KR101026502B1 - 마이크로ｒｎａ 안티센스 ｐｎａ, 그를 포함하는 조성물, 및 그의 사용 및 평가 방법 - Google Patents

마이크로ｒｎａ 안티센스 ｐｎａ, 그를 포함하는 조성물, 및 그의 사용 및 평가 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마이크로RNA(microRNA)의 활성이나 기능을 억제할 수 있는 펩타이드 핵산(PNA), 그를 포함하는 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하기 위한 조성물, 그를 이용하여 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하는 방법 및 그의 효과를 평가하는 방법에 관한 것으로서, DNA 및 RNA 보다 높은 강도와 특이성 및 민감도로 DNA 및 RNA와 상보적으로 결합하며, 핵산분해효소, 단백질분해효소 등의 생물학적 분해효소에 대해 안정성이 뛰어날 뿐만 아니라, pH 및 열과 같은 화학적 조건에 대한 안정성이 뛰어난 PNA를 사용함으로써, 기존의 안티센스 DNA 및 RNA 보다 훨씬 빠른 시간에 안티센스 효과를 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 내에서 오랫동안 안티센스 효과를 지속시킬 수 있다.
마이크로RNA, 안티센스, PNA, 세포 투과 단백질, Tat 펩타이드, 형질도입

Description

마이크로ＲＮＡ 안티센스 ＰＮＡ, 그를 포함하는 조성물, 및 그의 사용 및 평가 방법{MicroRNA antisense PNAs, compositions comprising the same, and methods for using and evaluating the same}
본 발명은 마이크로RNA 안티센스 PNA((microRNA antisense PNA), 그를 포함하는 조성물, 및 그의 사용 및 평가 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, siRNA(small interfering RNA)로 알려진 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제할 수 있는 마이크로RNA에 대한 안티센스 PNA, 그를 포함하는 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하기 위한 조성물, 그를 이용하여 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하는 방법 및 그의 효과를 평가하는 방법에 관한 것이다.
1993년 캐노랍디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans)에서 발생시기를 조절하는 일부 유전자가 밝혀졌는데, 이들 중 let-7과 lin-4는 단백질을 생산하지 않는 작은 RNA 조각(non-coding RNA)으로 밝혀졌다. 이 RNA들은 특정 발생단계에서 발현되어 발생을 조절한다고 하여 stRNA(small temporal RNA)라고 통칭되었다. 마이크로RNA는 21-25 뉴클레오타이드의 단일쇄(single-stranded) RNA 분자로서, 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 것으로, 특정 유전자의 mRNA 3' UTR(untranslated region)에 결합하여 유전자의 번역과정을 억제하는 것으로 알려져 있다. 실질적으로 동물에서 연구된 모든 마이크로RNA들은 특정 유전자의 mRNA 농도에 영향을 주지 않으면서 단백질 발현량을 감소시킨다. 또한 마이크로RNA는 RISC(RNA-induced silencing complex)에 연결되어 특정 mRNA에 상보적으로 결합하지만, 마이크로RNA 중앙 부분은 미스매치(mismatch)로 남아있어 기존의 siRNA와는 달리 mRNA를 분해하지 않는다. 동물 마이크로RNA과는 달리, 식물 마이크로RNA는 표적 mRNA와 완전히 일치(perfect match)하여 mRNA 분해를 유도함으로써 RNA 간섭현상을 유도한다. 몇몇 식물 마이크로RNA는 동물 마이크로RNA와 같이 번역 조절에 관여하기도 한다. 또 다른 연구는 동식물을 포함한 효모에서 마이크로RNA가 염색질(chromatin)의 메틸화를 유도함으로써 전사억제에 관여한다는 증거를 제시하고 있다. 이러한 마이크로RNA 중 일부는 종간의 보존도가 매우 높아, 이들이 중요한 생명현상에 관여하리라는 추측을 가능케 한다.
마이크로RNA는 두 단계의 과정으로 생성되는데, 최초의 마이크로RNA 전사체(primary miRNA/pri-miRNA)가 핵 내에서 드로샤(Drosha)라는 RNaseⅢ 타입 효소에 의해 70-90 뉴클레오타이드 정도의 스템-루프(stem-loop) 구조의 pre-miRNA로 만들어지고, 이후 pre-miRNA는 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)라는 효소에 의해 절단되어 21-25 뉴클레오타이드의 성숙 마이크로RNA(mature microRNA)로 만들어진다. 최근까지 많은 연구진들에 의해 마이크로RNA가 암세포와 간세포(stem cell)에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 세포증식, 세포분화, 세포사멸 및 지방 대사 조절 등에서 중요한 작용을 하는 것으로 밝혀졌다. 그러나 아직까지 마이크로RNA의 많은 기능이 밝혀지지 않고 있어 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
현재 마이크로RNA에 대한 연구는 리포터(reporter) 유전자의 분석, 마이크로어레이(Microarray), 노던 블랏(Northern blot), 실시간 PCR(real-time polymerase chain reaction) 등을 이용하여 발현양상을 조사하거나, 안티센스 DNA나 RNA를 이용하여 이루어져 왔다(문헌 [Boutla A, Delidakis C, and Tabler M. (2003) Developmental defects by antisense-mediated inactivation of micro-RNAs 2 and 13 in Drosophila and the identification of putative target genes. Nucleic Acids Res. 31(17):4973-4980]). 최근에는 메틸기로 인해 RNA보다 더 RNA에 대한 결합력이 높고 핵산분해효소에 안정적인 2'-O-메틸(2'-O-Me) RNA나, 2'-O-Me 보다 더 높은 결합력을 가진 2'-O-메톡시 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 마이크로RNA에 대한 안티센스로 사용하기도 하였다(문헌 [Weiler J, Hunziker J and Hall J. (2006) Anti-miRNA oligonucleotides (AMOs): ammunition to target miRNAs implicated in human disease? Gene Therapy 13:496-502]). 또한 핵산분해효소에 의해 분해되기 쉬운 DNA의 결점을 보완하기 위하여, LNA(Locked Nucleic Acid)를 DNA와 혼합한 올리고뉴클레오타이드를 사용하기도 하는데, 이들은 DNA보다 민감성과 선택성이 뛰어난 것으로 알려져 있다(문헌 [Cha J A, Krichevsky A M and Kosik K S. (2005) microRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res. 65:6029-6033]). 더불어 콜레스테롤이 결합된 RNA 유사물질(antagomir)을 합성하여 마이크로RNA의 기능을 조사하는 연구가 수행된 바 있다(문헌 [Krutzfeldt J, Rajewsky N, Braich R, Rajeev K G, Tuschl T, Manoharan M and Stoffel M. (2005) Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature 438:685-689]). 이들은 마이크로RNA에 대한 안티센스로서, 마이크로RNA의 기능을 차단하여 그 기능을 수행하는데, 이는 마이크로RNA의 기능연구에 있어서 매우 중요하다.
상기한 바와 같이, DNA와 RNA의 결점을 극복하기 위하여, LNA나 2-O-메틸 올리고뉴클레오타이드 등과 같이 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드가 사용되었으나, 이들은 세포 내에서 여전히 엔도뉴클레아제(endo-nucelase)나 엑소뉴클레아제(exo-nuclease)에 의해 분해되거나, 변형으로 인해 특이성이 저하되거나 세포 내 독성을 야기하는 등의 문제가 있다(문헌 [Crinelli R, Bianchi M, Gentilini L, and Magnani M. (2002) Design and characterization of decoy oligonucleotides containing locked nucleic acids. Nucleic Acids Res. 30(11):2435-2443] 및 문헌 [Hutvagner G, Simard MJ, Mello C C, Zamore P D. Hutvagner G, Simard M J, Mello C C, and Zamore P D. (2004) Sequence-specific inhibition of small RNA function. PLoS Biol. 2(4):E98]). 따라서 마이크로RNA의 기능을 차단하는 보다 효율적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 개발이 필요하다.
한편, PNA(Peptide Nucleic Acids)는 DNA와 구조가 유사한 고분자 화학물질로, DNA 및 RNA와 결합할 수 있는 단백질 형태를 한 핵산이다(Nielsen P E, Buchardt O, Egholm M, Berg R H, US Patent 5,539,082, Peptide nucleic acids). PNA의 기본 백본(backbone)은 폴리펩타이드 구조를 형성하고 있다(도 1). DNA가 인산기에 의해 음성전기를 띠고 있는 반면, PNA는 펩타이드 결합에 의해 전기적으 로 중성이다. 기존에 알려진 핵산분해효소들은 PNA의 구조를 인식하지 못하기 때문에, PNA는 생체 내에서 핵산분해효소에 의해 분해되지 않아 높은 안정성을 갖는다. 그밖에도, PNA는 여러 가지 장점을 갖는데, DNA 및 RNA와 높은 결합력을 가지며, 필요에 따라 형광물질을 부착하거나 이온을 결합시켜 용해도를 증가시키기가 용이하며, 단 하나의 염기서열 차이가 있어도 전체 유전체에서 검출할 수 있을 정도의 특이성을 가지고, 펩타이드를 결합함으로써 새로운 기능을 도입할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 이러한 장점을 토대로, PNA는 유전병을 일으키는 돌연변이의 추적이나 병원성 세균 및 바이러스 감염의 초기 진단 수단으로, 암세포 억제 연구, 병원미생물학, 바이러스학 등에서 폭넓게 응용될 수 있다. 아울러, 지난 몇 년 동안 PNA를 이용한 안티센스 개발에 관한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 그러나, 마이크로RNA에 대한 안티센스로서 PNA를 이용하려는 시도는 알려진 바가 없다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 상기한 장점을 갖는 PNA를 이용하여 마이크로RNA와 특이적으로 결합하여 그들의 활성이나 기능을 억제할 수 있는 안티센스를 제작하기 위하여 지속적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 기존의 안티센스 DNA 및 RNA 보다 우수한 효과를 나타내고, 세포 내에서 오랫동안 그 효과를 지속시킬 수 있는 안티센스 PNA를 발명하였다.
따라서 본 발명의 목적은 마이크로RNA와 상보적으로 결합함으로써 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하는 마이크로RNA 안티센스 PNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유효성분으로서 상기 마이크로RNA 안티센스 PNA를 포함하는, 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마이크로RNA 안티센스 PNA를 이용하여 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 마이크로RNA 안티센스 PNA의 효과를 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1면은 10 내지 25 염기로 이루어지고, 마이크로RNA와 상보적으로 결합함으로써 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하는, 마이크로RNA 안티센스 PNA에 관한 것이다.
본 발명의 제2면은 유효성분으로서 상기 마이크로RNA 안티센스 PNA를 포함하는, 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제3면은 상기 마이크로RNA 안티센스 PNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제4면은 안티센스 PNA의 존재 및 부재 하에서 각각 마이크로RNA의 발현량을 측정하여 비교하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA 안티센스 PNA의 효과를 평가하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 인공적으로 합성된 DNA 유사체로서, DNA 및 RNA 보다 높은 강도와 특이성 및 민감도로 DNA 및 RNA와 상보적으로 결합하며, 핵산분해효소, 단백질 분해효소 등의 생물학적 분해효소에 대해 안정성이 뛰어날 뿐만 아니라, pH 및 열과 같은 화학적 조건에 대한 안정성이 뛰어난 마이크로RNA 안티센스 PNA를 사용하기 때문에, DNA나 RNA를 사용하는 기존의 안티센스 제제보다 세포 내에서 오랫동안 그 효과를 지속시킬 수 있고 보존 기간이 길고 효율적으로 사용될 수 있다는 장점이 있다. 본 발명의 안티센스 PNA는 마이크로RNA의 기능연구에 사용되어 진핵생물의 유전자 발현의 조절을 이해하는 연구에 사용될 수 있을 뿐 아니라, 마이크로RNA의 대사 또는 기능의 결함으로 인해 발생하는 질병의 연구와 치료를 위한 신약으로도 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 마이크로RNA와 상보적으로 결합함으로써 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하는, 마이크로RNA 안티센스 PNA에 관한 것이다. 본 발명의 안티센스 PNA는 10 내지 25머의 염기로 이루어지는 것으로서, 특히 15 염기로 이루어질 수 있으나, 10 내지 14머 정도의 짧은 길이의 PNA나 16 내지 25머 정도의 PNA, 마이크로RNA의 씨드(seed) 부분인 5' 부분과 3' 부분의 일부를 포함하는 PNA 또한 마이크로RNA에 대한 안티센스로서의 기능을 충분히 수행할 것으로 예상되는 바, 이들은 모두 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명에서, 마이크로RNA는 특별한 제한 없이 모든 종류의 마이크로RNA를 포함하며, 예를 들어, miR16, miR221, miR222, miR31, miR24, miR21, miR181a, miR23a, miR19b, miR20a, let7g, miR34a, miR30a, miR146a, miR130a, miR155, miR373, miR122a, miR145, miR191, miR193b 및 miR802 를 포함하나, 이들로 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 안티센스 PNA는 마이크로RNA와 상보적으로 결합하여 그 활성이나 기능을 억제하는 한, 그 염기서열이 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 아래 표 1에 나타낸 서열번호 1 내지 82, 바람직하게는, 서열번호 1 내지 4, 7, 11, 19, 21, 23, 26, 29 내지 32, 34 내지 36, 44, 47, 48, 51, 52, 54, 55, 59, 63, 65, 66, 68 내지 80, 및 82 중 어느 하나의 염기서열을 가질 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
서열번호 명칭 염기서열 설명
1 miR16-1 atttacgtgctgcta miR16에 대한 안티센스
2 miR16-2 tatttacgtgctgct miR16에 대한 안티센스
3 miR16-3 atatttacgtgctgc miR16에 대한 안티센스
4 miR16-4 aatatttacgtgctg miR16에 대한 안티센스
5 miR16-5 caatatttacgtgct miR16에 대한 안티센스
6 miR16-6 ccaatatttacgtgc miR16에 대한 안티센스
7 miR16-7 gccaatatttacgtg miR16에 대한 안티센스
8 miR16-8 cgccaatatttacgt miR16에 대한 안티센스
9 miR16-9 caatatttacgtgctgct miR16에 대한 안티센스
10 miR221-1 gcagacaatgtagct miR221에 대한 안티센스
11 miR221-2 agcagacaatgtagc miR221에 대한 안티센스
12 miR221-3 cagcagacaatgtag miR221에 대한 안티센스
13 miR221-4 ccagcagacaatgta miR221에 대한 안티센스
14 miR221-5 cccagcagacaatgt miR221에 대한 안티센스
15 miR221-6 acccagcagacaatg miR221에 대한 안티센스
16 miR221-7 aacccagcagacaat miR221에 대한 안티센스
17 miR221-8 aaacccagcagacaa miR221에 대한 안티센스
18 miR221-9 gaaacccagcagaca miR221에 대한 안티센스
19 miR221-10 cccagcagacaatgtagc miR221에 대한 안티센스
20 miR222-1 tagccagatgtagct miR222에 대한 안티센스
21 miR222-2 gtagccagatgtagc miR222에 대한 안티센스
22 miR222-3 agtagccagatgtag miR222에 대한 안티센스
23 miR222-4 cagtagccagatgta miR222에 대한 안티센스
24 miR222-5 ccagtagccagatgt miR222에 대한 안티센스
25 miR222-6 cccagtagccagatg miR222에 대한 안티센스
26 miR222-7 acccagtagccagat miR222에 대한 안티센스
27 miR222-8 gacccagtagccaga miR222에 대한 안티센스
28 miR222-9 agacccagtagccag miR222에 대한 안티센스
29 miR222-10 gagacccagtagcca miR222에 대한 안티센스
30 miR31-1 tgccagcatcttgcc miR31에 대한 안티센스
31 miR31-2 atgccagcatcttgc miR31에 대한 안티센스
32 miR31-3 tatgccagcatcttg miR31에 대한 안티센스
33 miR31-4 ctatgccagcatctt miR31에 대한 안티센스
34 miR31-5 gctatgccagcatct miR31에 대한 안티센스
35 miR31-6 agctatgccagcatc miR31에 대한 안티센스
36 miR31-7 cagctatgccagcat miR31에 대한 안티센스
37 miR24-1 tgctgaactgagcca miR24에 대한 안티센스
38 miR24-2 ctgctgaactgagcc miR24에 대한 안티센스
39 miR24-3 cctgctgaactgagc miR24에 대한 안티센스
40 miR24-4 tcctgctgaactgag miR24에 대한 안티센스
41 miR24-5 ttcctgctgaactga miR24에 대한 안티센스
42 miR24-6 gttcctgctgaactg miR24에 대한 안티센스
43 miR24-7 tgttcctgctgaact miR24에 대한 안티센스
44 miR24-8 ctgttcctgctgaac miR24에 대한 안티센스
45 miR21-2 cagtctgataagcta miR21에 대한 안티센스
46 miR21-3 tcagtctgataagct miR21에 대한 안티센스
47 miR21-8 caacatcagtctgat miR21에 대한 안티센스
48 miR181a-1 gacagcgttgaatgt miR181a에 대한 안티센스
49 miR181a-2 tcaccgacagcgttgaatgt miR181a에 대한 안티센스
50 miR23a-1 tccctggcaatgtga miR23a에 대한 안티센스
51 miR23a-2 ggaaatccctggcaatgtga miR23a에 대한 안티센스
52 miR19b-1 tgcatggatttgcac miR19b에 대한 안티센스
53 miR19b-2 agttttgcatggatttgcac miR19b에 대한 안티센스
54 miR20a-1 cactataagcacttt miR20a에 대한 안티센스
55 miR20a-2 acctgcactataagcacttt miR20a에 대한 안티센스
56 let7g-1 caaactactacctca let7g에 대한 안티센스
57 let7g-2 acaaactactacctc let7g에 대한 안티센스
58 let7g-3 tacaaactactacct let7g에 대한 안티센스
59 let7g-4 gtacaaactactacc let7g에 대한 안티센스
60 let7g-5 tgtacaaactactac let7g에 대한 안티센스
61 let7g-6 ctgtacaaactacta let7g에 대한 안티센스
62 let7g-7 actgtacaaactact let7g에 대한 안티센스
63 miR34a-1 agctaagacactgcc miR34a에 대한 안티센스
64 miR34a-2 caaccagctaagacactgcc miR34a에 대한 안티센스
65 miR30a-1 gtcgaggatgtttac miR30a에 대한 안티센스
66 miR146a-1 tggaattcagttctc miR146a에 대한 안티센스
67 miR146a-2 ccatggaattcagttctc miR146a에 대한 안티센스
68 miR130a-1 ttttaacattgcact miR130a에 대한 안티센스
69 miR130a-2 cccttttaacattgcact miR130a에 대한 안티센스
70 miR155-1 tcacgattagcatta miR155에 대한 안티센스
71 miR155-2 ctatcacgattagca miR155에 대한 안티센스
72 miR373-1 aaaatcgaagcactt miR373에 대한 안티센스
73 miR373-2 cccaaaatcgaagcactt miR373에 대한 안티센스
74 miR122-1 ccattgtcacactcc miR122에 대한 안티센스
75 miR122-2 acaccattgtcacactcc miR122에 대한 안티센스
76 miR145-1 cctgggaaaactgga miR145에 대한 안티센스
77 miR145-2 attcctgggaaaactgga miR145에 대한 안티센스
78 miR191-1 ttttgggattccgtt miR191에 대한 안티센스
79 miR191-2 tgcttttgggattccgtt miR191에 대한 안티센스
80 miR193b-1 actttgagggccagt miR193b에 대한 안티센스
81 miR802-1 tgaatctttgttact miR802에 대한 안티센스
82 miR802-2 ggatgaatctttgttact miR802에 대한 안티센스
본 발명에 따른 PNA는 그 자체로 세포 내로 도입되어 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하는데 사용될 수 있다. 그러나 PNA는 전기적으로 중성이므로, 세포의 지질 성분에 의해 세포 내로 도입되는데 장애를 받는다. 이를 극복하기 위하여, 세포 내로의 전달 시스템에 대한 연구가 많이 이루어진 바, 예를 들어, 세포 투과 단백질(cell penetrating protein, CPP)(문헌 [Pooga M, Hallbrink M, Zorko M, and Langel U. (1998) Cell penetration by transportan. Faseb J. 12: 67-77]), 인슐린-양 성장인자 Ⅰ-수용체(Insulin-like growth factor I-receptor)(문헌 [Basu S, and Wickstrom E. (1997) Synthesis and characterization of a peptide nucleic acid conjugated to a D-peptide analog of insulin-like growth factor 1 for increased cellular uptake. Bioconjug. Chem. 8: 481-488]), 어시알로글리코프로테인 수용체(Asialoglycoprotein receptor)(문헌 [Zhang X, Simmons C G, and Corey D R. (2001) Liver cell specific targeting of peptide nucleic acid oligomers. Bioorg Med. Chem. Lett. 11: 1269-1271])를 부착하여 세포 내 도입을 유도하거나, 전기천공(electroporation)(문헌 [Wang G, Xu X, Pace B, Dean D A, Glazer P M, Chan P, Goodman S R, and Shokolenko I. (1999) Peptide nucleic acid (PNA) binding-mediated induction of human gamma-globin gene expression. Nucleic Acids Res. 27(13):2806-2813]) 또는 리포좀(문헌 [Faruqi A F, Egholm M, and Glazer P M. (1998) Peptide nucleic acid-targeted mutagenesis of a chromosomal gene in mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 95(4):1398-1403])을 이용하여 세포 내 도입을 유도하는 방법이 알려져 있다. 일반적으로 CPP는 크게 3 종류로 분류될 수 있다. 첫째, 후천성 면역결핍증후군을 일으키는 HIV-1의 전사관련 단백질인 Tat 단백질의 49-57번 사이에 존재하는 Tat 펩타이드이다. 둘째, 호메오도메인(homeodomain)에서 유래된 펩타이드인 페네트라틴(penetratin)으로, 이는 초파리(Drosophila)의 호메오프로테인(homeoprotein)인 안테나페디아(antennapedia)의 호메오도메인에서 발견되었다. 셋째, 막 전위 서열(membrane translocating sequence, MTS) 또는 신호 서열(signal sequences)에 기초한 펩타이드이다. PNA를 세포 내로 효율적으로 도입하는데 사용될 수 있는 펩타이드들로는 아래 표 2에 나타낸 것들이 알려져 있는 바, 본 발명에서는 이들 펩타이드 중 어느 하나 또는 이로부터 유래된 것을 PNA에 연결하여 사용할 수 있다.
펩타이드의 타입 서열
옥트레오타이드(Octreotide)(SMSTR 결합) DF-C[CFDWKTC]T
(D: D형, C: 사이클릭 펩타이드)
Tat 펩타이드 GRKKRRQRRRPPQ
NLS(Nuclear localization signal) PKKKRKV
양이온성 펩타이드 KKKK, 또는
KK[AAKK]3 또는 KK[SSKK]3
H 부위 AAVALLPAVLLALLA
C-myc tag 서열 EQKLISEEDLNA
PTD(Protein transduction domain)-4 YARAAARQARA
트랜스포탄(Transportan)
(Designed cell membrane active peptide) 		GWTLNSAGYLLGKINLKALA-ALAKKIL
세균 세포막 활성 펩타이드 KFFKFFKFFK
NL1.1 결합 티로신 키나제 수용체 AEGEFMYWGDSHWLQYWYE-GDPAKGGSGGGSGGGKG
NL4c 결합 티로신 키나제 수용체 AEGEFFCVSSGGGSSCWPDPA-KGGSGGGSGGGSKG
최소 전사 활성화제 GG-[PADALDDFDLDML]2,3
p안테나페디아 (43-58) pAntp/페네트라틴 RQIKIWFQNRRMKWKK
유전자-특이적 전사 활성화를 위한
활성화 영역(Gal 80 BP) 		RHGEKWFLDDFTNNQM
신호 서열 기초 펩타이드 (Ⅰ) QPKKKRKV
신호 서열 기초 펩타이드 (Ⅱ) AAVALLPAVLLALLAP
99mTc 킬레이팅 펩타이드 GDAGG (D: D형)
IGF1 D[GGGGCSKC] (D: D형)
미토콘드리아 획득 펩타이드 MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSL
YDEGE YDEEGGGE-NH2
M918 MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV-NH2
R6-Pen NH2-RRRRRRRQIKIWFQNRRMKWKKGGC
그밖에도, PNA에 유용한 다른 펩타이드나 새로운 펩타이드도 PNA에 연결하여 사용할 수 있다. 이들 펩타이드는 PNA에 바로 연결될 수도 있으나 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid) 링커(O-링커), 화학식 1의 E-링커, 화학식 2의 X-링커 등과 같은 적절한 링커를 통해 PNA에 연결될 수 있다.
Figure 112008080810458-pat00001
Figure 112008080810458-pat00002
상기 펩타이드 이외에도, 폴리아르기닌, 페네트라틴, α-아미노아크리딘 등이 PNA의 세포 내 도입을 증진시키는 것으로 알려져 있는 바, 본 발명에서는 PNA에 이들 중 어느 것을 연결할 수도 있다. 본 발명의 구체예에서, PNA의 세포 내 도입을 증진시키기 위한 펩타이드는 변형된 Tat 펩타이드, 특히 서열번호 83의 아미노산 서열(RRRQRRKKR)을 갖는 것(R 펩타이드)과, 서열번호 84의 아미노산 서열(KFFKFFKFFK)을 갖는 것(K 펩타이드)일 수 있다.
본 발명에서는, 상기 마이크로RNA 안티센스 PNA를 세포 내로 도입함으로써, 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제할 수 있다. 마이크로RNA 안티센스 PNA는 예를 들어, 양이온성 지질, 특히 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(인비트로 젠(Invitrogen))을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 양이온성 지질을 이용하는 것 이외의 방법(예: 전기천공, 리포좀 등)을 이용하여 안티센스 PNA를 세포 내로 도입하는 경우에는 펩타이드와 결합된 PNA 이외에도 펩타이드와 결합되지 않은 PNA도 마이크로RNA에 대한 안티센스로서의 기능을 수행할 수 있다.
본 발명은 또한, 유효성분으로서 상기 마이크로RNA 안티센스 PNA를 포함하는, 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 마이크로RNA 활성 또는 기능 억제용 조성물은 예를 들어, 마이크로RNA-매개 질환의 예방 또는 치료제로도 사용될 수 있을 것인바, 마이크로RNA 안티센스 PNA의 유효용량은 대상의 연령, 성별, 건강상태, 질환의 종류 및 중증도 등에 따라 적절히 결정될 수 있으나, 예를 들면, 성인을 기준으로 하여 1회당 0.1~200 ㎎ 용량으로 투여될 수 있으며, 하루에 1회 또는 2~3회 분할 투여될 수 있다. 이를 위해, 통상적인 유전자 요법(gene therapy), 예를 들어 체외(ex vivo) 요법이나 체내(in vivo) 요법을 사용할 수 있다.
본 발명에서는, 안티센스 PNA의 존재 및 부재 하에서 각각 마이크로RNA의 발현량을 측정하여 비교함으로써 안티센스 PNA의 효과를 평가할 수 있다. 이때, 발현량을 측정하기 위해서는 당업계에 알려진 통상의 방법 중 어느 것이라도 사용할 수 있는 바, 예를 들어, 리포터(reporter) 유전자, 노던 블랏, 마이크로어레이, 실시간 PCR, 인 비보/인 시튜 혼성화(in vivo/in situ hybridization) 또는 표지화(labeling)를 사용할 수 있다. 일례로, 리포터 유전자를 사용하여 유전자 발현량을 측정하는 경우에는,
⒜ 안티센스 PNA를 리포터 유전자(예: 레닐라 루시페라제(Renilla luciferase))를 포함하는 벡터(대조 벡터)와, 리포터 유전자(예: 파이어플라이 루시퍼라제(firefly luciferase)) 및 표적 마이크로RNA에 대한 결합 서열(binding sequence)을 포함하는 벡터(실험 벡터)와 혼합한 후 세포 내로 도입하고;
⒝ 단계 ⒜의 대조 벡터와 실험 벡터로부터 리포터 유전자의 발현량을 각각 측정 비교함으로써:
마이크로RNA 안티센스 PNA의 효과를 평가할 수 있다.
상기 실험 벡터는 리포터 유전자(예: 파이어플라이 루시페라제)를 포함하는 벡터에 표적 마이크로RNA에 대한 결합 서열을 도입하여 제조할 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든지 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 안티센스 PNA의 합성
PNA의 마이크로RNA에 대한 안티센스 효과를 확인하기 위하여, 특정 마이크로RNA(miR16, miR221, miR222, miR31, miR24, miR21, miR181a, miR23a, miR19b, miR20a, let7g, miR34a, miR30a, miR146a, miR130a, miR155, miR373, miR122a, miR145, miR191, miR193b, miR802)에 대해 상보적인 서열을 갖는 안티센스 PNA를 합성하였다. 마이크로RNA는 보통 21 내지 25개의 뉴클레오타이드로 이루어져 있는 데, 그 중 염기서열 2번부터 8번까지는 씨드 서열(seed sequence)로 알려져 있다. 마이크로RNA에 상보적으로 결합할 수 있도록, 표적 마이크로RNA의 염기서열 1번부터 15번까지, 2번부터 16번까지, 3번부터 17번까지 등 서열이 다른 15개의 염기로 이루어진 PNA를 합성하였다. 이들 PNA에 O 링커를 사용하여 변형된 HIV-1 Tat 펩타이드(R-펩타이드, RRRQRRKKR)를 결합시켰다. 또한 변형된 Tat 펩타이드의 효과를 비교 평가하기 위하여, 동물세포가 아닌 E. 콜라이(E. coli)에서 PNA의 세포 내 도입을 증가시키는 것으로 알려져 있는 K-펩타이드(KFFKFFKFFK)를 결합시킨 안티센스 PNA를 합성하였다. 또한, 안티센스 활성을 갖지 않는 대조 PNA(con-K, con-R 및 con-2R)를 합성하였다. 합성한 안티센스 PNA 및 대조 PNA를 아래 표 3에 나타내었다.
명칭 특정 마이크로RNA에 대한
안티센스/대조 PNA 서열		 안티센스/대조 PNA
염기서열의 서열번호
miR16-1(R) RRRQRRKKR-O-atttacgtgctgcta 1
miR16-2(R) RRRQRRKKR-O-tatttacgtgctgct 2
miR16-3(R) RRRQRRKKR-O-atatttacgtgctgc 3
miR16-4(R) RRRQRRKKR-O-aatatttacgtgctg 4
miR16-5(R) RRRQRRKKR-O-caatatttacgtgct 5
miR16-6(R) RRRQRRKKR-O-ccaatatttacgtgc 6
miR16-7(R) RRRQRRKKR-O-gccaatatttacgtg 7
miR16-8(R) RRRQRRKKR-O-cgccaatatttacgt 8
miR16-9(R) RRRQRRKKR-O-caatatttacgtgctgct 9
miR16-2 tatttacgtgctgct 2
miR16-1(K) KFFKFFKFFK-O-atttacgtgctgcta 1
miR16-2(K) KFFKFFKFFK-O-tatttacgtgctgct 2
miR16-3(K) KFFKFFKFFK-O-atatttacgtgctgc 3
miR16-4(K) KFFKFFKFFK-O-aatatttacgtgctg 4
miR16-5(K) KFFKFFKFFK-O-caatatttacgtgct 5
miR16-6(K) KFFKFFKFFK-O-ccaatatttacgtgc 6
miR16-7(K) KFFKFFKFFK-O-gccaatatttacgtg 7
miR16-8(K) KFFKFFKFFK-O-cgccaatatttacgt 8
miR16-9(K) KFFKFFKFFK-O-caatatttacgtgctgct 9
miR221-1(R) RRRQRRKKR-O-gcagacaatgtagct 10
miR221-2(R) RRRQRRKKR-O-agcagacaatgtagc 11
miR221-3(R) RRRQRRKKR-O-cagcagacaatgtag 12
miR221-4(R) RRRQRRKKR-O-ccagcagacaatgta 13
miR221-5(R) RRRQRRKKR-O-cccagcagacaatgt 14
miR221-6(R) RRRQRRKKR-O-acccagcagacaatg 15
miR221-7(R) RRRQRRKKR-O-aacccagcagacaat 16
miR221-8(R) RRRQRRKKR-O-aaacccagcagacaa 17
miR221-9(R) RRRQRRKKR-O-gaaacccagcagaca 18
miR221-10(R) RRRQRRKKR-O-cccagcagacaatgtagc 19
miR222-1(R) RRRQRRKKR-O-tagccagatgtagct 20
miR222-2(R) RRRQRRKKR-O-gtagccagatgtagc 21
miR222-3(R) RRRQRRKKR-O-agtagccagatgtag 22
miR222-4(R) RRRQRRKKR-O-cagtagccagatgta 23
miR222-5(R) RRRQRRKKR-O-ccagtagccagatgt 24
miR222-6(R) RRRQRRKKR-O-cccagtagccagatg 25
miR222-7(R) RRRQRRKKR-O-acccagtagccagat 26
miR222-8(R) RRRQRRKKR-O-gacccagtagccaga 27
miR222-9(R) RRRQRRKKR-O-agacccagtagccag 28
miR222-10(R) RRRQRRKKR-O-gagacccagtagcca 29
miR31-1R RRRQRRKKR-O-tgccagcatcttgcc 30
miR31-2R RRRQRRKKR-O-atgccagcatcttgc 31
miR31-3R RRRQRRKKR-O-tatgccagcatcttg 32
miR31-4R RRRQRRKKR-O-ctatgccagcatctt 33
miR31-5R RRRQRRKKR-O-gctatgccagcatct 34
miR31-6R RRRQRRKKR-O-agctatgccagcatc 35
miR31-7R RRRQRRKKR-O-cagctatgccagcat 36
miR24-1R RRRQRRKKR-O-tgctgaactgagcca 37
miR24-2R RRRQRRKKR-O-ctgctgaactgagcc 38
miR24-3R RRRQRRKKR-O-cctgctgaactgagc 39
miR24-4R RRRQRRKKR-O-tcctgctgaactgag 40
miR24-5R RRRQRRKKR-O-ttcctgctgaactga 41
miR24-6R RRRQRRKKR-O-gttcctgctgaactg 42
miR24-7R RRRQRRKKR-O-tgttcctgctgaact 43
miR24-8R RRRQRRKKR-O-ctgttcctgctgaac 44
miR21-2R RRRQRRKKR-O-cagtctgataagcta 45
miR21-3R RRRQRRKKR-O-tcagtctgataagct 46
miR21-8R RRRQRRKKR-O-caacatcagtctgat 47
miR181a-1R RRRQRRKKR-O-gacagcgttgaatgt 48
miR181a-2R RRRQRRKKR-O-tcaccgacagcgttgaatgt 49
miR23a-1R RRRQRRKKR-O-tccctggcaatgtga 50
miR23a-2R RRRQRRKKR-O-ggaaatccctggcaatgtga 51
miR19b-1R RRRQRRKKR-O-tgcatggatttgcac 52
miR19b-2R RRRQRRKKR-O-agttttgcatggatttgcac 53
miR20a-1R RRRQRRKKR-O-cactataagcacttt 54
miR20a-2R RRRQRRKKR-O-acctgcactataagcacttt 55
let7g-1R RRRQRRKKR-O-caaactactacctca 56
let7g-2R RRRQRRKKR-O-acaaactactacctc 57
let7g-3R RRRQRRKKR-O-tacaaactactacct 58
let7g-4R RRRQRRKKR-O-gtacaaactactacc 59
let7g-5R RRRQRRKKR-O-tgtacaaactactac 60
let7g-6R RRRQRRKKR-O-ctgtacaaactacta 61
let7g-7R RRRQRRKKR-O-actgtacaaactact 62
miR34a-1R RRRQRRKKR-O-agctaagacactgcc 63
miR34a-2R RRRQRRKKR-O-caaccagctaagacactgcc 64
miR30a-1R RRRQRRKKR-O-gtcgaggatgtttac 65
miR146a-1R RRRQRRKKR-O-tggaattcagttctc 66
miR146a-2R RRRQRRKKR-O-ccatggaattcagttctc 67
miR130a-1R RRRQRRKKR-O-ttttaacattgcact 68
miR130a-2R RRRQRRKKR-O-cccttttaacattgcact 69
miR155-1R RRRQRRKKR-O-tcacgattagcatta 70
miR155-2R RRRQRRKKR-O-ctatcacgattagca 71
miR373-1R RRRQRRKKR-O-aaaatcgaagcactt 72
miR373-2R RRRQRRKKR-O-cccaaaatcgaagcactt 73
miR122-1R RRRQRRKKR-O-ccattgtcacactcc 74
miR122-2R RRRQRRKKR-O-acaccattgtcacactcc 75
miR145-1R RRRQRRKKR-O-cctgggaaaactgga 76
miR145-2R RRRQRRKKR-O-attcctgggaaaactgga 77
miR191-1R RRRQRRKKR-O-ttttgggattccgtt 78
miR191-2R RRRQRRKKR-O-tgcttttgggattccgtt 79
miR193b-1R RRRQRRKKR-O-actttgagggccagt 80
miR802-1R RRRQRRKKR-O-tgaatctttgttact 81
miR802-2R RRRQRRKKR-O-ggatgaatctttgttact 82
con-K KFFKFFKFFK-O-gacaacaatgaatgt 85
con-R RRRQRRKKR-O-gacaacaatgaatgt 85
con-2R RRRQRRKKR-O-attaatgtcggacaa 86
실시예 2: 안티센스 PNA 의 기능 및 결합 펩타이드의 종류가 안티센스 기능에 미치는 영향 평가
안티센스 PNA의 기능 및 그에 결합되는 펩타이드의 종류가 안티센스 기능에 미치는 영향을 평가하기 위하여, HeLa 세포를 24 웰 플레이트에 웰당 6×104 개로 도말한 후 24 시간 동안 배양하였다. 양이온성 지질 물질인 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 이용하여 miR16에 대한 결합 서열이 클로닝되어 있는 pGL3-대조 벡터(파이어플라이 루시페라제 유전자 함유, 프로메가(Promega), 도 2 참조)와 레닐라 루시페라제 유전자를 함유하는 벡터, pGL3-대조 벡터를 miR16용 안티센스 PNA와 함께 형질전환시켰다. miR16용 안티센스 PNA 대신 대조 PNA(con-K 및 con-R)를 같은 방법으로 형질전환시켰다. 리포터 유전자의 발현량를 조사하여 안티센스 PNA의 효과를 확인하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 합성한 15 염기 길이의 miR16용 안티센스 PNA가 모두 마이크로RNA 16의 기능을 억제하는 안티센스 효과를 보였다. 또한 변형된 Tat 펩타이드(R 펩타이드)가 결합되어 있는 안티센스 PNA가 K 펩타이드가 결합되어 있는 안티센스 PNA에 비해 높은 효율을 갖는 것이 확인되었다.
실시예 3: 펩타이드 결합이 안티센스 기능에 미치는 영향 평가
변형된 Tat 펩타이드가 결합된 안티센스 PNA와, 펩타이드가 결합되지 않은 안티센스 PNA의 효과를 비교하기 위하여, 먼저 HeLa 세포를 24 웰 플레이트에 웰당 6×104 개로 도말한 후 24 시간 동안 배양하였다. 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 이용하여 miR16에 대한 결합 서열이 클로닝되어 있는 pGL3-대조 벡터(상기 도 2 참조)와 레닐라 루시페라제 유전자를 함유하는 벡터를 200 nM miR16용 안티센스 PNA와 함께 형질전환시켰다. miR16용 안티센스 PNA 대신 대조 PNA(con-R)도 같은 방법으로 형질전환시켰다. 형질도입 후 48 시간 동안 배양한 후 이중 루시페라제 어세이 시스템(Dual luciferase assay system)(프로메가)을 이용하여 파이어플라이 루시페라제와 레닐라 루시페라제의 발현량를 측정하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 변형된 Tat 펩타이드가 결합된 miR16용 안티센스 PNA(modified PNA)는 마이크로RNA 16에 대한 안티센스 효과를 나타내었고, Tat 펩타이드가 결합되지 않은 miR16용 PNA(unmodifided PNA, 300 nM)는 변형된 Tat 펩타이드가 결합된 miR16용 안티센스 PNA보다 낮지만, 안티센스 효과를 나타내었다.
실시예 4: 표적 miR16에 대한 PNA의 효과 평가
마이크로RNA에 대한 안티센스 PNA의 효과를 확인하기 위하여, miR16 마이크로RNA에 대한 결합 서열을 포함하는 실험 벡터를 사용하였다. 이를 위하여 파이어플라이 루시페라제 유전자를 포함하는 pGL3-대조 벡터(프로메가)를 이용하였다. 형질도입 수준을 비교하기 위하여, 레닐라 루시페라제 유전자를 포함하는 대조 벡터(프로메가)를 사용하였다.
miR16에 대한 결합 서열을 pGL3-대조 벡터의 루시페라제 유전자의 3' UTR 부분의 XbaⅠ 내로 삽입하여 실험 벡터를 제조하였다. miR16 마이크로RNA의 서열은 miR 염기서열 데이터베이스(miRBase Sequence Database)(http://microRNA.sanger.ac.uk/sequences/)를 참조하여 정하였다(표 4a).
서열번호 이름 마이크로RNA 염기서열
87 miR16 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG
마이크로RNA 서열과 같은 길이로 대응하는 상보적인 DNA를 5'과 3'에 XbaⅠ 위치가 들어갈 수 있게 합성하여(표 5a) pGL3-대조 벡터에 클로닝하였다.
서열번호 이름 miR 표적 서열 클로닝 올리고머
90 miR16-F ctagacgccaatatttacgtgctgctacgaattcaatccgt
91 miR16-R ctagacggattgaattcgtagcagcacgtaaatattggcgt
기존의 마이크로RNA에 대한 안티센스와 PNA 안티센스의 효율을 비교하기 위하여, 엑시콘(Exiqon)사의 miR16용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브(Knockdown probes)와 다마콘(Dharmacon)사의 마이크로RNA 저해제인 miR16용 miRIDNA를 구입하여 200 nM 농도에서 그 효과를 비교하였다. PNA의 경우, 도 3에서 200 nM 농도에서 효율이 높은 것으로 나타난 2가지 PNA(1번과 7번)을 각각 100 nM을 혼합하여 사용하였다.
HeLa 세포를 24 시간 동안 배양한 후, miR16에 대한 결합 서열이 도입된 실험 벡터와 레닐라 루시페라제 유전자를 포함하는 대조 벡터를 miR16용 마이크로RNA 안티센스 PNA, 엑시콘사의 miR16용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브, 다마콘 사의 miR16용 miRIDNA 중 하나와 함께 HeLa 세포에 형질도입하였다. 형질도입은 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 이용하여 수행하였다. 마이크로RNA 저해제의 효과를 확인하기 위해 핵산염기서열이 miR16과 전혀 다른 대조 PNA(con-R), 엑시콘사의 miRNA181b용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브, 다마콘사의 miRNA181b용 miRIDNA를 같은 방법으로 형질전환시켰다. 형질도입 후 48 시간 동안 배양하고, 이중 루시페라제 어세이 시스템(프로메가)을 이용하여 파이어플라이 루시페라제와 레닐라 루시페라제의 발현량를 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. miR16용 안티센스 PNA에 대해서는 그의 대조 PNA(con-R)에 대한 상대적인 측정값을, miR16용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브에 대해서는 miRNA181b용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브에 대한 상대적인 측정값을, miR16용 miRIDNA에 대해서는 miRNA181b용 miRIDNA에 대한 상대적인 측정값을 표시하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 안티센스 PNA는 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브와 miRIDIAN에 비해 마이크로RNA 16에 대해 2.5배 이상의 안티센스 효과를 보였다.
실시예 5: 농도에 따른 miR-16 안티센스 PNA의 효과 평가
마이크로RNA 16에 대한 안티센스 PNA의 효과를 농도별로 확인해보기 위하여, HeLa 세포를 24 시간 동안 배양한 후, miR16에 대한 결합 서열이 도입된 벡터와 레닐라 루시페라제 유전자를 포함하는 대조 벡터를 각각 50, 100, 200 및 300 nM 농도의 안티센스 PNA(1번과 7번의 혼합물)와 함께 HeLa 세포에 형질도입하였다. 형질도입은 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 이용하여 수행하였다. miR16용 안티센스 PNA 대신 대조 PNA(con-R)도 같은 방법으로 형질전환시켰다. 형질도입 후 48 시간 동안 배양한 후 이중 루시페라제 어세이 시스템(프로메가)을 이용하여 파이어플라이 루시페라제와 레닐라 루시페라제의 발현량를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 200 nM 이상의 농도로 miR16용 안티센스 PNA를 처리하였을 때 miR16에 대한 안티센스의 효과가 가장 높았다.
실시예 6: 시간에 따른 miR-16 안티센스 PNA의 효과 평가
마이크로RNA 16에 대한 안티센스로서의 PNA의 효과를 시간별로 확인해 보기 위하여, HeLa 세포를 24 시간 동안 배양한 후, miR16에 대한 결합 서열이 도입된 벡터와 레닐라 루시페라제 유전자를 포함하는 대조 벡터를 200 nM의 miR16용 안티센스 PNA(miR16-1 100 nM과 miR16-7 100 nM의 혼합물) 및 200 nM의 miR16용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브와 함께 HeLa 세포에 형질도입하였다. 형질도입은 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 이용하여 수행하였다. 마이크로RNA 저해제의 효과를 확인하기 위해 핵산염기서열이 miR16과 전혀 다른 대조 PNA(con-R), 엑시콘사의 miRNA 181b용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브를 같은 방법으로 형질전환시켰다. 형질도입 후 각각 24, 36 및 48 시간동안 배양한 후 이중 루시페라제 어세이 시스템(프로메가)을 이용하여 파이어플라이 루시페라제와 레닐라 루시페라제의 발현량를 측정하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다. miR16용 안티센스 PNA에 대해서는 그의 대조 PNA(con-R)에 대한 상대적인 측정값을, miR16용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브에 대해서는 miRNA181b용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브에 대한 상대적인 측정값을 표시하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, miRCURY™ LNA 녹다운 프로브는 48 시간 후에야 효과를 나타내는데 비해, 안티센스 PNA는 24 시간 후에 이미 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브 48시간 후와 동등한 안티센스 효과를 나타내고 36시간 후에는 안티센스 효과가 더 증가하였다. 따라서 마이크로RNA 안티센스 PNA를 사용하면 기존의 마이크로RNA 안티센스 프로브를 사용하는 것보다 1/2 시간에 안티센스 효과를 확인할 수 있기 때문에 연구개발에 필요한 시간을 크게 줄일 수 있다.
실시예 7: 표적 miR221에 대한 PNA의 효과 평가
miR221 마이크로RNA에 대한 결합 서열을 갖는 벡터를 제조하기 위하여, 변형된 pGL3-대조 벡터를 사용하였다. 즉 5' 측에 EcoRⅠ 제한위치를 포함하고 3' 측에 PstⅠ 제한위치를 포함하는 합성된 올리고머를 변형된 pGL3-대조 벡터의 EcoRⅠ/PstⅠ 위치에 클로닝하였다(표 4b 및 5b 참조).
서열번호 이름 마이크로RNA 염기서열
88 miR221 AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC
서열번호 이름 miR 표적 서열 클로닝 올리고머
92 miR221-F aattcgaaacccagcagacaatgtagctctgca
93 miR221-R gagctacattgtctgctgggtttcg
기존의 마이크로RNA에 대한 안티센스와 PNA 안티센스를 비교하기 위하여, 엑시콘사의 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브와 비교하였다. HeLa 세포를 24 시간 동안 배양한 후, miR221에 대한 결합 서열이 도입된 벡터와 레닐라 루시페라제 유전자를 포함하는 대조 벡터를 200 nM의 miR221용 안티센스 PNA(miR16-1 100 nM과 miR16-7 100 nM의 혼합물) 및 200 nM의 miR221용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브와 함께 HeLa 세포에 형질도입하였다. 마이크로RNA 저해제의 효과를 확인하기 위해 핵산염기서열이 miR221과 전혀 다른 대조 PNA(con-R), 엑시콘사의 miRNA 181b용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브를 같은 방법으로 형질전환시켰다. 형질도입은 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 이용하여 수행하였다. 형질도입 후 48 시간동안 배양한 후 이중 루시페라제 어세이 시스템(프로메가)을 이용하여 파이어플라이 루시페라제와 레닐라 루시페라제의 발현량를 측정하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었다. miR221용 안티센스 PNA에 대해서는 그의 대조 PNA(con-R)에 대한 상대적인 측정값을, miR221용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브에 대해서는 miRNA 181b용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브에 대한 상대적인 측정값을 표시하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, miR221 안티센스 PNA가 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브에 비해 마이크로RNA 221의 기능을 억제하는 안티센스 효과가 더 뛰어났다.
실시예 8: 표적 miR222에 대한 PNA의 효과 평가
miR222 마이크로RNA에 대한 결합 서열을 갖는 벡터를 제조하기 위하여, 변형된 pGL3-대조 벡터를 사용하였다. 즉 5' 측에 EcoRⅠ 제한위치를 포함하고 3' 측에 PstⅠ 제한위치를 포함하는 합성된 올리고머를 변형된 pGL3-대조 벡터의 EcoRⅠ/PstⅠ 위치에 클로닝하였다(표 4c 및 5c 참조).
서열번호 이름 마이크로RNA 염기서열
89 miR222 AGCUACAUCUGGCUACUGGGUCUC
서열번호 이름 miR 표적 서열 클로닝 올리고머
94 miR222-F aattcgagacccagtagccagatgtagctctgca
95 miR222-R gagctacatctggctactgggtctcg
기존의 마이크로RNA에 대한 안티센스와 PNA 안티센스를 비교하기 위하여,엑시콘사의 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브와 비교하였다. HeLa 세포를 24 시간 동안 배양한 후, miR222에 대한 결합 서열이 도입된 벡터와 레닐라 루시페라제 유전자를 포함하는 대조 벡터를 200 nM의 miR222용 안티센스 PNA(miR16-1 100 nM과 miR16-7 100 nM의 혼합물) 및 200 nM의 miR222용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브와 함께 HeLa 세포에 형질도입하였다. 형질도입은 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 이용하여 수행하였다. 마이크로RNA 저해제의 효과를 확인하기 위해 핵산염기서열이 miR222과 전혀 다른 대조 PNA(con-R), 엑시콘사의 miRNA 181b용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브를 같은 방법으로 형질전환시켰다. 형질도입 후 48 시간동안 배양한 후 이중 루시페라제 어세이 시스템(프로메가)을 이용하여 파이어플라이 루시페라제와 레닐라 루시페라제 발현량를 측정하였다.
그 결과를 도 9에 나타내었다. miR222용 안티센스 PNA에 대해서는 그의 대조 PNA(con-R)에 대한 상대적인 측정값을, miR222용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브에 대해서는 miRNA 181b용 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브에 대한 상대적인 측정값을 표시하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, miR222 안티센스 PNA가 miRCURY™ LNA 녹다운 프로브에 비해 마이크로RNA 222의 기능을 억제하는 안티센스 효과가 더 뛰어났다.
실시예 9: 표적 miR31, miR24, miR21, miR181a, miR23a, miR19b, miR20a, let7g, miR34a, miR30a, miR146a, miR130a, miR155, miR373, miR122a, miR145, miR191, miR193b, miR802에 대한 PNA의 효과 평가
miR 염기서열 데이터베이스에서 찾은 miR31, miR24, miR21, miR181a, miR23a, miR19b, miR20a, let7g, miR34a, miR30a, miR146a, miR130a, miR155, miR373, miR122a, miR145, miR191, miR193b, miR802 마이크로RNA 서열과 같은 길이로 대응하는 상보적인 DNA를 실시예 3과 같은 방법으로 pGL3-대조 벡터에 클로닝하였다.
HeLa 세포를 24 시간 동안 배양한 후, 각각의 마이크로RNA에 대한 결합 서열이 도입된 실험 벡터와 레닐라 루시페라제 유전자를 포함하는 대조 벡터를 200 nM 마이크로RNA 안티센스 PNA와 함께 HeLa 세포에 형질도입하였다. 형질도입은 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 이용하여 수행하였다. 마이크로RNA 안티센스 PNA의 효과를 확인하기 위해 핵산염기서열이 전혀 다른 대조 PNA(con-2R)도 같은 방법으로 형질전환시켰다. 형질도입 후 48 시간 동안 배양하고, 이중 루시페라제 어세이 시스템(프로메가)을 이용하여 파이어플라이 루시페라제와 레닐라 루시페라제의 발현량를 측정하였다.
그 결과를 도 10 내지 도 28에 나타내었다. 대조 PNA(con-2R)에 대한 상대적인 측정값을 표시하였다. 상기 도면에 나타낸 바와 같이, miR31-1R, miR31-2R, miR31-3R, miR31-5R, miR31-6R, miR31-7R, miR24-8R, miR21-8R, miR181-1R, miR23a-2R, miR19b-1R, miR20a-1R, miR20a-2R, let7g-4R, miR34a-1R, miR30a-1R, miR146a-1R, miR130a-1R, miR130a-2R, miR155-1R, miR155-2R, miR373-1R, miR373-2R, miR122-1R, miR122-2R, miR145-1R, miR145-2R, miR191-1R, miR191-2R, miR193b-1R, miR802-2R 안티센스 PNA를 사용한 경우 대조 PNA에 비해 2배 이상의 우수한 miRNA 기능 억제 효과를 보였다.
도 1은 DNA 및 PNA의 기본구조의 차이를 보여주는 도면이고;
도 2는 표적 마이크로RNA에 대한 결합 서열을 클로닝하기 위한 벡터의 구조를 개략적으로 보여주는 도면이며;
도 3은 K 펩타이드가 결합된 안티센스 PNA(상부)와 변형된 Tat 펩타이드(R 펩타이드)가 결합된 안티센스 PNA(하부)의 효과를 비교한 그래프이고;
도 4는 변형된 Tat 펩타이드(R 펩타이드)가 안티센스 PNA의 세포 내 도입에 미치는 영향을 보여주는 그래프이며;
도 5은 표적 miR16에 대한 기존 안티센스와 안티센스 PNA의 효과를 비교한 그래프이고;
도 6은 표적 miR16에 대한 안티센스 PNA의 농도별 효과를 비교한 그래프이며;
도 7은 표적 miR16에 대한 안티센스 PNA의 시간별 효과를 비교한 그래프이고;
도 8은 표적 miR221에 대한 기존의 안티센스와 PNA 안티센스의 효과를 비교한 그래프이며;
도 9은 표적 miR222에 대한 기존의 안티센스와 PNA 안티센스의 효과를 비교한 그래프이고;
도 10은 표적 miR31에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이며;
도 11은 표적 miR24에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이고;
도 12은 표적 miR21에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이며;
도 13은 표적 miR181a에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이고;
도 14은 표적 miR23a에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이며;
도 15은 표적 miR19b에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이고;
도 16은 표적 miR20a에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이며;
도 17은 표적 let7g에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이고;
도 18은 표적 miR34a에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이며;
도 19은 표적 miR30a에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이고;
도 20은 표적 miR146a에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이며;
도 21은 표적 miR130a에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이고;
도 22은 표적 miR155에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이며;
도 23은 표적 miR373에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이고;
도 24은 표적 miR122a에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이며;
도 25은 표적 miR145에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이고;
도 26은 표적 miR191에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이며;
도 27은 표적 miR193b에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이고;
도 28은 표적 miR802에 대한 PNA 안티센스의 효과를 보인 그래프이다.
<110> Panagene Inc. <120> MicroRNA antisense PNAs, compositions comprising the same, and methods for using and evaluating the same <150> KR10-2007-0120459 <151> 2007-11-23 <160> 95 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR16 antisense PNA miR16-1 <400> 1 atttacgtgc tgcta 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR16 antisense PNA miR16-2 <400> 2 tatttacgtg ctgct 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR16 antisense PNA miR16-3 <400> 3 atatttacgt gctgc 15 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR16 antisense PNA miR16-4 <400> 4 aatatttacg tgctg 15 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR16 antisense PNA miR16-5 <400> 5 caatatttac gtgct 15 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR16 antisense PNA miR16-6 <400> 6 ccaatattta cgtgc 15 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR16 antisense PNA miR16-7 <400> 7 gccaatattt acgtg 15 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR16 antisense PNA miR16-8 <400> 8 cgccaatatt tacgt 15 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR16 antisense PNA miR16-9 <400> 9 caatatttac gtgctgct 18 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR221 antisense PNA miR221-1 <400> 10 gcagacaatg tagct 15 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR221 antisense PNA miR221-2 <400> 11 agcagacaat gtagc 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR221 antisense PNA miR221-3 <400> 12 cagcagacaa tgtag 15 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR221 antisense PNA miR221-4 <400> 13 ccagcagaca atgta 15 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR221 antisense PNA miR221-5 <400> 14 cccagcagac aatgt 15 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR221 antisense PNA miR221-6 <400> 15 acccagcaga caatg 15 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR221 antisense PNA miR221-7 <400> 16 aacccagcag acaat 15 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR221 antisense PNA miR221-8 <400> 17 aaacccagca gacaa 15 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR221 antisense PNA miR221-9 <400> 18 gaaacccagc agaca 15 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR221 antisense PNA miR221-10 <400> 19 cccagcagac aatgtagc 18 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR222 antisense PNA miR222-1 <400> 20 tagccagatg tagct 15 <210> 21 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR222 antisense PNA miR222-2 <400> 21 gtagccagat gtagc 15 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR222 antisense PNA miR222-3 <400> 22 agtagccaga tgtag 15 <210> 23 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR222 antisense PNA miR222-4 <400> 23 cagtagccag atgta 15 <210> 24 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR222 antisense PNA miR222-5 <400> 24 ccagtagcca gatgt 15 <210> 25 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR222 antisense PNA miR222-6 <400> 25 cccagtagcc agatg 15 <210> 26 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR222 antisense PNA miR222-7 <400> 26 acccagtagc cagat 15 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR222 antisense PNA miR222-8 <400> 27 gacccagtag ccaga 15 <210> 28 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR222 antisense PNA miR222-9 <400> 28 agacccagta gccag 15 <210> 29 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR222 antisense PNA miR222-10 <400> 29 gagacccagt agcca 15 <210> 30 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR31 antisense PNA miR31-1 <400> 30 tgccagcatc ttgcc 15 <210> 31 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR31 antisense PNA miR31-2 <400> 31 atgccagcat cttgc 15 <210> 32 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR31 antisense PNA miR31-3 <400> 32 tatgccagca tcttg 15 <210> 33 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR31 antisense PNA miR31-4 <400> 33 ctatgccagc atctt 15 <210> 34 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR31 antisense PNA miR31-5 <400> 34 gctatgccag catct 15 <210> 35 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR31 antisense PNA miR31-6 <400> 35 agctatgcca gcatc 15 <210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR31 antisense PNA miR31-7 <400> 36 cagctatgcc agcat 15 <210> 37 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR24 antisense PNA miR24-1 <400> 37 tgctgaactg agcca 15 <210> 38 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR24 antisense PNA miR24-2 <400> 38 ctgctgaact gagcc 15 <210> 39 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR24 antisense PNA miR24-3 <400> 39 cctgctgaac tgagc 15 <210> 40 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR24 antisense PNA miR24-4 <400> 40 tcctgctgaa ctgag 15 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR24 antisense PNA miR24-5 <400> 41 ttcctgctga actga 15 <210> 42 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR24 antisense PNA miR24-6 <400> 42 gttcctgctg aactg 15 <210> 43 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR24 antisense PNA miR24-7 <400> 43 tgttcctgct gaact 15 <210> 44 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR24 antisense PNA miR24-8 <400> 44 ctgttcctgc tgaac 15 <210> 45 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR21 antisense PNA miR21-2 <400> 45 cagtctgata agcta 15 <210> 46 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR21 antisense PNA miR21-3 <400> 46 tcagtctgat aagct 15 <210> 47 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR21 antisense PNA miR21-8 <400> 47 caacatcagt ctgat 15 <210> 48 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR181a antisense PNA miR181a-1 <400> 48 gacagcgttg aatgt 15 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR181a antisense PNA miR181a-2 <400> 49 tcaccgacag cgttgaatgt 20 <210> 50 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR23a antisense PNA miR23a-1 <400> 50 tccctggcaa tgtga 15 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR23a antisense PNA miR23a-2 <400> 51 ggaaatccct ggcaatgtga 20 <210> 52 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR19b antisense PNA miR19b-1 <400> 52 tgcatggatt tgcac 15 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR19b antisense PNA miR19b-2 <400> 53 agttttgcat ggatttgcac 20 <210> 54 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR20a antisense PNA miR20a-1 <400> 54 cactataagc acttt 15 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR20a antisense PNA miR20a-2 <400> 55 acctgcacta taagcacttt 20 <210> 56 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let7g antisense PNA let7g-1 <400> 56 caaactacta cctca 15 <210> 57 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let7g antisense PNA let7g-2 <400> 57 acaaactact acctc 15 <210> 58 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let7g antisense PNA let7g-3 <400> 58 tacaaactac tacct 15 <210> 59 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let7g antisense PNA let7g-4 <400> 59 gtacaaacta ctacc 15 <210> 60 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let7g antisense PNA let7g-5 <400> 60 tgtacaaact actac 15 <210> 61 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let7g antisense PNA let7g-6 <400> 61 ctgtacaaac tacta 15 <210> 62 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let7g antisense PNA let7g-7 <400> 62 actgtacaaa ctact 15 <210> 63 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR34a antisense PNA miR34a-1 <400> 63 agctaagaca ctgcc 15 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR34a antisense PNA miR34a-2 <400> 64 caaccagcta agacactgcc 20 <210> 65 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR30a antisense PNA miR30a-1 <400> 65 gtcgaggatg tttac 15 <210> 66 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR146a antisense PNA miR146a-1 <400> 66 tggaattcag ttctc 15 <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR146a antisense PNA miR146a-2 <400> 67 ccatggaatt cagttctc 18 <210> 68 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR130a antisense PNA miR130a-1 <400> 68 ttttaacatt gcact 15 <210> 69 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR130a antisense PNA miR130a-2 <400> 69 cccttttaac attgcact 18 <210> 70 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR155 antisense PNA miR155-1 <400> 70 tcacgattag catta 15 <210> 71 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR155 antisense PNA miR155-2 <400> 71 ctatcacgat tagca 15 <210> 72 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR373 antisense PNA miR373-1 <400> 72 aaaatcgaag cactt 15 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR373 antisense PNA miR373-2 <400> 73 cccaaaatcg aagcactt 18 <210> 74 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR122 antisense PNA miR122-1 <400> 74 ccattgtcac actcc 15 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR122 antisense PNA miR122-2 <400> 75 acaccattgt cacactcc 18 <210> 76 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR145 antisense PNA miR145-1 <400> 76 cctgggaaaa ctgga 15 <210> 77 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR145 antisense PNA miR145-2 <400> 77 attcctggga aaactgga 18 <210> 78 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR191 antisense PNA miR191-1 <400> 78 ttttgggatt ccgtt 15 <210> 79 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR191 antisense PNA miR191-2 <400> 79 tgcttttggg attccgtt 18 <210> 80 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR193b antisense PNA miR193b-1 <400> 80 actttgaggg ccagt 15 <210> 81 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR802 antisense PNA miR802-1 <400> 81 tgaatctttg ttact 15 <210> 82 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR802 antisense PNA miR802-2 <400> 82 ggatgaatct ttgttact 18 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R peptide <400> 83 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg 1 5 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K peptide <400> 84 Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys 1 5 10 <210> 85 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control PNA <400> 85 gacaacaatg aatgt 15 <210> 86 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control PNA <400> 86 attaatgtcg gacaa 15 <210> 87 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA miR16 <400> 87 uagcagcacg uaaauauugg cg 22 <210> 88 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA miR221 <400> 88 agcuacauug ucugcugggu uuc 23 <210> 89 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA miR222 <400> 89 agcuacaucu ggcuacuggg ucuc 24 <210> 90 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR16 cloning oligomer miR16-F <400> 90 ctagacgcca atatttacgt gctgctacga attcaatccg t 41 <210> 91 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR16 cloning oligomer miR16-R <400> 91 ctagacggat tgaattcgta gcagcacgta aatattggcg t 41 <210> 92 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR221 cloning oligomer miR221-F <400> 92 aattcgaaac ccagcagaca atgtagctct gca 33 <210> 93 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR221 cloning oligomer miR221-R <400> 93 gagctacatt gtctgctggg tttcg 25 <210> 94 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR222 cloning oligomer miR222-F <400> 94 aattcgagac ccagtagcca gatgtagctc tgca 34 <210> 95 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR222 cloning oligomer miR222-R <400> 95 gagctacatc tggctactgg gtctcg 26

Claims (14)

10 내지 25 염기로 이루어지고, 마이크로RNA와 상보적으로 결합함으로써 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하는, 마이크로RNA 안티센스 PNA(Peptide Nucleic Acid).
제1항에 있어서, 마이크로RNA가 miR16, miR221, miR222, miR31, miR24, miR21, miR181a, miR23a, miR19b, miR20a, let7g, miR34a, miR30a, miR146a, miR130a, miR155, miR373, miR122a, miR145, miR191, miR193b 및 miR802 중 어느 하나인 안티센스 PNA.
제2항에 있어서, 서열번호 1 내지 4, 7, 11, 19, 21, 23, 26, 29 내지 32, 34 내지 36, 44, 47, 48, 51, 52, 54, 55, 59, 63, 65, 66, 68 내지 80, 및 82 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 안티센스 PNA.
제1항에 있어서, 펩타이드가 추가로 결합되어 있는 안티센스 PNA.
제4항에 있어서, 펩타이드가 PNA의 세포 내 도입을 증진시키기 위한 것인 안티센스 PNA.
제5항에 있어서, 펩타이드가 옥트레오타이드(Octerotide), Tat 펩타이드, NLS(Nuclear Localization Signal), 양이온성 펩타이드, H 부위, C-myc tag 서열, PTD(Protein Transduction Domain)-4, 트랜스포탄(Transportan), 세균 세포막 활성 펩타이드, NL1.1 결합 티로신 키나제 수용체, NL4c 결합 티로신 키나제 수용체, 최소 전사 활성화제, pAntp/페네트라틴, Gal 80 BP, 신호-서열 기초 펩타이드 (Ⅰ), 신호-서열 기초 펩타이드 (Ⅱ), 99mTc 킬레이팅 펩타이드, IGF1, 미토콘드리아 획득 펩타이드, YDEGE, M918 및 R6-Pen으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이거나 이로부터 유래된 것인 안티센스 PNA.
제6항에 있어서, 펩타이드가 서열번호 83 또는 84의 아미노산 서열을 갖는 것인 안티센스 PNA.
유효성분으로서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 마이크로RNA 안티센스 PNA를 포함하는, 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하기 위한 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 마이크로RNA 안티센스 PNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 활성이나 기능을 억제하는 방법.
제9항에 있어서, 마이크로RNA 안티센스 PNA를 양이온성 지질을 이용하여 세 포 내로 도입하는 방법.
마이크로RNA 안티센스 PNA의 존재 및 부재 하에서 각각 마이크로RNA의 발현량을 측정하여 비교하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA 안티센스 PNA의 효과를 평가하는 방법.
제11항에 있어서, 리포터 유전자, 노던 블랏, 마이크로어레이, 실시간PCR, 인 비보/인 시튜 혼성화 또는 표지화를 이용하여 마이크로RNA의 발현량을 측정하는 방법.
제12항에 있어서,
(a) 안티센스 PNA를 리포터 유전자를 포함하는 대조 벡터와, 리포터 유전자 및 표적 마이크로RNA에 대한 결합 서열을 포함하는 실험 벡터와 혼합한 후, 세포 내로 도입하고;
(b) 단계 (a)의 대조 벡터와 실험 벡터로부터 리포터 유전자의 발현량을 각각 측정 비교하는;
단계를 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 24~36시간 동안 세포를 배양한 후 마이크로RNA의 발현량을 측정하는 방법.
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