KR101002166B1 - 재조합형 ｇｓｔ 융합 단백질의 정제방법 - Google Patents

재조합형 ｇｓｔ 융합 단백질의 정제방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101002166B1
KR101002166B1 KR1020090029924A KR20090029924A KR101002166B1 KR 101002166 B1 KR101002166 B1 KR 101002166B1 KR 1020090029924 A KR1020090029924 A KR 1020090029924A KR 20090029924 A KR20090029924 A KR 20090029924A KR 101002166 B1 KR101002166 B1 KR 101002166B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gst
fusion protein
protein
gsh
gst fusion
Prior art date
Application number
KR1020090029924A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100111476A (ko
Inventor
이진화
Original Assignee
동서대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 동서대학교산학협력단 filed Critical 동서대학교산학협력단
Priority to KR1020090029924A priority Critical patent/KR101002166B1/ko
Publication of KR20100111476A publication Critical patent/KR20100111476A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101002166B1 publication Critical patent/KR101002166B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01018—Glutathione transferase (2.5.1.18)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 친화성 크로마토그래피를 통하여 글루타티온-S-전이효소 (GST, glutathione-S-transferase) 융합 단백질을 정제하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (1) GST 융합 단백질 유전자를 함유하는 균주를 배양하는 단계와, (2) 상기 (1) 단계에서 배양된 배양액을 원심분리하여 세포가 용리된 용리액을 얻는 단계와, (3) 상기 (2) 단계의 용리액을 글루타치온(GSH, glutathione) 결합 수지에 적용하여 GSH 친화성 컬럼에 GST 융합 단백질을 결합시키는 단계와, (4) 포름산을 함유하는 용리 완충액으로 GST 융합 단백질을 용리하는 단계, 및 (5) GST 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합형 GST 융합 단백질의 정제방법에 관한 것이다.
상기 정제방법에 의하면, GST에 융합된 단백질 고유의 구조적, 기능적 특성에 영향을 미치지 않으면서 고순도의 GST 융합 단백질을 얻을 수 있으며, 용리완충액으로서 GSH를 사용하는 경우에 비하여 비용 면에서 효율적이다.
GST 융합 단백질, 사이클로필린 A, 포름산, 친화성 크로마토그래피, GSH 결합 수지

Description

재조합형 ＧＳＴ 융합 단백질의 정제방법{Method for purification of recombinant GST-fusion protein}
본 발명은 친화성 크로마토그래피를 통하여 GST 융합 단백질을 정제하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (1) GST 융합 단백질 유전자를 함유하는 균주를 배양하는 단계와, (2) 상기 (1) 단계에서 배양된 배양액을 원심분리하여 세포가 용리된 용리액을 얻는 단계와, (3) 상기 (2) 단계의 용리액을 GSH 결합 수지에 적용하여 GSH 친화성 컬럼에 GST 융합 단백질을 결합시키는 단계와, (4) 포름산을 함유하는 용리 완충액으로 GST 융합 단백질을 용리하는 단계, 및 (5) GST 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합형 GST 융합 단백질의 정제방법에 관한 것이다.
글루타티온-S-전이효소 (GST, glutathione-S-transferase) 융합 단백질은 박테리아 및 포유류의 세포에서 끌어 내림 (pull-down) 또는 친화성-침전 시험법을 통한 단백질-단백질 간의 상호작용의 연구에 널리 이용된다.
일반적으로 GST 융합 단백질은, 과 발현된 GST 융합 단백질을 친화성 크로마토그래피를 통해 글루타티온(GSH)-결합 수지에 결합시킨 후, 과량의 환원된 GSH 를 포함하는 용리 완충액에 의해 용리시키는 방식에 의하여 정제된다. GSH가 GSH 결합 수지와 경쟁을 통하여 GST 융합 단백질을 용리하는 것이다. 그러나 이 기술은, GSH 결합 수지와 비 특이 단백질 사이의 결합이 약하여 GST-융합 단백질의 순도가 감소하고, 용리된 GST-융합 단백질 시료 내에 GSH가 잔존하는 등의 한계가 있다. 또한, 과량의 GSH가 용리 용액으로 소비되어야 하기 때문에, 비용이 많이 드는 문제가 있다. 한편, GST에 융합되는 단백질은 정제 과정을 거치는 동안 그 기능이 변성되지 않아야 한다.
이에, 본 발명자들은 융합 단백질의 기능에 영향을 미치지 않으면서 저비용으로 고순도의 GST 융합 단백질을 정제하는 새로운 방법을 개발하고자 노력한 결과, GSH 친화성 크로마토그래피에 의한 정제에 있어서 용리 완충액으로 2% 포름산을 사용할 경우, GST에 융합된 단백질 고유의 구조적, 기능적 특성에 영향을 미치지 않으면서 저렴한 비용으로 고순도의 GST 융합 단백질을 얻을 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 (1) GST 융합 단백질 유전자를 함유하는 균주를 배양하는 단계와, (2) 상기 (1) 단계에서 배양된 배양액을 원심분리하여 세포가 용리 된 용리액을 얻는 단계와, (3) 상기 (2) 단계의 용리액을 GSH 결합 수지에 적용하여 GSH 친화성 컬럼에 GST 융합 단백질을 결합시키는 단계와, (4) 포름산을 함유하는 용리 완충액으로 GST 융합 단백질을 용리하는 단계, 및 (5) GST 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합형 GST 융합 단백질의 정제방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) GST 융합 단백질 유전자를 함유하는 균주를 배양하는 단계와, (2) 상기 (1) 단계에서 배양된 배양액을 원심분리하여 세포가 용리된 용리액을 얻는 단계와, (3) 상기 (2) 단계의 용리액을 GSH 결합 수지에 적용하여 GSH 친화성 컬럼에 GST 융합 단백질을 결합시키는 단계와, (4) 포름산을 함유하는 용리 완충액으로 GST 융합 단백질을 용리하는 단계, 및 (5) GST 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합형 GST 융합 단백질의 정제방법에 관한 것이다.
상기 단계 (1) 은 GST 융합 단백질 유전자를 함유하는 균주를 배양하는 단계로서, 보다 구체적인 양태로서, i) 목적단백질을 코딩하는 DNA 서열을 제조하는 단계, ii) 상기 DNA 서열을 GST 코딩 DNA 서열을 포함하는 벡터에 작동가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계, iii) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계, 및 iv) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기 에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 용어, "GST(Glutathione-S-Transferase)"는 생체 내에서 다양한 유해독성 물질의 해독작용 및 신진대사에 관여하는 효소로서, 신체의 거의 모든 세포에 존재하고, 지질, 빌리루빈(bilirubin), 헴, 스테로이드 및 담즙염류 등 여러 소수성 및 양극성(amphipathic) 물질의 운반에 관여한다. 또한, 전자 친화성 기질을 글루타치온(GSH, glutathione)에 결합시키는 반응 촉매 역할을 하여, 글루타치온(Glu-Cys-Gly) 에서 -S-S 로 유지되는 3차 내지 4차 구조를 -SH로 환원시켜 활성 형태(active form)를 유지시키는 기능을 한다.
본 발명에서 GST 는 목적 단백질의 분리 및 정제를 용이하게 하기 위한 수단으로서 이용된다. GST 는 유전 공학 기술을 이용하여 단백질을 발현할 때 일반적으로 사용되는 융합 파트너이다. GST는 융합 단백질의 생산량 및 용해성(solubility)을 증가시키기도 하며, 고정화(immobilized) 글루타치온(예를 들면, 글루타치온 친화 크로마토그래피) 또는 상업적으로 가용한 GST 항체를 이용하여 정제 및 검출이 용이해지는 장점을 가지고 있다. 또한 트랜스퍼라제 활성을 측정함으로써 GST 융합 단백질의 정량도 가능하다.
본 발명에서 용어, "융합 단백질(fusion protein)"이란 두 개 이상의 단백질에서 유래한 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 폴리펩타이드를 말하며, 주로 두 개 이상의 단백질에서 유래한 아미노산을 코딩하는 핵산 서열을 재조합적으로 연결하여 하나의 융합 단백질을 제조하게 된다. 따라서, 본 발명에서 "GST 융합 단백질" 이란 GST 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 서열과, 목적 단백질을 코딩 하는 핵산 서열을 재조합적으로 연결하여 생산된 융합 단백질을 말한다.
본 발명에서, GST 와 융합될 수 있는 목적 단백질은 생물학적 활성 폴리펩티드가 제한 없이 사용될 수 있으며, 예컨대, 사이클로필린, 호르몬, 효소, 사이토카인, 과립구 콜로니 자극인자, 적혈구 생성인자, 베타셀룰린(betacellulin, BTC) 또는 항체 등이 사용될 수 있다. 구체적으로, 성장호르몬 방출 호르몬, 성장호르몬 방출 펩타이드, 인터페론 수용체류(예: 인터페론-알파, -베타 및 -감마, 수용성 타입 I 인터페론 수용체 등), 과립구-마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 글루카콘-유사 펩타이드류(GLP-1등), 지프로테인 관련수용체(G-protein-coupled receptor), 인터루킨류(예: IL-1 수용체, IL-4 수용체 등), 효소류(예: 글루코세레브로시다제 등), 인터루킨 및 사이토카인 결합 단백질류(예: IL-18bp, TNF-결합 단백질 등), 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin), 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포이에틴류(angiopoietin), 헤모글로빈, 트롬빈(thrombin), 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린(thrombomodulin), 혈액인자 Ⅶ, 혈액인자 Ⅶa, 혈액인자 Ⅷ, 혈액인자 Ⅸ, 혈액인자 XIII, 플라즈미노겐 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘(hirudin), 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴(angiostatin), 안지 오텐신(angiotensin), 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌(elcatonin), 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor), 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류(예: 신경 성장인자, 모양체 신경영양인자(cilliary neurotrophic factor), 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1), 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide), 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor), 네트린(netrin), 중성구 억제인자(neurophil inhibitor factor), 신경영양인자, 뉴트린(neuturin) 등), 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 시크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신(autotaxin), 락토페린(lactoferrin), 미오스타틴(myostatin), 수용체류(예: TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, B 세포 활성인자 수용체 등), 수용체 길항물질(예: IL1-Ra 등), 세포표면항원(예: CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 등), 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편류(예: scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd), 바이러스 유래 백신 항원 등 다양한 종류를 포함할 수 있다.
바람직하게는 사이클로필린 패밀리 단백질의 경우 본 발명의 정제방법에 더욱 효과적일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 사이클로필린 A가 본 발명의 정제방법에 더욱 효과적이다. 사이클로필린 A (CypA)는 사이토솔릭에 존재하는 인간 펩티딜프로릴 이성화효소 A로서, 펩티딜 프로릴 시스 트랜스 이성화효소 (PPIase)와 샤페 론 활성이 있고, 단백질 접힘을 촉진하는 단백질이다.
GST 융합 단백질의 제조함에 있어서, 우선 i) 목적단백질을 코딩하는 DNA 서열을 제조하는 단계를 수행하는 것이 바람직하다. 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 화학적 합성법, RT-PCR 등 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조할 수 있으나, 바람직하게는 목적 단백질의 DNA를 주형으로 하고, 상기 목적 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하는 PCR을 통하여 제조하는 것이 바람직하다. 상기 목적 유전자 증폭용 프라이머는 예를 들면, 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해, 나랭(Narang) 등의 포스포트리에스테르 방법, 보카지(Beaucage) 등의 디에틸포스포라미다이트 방법 및 미국 특허 제4,458,066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 다양한 방법으로 제조할 수 있다.
다음으로, ii) 상기에서 수득한 목적 단백질의 DNA 서열을 GST를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터에 작동가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계를 수행할 수 있다. GST와 목적 단백질이 융합된 형태의 융합 단백질을 제조하기 위해서는 GST 코딩 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 당업계에 일반적으로 사용되는 GST 유전자를 포함하는 발현 벡터라면 모두 제한 없이 사용할 수 있다. 한 양태로서 대장균이 숙주 세포로 이용되는 경우에는 pGEX 벡터(예, pGEX-2T 또는 pGEX-KG, Amersham) 또는 pET 벡터(Novagen)가 이용될 수 있다. 다른 양태로서 진핵 숙주 세포가 이용되는 경우에는 pESP 벡터(Stratagen)를 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 목적상 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 인트론, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 더 포함할 수 있다.
다음으로, iii) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계를 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 GST 융합 단백질의 코딩 DNA 서열을 발현시키는 데에는 매우 다양한 단핵세포성 숙주세포가 이용될 수 있다. 이들 숙주에는 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 마우스 세포와 같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포 및 조직배양된 인간 세포 및 식물 세포들이 포함된다. 바람직한 숙주 생명체로는 이. 콜라이 및 곤충 세포가 포함된다.
본 발명에서 숙주세포로의 “형질 전환” 또는 “형질감염”은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
다음으로, iv) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계를 수행할 수 있다. 본 발명에 따라 형질전환된 숙주 세포들은 공지된 기술을 이용하여 융합 단백질의 생산에 적합한 영양 배 지에서 배양된다. 예를 들어서, 세포들은 적당한 배지와 폴리펩타이드가 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 쉐이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지된 기술을 사용해서 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적절한 영양배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적인 공급자로부터 입수하거나 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있다. 융합 단백질이 배지로 직접 분비된다면 배지로부터 직접 분리할 수 있으며, 분비되지 않는다면 세포의 여액(lysate)으로부터 분리할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 라투스(rattus)의 사이클로필린A (cypA) 유전자를 주형으로 사용한 PCR 방법에 의해 CypA DNA 서열을 준비하고, 이를 pGEX-KG 플라스미드 안으로 연결하여 재조합 벡터 pGEX-KG/CypA 를 제조하였다 (도 1). 또한, pGEX-KG/CypA 를 E. coli TOP10F 균주에 형질전환하여 37℃, 5 ㎖ LBA 배지에서 철야로 배양하였다.
본 발명의 정제방법에 있어서, 단계 (2) 는 상기 (1) 단계에서 배양된 배양액을 원심분리하여 세포가 용리된 용리액을 얻는 단계이다.
이 단계에서는, 원심분리 또는 여과에 의해 세포 펠렛(cell pellet)을 수득하고, 파열된 세포벽 또는 세포막이 포함된 배지 성분들을 제거함으로써 세포파쇄물(cell lysate)을 포함하는 용리액을 얻는다. 구체적으로, 세포 펠렛은 당업계에 잘 알려진 방법, 예컨대 알칼리, 계면활성제 (CHAPS 및 SDS 등), 유기 용매 및 효소 (라이소자임 등)의 사용, 초음파처리(sonicatino) 및 고압분쇄기(French Press)의 사용, 주기적인 고온, 압력, 냉동 및 해동 사이클의 적용 등에 의하여 파쇄(lysis)할 수 있다. 상기에서 얻은 세포 파쇄물은 세포분획(fractionation)응ㄹ 통해 세포 파쇄물 내의 바이오매스의 최소 영역을 제거함으로써 깨끗한 용리액을 얻을 수 있는데, 예컨대 원심분리를 통해 세포의 파쇄되지 않은 부분 또는 불용성 세포 파편이 없는 상층액을 취함으로써 깨끗한 용리액을 얻을 수 있으며, 필요하다면 기타 당업계에 알려진 추가적인 정제과정을 거칠 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 원심분리로 얻은 세포 펠렛을 -80℃에서 동결시키고 1X PBS (phosphate buffered saline)의 10 ㎖에 재현탁시킨 후, 0.5% Triton X-100으로 처리하였다. 냉동 및 해동의 한 주기 후, 세포를 5초간 초음파처리 및 5초간 중지의 반복 과정을 거쳐 400W에서 15분간 얼음 위에서 초음파 처리하고, 4℃에서 15분간 최대 속도로 원심분리하여 세포의 깨끗한 용해물을 얻었다.
본 발명의 정제방법에 있어서, 단계 (3)은 상기 (2) 단계의 용리액을 GSH 결합 수지에 적용하여 GSH 친화성 컬럼에 GST 융합 단백질을 결합시키는 단계이다.
본 발명에 따라 발현된 융합 단백질은 GST를 함유하고 있기 때문에 용이하게 분리 및 정제할 수 있다. 이때 사용될 수 있는 분리 및 정제 방법으로는 상기 GST와 특이적으로 결합할 수 있는 물질, 예컨대 GST에 대한 항체 또는 글루타치온(GSH) 를 이용한 친화 크로마토그래피가 포함되며, 글루타치온 친화 크로마토그 래피를 이용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에서 회수한 배양물을 글루타치온 친화 레진이 충진된 컬럼에 넣어서 상기 글루타치온 친화 레진에 GST 융합 단백질이 흡착되도록 한다. 글루타치온이 결합된 레진은 예컨대, GST 세파로오스 4B 컬럼(Pharmacia-LKB), 또는 마우스 항-GST-세파로오스® 4B 등을 사용할 수 있다. 또한, 단계 (3) 에서는 GST 융합 단백질이 결합된 GSH 친화성 컬럼을 제1 인산염칼륨 10 mM 및 NaCl 1 M을 함유하는 완충용액, 또는 200mM 염화 칼륨이 함유된 20mM 인산칼륨 완충용액으로 수차례 세척하여 컬럼 내에 잔류하는 불순물들을 제거하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 원심분리하여 얻은 세포의 깨끗한 용해물을 글루타티온 친화성 수지(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 컬럼에 적용하였다. 구체적으로, GST-CypA 융합 단백질이 결합된 GSH 친화성 컬럼을 제1 인산염칼륨 10 mM 및 NaCl 1 M을 함유하는 용리 완충액에 앞선 완충액 (pH 7.4)으로 세척하여 GSH-결합 수지에 비특이적으로 결합된 단백질을 제거하였다.
본 발명의 정제방법에 있어서, 단계 (4)는 포름산을 함유하는 용리 완충액으로 GST 융합 단백질을 용리하는 단계이다.
본 발명에서는 GSH 융합 단백질을 용출하기 위한 용리 완충액으로서 포름산을 사용하는 것에 특징이 있으며, 바람직하게는 2% 의 포름산을 사용한다. 포름산은 강한 양성자 주개 능력이 있기 때문에, 아미노산 잔기 사이의 비 특이적인 수소결합을 제거함으로써, 응집된 단백질을 용해시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 단계 (3)에서 세척용 완충용액으로 컬럼 내 잔류하는 불순물을 제거한 후, 용리 완충액으로서 2% 포름산을 컬럼 내에 통과시켜 줌으로써 앞서 레진에 흡착된 GST 융합 단백질을 용출한다. 상기 용출액을 투석 및/또는 SDS-PAGE 전기영동하여 추가로 GST 융합 단백질을 정제할 수도 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, GSH 컬럼에 결합된 GST-CypA 융합 단백질을 2% 포름산 및 0.15 M NaCl을 함유하는 용리 완충액 (pH 2.05)을 사용하여 용리하였다.
본 발명의 정제방법에 있어서, 단계 (5)는 GST 융합 단백질을 회수하는 단계이다.
상기와 같이 제조, 정제 및 회수된 GST 융합 단백질은 그 자체로 이용될 수 있고, 경우에 따라 GST를 절단하여 목적 단백질만을 분리하여 이용할 수도 있다. GST와 목적 단백질의 절단에는 다양한 단백질 분해효소(protease)들이 이용될 수 있으며, 이는 GST 코딩 서열을 포함하는 벡터에 따라 달라진다. 통상적으로 트롬빈(thrombin), 인자 Xa(Factor Xa) 및 엔테로키나제(Enterokinase) 등이 이용되지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 정제방법에 따른 효과를 확인하기 위하여, 모든 용출액을 바이오 라드 이코노 시스템으로 분별하고, 용리된 분획을 곧장 1M Tris-HCl, pH 8.45를 함유하는 완충액 안으로 취하여 중화한 후, 웨스턴 블롯 분석법에 의해 분석하였다 (도 4). 그 결과, 2% 포름산을 사용하였을 때, 전체 용리액에 대한 쿠마시 블루 염색에 의하여 GST-CypA 융합 단백질의 단일 밴드만이 나타남으로써 그 순도를 확인할 수 있었다 (도 5, 레인 3). 또한, 정제된 단백질의 GST 부분의 GSH 친화성 컬럼에 대한 친화력이 경감되지 않았으며, 정제된 단백질이 CypA 의 샤페론 활성과 유사한 활성을 보였으므로 융합 단백질의 특이적인 기능이 포름산을 이용한 정제 후에도 영향을 받지 않았다는 것을 알 수 있었다 (도 6 내지 8).
따라서, 본 발명의 정제방법은 GST에 융합된 단백질 고유의 구조적, 기능적 특성에 영향을 미치지 않으면서 저렴한 비용으로 고순도의 GST 융합 단백질을 얻을 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 GST-융합 단백질을 용리시키기 위하여 GSH 대신 2% 포름산을 함유하는 용리 완충액을 사용하고 산성을 띤 시료를 수집 완충액으로 중화하는 방법을 이용함으로써, GST에 융합된 단백질 고유의 구조적, 기능적 특성에 영향을 미치지 않으면서 고순도의 GST 융합 단백질을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 GSH와 비교할 때 포름산의 구입 비용이 저렴 (포름산은 GSH 가격에 1/20)하므로 비용 면에서 효율적이다. 더욱이, 잔존 단백질의 제거를 위해 PBS와 포름산을 합하여 사용하는 것은 컬럼상의 GSH 결합 수지의 재생산을 가능하게 한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: pGEX - KG / Cyp A 발현 벡터의 제조
CypA DNA 서열을 라투스(rattus)의 사이클로필린A (cypA) 유전자를 주형으로 사용한 PCR 방법에 의해 준비하였다. 라투스 CypA의 유전자 서열로부터 전위 프라이머로 5'-GGATCCTCCAGCAAGTATATAG CATGGCC-3'를, 전환 프라이머로 5'-GAATTCGCAGAT CGTCAGTCAGTCACGAT-3'를 선택하였다. 전위 프라이머와 전환 프라이머는 각각 BamHI와 EcoRI를 위한 인식 부위를 가지고 있다. PCR은 온도 프로파일이 93℃에서 3분, 93℃에서 1분(변성), 58.5℃에서 1분(어닐링), 72℃에서 1분(신장) 및 72℃에서 10분인 30 주기로 행하여 졌다. 정제 후 516 bp의 PCR 생성물을 BamHI와 EcoRI로 자르고, 이에 상응하는 제한 부위에서 pGEX-KG 플라스미드 안으로 연결하였다 (도 1). 연결 혼합물을 E. coli TOP10F 균주로 형질전환하고 pGEX-KG 플라스미드에 CypA 유전자가 있는 새로운 형질 변환체를 DNA 서열에 의해 확인하였다. 결과물인 재조합 벡터는 pGEX-KG/CypA로 지칭하였다.
실시예 2: GST - CypA 융합 단백질 발현의 유도
pGEX-KG/CypA가 있는 E. coli TOP10F 균주를 37℃, 5 ㎖ LBA 배지에서 철야로 배양하였다. 또 하나의 500 ㎖ LBA 배지에 접종하기 위해 철야로 배양하였다. 0.1 mM 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 GST-CypA 융합 단백질의 도입 을 위한 배양에 첨가하고 3시간 배양하였다.
원심분리로 세포를 얻은 후 펠렛을 -80℃에서 동결시키고 1X PBS (phosphate buffered saline)의 10 ㎖에 재현탁시킨 후, 0.5% Triton X-100으로 처리하였다. 냉동 및 해동의 한 주기 후, 세포를 5초간 초음파처리 및 5초간 중지의 반복 과정을 거쳐 400W에서 15분간 얼음 위에서 초음파 처리하였다.
이렇게 얻은 세포 용리액을 SDS-PAGE로 분석한 후, 제조물의 상기 단백질 성분을 확인하기 위하여 쿠마시 블루 염색을 하였다. 유도 전의 세포 용리액 (도 2, 레인 1)과 비교할 때, 용리 후의 세포 용리액 (도 2, 레인 2)의 경우 융합 단백질의 발현에 있어서 분명한 증가를 보였다. 또한, GST-CypA 융합 단백질의 존재는 항 CypA항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 증명하였다. 기대하였던 것과 같이, 구성 벡터는 47 KDa 융합 단백질을 코딩하고, CypA(Mr 18KDa)과 GST(Mr ~29KDa) 사이 융합에 일치하였다 (도 2, 레인 3). GST 융합 단백질의 양을 측정하기 위하여, 단백질 농도 기준으로 BSA 0.5, 1, 2 및 3㎍을 세포 조 추출물 2, 10, 20 및 30㎍과 비교하였다 (도 3, 레인 5~8). GST-CypA 융합 단백질은 세포 조 추출물의 약 15%를 차지하였다.
실시예 3: GST - CypA 융합 단백질의 정제
실시예 2에 기재된 바와 같은 방법으로 GST-CypA 융합 단백질을 발현시킨 후, 원심분리로 세포를 얻은 후 펠렛을 -80℃에서 동결시키고 1X PBS (phosphate buffered saline)의 10 ㎖에 재현탁시킨 후, 0.5% Triton X-100으로 처리하였다. 냉동 및 해동의 한 주기 후, 세포를 5초간 초음파처리 및 5초간 중지의 반복 과정을 거쳐 400W에서 15분간 얼음 위에서 초음파 처리하였다. 4℃에서 15분간 최대 속도로 원심분리 후 세포의 깨끗한 용해물을 글루타티온 친화성 수지(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 컬럼에 적용하였다.
GST-CypA 융합 단백질이 결합된 GSH 친화성 컬럼을 제1 인산염칼륨 10 mM 및 NaCl 1 M을 함유하는 용리 완충액에 앞선 완충액 (pH 7.4)으로 세척하여 GSH-결합 수지에 비특이적으로 결합된 단백질을 제거하였다. GSH 컬럼에 결합된 GST-CypA 융합 단백질을 2% 포름산 및 0.15 M NaCl을 함유하는 용리 완충액 (pH 2.05)을 사용하여 용리하였다. 모든 용출액을 바이오 라드 이코노 시스템으로 분별하였다 (도 4, 상부 패널). 용리된 분획을 곧장 1M Tris-HCl, pH 8.45를 함유하는 완충액 안으로 취하여 중화한 후, 웨스턴 블롯 분석법에 의해 분석하였다 (도 4, 하부 패널).
다량의 GSH로 비 효율적인 용리의 결과로서 관찰되는 것과 같은 넓은 용리 프로파일과 비교할 때, 4개의 분획에서 뚜렷하고 좁은 1개가 나타났다 (전체 부피 2 ㎖). 재용리 과정에 의해서는 새로운 피크가 만들어지지 않았는데, 이는 2% 포름산에 의한 1 단계 용리가 거의 완벽하게 GST-CypA 융합 단백질을 용리한다는 것을 나타내는 것이다. 바이오 라드 이코노 시스템으로 분별하는 동안 피크를 나타내는 4개의 분획만이 GST-CypA 융합 단백질을 함유하고 있다는 것이 웨스턴 블롯 분석에 의하여 확인되었다 (도 4, 하부 패널). 2% 포름산을 사용하였을 때, 전체 용리액에 대한 쿠마시 블루 염색에 의하여 GST-CypA 융합 단백질의 단일 밴드만이 나타남으로써 그 순도가 확인되었다 (도 5, 레인 3). 반대로 GSH에 의하여 얻어진 용리액은 GST-CypA 융합 단백질 밴드만이 아니라 수개의 부가적인 밴드가 나타났다 (도 5, 레인 2).
순도가 현저히 고순도인 한편, 정제된 GST-CypA 융합 단백질은 단지 2.6 ㎎/100㎖ 배양만이 얻어졌다 (표 1). 세포 조 추출물의 0.69%를 차지하는 이 값은 BSA 단백질 농도기준과 비교하여 측정된 약 15%정도의 값보다 현저히 작았다. 그러나 2% 포름산에 의하여 얻은 GST-CypA 융합 단백질의 수율은 GSH를 사용하여 얻은 것보다 약 40% 정도 높았다 (표 1). E.coli에서 재조합 단백질의 과 발현은 불용성 물질과 비활성 집합체 (aggregation), 즉 봉입체의 형성을 초래한다.
정제된 재조합 GST-CypA 융합 단백질이 봉입체보다는 가용성 분획에서 얻어지기 때문에, 본 발명의 과정으로부터 비교적 낮은 수율이 기대되었다 (표 1). 그러나, 봉입체에의 최적의 용해는 GST-CypA 융합 단백질의 수율을 더 증가시킬 수 있다.
[표 1] GST-CypA 융합 단백질의 산출
파라미터 과량의 GSH를 함유하는 용리 완충액 2% 포름산을 함유하는
용리 완충액
전체 단백질의 양 2.5 ga 2.5 ga
GST-CypA의 양 0.375 g (100%)b 0.375 g (100%)b
GSH 친화성 크로마토그래피 후 GST-CypA 단백질 1.9 mg (0.51%)c 2.6 mg (0.69%)c
a 박테리아 배양의 100 ㎖ 기준. Bradford 분석법으로 측정.
b SDS-PAGE 겔 후 BSA 표준과 비교하여 측정.
c GSH 친화성 컬럼의 피크 면적 적분과 Bradford 분석법으로 측정.
본 발명에서 사용된 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석법은 다음과 같은 방식으로 행하여 졌다.
SDS - PAGE 및 웨스턴 블롯 분석
전체의 세포 용리액을 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하였다. 상기 겔을 아세트산 중의 0.05% 쿠마시 블루 및 25% 이소프로파놀로 30분간 염색하고, 10% 아세트산 및 10% 메탄올로 탈색하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 이동시킨단백질을 Ponceau S 염색에 의해 평가하고, TBST (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20) 중의 1.5% 소혈청 알부민 (BSA)안에 실온에서 2시간 봉쇄하였다. 니트로셀룰로스(NC) 막을 제1 항체와 함께 1시간 배양하였다. TBST로 막을 세척한 후, 1:2000 희석한 HRP-접합 제2 항체와 함께 배양하고, 항체 특이적 단백질을 SantaCruz Biotechnology, CA에서 제시된 방법에 따라 강화된 화학발광감지 시스템을 사용하여 관찰하였다. 항-CypA 항체를 Upstate Biotechnology로부터 획득하였다(Lake Placid, NY).
실시예 4: 용리된 GST - CypA 융합 단백질의 기능 보유 확인
CypA는 펩티딜 프로릴 시스 트랜스 이성화효소 (PPIase)와 샤페론 활성이 있는 풍부하게 발현된 사이토솔릭 단백질로, 이는 단백질 접힘에 필수적이다. 따라서, 고도로 정제된 GST-CypA 융합 단백질을 얻은 후, 단백질의 기능이 손상되지 않 은 채로 남아있다는 것을 증명하기 위하여, 정제된 단백질의 GST 부분의 GSH 친화성 컬럼에 대한 친화력을 측정하고, CypA부분의 PPIase 및 샤페론 활성을 평가하였다.
정제된 GST 융합 단백질상의 GST 와 GSH 사이의 친화력 확인
정제된 단백질의 GST와 GSH 사이의 친화력을 모니터하기 위하여, 용리된 융합 단백질을 GSH 결합 수지에 재도입하고, SDS-PAGE와 쿠마시 블루 염색에 의하여 평가하였다. 도 6에서 알 수 있듯이, 포름산으로 정제된 단백질은 여전히 GSH 결합 수지상의 GSH에 대한 친화력이 경감되지 않았으며, 겔 상의 2개의 GST 융합 단백질 사이에 위치 및 양에서 가시적인 차이가 관찰되지 않았다.
펩티딜 프로릴 시스 -트랜스 이성화효소 시험
펩티딜 프로릴 시스 트랜스 이성화효소(PPIase) 활성을 위한 수정된 방법을 논문 (Hong F, Lee J, Song J W, Lee S J, Ahn H, Cho J J , Ha J & Kim S S (2002)FASEB J 16, 1633-1635)에 이미 기술된 바와 같이 키모트립신과 함께 한 쌍의 시험법으로 사용하였다. 펩타이드 기질 N-숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로아닐라이드를 470 mM LiCl과 함께 트리플루로에탄올에 용해시켜 100 mM 스톡 용액을 만들었다. 이 스톡 용액은 사용 직전에 4 mM로 희석하였다. GST-CypA를 50 mM HEPES 와 86 mM NaCl, pH 8.0 (PPIase buffer)에 희석하여 2μM 스톡을 산출하였다. 1 입방 센티미터 큐벳에서 단백질 (최종 농도 20 nM) 10 ㎕를 860 ㎕의 PPIase 완충액 에 첨가하였다. 이 반응은 펩티드 기질 30 ㎕ (120 μM)를 첨가한 후, 급속 혼합 및 애머샴 바이오사이언스 분광 광도계 (Amersham Biosciences Spectrophotometer)로 400 nm에서 흡수를 측정함으로써 개시되었다.
IIPase 활성 분석에서, 이성질화 속도는 정제된 단백질에 의하여 급격하게 증가하고 Cyp 결합 약물 시클로스포린 A (CsA), PPIase 억제제에 의하여 완벽하게 억제되었다 (도 7).
GSH에 의하여 용리된 GST-CypA 융합 단백질은 유사한 활성을 보였다. 이러한 결과는 융합 단백질의 특이적인 기능이 포름산을 이용한 정제 후에도 영향을 받지 않았다는 것을 증명하는 것이다.
샤페론 활성 시험
42℃에서 미토콘드리아 시트르산 합성효소(CS)의 열 응집성에 대한 정제된 GST-CypA 융합 단백질의 효과를 논문 (Jakob U, Lilie H, Meyer I & Buchner J (1995) J Biol Chem 270, 7288-7294)에서와 같은 방법으로 관찰하였다. CS의 열 응집성은 애머샴 바이오사이언스 분광 광도계를 사용하여 360 nm에서 측정을 통해 결정되었다. 이 실험을 위해 30 μM CS를 사용하였다. 재생은 40 mM HEPES, 20 mM KOH, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM 아세트산 마그네슘 및 0.5 mM EDTA, pH 7.5 (Buffer A)를 포함한 재생 완충액으로 200 배 희석을 통하여 개시되었다. 42℃로 미리 가열한 Hsp90 또는 GST-CypA를 함유한 완충액에서 10분간 용해된 CS를 65분 동안 측정하였 다.
샤페론 활성 분석에서, 비록 GST-CypA 융합 단백질의 최대 활성이 Hsp90보다 약간 낮을지라도, 정제된 단백질은 CS 단독인 경우와 비교할 때 함량 의존적인 방식으로 CS의 열 응집체를 유의적으로 억제하였다. 변성 CS의 응집체를 억제하는 공지의 분자 샤페론인 Hsp90은 샤페론 활성의 긍정적인 조절자로서 이용되었다 (도 8).
GSH에 의하여 용리된 GST-CypA 융합 단백질은 유사한 활성을 보였다. 이러한 결과는 융합 단백질의 특이적인 기능이 포름산을 이용한 정제 후에도 영향을 받지 않았다는 것을 증명하는 것이다.
도 1 내지 3은 GST-CypA 융합 단백질의 정량과 발현을 나타낸 것이다. 도 1 은 재조합 발현 벡터 pGEX-KG/사이클로필린 A의 지도를 나타낸 것이고, 도 2는 IPTG로 유도 전 후 E. coli 의 세포 조 추출물의 분석을 나타낸 것이며 [레인 M: 분자량 표지; 레인 1: 유도 전 전체 세포 조 추출물; 레인 2: 유도 후 세포 조 추출물; 레인 3: 항-CypA 항체를 사용하여 IPTG로 유도 후 세포 조 추출물의 웨스턴 블롯 분석], 도 3은 GST-CypA 융합 단백질과 BSA 표준 단백질의 비교를 나타낸 것 [레인 M: 분자량 표지; 레인 1-4: BSA 0.5, 1, 2, 3 ㎍; 레인 5-8: 유도된 세포 세포 조 추출물 각각 2, 10, 20 및 30 ㎍. 단백질은 12% SDS-PAGE 겔로 분리하고 쿠마시 블루(coomassie blue)로 염색하였다]이다.
도 4 및 5는 2% 포름산을 함유하는 용리 완충액을 사용한 GST-CypA 융합 단백질의 정제를 나타낸 것이다. 도 4의 상부 패널은 크로마토그램의 차트 기록으로, 융합 단백질은 2% 포름산과 0.15M NaCl, pH 2.05를 함유하는 용리 완충액으로 용리시킨다 (최고점). 도 4의 하부 패널은 항-CypA 항체를 사용하여 상이한 용리 단계에서 정제된 GST-CypA 융합 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다 [레인 1-8: 상이한 단계에서의 각 용리액; 레인 9: 전체 세포 조 추출물]. 도 5는 SDS-PAGE 및 세포 용리액의 쿠마시 블루 염색 (레인 1), GSH 용리 방법에 의한 용리액 (레인 2) 및 2% 포름산 용리 방법에 의한 용리액 (레인 3)을 나타낸 것이다.
도 6 내지 8은 용리된 GST-CypA 융합 단백질 기능의 잔존을 나타낸 것으로, 도 6은 용리된 GST-CypA 융합 단백질의 GSH 결합 활성을 나타낸 것으로서 여기서 단백질은 12% SDS-PAGE 겔로 분리하고 쿠마시 블루로 염색한다 [레인 M: 분자량 표지; 레인 1: 2% 포름산을 함유하는 용리 완충액에 의한 용리액; 레인 2: 새로운 GSH-결합 수지에 결합한 레인 1 생성물로부터 새로운 용리액]. 도 5는 PPIase 활성 분석을 나타낸 것이다 [20 nM GST-CypA의 존재하의 촉매 효과 (채워진 원)와 20 nM GST-CypA 융합 단백질의 존재하에 사이클로필린 결합 약물인 사이클로포린 A(CsA) 10 nM에 의한 이성화 반응의 억제 (빈 원)]. 도 8은 샤페론 활성 분석을 나타낸 것이다 [150 nM CS (채워진 삼각형), 150 nM CS 및 200 nM Hsp90 (빈 삼각형), 150 nM CS 및 200 nM GST-CypA 융합 단백질(빈 원), 및 150 nM CS 및 500 nM GST-CypA 융합 단백질(채워진 원)의 존재 하에 CS의 열 응집].

Claims (7)

  1. (1) GST 융합 단백질 유전자를 함유하는 균주를 배양하는 단계와,
    (2) 상기 (1) 단계에서 배양된 배양액을 원심분리하여 세포가 용리된 용리액을 얻는 단계와,
    (3) 상기 (2) 단계의 용리액을 GSH 결합 수지에 적용하여 GSH 친화성 컬럼에 GST 융합 단백질을 결합시키는 단계와,
    (4) 2% 포름산을 함유하는 용리 완충액으로 GST 융합 단백질을 용리하는 단계, 및
    (5) GST 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 용리 완충액으로 2% 포름산을 사용하는 것에 특징이 있는 재조합형 GST 융합 단백질의 정제방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1) 은 i) 목적단백질을 코딩하는 DNA 서열을 제조하는 단계, ii) 상기 DNA 서열을 GST 코딩 DNA 서열을 포함하는 벡터에 작동가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계, iii) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키는 단계, 및 iv) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는 것인, GST 융합 단백질의 정제방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 GST에 융합되는 단백질은 사이클로필린, 호르몬, 효소, 사이토카인, 과립구 콜로니 자극인자, 적혈구 생성인자, 베타셀룰린(betacellulin, BTC) 또는 항체인 것인 GST 융합 단백질의 정제방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 GST에 융합되는 단백질은 사이클로필린 A인 것인 GST 융합 단백질의 정제방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 (4)에 앞서 상기 단계 (3)의 GST 융합 단백질이 결합된 GSH 친화성 컬럼을 세척 완충액 으로 세척하는 단계를 더 포함하는 것인 재조합형 GST 융합 단백질의 정제방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계 (4)에서 용리된 분획을 1M Tris-HCl를 함유하는 완충액으로 중화하는 단계를 더 포함하는 것인 재조합형 GST 융합 단백질의 정제방법.
KR1020090029924A 2009-04-07 2009-04-07 재조합형 ｇｓｔ 융합 단백질의 정제방법 KR101002166B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090029924A KR101002166B1 (ko) 2009-04-07 2009-04-07 재조합형 ｇｓｔ 융합 단백질의 정제방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090029924A KR101002166B1 (ko) 2009-04-07 2009-04-07 재조합형 ｇｓｔ 융합 단백질의 정제방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100111476A KR20100111476A (ko) 2010-10-15
KR101002166B1 true KR101002166B1 (ko) 2010-12-17

Family

ID=43131721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090029924A KR101002166B1 (ko) 2009-04-07 2009-04-07 재조합형 ｇｓｔ 융합 단백질의 정제방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101002166B1 (ko)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mol Cancer Ther, October 2008, Vol 10, pp3247-3255.

Also Published As

Publication number Publication date
KR20100111476A (ko) 2010-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gu et al. Chromatographic methods for the isolation of, and refolding of proteins from, Escherichia coli inclusion bodies
Choi et al. Recombinant enterokinase light chain with affinity tag: expression from Saccharomyces cerevisiae and its utilities in fusion protein technology
Jenny et al. A critical review of the methods for cleavage of fusion proteins with thrombin and factor Xa
JP2014110816A (ja) 開始メチオニン残基が除去された免疫グロブリンＦｃ領域の大量生産方法
AU2006329215A1 (en) Process for the production of preformed conjugates of albumin and a therapeutic agent
CA2902210C (en) Chemical crosslinkers
US20220372074A1 (en) Production and Purification Method for Polypeptide
KR20040097114A (ko) 글루카곤 유사 펩타이드 1 glp-1(7-36)과 glp-1 유사체를 생산하는 방법
Guerrero Montero et al. Escherichia coli “TatExpress” strains export several g/L human growth hormone to the periplasm by the Tat pathway
CN109486800B (zh) 一种新型赖氨酰肽链内切酶及其制备方法
US20160083713A1 (en) Novel peptidyl alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyases
Di Cesare et al. High-yield production of PASylated human growth hormone using secretory E. coli technology
US9611466B2 (en) Modified enterokinase light chain
CN109439643B (zh) 一种新型赖氨酸特异性内切酶及其制备方法
EP4067373A1 (en) Multifunctional multispecific multimeric biomolecule polymer having prolonged in-vivo duration
KR102155982B1 (ko) 폴리유비퀴틴 링커에 결합된 선형 다기능성 멀티머 생체분자 및 이의 용도
KR101002166B1 (ko) 재조합형 ｇｓｔ 융합 단백질의 정제방법
David et al. Semisynthesis and application of carboxyfluorescein-labelled biologically active human interleukin-8
Liu et al. Large scale preparation of recombinant human parathyroid hormone 1–84 from Escherichia coli
KR20190003694A (ko) 재조합 단백질을 생성시키는 방법
EP3741774A1 (en) N-terminal fusion partner for producing recombinant polypeptide, and method for producing recombinant polypeptide using same
RU2584572C2 (ru) Способ получения полипептида, конъюгированного с поли(этиленгликолевым) фрагментом, нуклеиновая кислота и слитый полипептид, предназначенные для применения в способе
KR100618563B1 (ko) 셀룰로오스 결합 도메인을 이용한 효모에서 재조합단백질의 제조방법
KR101099398B1 (ko) ＯｍｐＴ 프로테아제 변이체를 이용한 폴리펩티드의 절단 방법
RU2805307C1 (ru) Мультифункциональный мультиспецифический мультимерный биомолекулярный полимер, имеющий пролонгированную эффективность in vivo

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130628

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140627

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150623

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161207

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171201

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181203

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191202

Year of fee payment: 10