KR100996665B1

KR100996665B1 - 페닐 2-피리딜 케톡심을 유효성분으로 함유하는 세포 노화유도용 조성물 및 이를 이용한 세포 노화유도방법

Info

Publication number: KR100996665B1
Application number: KR1020070118752A
Authority: KR
Inventors: 장익순; 권요셉; 박준수; 정윤조
Original assignee: 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2007-11-20
Filing date: 2007-11-20
Publication date: 2010-11-25
Also published as: KR20090052184A

Abstract

본 발명은 세포 노화유도물질, 세포 노화유도방법 및 세포 노화의 마커에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 상기 세포 노화유도물질은, Phenyl 2-pyridyl ketoxime 또는 그 유도체, (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 또는 그 유도체이고, 상기 (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 또는 그 유도체의 입체이성질체인 대조물질 (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 또는 그 유도체를 사용하여 세포 또는 조직의 노화를 유도하고, 상기 대조물질을 포함하여, 상기 세포 노화유도물질을 세포 노화를 확인하는 마커로 사용한다. 본 발명은, 세포나 조직에 노화를 신속하고 저렴한 비용으로 정밀하게 유도하여, 직접적인 노화 연구를 가능하게 하고, 상기 세포나 조직의 노화 여부와 노화 정도를 상기 마커로 확인하여 질병을 초기에 확인하고, 더 나아가 암, 고혈압, 당뇨, 관절염, 심장병 등의 질환을 예방하는 기능을 한다. 또한, 다양한 연령의 포화 동물의 세포나 조직에 간편하고 저비용으로 적용할 수 있어, 노화와 관련된 분야의 연구를 증진시킨다. 또한, 본 발명은 노화세포를 검출하고, 노화를 진단할 수 있는 방법을 제공하므로, 노화와 관련된 분야에 다양하게 적용될 수 있다.

노화유도물질, 카베올린, 웨스턴 블롯팅, 분열증식속도, 마커, 노화진단

Description

페닐 2-피리딜 케톡심을 유효성분으로 함유하는 세포 노화유도용 조성물 및 이를 이용한 세포 노화유도방법{Composition for inducing cell senescence comprising phenyl 2-pyridyl ketoxime and method for inducing cell senescence using the same}

본 발명은 세포 노화유도물질, 세포 노화유도방법 및 세포 노화의 마커에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 Phenyl 2-pyridyl ketoxime 또는 그 유도체, (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 또는 그 유도체, 또는 (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 또는 그 유도체와 입체이성질체관계에 있는 (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 또는 그 유도체인 대조물질을 포함하는 상기 세포 노화유도물질을 세포에 배지투여 또는 세포내 도입하는 방법인 세포 노화유도방법과, 상기 세포 노화유도물질을 세포 노화를 확인하는 표지로 사용하는 세포 노화의 마커에 관한 것이다.

노화는 유전자, 단백질, 지질 등 생체를 구성하는 성분과 다양한 물리화학적 환경 요인과의 상호 작용에 의한 생화학적 변화와 생물학적 기능의 변화를 수반하 며 생체의 발생, 세포 분열, 세포 사멸 그리고 분화 등의 다양한 생명 현상의 변화가 함께 진행되는 복잡하고 종합적인 생명현상이다. 인간의 경우, 60세 이후부터 알츠하이머병 등의 뇌질환, 심 혈관 질환, 그리고 암의 발병과 이들 질병에 의한 사망률이 급격하게 증가되는 등 노화와 노인성 질환이 밀접하게 연관되어 있다.

따라서, 노화는 국민의 건강과 삶의 질 향상과 밀접한 관련이 있어 많은 나라에서 국가 차원의 집중적인 지원 아래 노화에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

노인 인구의 급증으로 노화 및 노인성 질환에 대한 관심은 높아지고 있으나 노화에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다. 또한 노인성 질환인 신경퇴행성 질환, 심혈관계 질환, 당뇨병 그리고 암 등 각 질병에 대한 연구는 전 세계적으로 매우 활발히 진행되고 있으나, 노화에 따른 질병의 증가와 연계성에 대한 연구는 매우 부족하다. 이를 위해선 세포수준에서부터 조직에 대한 노화의 이해가 필요하고 그에 따라 질병과 연계하여 연구함이 필요하다.

세포의 노화(cellular senescence)는 세포외 간질(Extra cellular Matrix)의 양적(quantitative), 질적(qualitative) 변화를 수반한다. 최근 유전자의 differential screening기법을 통하여 정상노화 섬유아세포 (normal senescent human fibroblast)와 조로(premature aging)가 주요 증상인 Werners syndrome 환자의 섬유아세포에서 과발현되는 유전자들을 검색해 냈으며, 이들은 세포외 간질의 콜라젠과 일래스틴의 상호결합(cross-linking)에 작용하는 lysyl-oxidase이며, fibronection의 수용체인 integrin α5β1 heterodimer의 형성을 감소시킨다.

또한, 노화와 더불어 혈관신생(angiogenesis) 과정이 매우 느려지는데, endothelial cell로부터 collagenase 분비가 줄어드는 것과, VEGF(vascular endothelial growth factor) 등의 혈관신생 관련 인자의 생성이 줄어드는 것이 중요한 원인임이 보고되었다. 이러한 보고들은 “노화는 세포외 간질 및 세포막 수용체(cell membrane receptor)의 변화를 수반”하는 것임을 시사하고 있다.

노화를 유도하는데에 작용하는 단백질 연구는 위에 언급한 lysyl-oxidase, 폴리펩티드 등과 같이 활발히 진행중이다. 폴리펩티드를 노화 유도 물질로 사용하는 기술(미국 특허공개 제2006-0009379호)이 알려져 있다. 그러나, 상기 폴리펩티드를 노화 유도 물질로 사용하는 경우, 유전적 변이를 유발하는 문제점이 있다.

이에 비해, 단백질 이외의 물질연구에 대한 보고는 그리 많지 않은 실정이다. 특히, 세포외 간질부분은 노화세포의 morphology를 나타내는데에 중요한 부분이나, integrin 단백질, focal adhesion kinase등의 몇몇 단백질 연구가 세포질 부분의 작은 G 단백질인 Rho, Rac, cdc42 등의 활성 연계되어 세포의 migration 위주로 주로 연구가 진행되고 있다.

또한, Ribonucleotide reductase인 hydroxyurea의해 노화가 유도(Yeo EJ et al. Exp Gerontol. 2000 Aug;35(5):553-71)됨이 보고되었다. 그러나, 상기 연구는 세포내 세포주기 조절인자들의 변화는 보이지 않는 문제점이 있다.

또한, 저분자 물질인 과산화수소를 노화 유도 물질로 사용하는 기술(대한민국 특허등록 제466623호)이 기재되어 있다. 그러나, 상기 과산화수소를 노화 유도 물질로 사용하는 경우, 세포가 손상되는 문제점이 남아 있다.

그리고, 실험동물학 분야에서는 다양한 실험동물 모델의 개발을 요구하고 있고, 유전자의 기능 분석을 통한 질병의 연구와 신약개발에 없어서는 안 될 중요한 도구로 실험동물이 활용되고 있다. 이러한 실험동물 생산 및 판매를 하는 기업들이 있으나, 노화관련 연구를 위한 노화동물 생산은 전혀 되어 있지 않다.

본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서 저분자 물질을 사용함에 의해, 세포의 손상과 유전적 변이를 유발하지 않으면서도 노화를 유도하여 노화 연구의 모델을 제공하는 세포 노화유도물질을 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명의 상기 목적은 Phenyl 2-pyridyl ketoxime 또는 그 유도체를 포함한 세포 노화유도물질을 형성함으로써 달성할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 목적은 (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 또는 그 유도체를 포함한 세포 노화유도물질을 형성함으로써 달성할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 목적은 (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 또는 그 유도체와 입체이성질체 관계에 있는 하기 화학식 3의 (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 또는 그 유도체로서, 노화유도를 하지 않으며 세포 노화유도의 기준점으로 사용되는 대조물질을 형성함으로써 달성할 수 있다.

또한, 본 발명은 노화유도물질을 사용하여 포유동물 세포의 노화를 신속히 유도하는 노화유도방법을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명의 상기 목적은 상기 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 포 유동물의 세포에 배지투여 또는 세포내 도입하는 단계를 포함하는 포유동물 세포의 노화유도방법을 제공함으로써 달성할 수 있다.

또한, 본 발명은 노화유도물질을 입체이성질체인 대조물질과 대비하여 세포 노화를 확인하는 표지인 마커로 제공함을 목적으로 한다.

본 발명의 상기 목적은 상기 세포 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 포함하는 세포 노화의 마커를 제공함으로써 달성할 수 있다.

또한, 본 발명은 노화세포를 검출하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명의 상기 목적은 상기 세포 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 마커로 사용하고, 발현되는 카베올린 단백질을 측정하여 노화세포를 검출하는 방법을 제공함으로써 달성할 수 있다.

또한, 본 발명은 노화를 진단하는 방법을 제공함으로 목적으로 한다.

본 발명의 상기 목적은 상기 세포 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 마커로 사용하고, 발현되는 카베올린 단백질을 측정하여 노화를 진단하는 방법을 제공함으로써 달성할 수 있다.

본 발명은 세포 노화유도물질에 있어서, 상기 세포 노화유도물질은 하기 화 학식 1의 Phenyl 2-pyridyl ketoxime 또는 그 유도체를 포함한다.

여기서, R1은 -H, C1 ~ C5 알킬기, C1 ~ C5 시클로 알킬기이고,

R2는 -H, C1 ~ C5 알킬기, C1 ~ C5 시클로 알킬기, -Cl, -F, -Br, -I이고,

R3는 -H, C1 ~ C5 알킬기, C1 ~ C5 시클로 알킬기, -COOH, -NH₂, -OH, -SH이고,

R4, R5, R6는 -H, C1 ~ C5 알킬기, C1 ~ C5 시클로 알킬기이고,

R7은 -H, C1 ~ C5 알킬기, C1 ~ C5 시클로 알킬기, -NO₂, -PO₃, -SO₄이고,

R8, R9는 -H, C1 ~ C5 알킬기, C1 ~ C5 시클로 알킬기이다.

또한, 본 발명의 세포 노화유도물질은 하기 화학식 2의 (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 또는 그 유도체를 포함한다.

여기서, R1은 -H, C1 ~ C5 알킬기, C1 ~ C5 시클로 알킬기, -COOH, -NH₂, -OH, -SH이고,

R3, R4는 C1 ~ C5 알킬기, C1 ~ C5 시클로 알킬기, -Cl, -F, -Br, -I, -COOH, -NH₂, -OH, -SH이다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 2의 (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 또는 그 유도체와 입체이성질체 관계에 있는 하기 화학식 3의 (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 또는 그 유도체로서, 노화유도를 하지 않으며 세포 노화유도의 기준점으로 사용되는 대조물질을 포함한다.

구체적으로, 다양한 세포모델을 이용하여 세포분열에 중요한 mitogenic signaling, 항상성을 조절하는 metabolic signaling, 노화에 따른 관련 인자의 관찰, 신경세포에서의 노화에 따른 변화, 조직과 노화에 따른 퇴행성 질환들에 대하여 다각적인 연구를 하여 노화에 따른 변화 및 기전을 밝히기 위해 세포와 조직에 대해 노화를 신속히 유도하는 세포 노화유도물질을 제공하는 것이다.

또한, 대형 공동연구장비 등을 활용하여 노화관련 마커를 제공하고, 노화세포 검출방법과 노화진단방법을 제공한다. 이러한 관점에서 세포 노화와 관련된, 세포막 및 세포외 간질에 존재하는 각종 단백질 변화를 관찰하고, 노화와 관련된 새로운 마커를 찾는 것은 세포의 노화 및 각종 조직의 노화를 이해하고 노화관련 질병의 작용점 예측을 하는데 중요한 역할을 한다.

이때, 상기 화학식 1, 화학식 2의 세포 노화유도물질과 그 유도체는 세포외 간질 부분에서 젊은 세포와 비교하여 노화세포에서 많이 나타나는 물질이다. 상기 세포 노화물질과 그 유도체가 상기 노화세포에서 많이 발견되므로, 기체크로마토그래피-질량분석(GC-MS)법으로 분리한 후, 데이터베이스 검사(DB search)하여 후보물질을 확보하고, 상기 후보물질을 순수하게 얻은 후 상기 젊은 세포에 처리하여 세포모양의 변화와 세포 성장능력을 측정하고, 웨스턴 블롯팅 방법으로(western bolt) 노화의 결과인 카베올린 단백질의 발현증가를 확인하여, 상기 화학식 1, 화학식 2의 세포 노화유도물질과 그 유도체의 노화유도효과가 있음을 알아내었다.

그런 다음, 상기 화학식 1, 화학식 2의 세포 노화유도물질과 그 유도체를 합성하여, 상기의 방법에 따라 젊은 세포에 다시 처리하여, 상기 화학식 1, 화학식 2의 세포 노화유도물질과 그 유도체가 노화를 유도한다는 것을 검증하였다.

그리고, 상기 화학식 2의 세포 노화유도물질과 그 유도체는 입체 이성질체를 가질 수 있으므로, 상기 화학식 3의 대조물질을 합성하여 상기 대조물질을 젊은 세포에 처리하여, 상기 대조물질이 노화를 유도하는가를 살펴보았으나, 상기 대조물 질은 입체 이성질체일 뿐, 상기 화학식 2의 세포 노화유도물질과 그 유도체와 달리 노화를 유도하지 않는 것으로 나타났다. 그러나, 상기 화학식 3의 대조물질을 상기 화학식 2의 세포 노화유도물질과 그 유도체와 함께 젊은 세포에 처리하여 노화 유도를 알아보는 경우, 대비되는 값에 의해, 상기 화학식 2의 세포 노화유도물질과 그 유도체의 노화 유도 능력 검증이 용이하게 된다. 그러므로, 상기 대조물질을 세포 노화유도물질과 그 유도체와 함께 노화를 확인하는 표지인 마커로 사용하는 경우, 상기 마커에 의해 노화세포를 검출할 수 있고, 이에 따라 세포 노화를 정밀히 진단할 수 있다.

상기 화학식 1의 Phenyl 2-pyridyl ketoxime을 젊은 세포에 처리하였을 때, 24 ~ 68 시간 내에 상기 젊은 세포의 모양이 노화세포와 비슷하게 동그랗게 변하기 시작하고, 상기 젊은 세포의 세포성장능력이 감소하여 세포주기 진행이 느려진다. 10일 이상 진행하면 완전한 구형의 노화세포 모양이 되고, β-gal(β-galactosidase) 염색이 되어 노화세포의 특성을 나타낸다. 또한, 상기 처리된 세포는 분열증식속도도 감소하는 특성을 나타낸다.

이때, 상기 화학식 1의 Phenyl 2-pyridyl ketoxime은 Phenyl(2-pyridyl)ketone과 NH₂OH·H₂O를 반응시켜 얻으나, 그에 한정하지 않는다.

또한, 상기 화학식 1의 Phenyl 2-pyridyl ketoxime의 유도체인 Phenyl 4-methylpyridyl ketoxime을 젊은 세포에 처리하여 노화세포를 유도하는 방법은 상기 Phenyl 2-pyridyl ketoxime과 동일하다.

상기 Phenyl 4-methylpyridyl ketoxime은 (4-Methyl-pyridin-2-yl)-phenyl-methanone과 NH₂OH·H₂O를 반응시켜 얻으나, 그에 한정하지 않는다.

여기서, 상기 methyl기 대신에 C1 ~ C5 알킬기, C1 ~ C5 시클로알킬기, -NO₂, -PO₃, -SO₄를 사용하는 경우도 동일하다.

또한, 상기 화학식 1의 Phenyl 2-pyridyl ketoxime의 유도체인 Benzoyl 2-pyridyl ketoxime을 젊은 세포에 처리하여 노화세포를 유도하는 방법은 상기 Phenyl 2-pyridyl ketoxime과 동일하다.

상기 Benzoyl 2-pyridyl ketoxime은 4-(Pyridine-2-carbonyl)-benzoic acid와 NH₂OH·H₂O를 반응시켜 얻으나, 그에 한정하지 않는다.

여기서, 상기 -COOH기 대신에 C1 ~ C5 알킬기, C1 ~ C5 시클로알킬기, -NH₂, -OH, -SH를 사용하는 경우도 동일하다.

또한, 상기 화학식 1의 Phenyl 2-pyridyl ketoxime의 유도체인 3-Chlorophenyl 2-pyridyl ketoxime을 젊은 세포에 처리하여 노화세포를 유도하는 방법은 상기 Phenyl 2-pyridyl ketoxime과 동일하다.

상기 3-Chlorophenyl 2-pyridyl ketoxime은 (3-Chloro-phenyl)-pyridine-2-yl-methanone과 NH₂OH·H₂O를 반응시켜 얻으나, 그에 한정하지 않는다.

여기서, 상기 -Cl기 대신에 C1 ~ C5 알킬기, C1 ~ C5 시클로 알킬기, -F, -Br, -I를 사용하는 경우도 동일하다.

이러한 상기 화학식 1, 화학식 2의 세포 노화유도물질과 그 유도체는 세포의 FAK(focal adhesion kinase)에 작용하여 세포의 모양을 변화시키고, 세포주기를 느리게 한다.

상기 화학식 2의 (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol을 젊은 세포에 처리하였을 때, 24 ~ 68 시간 내에 상기 젊은 세포의 모양이 노화세포와 비슷하게 동그랗게 변하기 시작하고, 상기 젊은 세포의 세포성장능력이 감소하여 세포주기 진행이 느려진다. 10일 이상 진행하면 완전한 구형의 노화세포 모양이 되고, β-gal(β-galactosidase) 염색이 되어 노화세포의 특성을 나타낸다. 또한, 상기 처리된 세포는 분열증식속도도 감소하는 특성을 나타낸다.

이때, 상기 화학식 2의 (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol은 중간체인 (R)-S-benzyl thioglycerate를 p-toluene sulfonic acid와 dimethoxy propane과 반응시켜 얻으나, 그에 한정하지 않는다.

또한, 상기 화학식 3의 (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol은 노화를 유도하지 않으나, 상기 화학식 2의 입체이성질체로서, 상기 화학식 2의 (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol의 노화 유도 효과를 대비하여 나타내는 특성이 있다.

그러므로, 상기 화학식 3의 (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol을 대조물질로 노화유도물질에 포함시켜, 상기 화학식 3의 대조물질에 대해 상기 화학식 1, 화학식 2의 노화유도물질의 세포나 조직의 노화유도를 정성, 정량적으로 측정할 수 있다.

따라서, 본 발명의 세포 노화유도물질에 상기 대조물질을 포함시킨다.

이때, 상기 화학식 3의 (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol은 2,3-O-isopropylidene-L-methyl glycerate를 LiBH₄와 반응시켜 얻으나, 그에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 배지투여 또는 세포 내로의 도입에 의해 포유동물의 세포내에 존재하는 카베올린 단백질의 발현 증가를 유도하는 방법을 제공한다.

세포가 노화됨에 따라 상기 카베올린 단백질의 발현이 증가된다. 상기 카베올인 단백질은 노화세포에서 많이 나타나므로, 상기 카베올린의 양이 많을수록 노화의 정도가 크다는 것을 알 수 있다.

일반적으로, 포유동물의 수명에 따라 노화에 걸리는 시간이 다르고, 장시간이 소요되므로, 노화 연구를 위해 노화를 신속히 유도할 필요성이 있다.

이때, 상기 포유동물의 노화를 자연적인 상태에서 인위적인 상태로 유도하기는 하지만, 노화의 근본 현상은 유지하여야 하므로, 상기 노화유도물질을 사용하여 노화를 유도하더라고, 노화의 현상인 상기 카베올린 단백질의 발현양의 증가가 나타나야 한다.

그러므로, 노화를 신속히 유도하여 세포에서 발현되는 카베올린 단백질을 발현양을 증가시키기 위해, 세포에 상기 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 배지투여 또는 세포내로 도입한다.

세포에 상기 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 배지투여하는 방법은, 용매 디메틸 설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO), 글리세롤(glycerol), 또는 에틸아세테이드(ethylacetate)에 상기 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 용해시켜, 농도가 진한 표준용액(stock solution)을 만들고, 세포가 있는 배지에 상기 용액을 농도에 맞게 투입한다.

또한, 상기 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 세포내 도입하는 방법은, 상기 용액을 미세주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기천공법, 또는 양 이온성 리포좀 이용법을 사용한다.

상기 미세주입법은 상기 용액을 주사기, 침 등을 이용하여 세포내부로 주입하는 방법이다.

상기 칼슘 포스페이트 공동-침전법은 상기 용액을 염화칼슘과 혼합한 후, 인산완충용액(phosphate buffered saline solution, PBS)에 넣어 인큐베이트하여 상기 용액이 들어간 칼슘 포스페이트 침전을 형성하고, 상기 세포가 상기 용액이 들어간 칼슘 포스페이트 침전을 엔도사이토시스(Endocytosis; 세포 이물 흡수) 또는 파고사이토시스(Phagocytosis; 식세포 작용)에 의해 포획하여 세포내로 도입하는 방법이다.

상기 전기천공법은 상기 세포에 전기적인 펄스를 주어 상기 용액이 들어갈 구멍을 만들어 상기 구멍을 통해 상기 용액이 세포내로 도입되는 방법이다.

상기 양 이온성 리포좀 이용법은 합성된 양이온 지질로 리포좀 수송체를 만 들고, 상기 리포좀 수송체를 통해 상기 용액을 세포내로 도입하는 방법이다.

여기서, 상기 노화유도물질에 의해 상기 카베올린 단백질의 발현양을 측정할 필요성이 발생한다.

즉, 화학식 1 내지 화학식 3의 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 배지투여 또는 세포 내로의 도입에 의해 포유동물의 세포내에 존재하는 카베올린 단백질의 발현 증가를 웨스턴 블롯팅 방법에 의해 측정하는 카베올린 단백질의 발현 증가를 측정하는 방법을 제공한다.

상기 웨스턴 블롯팅 방법은 항체를 사용한 단백질의 분리, 검출을 위한 방법이다.

여기서, 상기 웨스턴 블롯팅 방법은,

포유동물의 세포에 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 배지 투여 또는 세포내 도입한 후 배양하는 단계; 상기 배양된 포유동물의 세포 시료를 용해하는 단계; 상기 용해된 세포로부터 단백질을 수득하는 단계; 상기 수득된 단백질을 변성시키는 단계; 상기 변성된 단백질을 SDS-PAGE하는 단계; 상기 SDS-PAGE가 완료된 겔 상의 변성 단백질을 니트로셀룰로오즈 멤브레인으로 전이하는 단계; 상기 니트로셀룰로오즈 멤브레인상의 단백질과 1차 항체인 항카베올린 항체를 반응시키는 단계; 상기 1차 항체와의 결합능을 가지며, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제 및 호스래디쉬 퍼록시다아제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 효소가 결합된 2차 항체를 상기 1차 항체와 반응시키는 단계; 상기 2차 항체에 결합된 효소의 기질 을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및 상기 발색반응에 의해 전개된 발색의 정도를 측정하는 단계;를 포함한다.

상기 웨스턴 블롯팅 방법에서 상기 포유동물의 세포에 상기 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 배지투여 또는 세포내 도입한 후 배양한다.

상기 배지투여 방법에 대한 상세한 설명은 앞의 기재를 원용한다.

상기 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질의 포유동물 세포 내로의 도입은 미세주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기천공법, 또는 양 이온성 리포좀 이용법이다.

상기 세포내 도입에 대한 상세한 설명은 앞의 기재를 원용한다.

이때, 상기 노화유도물질에 의해 상기 세포가 노화유도되어 발현된, 상기 카베올린 단백질은 상기 웨스턴 블롯팅의 발색반응을 통해 검출 및 정량측정된다.

그러므로, 상기 노화유도물질은 상기 카베올린 단백질의 발현양의 증가를 통해 상기 세포에서 노화를 유도함을 알 수 있다.

즉, 화학식 1 내지 화학식 3의 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 포유동물의 세포에 배지투여 또는 세포내 도입하는 단계를 포함하는 포유동물 세포의 노화유도방법을 제공한다.

앞의 설명과 같이, 상기 노화유도물질은 상기 세포에서 젊은 세포에 처리하였을 때, 24 ~ 68 시간 내에 상기 젊은 세포의 모양이 노화세포와 비슷하게 동그랗게 변하기 시작하고, 상기 젊은 세포의 세포성장능력이 감소하여 세포주기 진행이 느려진다. 10일 이상 진행하면 완전한 구형의 노화세포 모양이 되고, β-gal(β-galactosidase) 염색이 되어 노화세포의 특성을 나타낸다. 또한, 상기 처리된 세포는 분열증식속도도 감소하는 특성을 나타낸다.

상기 화학식 1, 화학식 2의 세포 노화유도물질과 그 유도체가 노화를 유도하는 노화메커니즘은 세포의 FAK(focal adhesion kinase)에 작용하여 세포의 모양을 변화시키고, 세포주기를 느리게 하기 때문이다. 그러나, 그것에 한정하지 않는다.

상기 화학식 3의 대조물질은 노화를 유도하지 않고, 상기 세포 노화유도물질과 그 유도체의 노화유도에 대한 기준점으로 사용한다.

여기서, 상기 배지투여 방법에 대한 상세한 설명은 앞의 기재를 원용한다.

여기서, 상기 세포내 도입에 대한 상세한 설명은 앞의 기재를 원용한다.

또한, 본 발명은, 화학식 1 내지 화학식 3에 기재된 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 포함하는 세포 노화의 마커를 제공한다.

상기 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질은 상기 처리된 세포의 모양을 변화시키고, 상기 카베올린 단백질의 발현을 증가시키고, 세포주기를 느리게 변화시키는 등 노화를 유발하고, 또한 노화세포에 존재한다.

그러므로, 노화세포에서 발견되는 상기 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조 물질의 정성, 정량 특성을 측정하여, 상기 노화세포의 노화 정도를 검출할 수 있다. 이러한 특성을 이용하여 세포의 노화를 확인, 검증하는 표지인 마커로 사용한다. 합성된 상기 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 마커로서 다양한 연령의 세포에 함께 넣어 비교하면, 상기 세포의 노화 여부와 노화 정도를 알 수 있다.

상기 대조물질은 상기 세포 노화유도물질 또는 그 유도체와 대비하여 노화 세포의 확인용 표지로서 사용된다.

이때, 노화가 유도되었는 가를 검정하기 위해, 상기 화학식 3의 대조물질을 함께 세포 노화의 마커로 사용하여, 노화의 여부와 노화 정도를 더욱 정밀하게 검출할 수 있다.

이러한, 상기 대조물질은 제2항에 기재된 상기 세포 노화유도물질 또는 그 유도체와 입체이성질체이다. 그러므로, 세포내에 상기 대조물질을 투여함에 따라 나타나는 물리적, 화학적 충격이 거의 없거나 최소화할 수 있다. 또한, 노화 여부와 노화 정도를 측정하는 기준점이 될 수 있다.

또한, 화학식 3에 기재된 대조물질을 노화 세포 또는 노화 조직의 마커로 사용할 때, 질량분석 장비를 이용하여 상기 대조물질의 질량값을 검출 또는 정량하는 방법을 제공한다.

상기 대조물질이 노화 여부와 노화 정도를 측정하는 기준점으로서 사용하므로, 상기 대조물질의 질량값을 검출 또는 정량할 필요가 있고, 그 방법으로 질량분석 장비를 이용한다. 상기 질량분석 장비는 최소량의 시료로 정밀하게 검출 또는 정량할 수 있는 장점이 있다.

또한, 화학식 3에 기재된 대조물질을 노화 세포 또는 노화 조직의 마커로 사용할 때, 액체 크로마토그래피법을 이용하여 상기 대조물질을 검출 또는 정량하는 방법을 제공한다.

상기 대조물질이 노화 여부와 노화 정도를 측정하는 기준점으로서 사용하므로, 상기 대조물질의 검출과 정량의 필요성이 있고, 그 방법으로 액체 크로마토그래피법을 사용한다. 상기 액체 크로마토크래피법은 상기 대조물질의 물리적, 화학적 특성을 간편하게 측정할 수 있는 장점이 있다.

여기서, 상기 액체 크로마토그래피법외에 다른 얇은 막, 고속액체, 겔침투, 또는 기체 크로마토그래피법을 사용하는 것도 용도에 따라 가능하다.

또한, 화학식 1 내지 화학식 3에 기재된 세포 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 마커로 사용하고, 발현되는 카베올린 단백질을 측정하여 노화세포를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 화학식 1 내지 화학식 3에 기재된 세포 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 마커로 사용하고, 발현되는 카베올린 단백질을 측정하는 방법에 의해 다양한 연령의 세포에서, 노화 세포를 검출할 수 있다. 상기 다양한 연령의 세포는 세포 내부적인 요인, 또는 세포 외부적인 요인에 의해 노화가 유발될 수 있다.

그 일예로, 암, 당뇨, 고혈압, 간경화, 관절염, 디스크 등 여러 질병에 의해 유발된 노화세포도 검출할 수 있다.

또한, 노화세포를 검출하는 방법이 간단하고, 명확하고, 비용이 저렴한 특성이 있고, 시간이 적게 소요되므로, 인간을 포함한 포유 동물의 시기별 노화 세포 검출에 유리하다.

또한, 화학식 1 내지 화학식 3에 기재된 세포 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 마커로 사용하고, 발현되는 카베올린 단백질을 측정하여 노화를 진단하는 방법을 제공한다.

상기 화학식 1 내지 화학식 3에 기재된 세포 노화유도물질, 그 유도체, 또는 대조물질을 마커로 사용하고, 발현되는 카베올린 단백질을 측정하는 방법에 의해, 인간을 포함한 포유 동물의 노화 세포를 검출하고, 상기 노화 세포를 검출함과 동시에, 또는 노화 세포를 검출하지 않고도 상기 마커로 확인되는 상기 노화 유도물질을 검출, 정량하여 상기 인간을 포함한 포유 동물의 노화를 진단할 수 있다.

상기 노화 진단 방법은 비용이 저렴하고, 진단 시간이 적고, 정밀하고, 병의 진단에 따른 적용이 가능하므로, 여러 용도에 걸쳐 다양하게 사용될 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 세포 노화유도물질, 세포 노화유도방법 및 세포 노화의 마커는 세포나 조직에 노화를 신속하고 저렴한 비용으로 정밀하게 유도하여, 직접적인 노화 연구를 가능하게 하고, 상기 세포나 조직의 노화 여부와 노화 정도를 상기 마커로 확인하여 질병을 초기에 확인하고, 더 나아가 암, 고혈압, 당뇨, 관절염, 심장병 등의 질환을 예방하는 기능을 한다. 또한, 다양한 연령의 포화 동물의 세포나 조직에 간편하고 저비용으로 적용할 수 있어, 노화와 관련된 분야의 연구를 증진시키는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 노화세포를 검출하고, 노화를 진단할 수 있는 방법을 제공하므로, 세포 내부와 세포 외부, 즉 환경적인 영향에 의해 유발된 노화 등 모든 노화에 다양하게 적용되는 장점이 현저하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 - Phenyl 2- pyridyl ketoxime 합성

10g의 Phenyl(2-pyridyl)ketone과 5.98g의 NH₂OH·H₂O를 95% 에탄올 4mL와 물 4mL가 혼합된 용액에 넣고 섞어준다. 이 혼합물에 NaOH 가루 11.0g를 천천히 넣으며 교반한다. 상온에서 1시간 동안 교반한 후, 물 50mL를 더 넣고 중화하고, 드라이아이스를 넣어 더 중화시킨 후, 침전물을 얻어 정제하여 87% 수득률로 생성물을 얻는다.

실시예 2 - Phenyl 4- methylpyridyl ketoxime 합성

11g의 (4-Methyl-pyridin-2-yl)-phenyl-methanone과 6g의 NH₂OH·H₂O를 95% 에탄올 4mL와 물 4mL가 혼합된 용액에 넣고 섞어준다. 이 혼합물에 NaOH 가루 11.0g를 천천히 넣으며 교반한다. 상온에서 1시간 동안 교반한 후, 물 50mL를 더 넣고 중화하고, 드라이아이스를 넣어 더 중화시킨 후, 침전물을 얻어 정제하여 생성물을 얻는다.

실시예 3 - Benzoyl 2- pyridyl ketoxime 합성

12g의 4-(Pyridine-2-carbonyl)-benzoic acid와 6.5g의 NH₂OH·H₂O를 95% 에탄올 4mL와 물 4mL가 혼합된 용액에 넣고 섞어준다. 이 혼합물에 NaOH 가루 11.0g를 천천히 넣으며 교반한다. 상온에서 1시간 동안 교반한 후, 물 50mL를 더 넣고 중화하고, 드라이아이스를 넣어 더 중화시킨 후, 침전물을 얻어 정제하여 생성물을 얻는다.

실시예 4 - 3- Chlorophenyl 2- pyridyl ketoxime 합성

11g의 (3-Chloro-phenyl)-pyridine-2-yl-methanone과 6g의 NH₂OH·H₂O를 95% 에탄올 4mL와 물 4mL가 혼합된 용액에 넣고 섞어준다. 이 혼합물에 NaOH 가루 11.0g를 천천히 넣으며 교반한다. 상온에서 1시간 동안 교반한 후, 물 50mL를 더 넣고 중화하고, 드라이아이스를 넣어 더 중화시킨 후, 침전물을 얻어 정제하여 생 성물을 얻는다.

실시예 5 - (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 합성

중간체인 (R)-S-benzyl thioglycerate를 p-toluene sulfonic acid와 dimethoxy propane과 반응시켜 얻는다. 중간체 (R)-S-Benzyl thioglycerate를 만들기 위해 이스트(Baker's yeast) 1.5Kg과 글루코스 1.5Kg을 30℃, 20L의 물에 녹인다. 30분이 지난 후 20g의 benzyl mercaptan을 20mL의 에탄올에 녹여 천천히 떨어뜨려 섞어준 후 25℃에서 18시간 동안 발효시킨다. 에틸아세테이트를 이용하여 추출하고 정제하여 중간체 (R)-S-Benzyl thioglycerate를 합성한다. 만들어진 중간체 1g을 50mL 아세톤에 녹인 후 0.1g의 p-toluene sulfonic acid와 1.2mL의 dimethoxy propane은 넣어 25℃에서 교반한 후, 3시간 동안 가열시켜 리플럭스 시킨 후 반응을 종결시킨다. 5% NaHCO₃로 중화시킨 후 추출과정을 거쳐 컬럼을 이용하여 분리 정제한 후 LiAlH₄를 이용하여 83% 수득률로 생성물을 얻는다.

실시예 6 - (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 합성

2,3-O-isopropylidene-L-methyl glycerate를 에테르에 녹여 0℃에서 LiBH₄를 처리한 후 3시간 동안 교반한 후, 유기용매로 추출하여 생성물을 95% 수득률로 얻는다.

실시예 7 - 세포 성장(젊은 세포와 늙은 세포의 제작)

Primary 인간 섬유아세포는 신생아의 음경포피(foreskin)에서 분리하였다. 세포는 10% FBS와 항생제가 포함된 DME 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium)에서 계대 배양으로 유지하였다. 구성 분자종의 차이는 세포수가 2배가 되는 population doubling이 25이하인 젊은 세포와 65-70인 늙은 세포와 비교하였다. 노화(Senescent) 세포의 특성은 형태적인 변화, b-galsctosidase 활성도 증가, 그리고 세포분열능의 감소비율 정도로 특정지어졌다. DME 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium)에서 세포를 60-70% 채울 정도로 1-2일 정도 키운 다음, 0.1% BSA(bovine serum albumin) 또는 세럼 결핍 배지 상에서 2일간 키워 세럼 결핍(serum-starvation)에 의해 세포를 G1 arrest에 이르게 하는 세포동화를 시킨 후 처리하였다.

실시예 8 - 젊은 세포의 간질부분(YM)와 늙은 세포의 간질부분(OM)의 저분자 물질의 비교

늙은 세포의 간질부분(OM)과 젊은 세포의 간질부분(YM)에 포함되어 있는 저분자 물질들을 분석하기 위하여 스크레퍼를 이용하여 배양접시(culture dish)에서 늙은 세포의 간질부분(OM)과 젊은 세포의 간질부분(YM) 세포를 모두 끓어서 제거한 후, 메탄올을 이용하여 배양접시(culture dish)의 표면에 처리하고, 초음파를 이용하여 배양접시(culture dish)의 표면에 붙어 있는 유기물을 모두 떼어내었다. 그 다음 시료 속에 포함되어 있는 단백질 등을 제거하기 위하여 클로로포 름(chloroform)을 처리하고, 볼텍스(vortex)를 이용하여 1분 동안 충분히 흔들어준 후, 원심분리기를 이용하여 실온에서 13,000g의 속도로 30분간 원심분리 하였다. 그 다음 펠릿(Pellet)이 섞이지 않도록 유기용매층만을 조심스럽게 뽑아내고, 유기용매용 PTFE 필터(PTFE filter)를 이용하여 걸러내었다. 시료의 농축을 위하여 원심건조농축기(speed vacuum dryer)를 이용하여 유기용매를 모두 증발시킨 후, 다시 10㎕의 헥산으로 녹여 그 중 1㎕를 분석에 이용하였다. 늙은 세포의 간질부분(OM)과 젊은 세포의 간질부분(YM)에 포함되어 있는 저분자물질 분석은 GC/Mass spectrometry(Agilent 6890GC/5973MS, Palo Alto, USA)를 사용하였으며, GC-Mass에 의해 분리된 피크의 성분은 NIST(National Institute of Standard and Technology) chemical library(Wiley 275 L)에 근거하여 동정하였다.

휘발성 성분의 분석을 위한 GC/MS의 작동 조건은 다음과 같다. GC는 DB-5(0.25 mm×60m, film thickness 0.25 μm) 칼럼(column)이 장착된 Agilent 6890N(USA)을 사용하였으며, 주입기의 온도는 280℃이었다. 오븐의 온도는 70℃에서 3분간 유지시킨 후 시 10℃/min의 속도로 승온하여 300℃에서 5분간 유지시켰다. 이송기체(Carrier gas)로는 헬륨(He)을 1mL/min의 흐름속도로 사용하였고, 시료 1μL를 주입하여 분할율(split ratio) 30:1에서 분석하였다. GC/MS는 Interface의 온도가 250℃이었으며, EI(Electron Ionization) 이온화전압(ionization voltage)은 70eV를 사용하였다. 분자량의 분석 범위는 50-550 m/z 영역을 스캔모드로 분석하였으며, 각 물질은 질량분석기의 Electro-Ionization source에서 70eV의 에너지값을 가하여 나타나는 깨짐 현상(Fragmentation)을 통하여 모든 물질을 정성 하였다. 도 1a에 젊은 세포의 간질부분(YM)의 기체 크로마토그램을, 도 1b에 늙은 세포의 간질부분(OM)의 기체 크로마토그램을 나타내었다.

늙은 세포에 많이 존재하는 저분자물질은 Phenyl 2-pyridyl ketoxime, 또는 (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol이었다.

실시예 9 - 물질 1,2,3 처리

9-1 물질 1,2,3 세포에 처리

물질 1, 2, 3을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 1M 스탁용액(stock solution)을 만들었다. 물질 1은 98% Phenyl 2-pyridyl ketoxime이고, 물질 2는 1M (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol이고, 물질 3은 1M (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol이다. 세포 배양 배지(Cell culture media)의 부피에 맞추어 처리농도를 얻었다. 젊은 세포 배양시 물질 1, 2, 3을 처리하기 전 세럼 결핍 배지(serum free media)로 1일간 처리하여 세포를 안정화(synchronization)시켰다. 마이크로피펫(micropippet)으로 세포에 물질 1,2,3을 처리한 후, 24, 48, 72hr 이상 배양하여 형태학적 변화(morphological change)를 관찰하였다. 이후, 세포의 성장을 알아보는 MTT 검색(MTT assay)을 실시하였다. 그런 다음 발현 단백질을 확인하기 위한 웨스턴 블롯팅 방법(Western blot)을 실시하였다.

9-2 물질 1,2,3 동물에 처리

3~6 월령 C57BL/6J 쥐(mice)에 필요한 물질 1,2,3 처리농도를 구하였다. 이때 무게당 농도(XM/Kg)으로 처리하였다. 물질 1,2,3을 준비하여 쥐(mice)의 꼬리정맥에 32G 바늘크기(needle size) 주사기를 이용하여 전신주입(systemic injection)하였다. 경우에 따라 복강주사(IP injection)하였다. 주입(Injection) 후 24, 48, 72hr 및 2~4 주 후의 처리군과 24 월령의 노화대조군을 비교하였다. 쥐 희생(Mice sacrifice)후 각 조직별로 자른(section) 후 웨스턴 블롯팅 방법(western blot)으로 비교하였다.

실시예 10 - 물질 1,2,3 처리후 세포모양의 촬영

젊은 세포에 물질 1,2,3 처리 후 세포모양을 촬영하였다. 물질 1은 98% Phenyl 2-pyridyl ketoxime이고, 물질 2는 1M (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol이고, 물질 3은 1M (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol이다.

실험방법은 젊은 세포 (104 cells/well)를 24h, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 키운 후, 물질 1, 물질 2, 물질 3을 용매 DMSO에 0, 0.1, 1, 10 mM 농도로 용액을 만든 후, 세포에 처리하여 48시간 뒤에 세포의 모양을 관찰하였다.

도 2a 내지 도 2c는 세포에 Phenyl 2-pyridyl ketoxime(물질 1)을 농도에 따라 처리한 사진으로, 물질 1의 농도가 커질수록 세포수가 감소하고, 세포모양이 구형이 되는 경향이 있다.

도 3a 내지 도 3c는 세포에 (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol(물질 2)을 농도에 따라 처리한 사진으로, 물질 2의 농도가 커질수록 세포수가 급격히 감소하고, 세포모양이 구형이 된다.

도 4a 내지 도 4c는 세포에 (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol(물질 3)을 농도에 따라 처리한 사진으로, 물질 3의 농도와 무관하게 세포모양이 변함이 없다.

실시예 11 - 물질 1,2,3을 처리후 세포의 분열증식속도 ( proliferation rate) 측정

물질 1은 98% Phenyl 2-pyridyl ketoxime이고,

물질 2는 1M (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol이고,

물질 3은 1M (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol이다.

96 well plate에 young cell (p13)을 2x103cells/well로 seeding을 한 후 37℃, 5% CO₂하에 24hr 배양한 후. 물질1, 물질2, 물질3을 1mM 농도로 각각 처리하고, 48hr 배양하였다. cck-8을 10u씩 처리하고, 4hr 배양한 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 표 1은 측정한 흡광도를 나타낸다.

흡광도
	1	2	평균	표준편차
control	0.88	0.923	0.902	0.030
물질 1	0.589	0.581	0.585	0.006
물질 2	0.684	0.653	0.669	0.022
물질 3	0.783	1.168	0.976	0.272

표 1과 같이, Phenyl 2-pyridyl ketoxime(물질 1), 또는 (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol(물질 2)를 처리한 세포에서의 흡광도가 control, 또는 (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol(물질 3)을 처리한 세포에서의 흡광도보다 적은 값으로 나타났고, 이는 물질 1과 물질 2를 처리한 세포가 노화되어 분열증식속도가 감소함에 의해 세포수가 감소했기 때문이다.

도 5에 450nm에서의 흡광도를 도표로 나타내었다.

실시예 12 - 물질 1,2,3을 처리후 유도된 노화세포에서의 카베올린 단백질 발현증가 확인

여기서, 물질 1은 98% Phenyl 2-pyridyl ketoxime이고,

물질 2는 1M (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol이고,

물질 3은 1M (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol이다. 카베올린 단백질(Caveolin-1)은 젊은 세포에서는 발현이 잘 되지 않고, 노화된 세포에서 증가한다. 물질 1, 2에 의해 노화가 유도된 섬유아세포에서, 카베올린 단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅 방법(Western bolt)으로 확인하였다.

6웰플레이트(6well plate)에 젊은 세포(p13)을 5x103cells/well로 파종(seeding)한 후 37℃, 5% CO₂하에 24hr 배양한 후, 물질1, 물질2, 물질3을 각각 1mM 농도로 처리하고, 48hr 배양하였다. 단백질들의 발현 수준을 확인하기 위해 세포를 세포용해버퍼(cell lysis buffer; 1% Triton X-100, 25mM Hepes(pH 8.0), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM NaVO₃, 1mM NaF, 20mM b-glycerol-p, PIC: protease inhibitor cocktail-Roche사)로 용해하고, 이를 4℃에서 9000rpm으로 10분간 원심 분리하여 그 상층액을 취하였다. 이렇게 얻은 세포 추출물을 내재성 막단백질(integral membrane protein)인 BCL을 사용해서 단백질 정량한 뒤, 동량의 단백질을 취하여 5X SDS 시료버퍼(5X SDS sample buffer; 60mM Tris-Cl(pH 6.8), 25% glycerol, 2% SDS, 14.4mM β-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue)를 넣고, 5분간 끓여 변성시켰다. 이렇게 얻은 30-40㎍ 단백질 추출액을 8-10% 폴리아크릴아미이드겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 분리시켰다. 분리된 단백질을 겔(gel)로부터 니트로셀룰로오즈 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 전이하였다. 전이버퍼(Transfer buffer; pH 8.3 25mM Tris-base, 192mM glycine, 20% methanol)를 이용하여 1A의 전류에서 2시간 동안 0.2μm 니트로셀룰로오즈 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 전기적으로 전이하였다. 전이된 니트로셀룰로오즈 멤브레인(nitrocellulose membrane)을 5% 탈지분유(non-fat dried milk)가 들어있는 TTBS(Tris Buffered Saline with Tween-20)로 1시간 동안 블로킹(blocking)시킨 후, 희석된 1차 항체(primary antibody)와 상온에서 2시간 또는 4℃에서 오버나잇(over night) 항원 항체 반응을 시켰다. 그런 다음, TBS-0.1% Tween-20으로 5분씩 3회에 걸쳐 세척한 후에 양고추냉이과산화효소 (호스래디쉬 퍼록시다아제, horseradish peroxidase, HRP)가 붙어 있는 염소 항 마우스 면역글로불린 (goat anti mouse IgG)와 토끼 항 염소 면역글로불린(rabbit anti goat IgG)를 5% 탈지분유가 들어있는 TBS(Tris buffered saline)에 1:2000으로 희석한 것을 사용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, TBS-0.1 % Tween-20으로 5분씩 3회 세척하고, 과산화효소기질(peroxidase substrate)를 포함하고 있는 ECL kit(Pierce)를 이용하여 X-ray film(Kodak)에 현상 인화하여 단백질을 확인하였다.

도 6에서와 같이, 세포에 물질 1 또는 물질 2를 처리하는 경우, 카베올린 단백질이 선명하게 확인됨을 알 수 있었다. 물질 3을 처리하는 경우는 control과 같이, 카베올린 단백질은 검출되지 않음을 확인하였다.

참고문헌

1. Yeo EJ, Hwang YC, Kang CM, Kim IH, Kim DI, Parka JS, Choy HE, Park WY, Park SC. enescence-like changes induced by hydroxyurea in human diploid fibroblasts. Exp Gerontol. 2000 Aug;35(5):553-71.

2. Yeo EJ, Hwang YC, Kang CM, Choy HE, Park SC. Reduction of UV-induced cell death in the human senescent fibroblasts. Mol Cells. 2000 Aug 31;10(4):415-22.

3. Jang IS, Yeo EJ, Park JA, Ahn JS, Park JS, Cho KA, Juhnn YS, Park SC. Altered cAMP signaling induced by lysophosphatidic acid in senescent human diploid fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Mar 21;302(4):778-84.

4. Jang IS, Rhim JH, Kim KT, Cho KA, Yeo EJ, Park SC. Lysophosphatidic acid-induced changes in cAMP profiles in young and senescent human fibroblasts as a clue to the ageing process. Mech Ageing Dev. 2006 May;127(5):481-9. Epub 2006 Mar 3.

5. Cho KA, Ryu SJ, Oh YS, Park JH, Lee JW, Kim HP, Kim KT, Jang IS, Park SC. Morphological adjustment of senescent cells by modulating caveolin-1 status. J Biol Chem. 2004 Oct 1;279(40):42270-8. Epub 2004 Jul 19.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

도 1a는 본 발명에 따른 젊은 세포의 간질부분(YM)의 기체 크로마토그램이다.

도 1b는 본 발명에 따른 늙은 세포의 간질부분(OM)의 기체 크로마토그램이다.

도 2a 내지 도 2c는 본 발명에 따라 세포에 Phenyl 2-pyridyl ketoxime을 농도에 따라 처리한 사진이다.

도 3a 내지 도 3c는 본 발명에 따라 세포에 (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol을 농도에 따라 처리한 사진이다.

도 4a 내지 도 4c는 본 발명에 따라 세포에 (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol을 농도에 따라 처리한 사진이다.

도 5는 본 발명에 따라 세포에 Phenyl 2-pyridyl ketoxime, (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol, (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol을 농도에 따라 처리하여 배양한 후, 450nm에서 측정한 흡광도를 나타낸 도면이다.

도 6은 본 발명에 따라 세포에 Phenyl 2-pyridyl ketoxime, (R)-(-)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol, (S)-(+)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol을 농도에 따라 처리하여 배양한 후, 발현된 카베올린 단백질을 웨스턴 블롯팅 방법에 의해 확인한 사진이다.

Claims

하기 화학식 1의 페닐 2-피리딜 케톡심을 유효성분으로 함유하는 세포 노화유도용 조성물:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R₁ 내지 R₉는 서로 독립적으로 H이다.
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페닐 2-피리딜 케톡심을 배지투여 또는 세포 내로의 도입에 의해 인간을 제외한 포유동물의 세포내에 존재하는 카베올린 단백질의 발현 증가를 유도하는 방법.
페닐 2-피리딜 케톡심을 배지투여 또는 세포 내로의 도입에 의해 인간을 제외한 포유동물의 세포내에 존재하는 카베올린 단백질의 발현 증가를 웨스턴 블롯팅 방법에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는 카베올린 단백질의 발현 증가를 측정하는 방법.
제5항에 있어서,

상기 웨스턴 블롯팅 방법은,

인간을 제외한 포유동물의 세포에 페닐 2-피리딜 케톡심을 배지투여 또는 세포내 도입한 후 배양하는 단계;

상기 배양된 인간을 제외한 포유동물의 세포 시료를 용해하는 단계;

상기 용해된 세포로부터 단백질을 수득하는 단계;

상기 수득된 단백질을 변성시키는 단계;

상기 변성된 단백질을 SDS-PAGE로 분리하는 단계;

상기 SDS-PAGE로 분리된 겔 상의 변성 단백질을 니트로셀룰로오즈 멤브레인으로 전이하는 단계;

상기 니트로셀룰로오즈 멤브레인상의 단백질과 1차 항체인 항카베올린 항체를 반응시키는 단계;

상기 1차 항체와의 결합능을 가지며, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제 및 호스래디쉬 퍼록시다아제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 효소가 결합된 2차 항체를 상기 1차 항체와 반응시키는 단계;

상기 2차 항체에 결합된 효소의 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및

상기 발색반응에 의해 전개된 발색의 정도를 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 카베올린 단백질의 발현 증가를 측정하는 방법.
페닐 2-피리딜 케톡심을 인간을 제외한 포유동물의 세포에 배지투여 또는 세포내 도입하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물 세포의 노화유도방법.
제7항에 있어서, 상기 페닐 2-피리딜 케톡심의 인간을 제외한 포유동물 세포 내로의 도입은 미세주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기천공법, 또는 양 이온성 리포좀 이용법 중에서 선택된 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물 세포의 노화유도방법.
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