KR101000889B1 - 근적외선 분광기를 이용한 산물벼의 비파괴적 현미 및 백미단백질 함량 측정 방법 - Google Patents
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Abstract
산물벼를 이용한 도정미의 단백질 함량 예측 방법이 개시된다. 이러한 예측 방법은 테스트 시료 산물벼를 투과한 근적외선으로부터 근적외선 스펙트럼을 획득하는 단계와, 상기 테스트 시료 산물벼를 도정하여 도정미로 만들고, 상기 도정미의 단백질 함량을 측정하는 단계와, 측정된 상기 도정미의 단백질 함량과 획득된 상기 근적외선 스펙트럼의 상관관계를 이용하여 최적의 검량식을 유도하는 단계와, 측정대성 시료 산물벼를 투과한 근적외선으로부터 근적외선 스펙트럼을 획득하는 단계, 및 상기 검량식을 이용하여 상기 측정 대상 시료 산물벼의 가공후 도정미의 단백질 함량을 예측하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 검량식은 MPLS W-X-Y-Z(W는 미분횟수, X는 스펙트럼의 측정파장 갭(nm), Y는 파장갭 수처리에서 스펙트럼의 연결을 부드럽게 하기 위한 수처리, Z 는 더욱더 스펙트럼의 모양을 부드럽게 하기 위한 수처리)로 표현되는 변형 부분최소 자승법(MPLS)이고, 상기 도정미가 현미인 경우, 상기 검량식은 MPLS 2-4-4-1을 적용하고, 상기 도정미는 백미인 경우, 상기 검량식은 MPLS 0-0-1-1을 적용하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 미곡종합처리장의 산물벼 구매 및 시험연구용 벼 수확 직후 현미 및 백미의 단백질 함량 예측이 가능해짐에 따라 건조 및 도정과정 없이 신속하고 비파괴적인 단백질 함량 분석이 가능하다. 따라서 본 발명은 산물벼의 품질을 간편, 신속하게 평가할 수 있다.
산물벼, 근적외선 분광법, NIRS, 단백질, 현미, 백미
Description
본 발명은 산물벼를 이용한 도정미의 단백질 함량 예측 방법에 관한 것으로, 보다 상세히 근적외선 분광기를 이용한 산물벼를 이용한 도정미의 단백질 함량 예측 방법에 관한 것이다.
2006년도 농림통계연보에 따르면, 벼는 한국의 가장 주된 식량작물로 약 98만ha의 경지에서 정곡으로 연간 약 477만 톤이 생산되고 있다. 2006년부터 취반용 수입쌀이 유통되고 쌀 시장이 다양화되면서 소비자들의 식미에 대한 관심이 증가하고 고품질 쌀에 대한 요구도가 높아지고 있으며, 고품질 쌀의 기준으로는 완전미율과 수분 함량, 단백질 함량 등이 중요시되고 있다.
수분 함량은 수확 시기와 건조 방식 및 건조 시간에 따라 결정되는 것으로 적정 수확시기에 수확하여, 45～50℃이하에서 건조하는 방법이 추천되고 있다. 수확 후 과도한 건조는 동할립을 증가시키고, 발아율을 감소시키며, 단백질과 전분의 변성을 가져오고, 식미를 떨어뜨린다고 알려져 있다.
단백질은 쌀에서 전분 다음으로 많은 성분이다. 단백질 함량은 품종, 기후, 재배조건에 따라 변이가 심하며, 쌀의 품질과 밥의 물성에 영향을 미쳐 단백질이 많을수록 밥이 단단하고 부착성이 떨어져 식미가 저하된다고 보고된 바 있다.
이러한 단백질 함량은 정선과 건조, 제현과 정백과정을 거쳐서 백미로 가공한 후에나 함량 측정이 가능해, 수매 시 단백질 함량을 확인할 방법이 없어 산물벼 수매가를 단백질 함량에 따라 차별화 할 수 있는 방법이 없는 실정이다. 최근 유통 쌀은 도정시기 및 유통기한 설정으로 시기별로 요구량만큼 도정해서 판매되는 등 정조 혹은 현미 상태로 판매 직후까지 저장되는 경우가 많아 원료곡의 단백질 함량을 수확기에 확인하기 어렵다. 따라서 백미 및 현미의 단백질 측정을 위해서는 판매시기 마다 시료를 채취하여 정선, 건조, 제현과 정백과정을 거쳐서 가공한 후 단백질 함량을 측정해야하는 한계가 있다.
또한, 현재 농가로부터 미곡종합처리장에서 산물벼를 구입 시 단백질 함량을 비파괴적으로 알아내기 위한 방법이 전무한 상태이다. 기존의 방법으로는 산물벼의 품질을 중량, 육안검사 등을 통해 주관적으로 판단하고 단백질 함량을 알아내기 위해서는 건조 후 제현하여 현미로 가공 후 다시 백미로 도정하여 화학분석 등으로 단백질 함량을 측정하였다.
기존의 화학분석방법은 고가의 장비와 숙련된 인력 및 소요 경비, 시간의 부담이 심각하고 시료의 손실이 있다는 점에서 실용화 가능성이 낮다. 또한 기존의 근적외 분광분석기를 이용한 백미 검량식의 경우 건조와 도정을 거쳐 한정된 수분범위의 백미 상태로 시료를 가공한 후에만 성분 분석이 가능하다는 한계를 지니고 있다.
이에 따라, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 가공전의 산물벼를 통해서 가공 후 생산되는 도정미(현미 또는 백미)에 포함되는 단백질 함량을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 예시적인 일 실시예에 의한 산물벼를 이용한 도정미의 단백질 함량 예측 방법은 테스트 시료 산물벼를 투과한 근적외선으로부터 근적외선 스펙트럼을 획득하는 단계와, 상기 테스트 시료 산물벼를 도정하여 도정미로 만들고, 상기 도정미의 단백질 함량을 측정하는 단계와, 측정된 상기 도정미의 단백질 함량과 획득된 상기 근적외선 스펙트럼의 상관관계를 이용하여 최적의 검량식을 유도하는 단계와, 측정대성 시료 산물벼를 투과한 근적외선으로부터 근적외선 스펙트럼을 획득하는 단계, 및 상기 검량식을 이용하여 상기 측정 대상 시료 산물벼의 가공후 도정미의 단백질 함량을 예측하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 검량식은 MPLS W-X-Y-Z(W는 미분횟수, X는 스펙트럼의 측정파장 갭(nm), Y는 파장갭 수처리에서 스펙트럼의 연결을 부드럽게 하기 위한 수처리, Z 는 더욱더 스펙트럼의 모양을 부드럽게 하기 위한 수처리)로 표현되는 변형 부분최소 자승법(MPLS)이고, 상기 도정미가 현미인 경우, 상기 검량식은 MPLS 2-4-4-1을 적용하고, 상기 도정미는 백미인 경우, 상기 검량식은 MPLS 0-0-1-1을 적용하는 것을 특징으로 한다.
예컨대, 상기 근적외선 스펙트럼은 상기 산물벼를 투과한 근적외선으로부터 획득될 수 있다.
예컨대, 상기 도정미의 단백질 함량을 측정하는 단계는, 켈달(Kjeldahl)법을 이용할 수 있다.
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따라서, 미곡종합처리장의 산물벼 구매 및 시험연구용 벼 수확 직후 현미 및 백미의 단백질 함량 예측이 가능해짐에 따라 건조 및 도정과정 없이 신속하고 비파괴적인 단백질 함량 분석이 가능하다. 따라서 본 발명은 산물벼의 품질을 간편, 신속하게 평가할 수 있다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성 요소는 제2 구성 요소로 명명 될 수 있고, 유사하게 제2 구성 요소도 제1 구성 요소로 명명될 수 있다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 '산물벼'란 벼 수확 직후의 다양한 수분함량을 지니는 벼를 의미하고, '도정미'란 산물벼를 도정하여 현미 또는 백미로 가공한 상태의 쌀을 의미한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예들을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 예시적인 일 실시예에 의한 산물벼를 이용한 도정미의 단백질 함량 예측 방법은 테스트 시료 산물벼로부터 근적외선 스펙트럼을 획득하는 단계(단 계1)와, 상기 테스트 시료 산물벼를 도정하여 도정미로 만들고, 상기 도정미의 단백질 함량을 측정하는 단계(단계2)와, 측정된 상기 도정미의 단백질 함량과 획득된 상기 근적외선 스펙트럼의 상관관계를 이용하여 최적의 검량식을 유도하는 단계(단계3)와, 상기 검량식을 이용하여 상기 측정 대상 시료 산물벼의 가공후 도정미의 단백질 함량을 예측하는 단계(단계4)를 포함한다.
단계 1에서는 산물벼의 근적외선 스펙트럼을 획득한다. 본 발명에서는 수분함량이 12%에서 29%인 모든 자포니카형 벼에 사용할 수 있다. 마찬가지 방법을 다른 종류의 벼에도 적용할 수 있음은 물론이다.
근적외선 분광분석법은 대부분의 천연물이 특정 영역 파장에서 근적외 복사선을 흡수한다는 원리를 이용하여, 분자에 의해 흡수되는 근적외선 흡광 스펙트럼을 통해 분자구조에 대한 정보를 분석하여 물질의 정량분석에 활용된다.
본 발명에서 사용하는 근적외선 분광기는(Infratec 1241, FOSS Analytical AB)는 근적외선 파장대역이 850-1100nm으로 시료는 산물벼 상태로 스캐닝 하며, 측정방식은 반사와 투과 방식 중 투과(transmittance)법을 사용한다.
이 근적외선 분광기는 물질에 대한 비과괴적이며 신속한 정량분석이 가능하고 다른 근적외선 분광기에 비해 비숙련자도 사용이 용이해 검량선 작성 후 적용 시 실용화 및 산업화에 유용한 모델이다.
단계 2에서는 상기 산물벼를 도정하여 현미 또는 백미를 제조하고, 이것에 포함된 단백질의 함량을 이때 통상적으로 인정받는 켈달(켈달(Kjeldahl))법으로 분석한다.
단계 3에서는 이렇게 분석된 자료를 통해, 상기 근적외선 스펙트럼을 이용하여 검량선을 유도한다. 상기 얻어진 스펙트럼은 복잡하고 흡광 스펙트럼의 중첩이 일어나기 때문에 이러한 문제점을 해결하기 위해 다양한 통계처리를 수행하여 최적의 검량선을 유도한다.
먼저 산물벼의 근적외 스펙트럼을 수학적으로 전처리하며, 이는 조사된 빛의 산란 효과를 일차적으로 보정해 주는 것으로 이 과정에서 일정한 수준을 벗어난 값을 제거해 회귀분석의 변수를 줄이고, 검량식의 신뢰성을 높이게 된다.
이러한 전처리 후 미분법을 적용하고 수처리 후 여러 회귀분석을 수행하여 검량식을 유도하며 이 경우 변형 부분최소제곱법(modified partial least square, MPLS)을 사용한다.
변형 부분최소제곱법은 최소자승회귀분석법과 거의 동일하며 주성분과 실험실 값 이용 시 normalise라는 수학적 처리를 추가하여 최고자승법에 이용된다. 최소자승회귀분석법은 스펙트럼 데이터에서 추출되는 주성분(principal component)과 실험실 값(laboratory reference data)을 이용하여 예측되는 값과 실험실 값 사이의 오차의 제곱이 최소가 되는 회귀식을 만드는 방법이다. 본 발명에서는 산물벼를 이용한 현미 및 백미 단백질 함량 분석 검량선 작성 시 MPLS법이 가장 바람직하여 최적의 검량식을 유도할 수 있다.
단계 4에서는 측정대상 시료 산물벼에 적외선을 조사하고 이의 스펙트럼을 획득한후, 상기 유도된 검량식을 이용하여 측정대상 시료 산물벼가 도정된 후 얻어질 현미 또는 백미의 단백질 함량을 예측한다.
이하 본 발명의 실시 예를 상세히 설명한다.
<
실시예
1>
산물벼
근적외선분광분석을
통한 현미 단백질 측정
(1) 테스트 시료
산물벼의
준비 및 스펙트럼 획득
테스트 시료 산물벼는 국내 각지에서 2005년과 2006년에 재배된 다양한 품종의 산물벼를 3차에 걸쳐 수확 후 건조하지 않은 상태로 미곡종합처리장과 작물과학원의 시험재배포장을 통하여 수집하였다. 산물벼 시료는 12%～29%의 수분 함량 범위에서 도 1에서 도시된 바와 같이, 스펙트럼을 획득하였다. 근적외 스펙트럼은 근적외선 대역 (850nm ～ 1050nm)에서 산물벼 상태로 스캐닝 하였으며, 측정방식은 도 1에서 도시된 바와같이 투과(transmittance)법을 사용하였고 2nm간격으로 스캐닝을 실시하였다.
많은 시료를 분석하였기 때문에 성분 함량의 변이가 넓게 나타났으며 도 2와 같은 다양한 스펙트럼을 얻을 수 있었다.
(2)
도정미의
단백질 함량 측정
이 후 현미의 단백질 함량 측정을 위해 제현기(Model SY88-TH, Ssangyoung Ltd., Korea)와 정미기(Model NPL-102M, Ssangyoung Ltd., Korea)를 이용하여 현미로 균일하게 도정하였다.
본 재료들의 수분함량은 105℃ 수분함량 측정법에 근거한 수분함량측정기(Kett PQ 510, Japan)와 근적외선분광분석기(Infratec 1241, FOSS)에 내장된 수 분 함량 예측프로그램을 이용하여 분석에 이용하였다.
단백질 함량은 켈달(Kjeldahl)법에 따라 측정하였으며 그 원리는 다음과 같다. 먼저 분쇄된 현미 및 백미 가루에 진한 황산 및 산화제를 가하여 가열분해하고 생성된 황산암모늄에 과잉의 알칼리를 가해 암모니아를 발생시켜, 이것을 가열 증류해서 일정량의 산 표준액에 흡수시킨다. 산은 암모니아 량에 따라서 중화되므로 과잉의 산을 알칼리표준액으로 역적정하여 전 질소량을 구하게 된다. 이러한 켈달(Kjeldahl)법은 다음의 4단계 반응으로 진행된다.
- 분해 : 질소(N) + H2SO4 → (NH4)2SO4 + SO2↑ +CO2↑ + CO↑ + H2O↑
- 증류 : (NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O
- 중화 : 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
- 적정 : H2SO4 + 2HaOH → Na2SO4 + 2H2O
본 재료들의 단백질 함량은 먼저 분말 시료 0.5g가량을 정확히 칭량한 다음 분해튜브에 시료, 촉매제 1정, 진한 황산 10㎖를 차례로 넣고 분해기가 420℃까지 예열된 상태에서 분해튜브를 스탠드(stand)를 이용해 분해기에 장착하고 약 40분간 분해한다. 분해가 완료되면 분해튜브를 자동증류, 적정장치로 옮기고 증류 및 적정하여 아래의 수학식 1을 이용하여 조단백질을 계산한다.
상기 수학식 1에서, V은 본실험에 대한 0.1N-H2SO4 적정치 (㎖)이고, V0은 공시험(Blank test)에 대한 0.1N-H2SO4 적정치 (㎖)이고, F은 0.1N - H2SO4 표준용액의 팩터(factor)이고, 5.95 값은 질소환산계수이고, S는 시료채취량(g) 이다.
이러한 방법으로 계산된 단백질 함량은 위에서 측정된 수분함량을 기초로 건물중(Dry weight)을 기준으로 보정 후 실험실 값으로 사용되었다.
표 1. 현미 상태에서 측정된 단백질 시료수와 측정결과
| 구분 | 시료의 개수(개) | 범위 | 평균 | 표준편차 |
| 산물벼(현미) | 751 | 4.42~12.89 | 8.66 | 1.41 |
(3) 최적의
검량식
유도
도면 2, 3, 4, 5는 본 발명에 의해 분석된 벼 단백질 최고 및 최저치 시료가 나타내는 스펙트럼을 찾기 위해 4가지 산란보정(Scatter correction)을 위한 스펙트럼 처리 방식을 보여 준다.
산란되는 빛은 스펙트럼과 실험값 사이에 상관관계를 왜곡하는 비선형적 함수로 이것을 보정해 주는 것이다. 도면 2에서 보는 바와 같이 산란보정은 Inverse MSC가 가장 적합한 방식임으로 scatter 항목은 Inverse MSC(multiplicative scatter correction)로 고정한 후 여러 가지 회귀식과 수처리 방식으로 검량식 작성을 수행하였다.
(가) 수처리(
Math
treatment
) 및 회귀분석
수처리는 미분법을 나타내는 것으로 가장 많이 사용되는 스펙트럼 전처리 기법으로 스펙트럼을 미분하여 흡수대의 변화를 강조함으로써 스펙트럼의 변화는 증폭되고, 동시에 변화만 보기 때문에 바탕선이 움직여도 관계가 없다. 즉 미분으로 바탕선 변화가 제거 된다.
수처리 W-X-Y-Z 에서 W는 미분 회수 이며, X는 스펙트럼의 nm 측정 파장 갭, Y는 파장 갭 수처리에서 스펙트럼의 연결을 부드럽게 하기 위한 수처리(smooth 1) , Z는 더욱 더 스펙트럼 모양을 부드럽게 처리하기 위한 수처리(smooth 2)를 나타낸다. 갭(gap)은 미분할 때 사용되면 범위를 지정하며 갭이 4이 경우 8nm를 의미한다. smooth는 부드럽게 곡선화 하기 위한 평균 데이터 포인트의 수로 갭 사이즈와 동일하거나 작게 사용한다.
상기 얻어진 근적외선 스펙트럼을 하기 표2에서 보는 바와 같이 0차, 1차 또는 2차 미분법 그리고 0nm 또는 4nm의 측정 파장 갭으로 수처리를 수행하였다.
수처리된 스펙트럼은 회귀분석을 통하여 검량식을 작성하였다.
회귀분석은 근적외선 분광분석기에 사용되는 계량분석화학(Chemometrics)을 이용하여 주성분회귀분석법(Principle Component Regression, PCR), 부분최소자승법(Partial Least Square, PLS), 변형 부분최소자승법(Modified Partial Least Square, MPLS) 등 여러 가지 방법으로 검량식을 산출하였으며, 작성된 검량식을 상호비교 분석한 후 최적의 예측모델을 도출하였다.
아래의 표2는 산물벼에서 현미 단백질 함량분석을 위한 검량식 작성의 결과이다.
표 2. 산물벼에서 현미 단백질 함량분석을 위한 검량식
| 회귀식 | 수처리 | Calibration set (산물벼 스캔에서 현미로써 단백질 예측) | |||||
| N | mean | SEC | RSQ | SECV | 1-VR | ||
| PCR | 0-0-1-1 | 750 | 8.5903 | 0.4386 | 0.8914 | 0.4395 | 0.8909 |
| 1-4-4-1 | 749 | 8.5843 | 0.4344 | 0.8919 | 0.4354 | 0.8913 | |
| 2-4-4-1 | 751 | 8.5935 | 0.4331 | 0.8957 | 0.4348 | 0.8948 | |
| PLS | 0-0-1-1 | 753 | 8.5993 | 0.3971 | 0.9117 | 0.4043 | 0.9084 |
| 1-4-4-1 | 750 | 8.5904 | 0.4055 | 0.9056 | 0.4113 | 0.9028 | |
| 2-4-4-1 | 748 | 8.5833 | 0.3954 | 0.9083 | 0.4038 | 0.9043 | |
| MPLS | 0-0-1-1 | 752 | 8.6174 | 0.405 | 0.9130 | 0.4154 | 0.9084 |
| 1-4-4-1 | 746 | 8.5799 | 0.3989 | 0.9072 | 0.4040 | 0.9047 | |
| 2-4-4-1 | 753 | 8.6063 | 0.3957 | 0.9144 | 0.4045 | 0.9105 | |
SEC : 검량식의 표준오차 (standard error of calibration)
RSQ : 다중결정계수 (squared coefficient of multiple determination in calibration)
SECV : Cross validation (CV)의 표준오차 (standard error of cross validation)
1-VR : 1-Varianace
검량식은 표 2와 같이 MPLS(Modified Partial Least Squares)법의 2차미분이 검량식 작성에 최적인 것으로 나타났는데, 현미의 경우, 단백질은 2, 4, 4, 1 (2차미분, 측정파장의 gap 4nm, smooth 1항목 4 조정, smooth 2 항목 1 조정)을 통한 검량식이 RSQ값이 가장 높게 나타났다. 따라서, 가장 우수한 것으로 판단되었다(표 3).
표 3. 산물벼에서 현미 단백질 함량분석을 위한 검량식 선정
| Math treatment | Calibration set | Validation set | ||
| R2 | SEC | r2 | SEP | |
| 2-4-4-1 | 0.9144 | 0.3957 | 0.919 | 0.395 |
SEP : 표준예측오차
(나) 검증
검량식이 얻어지면 이 검량식의 적용이 합당한지 검증한다. 따라서 검량식을 만들 때 Cross Validation (CV)을 사용하여 검량세트 내에서 내부 검증을 한다. 이 방법은 검량세트 내 시료 중 일부는 검량식을 만드는데 이용되고, 검량식 작성에 제외된 시료들을 대상으로 별도의 예측세트(Prediction set)를 만들어 검량식을 검증하는 것이다.
산물벼의 근적외선 분광분석을 통한 현미의 단백질 함량 측정 방법은 정리하 면 하기와 같다
(a) 근적외선 스펙트럼의 바탕선 고정을 위한 스캐터(Scatter)는 Inverse MSC, 수처리는 2차 미분법을 이용하는 것이 바람직하며, 또한 측정 파장별 갭은 4nm경우가 적당하다.
(b) 적정 검량식을 도출하기 위한 회귀식 작성은 MPLS(Modified Partial Least Squares)법이 가장 적합하다.
본 발명의 검량선을 확인하기 위해 최종적으로 실제 산물벼의 스펙트럼으로 현미 시료를 단백질 예측모델에 적용하였다. 단백질 분석 기준으로는 가장 일반적으로 습식분석 방식인 켈달(Kjeldahl) 분해법과 비교하였다. 그 결과 상관계수는 0.9468, 회귀분석 결정계수는 0.8964의 높은 값을 나타내어 검량식의 정확성을 확인할 수 있었다(도 6 참조).
(4) 측정대상 시료
산물벼에
적용
이렇게 구해진 최적의 검량식을 측정대상 시료 산물벼에 적용하여 근적외선 스펙트럼을 구하고, 상기 최적의 검량식을 적용하여 산물벼를 도정한 현미의 단백질 함량을 예측한다.
<실시 예2>
산물벼
근적외선분광분석을
통한 백미 단백질 측정
(1) 테스트 시료
산물벼의
준비 및 스펙트럼 획득
본 발명의 재료인 산물벼는 국내 각지에서 2005년과 2006년에 재배된 다양한 품종의 산물벼를 3차에 걸쳐 수확 후 건조하지 않은 상태로 미곡종합처리장과 작물과학원의 시험재배포장을 통하여 수집하였다. 산물벼 시료는 12%～29%의 수분 함량 범위에서 도 1에서 도시된 바와 같이, 스펙트럼을 획득하였다. 근적외 스펙트럼은 근적외선 대역 (850nm ～ 1050nm)에서 산물벼 상태로 스캐닝 하였으며, 측정방식은 도 1에서 도시된 바와같이 투과(transmittance)법을 사용하였고 2nm간격으로 스캐닝을 실시하였다.
많은 시료를 분석하였기 때문에 성분 함량의 변이가 넓게 나타났으며 도 2와 같은 다양한 스펙트럼을 얻을 수 있었다.
(2)
도정미의
단백질 함량 측정
이 후 백미의 단백질 함량 측정을 위해 제현기(Model SY88-TH, Ssangyoung Ltd., Korea)와 정미기(Model NPL-102M, Ssangyoung Ltd., Korea)를 이용하여 백미로 균일하게 도정하였다.
본 재료들의 수분함량은 105℃ 수분함량 측정법에 근거한 수분함량측정기(Kett PQ 510, Japan)와 근적외선분광분석기(Infratec 1241, FOSS)에 내장된 수분 함량 예측프로그램을 이용하여 분석에 이용하였다.
단백질 함량은 켈달(Kjeldahl)법에 따라 측정하였으며 그 원리는 다음과 같다. 먼저 분쇄된 현미 및 백미 가루에 진한 황산 및 산화제를 가하여 가열분해하고 생성된 황산암모늄에 과잉의 알칼리를 가해 암모니아를 발생시켜, 이것을 가열 증류해서 일정량의 산 표준액에 흡수시킨다. 산은 암모니아 량에 따라서 중화되므로 과잉의 산을 알칼리표준액으로 역적정하여 전 질소량을 구하게 된다. 이러한 켈달(Kjeldahl)법은 다음의 4단계 반응으로 진행된다.
- 분해 : 질소(N) + H2SO4 → (NH4)2SO4 + SO2↑ +CO2↑ + CO↑ + H2O↑
- 증류 : (NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O
- 중화 : 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
- 적정 : H2SO4 + 2HaOH → Na2SO4 + 2H2O
본 재료들의 단백질 함량은 먼저 분말 시료 0.5g가량을 정확히 칭량한 다음 분해튜브에 시료, 촉매제 1정, 진한 황산 10㎖를 차례로 넣고 분해기가 420℃까지 예열된 상태에서 분해튜브를 stand를 이용해 분해기에 장착하고 약 40분간 분해한다. 분해가 완료되면 분해튜브를 자동증류, 적정장치로 옮기고 증류 및 적정하여 조단백질을 계산한다. 조단백질의 계산에는 앞서 언급한 수학식 1을 이용한다.
표 1. 백미 상태에서 측정된 단백질 시료수와 측정결과
| 구분 | 시료의 개수(개) | 범위 | 평균 | 표준편차 |
| 산물벼(백미) | 254 | 6.13~9.40 | 7.47 | 0.656 |
(3) 최적의
검량식
유도
도면2, 3, 4, 5는 본 발명에 의해 분석된 벼 단백질 최고 및 최저치 시료가 나타내는 스펙트럼 을 찾기 위해 4가지 산란보정(Scatter correction)을 위한 스펙트럼 처리 방식을 보여 준다.
산란되는 빛은 스펙트럼과 실험값 사이에 상관관계를 왜곡하는 비선형적 함수로 이것을 보정해 주는 것이다. 도면 2에서 보는 바와 같이 산란보정은 Inverse MSC가 가장 적합한 방식임으로 scatter 항목은 Inverse MSC(multiplicative scatter correction)로 고정한 후 여러가지 회귀식과 수처리 방식으로 검량식 작성을 수행하였다.
(가) 수처리(
Math
treatment
) 및 회귀분석
수처리는 미분법을 나타내는 것으로 가장 많이 사용되는 스펙트럼 전처리 기법으로 스펙트럼을 미분하여 흡수대의 변화를 강조함으로써 스펙트럼의 변화는 증폭되고, 동시에 변화만 보기 때문에 바탕선이 움직여도 관계가 없다. 즉 미분으로 바탕선 변화가 제거 된다.
수처리 W-X-Y-Z 에서 W는 미분 회수 이며, X는 스펙트럼의 nm 측정 파장 갭, Y는 파장 갭 수처리에서 스펙트럼의 연결을 부드럽게 하기 위한 수처리(smooth 1) , Z는 더욱 더 스펙트럼 모양을 부드럽게 처리하기 위한 수처리(smooth 2)를 나타 낸다. gap은 미분할 때 사용되면 범위를 지정하며 gap이 4이 경우 8nm를 의미한다. smooth는 부드럽게 곡선화 하기 위한 평균 데이터 포인트의 수로 gap 사이즈와 동일하거나 작게 사용한다.
상기 얻어진 근적외선 스펙트럼을 하기 표2에서 보는 바와 같이 0차, 1차 또는 2차 미분법 그리고 0nm 또는 4nm의 측정 파장 갭으로 수처리를 수행하였다.
수처리된 스펙트럼은 회귀분석을 통하여 검량식을 작성하였다.
회귀분석은 근적외선 분광분석기에 사용되는 Chemometrics program(Winisi II, Foss Infrasoft International LLC.)을 이용하여 주성분회귀분석법(PCR:Principle Component Regression), 부분최소자승법(PLS:Partial Least Squares), 변형 부분최소자승법(MPLS:Modified Partial Least Squares) 등 여러 가지 방법으로 검량식을 산출하였으며, 작성된 검량식을 상호비교 분석한 후 최적의 예측모델을 도출하였다
하기 표2는 산물벼에서 백미 단백질 함량분석을 위한 검량식 작성의 결과이다.
표 2. 산물벼에서 백미 단백질 함량분석을 위한 검량식 작성
| 회귀식 | 수처리 | Calibration set (산물벼 스캔에서 백미로써 단백질 예측) | |||||
| N | mean | SEC | RSQ | SECV | 1-VR | ||
| PCR | 0-0-1-1 | 244 | 7.4617 | 0.2684 | 0.8155 | 0.2754 | 0.8058 |
| 1-4-4-1 | 243 | 7.4489 | 0.2621 | 0.8242 | 0.2691 | 0.8145 | |
| 2-4-4-1 | 242 | 7.4567 | 0.2581 | 0.829 | 0.267 | 0.8166 | |
| PLS | 0-0-1-1 | 240 | 7.4553 | 0.2344 | 0.8603 | 0.2466 | 0.8452 |
| 1-4-4-1 | 242 | 7.4518 | 0.2511 | 0.8364 | 0.2626 | 0.8207 | |
| 2-4-4-1 | 246 | 7.4563 | 0.2693 | 0.8218 | 0.2832 | 0.8022 | |
| MPLS | 0-0-1-1 | 239 | 7.4623 | 0.231 | 0.8672 | 0.2428 | 0.853 |
| 1-4-4-1 | 244 | 7.4686 | 0.2464 | 0.8497 | 0.2759 | 0.8113 | |
| 2-4-4-1 | 244 | 7.4603 | 0.2532 | 0.8367 | 0.2706 | 0.8131 | |
SEC : 검량식의 표준오차 (standard error of calibration)
RSQ : 다중결정계수 (squared coefficient of multiple determination in calibration)
SECV : Cross validation (CV)의 표준오차 (standard error of cross validation)
1-VR : 1-Varianace
검량식은 표 2와 같이 MPLS(Modified Partial Least Squares)법의 0차미분이 검량식 작성에 적당한 것으로 나타났는데, 백미 단백질은 0, 0, 1, 1 (0차미분, 측정파장의 gap 없음, smooth 1항목 1 조정, smooth 2 항목 1 조정)을 통한 검량식이 RSQ값이 가장 높게 나타났다. 따라서, 가장 우수한 것으로 판단되었다.
표 3. 산물벼에서 백미 단백질 함량분석을 위한 검량식 선정
| Math treatment | Calibration set | Validation set | ||
| R2 | SEC | r2 | SEP | |
| 0-0-1-1 | 0.8672 | 0.231 | 0.842 | 0.252 |
SEP : 표준예측오차
(나) 검증
검량식이 얻어지면 이 검량식의 적용이 합당한지를 검증하여야 한다. 따라서 검량식을 만들 때 Cross Validation (CV)을 사용하여 검량세트 내에서 내부 검증을 한다. 이 방법은 검량세트 내 시료 중 일부는 검량식을 만드는데 이용되고, 검량식 작성에 제외된 시료들을 대상으로 별도의 예측세트(Prediction set)를 만들어 검량식을 검증하는 것이다.
산물벼의 근적외선분광분석법을 이용한 백미 단백질 함량 측정 방법은 정리하면 하기와 같다.
(a) 근적외선 스펙트럼의 바탕선 고정을 위한 Scatter는 Inverse MSC, 수처리는 0차 미분법을 이용하는 것이 바람직하며, 또한 측정 파장별 갭은 없을 때가 적당하다.
(b) 적정 검량식을 도출하기 위한 회귀식 작성은 MPLS(Modified Partial Least Squares)법이 가장 적합하였다.
본 발명의 검량선을 확인하기 위해 최종적으로 실제 산물벼의 스펙트럼으로 백미 단백질을 예측모델에 적용하였다. 단백질 분석 기준으로는 가장 일반적으로 습식분석 방식인 켈달(Kjeldahl) 분해법과 비교하였다. 그 결과 상관계수는 0.8585, 회귀분석 결정계수는 0.737의 높은 값을 나타내어 검량식의 정확성을 확인할 수 있었다(도 7 참조).
(4) 측정대상 시료
산물벼에
적용
이렇게 구해진 최적의 검량식을 측정대상 시료 산물벼에 적용하여 근적외선 스펙트럼을 구하고, 상기 최적의 검량식을 적용하여 산물벼를 도정한 백미의 단백질 함량을 예측한다.
앞서 설명한 본 발명의 상세한 설명에서는 본 발명의 바람직한 실시예들을 참조하여 설명하였지만, 해당 기술분야의 숙련된 당업자 또는 해당 기술분야에 통상의 지식을 갖는 자라면 후술될 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 기술 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 설명 및 아래의 도면은 본 발명의 기술사상을 한정하는 것이 아닌 본 발명을 예시하는 것으로 해석되어져야 한다.
도 1은 산물벼로부터 근 적외선을 획득하는 과정을 보여주는 단면도이다.
도 2는 산물벼로부터 획득한 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
도 3은 도 2의 스펙트럼에 Inverse MSC, 수처리 0-0-1-1을 적용한 후의 그래프이다.
도 4는 도 2의 스펙트럼에 Inverse MSC, 수처리 1-4-4-1을 적용한 후의 그래프이다.
도 5는 도 2의 스펙트럼에 Inverse MSC, 수처리 2-4-4-1을 적용한 후의 그래프이다.
도 6은 근적외선 스펙트럼과 현미의 습식분석방법인 켈달법의 상관계수, 회기분석 결정계수를 보여주는 그래프이다.
도 7은 근적외선 스펙트럼과 백미의 습식분석방법인 켈달법의 상관계수, 회기분석 결정계수를 보여주는 그래프이다.
Claims (6)
- 테스트 시료 산물벼를 투과한 근적외선으로부터 근적외선 스펙트럼을 획득하는 단계;상기 테스트 시료 산물벼를 도정하여 도정미로 만들고, 상기 도정미의 단백질 함량을 측정하는 단계;측정된 상기 도정미의 단백질 함량과 획득된 상기 근적외선 스펙트럼의 상관관계를 이용하여 최적의 검량식을 유도하는 단계;측정대상 시료 산물벼를 투과한 근적외선으로부터 근적외선 스펙트럼을 획득하는 단계; 및상기 검량식을 이용하여 상기 측정 대상 시료 산물벼의 가공후 도정미의 단백질 함량을 예측하는 단계를 포함하고,상기 검량식은 MPLS W-X-Y-Z(W는 미분횟수, X는 스펙트럼의 측정파장 갭(nm), Y는 파장갭 수처리에서 스펙트럼의 연결을 부드럽게 하기 위한 수처리, Z 는 더욱더 스펙트럼의 모양을 부드럽게 하기 위한 수처리)로 표현되는 변형 부분최소 자승법(MPLS)이고,상기 도정미가 현미인 경우, 상기 검량식은 MPLS 2-4-4-1을 적용하고,상기 도정미는 백미인 경우, 상기 검량식은 MPLS 0-0-1-1을 적용하는 것을 특징으로 하는 산물벼를 이용한 도정미의 단백질 함량 예측 방법.
- 삭제
- 제1 항에 있어서,상기 도정미의 단백질 함량을 측정하는 단계는, 켈달(Kjeldahl)법을 이용하는 것을 특징으로 하는 산물벼를 이용한 도정미의 단백질 함량 예측 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080064142A KR101000889B1 (ko) | 2008-07-03 | 2008-07-03 | 근적외선 분광기를 이용한 산물벼의 비파괴적 현미 및 백미단백질 함량 측정 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080064142A KR101000889B1 (ko) | 2008-07-03 | 2008-07-03 | 근적외선 분광기를 이용한 산물벼의 비파괴적 현미 및 백미단백질 함량 측정 방법 |
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