전된 전하량이 증가하게 되어, 중성 및 알카리성 조건에서는 입자간의 척력이 강해지고 분산성이 높아지는 것을 나타내는 것이라 판단되었다.

이러한 본 발명의 실시예 1 내지 7의 제타-포텐셜의 분석 결과로부터, 마이크로캡슐화된 혈전분해효소제의 경구투여시 강산성의 위액 조건에서는 코팅 효소제는 응집하여 낮은 용해도 특성을 나타내어 효소물질의 방출을 억제하는 반면에, 중성 pH의 장에 도달하면 입자간 분산성이 높아져 높은 용해도 특성을 나타내어 신속하게 용출됨으로서 장용성 제제가 갖추어야 할 이론적인 방출거동 특성을 정확하게 보유하고 있다고 평가할 수 있었다. 또한, 상기 실시예 1 내지 7 중에서 분리 유청 단백질보다는 말토덱스트린을 피복물질로 한 코팅제에서의 장용성 거동이 약간 더 좋을 것으로 예측되었다.

<혈전분해효소의 효소활성 측정방법>

혈전분해효소제의 효소 활성은 Fibrinolytic activity(FU/ml)로서 다음과 같이 측정하였다.

① 인산 나트륨 완충액(sodium phosphate buffer, pH 7.4) 1.4ml와 동일 버퍼에 녹인 0.5% 피브리노겐 용액을 혼합한 후, 37℃ 수조에서 5분간 가온한 후 트롬빈 용액 0.1ml를 첨가하고 10분간 동 수조에서 방치하여 혈전을 생성시켰다.

② 시료용액 100㎕를 첨가하여 60분간 동일 수조에서 반응시켰으며, 이때 20분 간격으로 격렬하게 교반을 가해주었다.

③ TCA 용액 2ml을 가하여 반응을 정지시킨 후 20분간 동일 수조에서 방치 후에 15,000rpm에서 5분간 원심분리하여 여액을 채취 후 275nm에서 흡광도를 측정하였다.

④ 이때, 대조구로는 미리 동량의 TCA 용액을 가하고 시료를 첨가한 것을 동법에 따라 사용하였다.

⑤ 각 시료의 활성은 시료 1ml가 1분간 0.01의 흡광도 증가를 가져오는 활성으로 정의하였다.

실험예 3: 나노화 혈전분해효소제의 활성 평가

본 실험예에서는 상기 본 발명의 제조예 2에서 제조된 미분화 혈전분해효소제에 대하여 상기 혈전분해효소의 효소활성 측정방법으로 효소 활성을 측정하여 미분체화 공정 중에 효소 실활 현상이 발생할 수 있는지를 관찰하였다.

	냉각방식	입자 크기(㎛)	효소 활성(Fu/g)
원물	-	-	200
d_(0.1)()	자체냉각	0.533	240
d_(0.1)()	Dry ice 냉각	0.662	230
d_(0.5)()	자체냉각	0.810	220
d_(0.5)()	Dry ice 냉각	0.819	235
d_(0.9)()	자체냉각	2.325	225
d_(0.9)()	Dry ice 냉각	2.103	230

상기 표 3에 의하면, 일반적인 소형 조리용 믹서(food mixer)나 건식분쇄기를 이용하여 조분쇄한 시료와 비교시, 효소활성의 감소 경향은 없었으며 약간 증가하는 경향을 나타냈다. 이에 미분화시킨 시료의 경우 동일한 추출 조건에서 효소 성분의 용출이 보다 용이한 것으로 판단되었다.

실험예 4: 나노화 혈전분해효소 마이크로캡슐제제의 인공 위액 내에서의 효소활성 안정성

본 실험예에서는 상기 실시예 1 내지 7의 마이크로코팅 효소제를 pH 2.4의 인공위액 조건에서 노출시킨 후 혈전분해 효소 활성을 측정하여, 위액 조건 중에서의 효소활성의 안정성을 검토하였다.

인공위액 조건은 식품 붕해도 시험 상의 인공위액 조건을 사용하였으며(염화나트륨 2.0 g, 묽은 염산 24.0 mL /L, pH 1.2), 위 수축 운동을 고려하여 분당 100회의 왕복운동을 실시하였고, 노출시간은 위를 통과하는 시간을 고려하여 3시간으로 하였다.

대조구 시료로는 농축 혈전분해효소 원물(16,000fu/g)을 1/10로 희석시켜 활성을 비교하였다.

모든 시료액은 인공위액 조건 노출 후에 pH를 7.0으로 재조정 후 효소활성을 상기 혈전분해효소의 효소활성 측정방법에 따라 측정하였다.

혼합비	효소 활성
혼합비	반응 전 (Fu/g)	반응 후	효소 안정성
농축 혈전분해효소 원물	1,600	920	57.5
실시예 1		1,150	71.2
실시예 2		1,200	75.0
실시예 3		1,200	75.0
실시예 4		1,300	81.3
실시예 5		1,250	78.1
실시예 6		1,350	84.4
실시예 7		1,390	86.9

상기 표 4에 나타나는 바와 같이, 농축 혈전분해효소 원물의 경우 강산성의 인공위액 조건에 노출 시킨 후 효소활성은 반응 전에 비교하여 57.5%로 감소하는 경향을 나타냈다. 한편, 본 발명의 실시예 1 내지 7에서 제조된 마이크로 코팅 효소제의 경우에는 전반적으로 효소 활성의 감소치가 감소되어 활성의 안정성이 개선되는 경향을 나타내었다. 강산성의 위액 조건에서 활성의 안정성이 상대적으로 증가한 것은 사용된 코팅제가 산성의 수용액 상태에서 결정 상태를 유지하는 효과와 pH와 관련한 단백질 성분의 완충작용에 의한 것으로 판단되며, 실제 생체 내 경구투여 시에 효소활성의 안정화에 크게 기여할 수 있을 것으로 판단되었다.

실험예 5: 나노화 혈전분해효소 마이크로캡슐제제의 인공 장액 내 용출성 평가

본 실험예에서는 마이크로 코팅된 혈전분해효소제의 장내 조건에서의 용출성을 인공장액 용액(pH 6.80. 2N 인산이수소칼륨시액 250 mL, 0.2N 수산화나트륨시액 118 mL/L)을 사용하여 관찰하였다.

상기 실시예 1 내지 7의 마이크로 코팅 효소제를 10% 농도로 인공장액 용액에 투입한 후 장내 연동운동 조건을 고려하여 분당 100회 회전진탕하였으며 20분 단위로 상층 액을 취하여 효소 활성의 검출 정도를 관찰하였다. 효소의 활성을 상기 혈전분해효소의 효소활성 측정방법에 따라 측정하여, 인공장액조건에서의 효소활성의 용출성을 표 5에 나타내었다.

	검출시간대(min) 별 효소 활성(Fu/ml)
	반응 전 보유활성	20	40	60	80
농축 혈전분해효소 원물	160	155	160	160	160
실시예 1		80	110	115	140
실시예 2		94	124	145	160
실시예 3		92	114	139	160
실시예 4		140	160	160	160
실시예 5		135	160	160	160
실시예 6		138	150	160	160
실시예 7		150	160	160	160

상기 표 5에 나타나는 바와 같이, 수용성이 강한 코팅되지 않은 효소 원물과 마이크로 코팅한 혈전분해효소제 활성의 장액 조건에서의 용출성을 비교한 결과, 실시예 1 내지 7의 각 마이크로 코팅제의 용출성은 초기에는 약간 감소하는 경향을 나타냈다. 또한, MD단독으로 코팅된 경우보다는 Tween 80, WPI가 혼합 사용된 코팅제의 용출성이 증가되는 경향을 나타내었으며 원물효소제와 거의 유사한 용출 특성을 나타내었다. 이와 같이 pH 6.8의 장액 조건에서 원물 효소제와 동일한(신속한) 용출특성이 관찰됨으로서, 마이크로 코팅 혈전분해효소제의 생체 내 경구 투여 시에 위액 조건을 견뎌내고 장내에 도달한 혈전분해효소는 신속히 용출됨으로서 혈전생성억제, 혈압 조절, 혈전용해와 관련한 생체 내 효능 발휘가 보다 강화될 수 있을 것으로 판단되었다.

실험예 6: 나노화 혈전분해효소 마이크로캡슐제제의 가속시험 안정성 평가

본 실험예에서는 마이크로 코팅된 혈전분해효소제의 장기간 유통시 효소 활성의 안정성을 검토하기 위하여 가속시험 안정성을 평가하였다.

상기 실시예 1 내지 7의 코팅 효소제는 100g 단위로 Al 파우치 포장지에 소분 밀봉포장하였으며, 40℃, 상대습도 70% 조건에서 2주 간격으로 효소활성을 농축 혈전분해효소 원물과 비교 측정하여 효소활성의 안정성에 관련한 개선 효과를 관찰하였다.

	검출시간대(min) 별 효소 활성(Fu/g)
	0	2	4	6	8
농축 혈전분해효소 원물	1600	1,510	1,450	1,440	1,350
실시예 1		1,520	1,440	1,410	1,410
실시예 2		1,490	1,440	1,330	1,340
실시예 3		1,510	1,470	1,450	1,350
실시예 4		1,540	1,500	1,430	1,400
실시예 5		1,560	1,500	1,450	1,400
실시예 6		1,550	1,440	1,400	1,410
실시예 7		1,500	1,450	1,330	1,340

상기 표 6에 의하면, 가속시험 조건에서 마이크로코팅된 혈전분해효소제는 비코팅된 원물 효소제와 유사하거나 약간 개선된 안정성을 발휘하였다. 본 발명의 혈전용해효소제는 효소활성의 최적온도는 체온 근처이며, 55℃수준까지 효소활성이 안정되어 있는 효소제로서 가속시험 조건에서의 급속한 활성감소 현상은 없었으며, 마이크로 코팅 효소제의 경우에는 이러한 원물 효소제의 안정성 특성을 그대로 유지하고 있거나 개선된 결과를 나타내고 있음을 볼 수 있었다.

이상 종합하면, 본 발명의 미분체화 후 마이크로 코팅된 각각의 혈전분해효소제들은 전체적으로 원물 효소제에 비교하여 인공 위액 조건에서 효소활성이 보다 안정적으로 유지되었으며, 인공 장액조건에서는 신속한 용출 특성을 나타내었으며, 온도에 비교적 안정한 원물 효소의 특성을 그대로 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

미세 혈전분해효소 입자가 말토덱스트린 및 분리유청단백질(whey protein isolate, WPI)로 피복된 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐로서,
산성조건에서는 용해도가 감소하는 반면 중성 조건에서는 용해도가 증가하여 경구투여시 장용성 거동을 나타내고,
상기 미세 혈전분해효소 입자는,
백미 또는 현미 99.75중량%, MgSO₄7H₂O 0.05중량%, K₂HPO₄0.05중량%, KH₂PO₄0.05중량% 및 분리대두단백(ISP) 0.1중량%로 이루어진 고체 배양용 배지에서 목이버섯(Auricularia auricula) 균사체를 배양함으로써 수득된 고상의 혈전분해효소제 원물을 분쇄기 자체 냉각 또는 드라이 아이스 냉각하여 미분화되어 0.5㎛ ~ 2.5㎛의 입자크기를 가지는 것을 특징으로 하는 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐.
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제1항에 있어서,
상기 혈전분해효소는 분자량이 15 ~ 17 KDa이며, 최적 활성 pH가 6.0 ~ 8.0이며, 최적 활성 온도가 20 ~ 40℃이며, Fe²⁺에 의해 활성이 증가하고 Ca²⁺, Co²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺, Mg²⁺, Hg²⁺ 및 EDTA에 의해 활성이 감소하며, 피브린 및 피브리노겐 분해 활성을 가진 것을 특징으로 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐.
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제1항에 있어서,
상기 미세 혈전분해효소 입자가 tween 80으로 더욱 피복된 것을 특징으로 하는 혈전분해효소의 나노 마이크로 캡슐.
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