KR101483725B1 - 표면증강 라만분광을 이용한 시료 내 특정물질의 분석방법및 분석장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표면증강 라만분광(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)을 이용한 시료 내 특정물질의 분석방법 및 분석장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 기재에 리셉터 분자를 고정시킨 다음, 상기 고정된 리셉터 분자와 시료 내 특정물질을 선택적으로 반응시키고, 반응된 시료 주위에 금속이온의 환원에 의해 금속나노입자를 형성시킨 후, 상기 시료 내 특정물질의 라만 분광을 측정하는 것을 특징으로 하는 표면증강 라만분광을 이용한 시료 내 특정물질의 분석방법 및 분석장치에 관한 것이다.

본 발명에 따른 표면증강 라만분광 분석방법은 선택적인 리셉터 분자와 결합된 시료 내 특정물질 고유의 라만 스펙트럼(Raman spectrum)을 이용하여, 다른 표지자의 결합 없이도 종래의 라만분광의 감도에 비해 뛰어난 감도를 가짐으로써 시료 내 특정물질 분석에 유용하다.

표면증강 라만분광(SERS), 리셉터 분자(receptor), 금속 나노입자

Description

표면증강 라만분광을 이용한 시료 내 특정물질의 분석방법 및 분석장치{Method and Apparatus for Detecting a Specific Molecule Using Surface-Enhanced Raman Spectroscopy}

본 발명은 표면증강 라만분광(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)을 이용한 시료 내 특정물질의 분석방법 및 분석장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 기재에 리셉터 분자를 고정시킨 다음, 상기 고정된 리셉터 분자와 시료를 선택적으로 반응시키고, 반응된 시료 주위에 금속이온의 환원에 의해 금속나노입자를 형성시킨 후 상기 시료 내 특정물질의 라만 분광을 측정하는 것을 특징으로 하는 표면증강 라만분광을 이용한 시료 내 특정물질의 분석방법 및 분석장치에 관한 것이다.

라만(Raman) 분광법은 물질의 고유한 진동 스펙트럼을 측정하는 것으로 물질의 고유한 스펙트럼을 찾아내어 각 물질의 정성, 정량 분석을 가능하게 한다.

그러나, 종래의 라만 분광에서 수득가능한 신호강도는 현저히 낮아 감도가 나쁘므로, 시료의 농축조작이 필수이고, 고비용이 소요될 뿐만 아니라 시료 조작 중 시료의 소실이나 변성 위험의 문제가 있다.

라만 활성분자가 특정한 종류의 금속표면에 근접하여 자극될 때, 라만 산란의 강도에 있어서 현저한 증가가 관찰되는데, 라만 강도에서 가장 큰 증가를 보이는 금속표면은 미세하거나 나노규모의 거친표면으로 이루어지고, 일반적으로 미세한 금속입자로 코팅된다. 예를들어, 금속 콜로이드와 같은 나노규모의 입자는 금속입자가 없는 경우의 라만산란 강도보다 라만 산란의 강도를 약 10⁶배 ~ 10⁷배 증가시킬 수 있다.

이와 같이, 표면증강 라만분광(SERS)은 금속 나노입자의 표면에 결합 또는 흡착된 화학물질의 라만 스펙트럼을 증폭하여 기존의 라만분광 분석법에 비하여 감도가 매우 높으며, 표면선택성이 있는 장점이 있다. 따라서, SERS를 활용하여 다양한 생화학 물질들을 분석한 연구결과들이 많이 발표되고 있다(T. Vo-Dinh et al ., Sensors & Actuator B, 29:183-189, 1995).

그러나, SERS는 시료가 은과 같은 금속나노입자에 흡착되어 있어야 강하게 나타나므로, 분석하고자 하는 화학물질의 선택적 흡착 또는 결합이 가능할 수 있도록 나노입자 표면을 개질하기가 어려운 단점이 있다. 라만 분광이 화학물질에 대해 고유의 스펙트럼을 가지고 있지만, 다양한 물질들이 혼합되어 있는 용액 및 기체에서 특정물질을 분석하기는 매우 어려운 문제점이 있다. 따라서 나노입자에 분석하고자 하는 물질을 선택적으로 결합하는 것이 필요하지만, 전술한 바와 같이 선택성 을 주기 위해 나노입자 표면을 개질하여 분석대상 물질이 선택적으로 나노입자에 결합되더라도 SERS에 의한 신호증강은 미미하게 된다.

대한민국 공개 특허 제2007-97177호 및 대한민국 공개 특허 제2005-13571호에는 금속 입자를 기판상에 코팅하여 시료를 상기 금속 입자에 접촉시켜 상기 기판에 여기광을 조사한 후, 그로부터 발생한 산란광의 스펙트럼을 분석하여 시료 중의 분석물을 검출하는 방법이 개시되어 있으나, 시료에 여러물질이 혼합되어 있는 경우 시료와 나노입자 결합의 선택성이 떨어져 분석물을 검출하기 힘들다는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래의 문제점을 개선하고자 예의 노력한 결과, 기재에 리셉터(receptor) 분자를 고정시킨 다음, 상기 고정된 리셉터 분자와 특정물질이 포함된 시료를 반응시키고, 상기 기재를 시드(seed)로 하여 금속나노입자를 화학적으로 형성시킨 결과, 이들의 선택적인 반응으로 인하여 분석하고자 하는 시료 내 특정물질의 라만분광 감도가 향상됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 기재에 고정화된 리셉터 분자에 특정물질이 함유된 시료를 반응시킨 후, 특정물질 주위로 환원된 금속나노입자를 형성시켜 표면증강 라만분광을 유도하여 시료 내의 특정물질을 분석하는 방법 및 분석장치를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 기재에 리셉터 분자를 고정화시키는 단계; (b) 상기 고정된 리셉터 분자와 시료를 반응시켜 상기 리셉터 분자와 시료 내 특정물질 간의 결합을 유도하는 단계; (c) 상기 리셉터 분자와 특정물질 간의 결합이 유도된 부위에 금속 나노입자를 형성시키는 단계; 및 (d) 상기 시료 내 특정물질의 라만 분광을 측정하는 단계를 포함하는 표면증강 라만분광을 이용한 시료 분석방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 기재에 고정화된 리셉터 분자와 시료 내 특정물질 간의 결합부위에 금속 나노입자가 형성된 칩; (b) 상기 칩으로 빛을 조사하는 광원; 및 (c) 상기 칩으로부터 반사된 광의 라만분광을 측정하는 라만분광기를 포함하는 표면증강 라만분광을 이용한 시료 내 특정물질의 분석장치를 제공한다.

본 발명에 따른 표면증강 라만분광 분석방법은 선택적인 리셉터 분자와 결합된 시료 내 특정물질 고유의 라만 스펙트럼(Raman spectrum)을 이용하여, 다른 표지자의 결합 없이도 종래의 라만분광의 감도에 비해 뛰어난 감도를 가짐으로써 시료 내 특정물질 분석에 유용할 뿐만 아니라, 기재표면에 결합되는 리셉터 분자를 한 종류 이상으로 사용할 수 있어, 한 종류 이상의 물질을 동시에 선택적으로 분석할 수 있는 효과를 갖는다.

본 발명은 일 관점에서, (a) 기재에 리셉터 분자를 고정화시키는 단계; (b) 상기 고정된 리셉터 분자와 시료를 반응시켜 상기 리셉터 분자와 시료 내 특정물질 간의 결합을 유도하는 단계; (c) 상기 리셉터 분자와 특정물질 간의 결합이 유도된 부위에 금속 나노입자를 형성시키는 단계; 및 (d) 상기 시료 내 특정물질의 라만 분광을 측정하는 단계를 포함하는 표면증강 라만분광을 이용한 시료 내 특정물질의 분석방법에 관한 것이다.

본 발명의 표면증강 라만분광을 이용한 시료 내 특정물질의 분석방법은 시료 내 특정물질 고유의 라만 스펙트럼(Raman spectrum)과 선택적인 리셉터 분자를 동시에 이용함으로써, 표면선택성과 라만 분광분석의 감도를 증진시켜 시료 내 특정물질을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명에 있어서, 기재는 리셉터 분자가 고정화되는 것으로, 상기 기재는 나노입자, 콜로이드, 액상, 막일 수 있다. 여기서, 나노입자는 금, 은, 자기(magnetic), 이산화규소(SiO₂), 이산화티타늄(TiO₂) 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 상기 나노입자는 이후에 금속 나노입자를 형성시키는 과정에서 하나의 시드(seed)로 작용하는 것을 특징으로 한다. 이 때, 상기 기재가 나노입자가 아닌 막 표면에 리셉터를 고정화 한 경우, 리셉터 자체가 금속이온의 환원에 의한 나노입자의 형성을 위한 시드로 작용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 기재는 일반적인 라만분광에서 사용되는 유리, 실리콘, 플라스틱 등과 같은 기판과 결합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 기재에 고정화되는 리셉터 분자는 항체, DNA, 압타머, PNA 및 리간드 등과 같이 시료 내 특정물질과 선택적인 결합을 유도할 수 있는 물질이 바람직하다. 상기 리셉터 분자가 강한 라만 신호를 가지고 있더라도, 시료 분자 내에 존재하는 라만 피크 중에서 리셉터 분자가 가진 라만 피이크와 다른 파장대에서 나타나는 특징적인 라만 피크를 찾아내어 분석물의 존재 여부 및 농도를 분석할 수 있다.

또한, 기재 표면에 고정화되는 리셉터 분자를 한 종류 이상으로 하여 시료 내에 분석하고자 하는 하나 이상의 특정물질을 선택적으로 분석할 수 있다.

본 발명에 있어서, 분석될 시료는 액체 또는 기체일 수 있으며, 시료 내 특정물질이란 라만 분광을 사용하여 측정될 수 있는 측정대상물질을 의미하는 것으로, 리셉터 분자에 대하여 선택적 결합을 할 수 있는 모든 물질을 일컫는다. 이 때, 상기 리셉터 분자와 시료 내 특정물질의 선택적 결합이란 항원-항체, DNA-DNA, DNA-RNA, PNA-DNA, PNA-RNA, 금속-배위결합 등과 같은 일반적인 특이적 결합(specific binding)을 모두 포함할 수 있다.

상기 리셉터 분자에 시료를 반응시키면, 시료 내 특정물질과 리셉터 분자는 선택적으로 결합하게 된다. 상기 리셉터 분자와 결합된 시료를 금속이온과 환원제를 혼합하여 제조된 수용액에 담지시켜 시료 주위에 금속 나노입자를 형성시키는데, 금속 나노입자 중에서도 금, 은, 구리 나노입자의 SERS 효과가 뛰어나 이들을 사용하는 것이 바람직하나, 그 중에서도 은 나노입자의 SERS의 효과가 가장 뛰어나므로 시료주위에 형성시킬 금속 나노입자는 은 나노입자인 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 있어서, 금속 나노입자를 형성하는 용액은 금속이온과 환원제를 혼합하여 제조할 수 있으며, Pierce, Invitrogen과 같은 시약회사에서도 구입이 가능하다.

따라서, 본 발명은 라만분광을 이용하여 시료 내 특정물질이 나타내는 고유한 라만 피크(Raman Peak)의 세기를 측정함으로써, 시료 내 특정물질의 농도 및 정성분석을 쉽게 측정할 수 있다.

이하, 도면을 참고하여 본 발명을 상세히 설명한다.

도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명은 기판 상에 기재인 나노입자가 결합되도록 기판을 개질시키고, 상기 개질된 기판 상에 나노입자를 결합시킨 다음, 결합된 나노입자와 리셉터 분자를 함유한 용액을 반응시켜 리셉터 분자를 나노입자에 고정 시킨다. 여기에 분석하고자 하는 특정물질이 함유된 시료를 반응시키면, 상기 리셉터 분자는 시료 내 특정물질과 선택적 결합을 하게 되고, 상기 리셉터 분자와 선택적 결합을 한 특정물질 주위에 금속 나노입자를 형성시킨다. 마지막으로, 전술한 바와 같은 과정을 거친 시료 내 특정물질의 라만분광을 측정하여 특정물질이 나타내는 고유한 라만 피크의 세기를 측정함으로써, 시료 내 특정물질을 분석할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 기재에 고정화된 리셉터 분자와 시료 내 특정물질 간의 결합부위에 금속 나노입자가 형성된 칩; (b) 상기 칩으로 빛을 조사하는 광원; 및 (c) 상기 칩으로부터 반사된 광의 라만분광을 측정하는 라만분광기를 포함하는 표면증강 라만분광을 이용한 시료 내 특정물질의 분석장치를 제공한다.

본 발명에 따른 칩은 기재 상에 리셉터 분자를 고정시킨 다음, 시료를 반응시켜, 상기 리셉터 분자와 시료 내 특정물질과 선택적 결합이 유도된 부위에 금속 나노입자를 형성시켜 제조되며, 상기 광원과 라만분광기는 본 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것을 쓸 수 있다.

상기 시료 내 특정물질의 분석장치는 전술된 바와 같은 분석방법에 따라 상기 기재로부터 산란된 특정물질 고유의 라만 스펙트럼을 측정하여 시료 내 특정물질을 분석할 수 있다.

본 발명은 개질된 유리 기판 상에 금 나노입자를 형성시킨 다음, 리셉터 분자로서 로다민 항체를 금 나노입자에 고정화시키고, 로다민이 함유된 시료를 상기 로다민 항체에 반응시킨 후, 상기 반응된 시료에 은 나노입자를 형성시켜 라만분광 을 측정한 결과, 시료에 포함된 로다민의 강한 라만 분광 스펙트럼을 확인하였다.

이하, 실시예를 참고하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 금 나노입자 표면 및 로다민 항체가 고정화된 칩의 제조

20nm 금 나노입자(BBInternational)를 아민기로 개질된 유리면 위에 결합시키고, 10mM의 머캅토운데카노익산(mercaptoundecanoic acid)을 녹인 에탄올 용액에 상기 금박막칩을 상온에서 20시간 정도 담지시켜 자기조립 단분자막이 형성되도록 하였다. 칩을 활성화하기 위하여, 증류수에 0.04M의 EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)와 0.01M의 NHS (N-hydroxysuccinimide)를 녹인 용액을 10분 동안 반응시켰다. 이후, 상기 칩에 0.2 ㎎/㎖ 농도의 항-로다민 항체(Abcam, Ab9093)를 함유한 0.1M 인산 완충용액(pH 7.0)을 첨가하여 30분 반응시켰다. 반응하지 않은 활성화기를 제거하기 위하여, 이후 상기 칩에 1M 농도의 에탄올 아민 용액(pH 8.5)을 5분 동안 흘려주었다. 또한, 상기 칩에 비선택적 반응이 일어날 수 있는 부분을 방지하기 위하여, 1%의 BSA(bovine serum albumin)를 PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4)에 녹인 용액을 30분 동안 흘려주어, 로다민 항체가 고정된 금박막 칩을 제조하였다. 이와 같 이 제조된 칩의 원자 현미경(Atomic Force Microscope, AFM) 이미지를 도 2에 도시하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 20 nm의 금 나노입자에 단백질이 잘 결합되어 있는 것을 알 수 있었다.

비교예 1: 금 나노입자 표면 및 BSA ( bovine serum albumin )가 고정화된 칩의 제조

실시예 1의 방법으로 동일하게 제조하되, 항-로다민 항체를 반응시키는 대신 0.1%의 BSA(bovine serum albumin)를 0.1 M 인산완충용액(pH 7.0)에 녹인 용액을 사용하여 반응시켜, BSA가 고정된 금박막 칩을 제조하였다.

시험예 1: 상기 제조된 두 칩의 SERS 분석

상기 실시예 1에서 제조된 로다민 항체를 고정화시킨 금박막 칩과 비교예 1에서 제조된 BSA만 고정화시킨 금박막 칩에 1μM 농도의 로다민(5-Carboxytetramethylrhodamine, Sigma-Aldrich)을 PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4)에 녹인 용액을 30분 동안 반응시켰다. 상기 칩을 PBS, 증류수를 이용하여 순차적으로 세척한 후, LI silver enhancement 킷(Invitrogen, 미국) 2ml (Enhancer 용액과 Initiator 용액 각각 1ml씩 혼합)에 30분 동안 빛이 차단된 곳에서 담지하였다. 상기 칩을 증류수로 세척하고, 질소개스로 건조한 후, 공초점 Raman 현미경으로 분석하였다. 상기 칩 중 로다민 항체를 고정화 한 경우의 AFM 이미지를 도 3에 도시하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 20 nm의 금 나노입자에 은 나노입자가 형성되어 50 nm 내외의 입자가 형성된 것을 알 수 있었다.

그 결과, 상기 두 칩에 대한 라만 스펙트럼을 도 4에 나타내었다. 도 4A에 나타난 바와 같이, 로다민 항체를 고정시킨 경우, 매우 강한 라만 피크가 나타나는 반면, 도 4B에 나타난 바와 같이 BSA만 고정시킨 경우, 라만 피크가 나타나지 않았다. 이는 로다민 고유의 라만 스펙트럼과 로다민의 선택적인 리셉터 분자로써 실시예 1에서 제조된 로다민 항체를 이용하여, 시료 내의 로다민을 선택적으로 분석할 수 있음을 의미한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명의 표면증강 라만분광을 이용하여 시료 내 특정물질을 분석하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.

도 2는 기판에 금 나노입자를 고착한 후, 리셉터 분자를 결합시킨 표면의 AFM 이미지이다.

도 3은 상기 리셉터 분자가 결합된 기판에 시료를 반응시킨 후, 은 나노입자를 형성시킨 AFM 이미지이다.

도 4는 시험예의 표면증강 라만 스펙트럼을 나타낸 그래프로서, 도 2A는 로다민 항체를 고정화시킨 후 로다민을 분석한 경우의 스펙트럼이고, 도 2B는 BSA만 고정화시킨 후 로다민을 분석한 스펙트럼이다.

<도면에 대한 설명>

1: 기판

11: 나노입자

21: 리셉터 분자

31: 시료

41: 은 나노입자

Claims (14)

1. 다음 단계를 포함하는, 표면증강 라만분광을 이용한 시료 내 특정물질의 분석방법:

   (a) 나노입자 기재에 항체, DNA, 압타머, PNA 및 리간드로 구성된 군에서 하나 이상의 리셉터 분자를 고정화하는 단계;

   (b) 상기 고정된 리셉터 분자와 시료를 반응시켜 상기 리셉터 분자와 시료 내 특정물질 간의 결합을 유도하는 단계;

   (c) 상기 리셉터 분자와 특정물질 간의 결합이 유도된 부위에 금, 은 및 구리로 구성된 군에서 선택되는 금속이온과 환원제를 혼합하여 상기 나노입자 기재를 시드(seed)로 하여 금속 나노입자를 형성시키는 단계; 및

   (d) 상기 리셉터 분자와 특정물질간의 결합이 유도된 부위에 형성된 금속 나노입자에 의해 특정물질의 표면증강라만분광을 측정하는 단계.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계의 나노입자는 금, 은, 자기(magnetic), 이산화규소(SiO₂) 및 이산화티타늄(TiO₂)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제

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