KR100989834B1 - 키토올리고당을 함유하는 피로 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키토올리고당을 유효성분으로 함유하는 피로 개선용 조성물 및 AMPK 활성 촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 키토올리고당을 함유하여 AMPK 및 지방대사 관련 효소에 영향을 줌으로써 간세포에서의 에너지 대사를 촉진시키는 조성물에 관한 것이다.

키토올리고당, AMPK, 활성, 촉진, 간세포, 에너지대사

Description

키토올리고당을 함유하는 피로 개선용 조성물{Composition for Reducing Fatigue Containing Chito-Oligosaccharide}

도 1은 키토올리고당 투여에 의한 총 AMPK 및 포스포(phospho)-AMPK(p-AMPK) 단백질 발현량의 변화를 측정한 결과이다.

도 2는 키토올리고당 투여에 의한 총 ACC 및 포스포-ACC(p-ACC) 단백질 발현량의 변화를 측정한 결과이다.

도 3은 키토올리고당 투여에 의한 간세포에서의 지방산 산화 정도를 측정한 그래프이다.

도 4는 키토올리고당 투여에 의한 간세포 내에서의 ATP 생성량의 변화를 측정한 그래프이다.

본 발명은 키토올리고당을 유효성분으로 함유하는 피로 개선용 조성물 및 AMPK 활성 촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 키토올리고당을 함유하 여 AMPK 및 지방대사 관련 효소에 영향을 줌으로써 간세포에서의 에너지 대사를 촉진시키는 조성물에 관한 것이다.

키토산은 폐수처리용 응집제, 중금속 흡착제, 기능성 식품, 이온교환제, 의약용품 등 많은 분야에서 널리 사용되고 있는데 이러한 기능적 특성은 키토산의 분자량과 탈아셀틸화에 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 키토산의 분자량을 조절하는 방법으로는 효소 및 화학적 분해 방법이 일반적으로 사용되고 있으나, 화학적 분해방법은 과량의 강산이나 강염기를 사용하기 때문에 폐수처리에 의한 환경문제를 발생시키는 문제점이 있는 것으로 알려져 있다.

최근 키틴, 키토산 및 그 유도체가 체내에 과잉축적된 유해 콜레스테롤을 흡착·배설하는 탈콜레스테롤 작용, 암세포의 증식을 억제하는 항암작용, 혈압상승의 원인이 되는 염화물 이온을 흡착하고 장에서의 흡수를 억제한 뒤 체외로 배출시킴으로써 혈압상승 억제 작용 및 장내의 유효세균을 증식시키고 세포를 활성화시키며 그 밖에도 혈당조절과 간 기능 개선 작용, 체내 중금속 및 오염물질 배출효과 등 여러 가지 생리활성을 보이기 때문에 생의학 산업분야에서 높은 부가가치를 지닌 유망한 물질로 많은 연구가 진행되고 있다.

특히 키토산을 산 또는 효소로 가수분해시킨 저분자의 다당류인 키토올리고당(chito-oligosaccharide)은 체내흡수가 키토산에 비해 높으며 면역증강작용, 항산화작용(Shon Y 등, J. Chitin and chitosan, 2001, 6, 107-110), 암세포 성장 저해 작용(Nam MY, J. Chitin and Chitosan, 1999, 4, 184-188) 등에 대한 선행연구가 있다. 또한 사염화탄소에 의해 유도된 간 상해를 억제하는 기능을 밝히기도 하였다(cheju J. Life Science, 2(2), 3-10, 1999).

키토올리고당은 현재 건강식품 및 일반식품으로의 다양한 사용에도 불구하고 관련 기능에 대한 물질특허로는 그 수가 제한적이다. 한국공개특허공보 제2005-0104910호에는 동맥경화예방에 효과적인 산화된 저밀도지단백(oxLDL)에서 산화 LDL의 수용체인 LOX-1 유전자 발현억제물질로서의 키토올리고당의 기능이 개시되어 있다. 한국공개특허공보 제2005-0091354호에는 키토올리고당의 PPAR 유전자의 발현억제기능이 개시되어 있다. 이 선행 특허는 분자량이 200-3000이며 중합도가 2-15인 키토올리당에 의한 에탄올 투여로 유발된 지방간 형성 억제를 실시예로 하였다. PPAR 유전자는 주로 지질대사의 필수적인 인자이며 콜레스테롤 항상성 조절 및 지방세포분화 등 지방세포의 합성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이 특허의 경우 키토올리고당이 지방의 합성을 억제하는 기작에 중점을 두었으며 그 평가 방법 또한 지방 합성에 관여된 PPAR-α, PPAR-γ, HMG-CoA 리덕타아제(reductase) 및 FAS를 중심적으로 측정하였다. 그러나 이런 지방 합성억제에 다른 한 축인 에너지 대사촉진과 관련된 지표를 측정하지 않아서 결국 흡수된 에너지원이 어떤 과정으로 소비되는지에 대한 구체적인 방안을 제시하지 못하였다. 또한, 한국공개특허공보 제2004-0083669호는 키토올리고당의 항당뇨 효과에 관한 것으로 글루코스 톨러런스와 인슐린 분비를 증가시켜 혈당의 낮추는 키토올리고당 아스코르빈산염에 대한 것이지만, 인슐린 비의존성 당뇨에 대한 적절한 해소방안으로는 볼 수 없다.

한편, AMPK는 세포 내 에너지가 부족한 상태에서 활성화되는 효소로서 다양한 대사 조절 기능을 통하여 에너지 부족상태로부터 회복을 도와 준다. AMPK (AMP- activated protein kinase)는 일종의 세린/트레오닌 키나아제(serin/threonin kinase)로 ATP에 비하여 AMP 레벨이 증가하는 스트레스 상황에서 활성화되어 세포 내 에너지(ATP) 생산을 증가시키는 효소이다(Bergeron R et al., Diabetes, 50, 1076-1082, 2001; Winder WW et al., Am J Physiol 277:E1-10, 1997). AMPK는 신체내 널리 분포하는 일종의 세린/트레오닌 키나아제로 세포 내 영양상태와 외부환경의 변화에 대한 세포의 적응을 중재하는 에너지 감지기 역할을 하는 것으로 알려지고 있다(Hardie DG, Ann Rev Biochem 67, 821-855, 1998; Hardie DG, Eur J Biochem 246, 259-273, 1997).

AMPK는 α, β, γ 등 3개의 서브유닛(subunit)을 가진 헤테로트리머(heterotrimer)로 하나의 촉매아단위(catalytic subunit) α와 두개의 조절아단위(regulatory subunit) β와 γ로 이루어진다(Kemp BE, Trend Biochem Sci 24:22-25, 1999). 63kd의 촉매아단위는 현재 두 종류의 아이소형(isoform)이 알려져 있는데 AMPKα1은 신체에 널리 분포되어 있고, AMPKα2는 골격근, 심장과 간에 분포하고 있다. β 서브유닛의 경우에도 β1 및 β2의 두 종류가 알려져 있으며, γ 서브유닛의 경우에는 γ1, γ2 및 γ3의 세 종류의 아이소형이 알려져 있다(Stapleton D et al., J Biol Chem 271, 611-614, 1996). AMPK는 세포 내 ATP의 감소와 더불어 AMP가 증가될 때 활성화 되는데 α2는 α1 서브유닛에 비해 AMP에 더 의존적이다. 활성화된 AMPK는 특이적인 단백서열 인식 모티프를 가진 많은 표적 단백질들의 세린(serine) 잔기를 인산화시킨다.

최근의 몇몇 연구들은 AMPK가 세포 내 에너지 상태의 변화에 반응하여 대사전환의 주된 조절자로서 탄수화물과 지방대사에 중요한 역할을 담당하고 있음을 보여주고 있다. AMPK 활성화가 간 대사에 미치는 영향에 대해서도 많은 연구가 이루어졌으며 특히 지방산과 스테롤의 합성과정에 중요한 조절 단계를 촉매하는 아세틸-CoA 카르복시라제(acetyl-CoA carboxylase; ACC)와 3-히드록시-3-메틸글루트릴-CoA 리덕타아제(3-hydroxy-3-methylglutryl-CoA reductase; HMGR)가 주된 연구대상으로 다루어졌다. 분리된 간세포에서 ATP를 고갈시키는 세포수준의 스트레스에 의한 AMPK의 활성화는 HMGR의 인산화를 유도하였고 지방산과 스테롤의 합성을 억제함이 알려졌다(Corton JM et al., Curr Biol 4, 315-324, 1994; Henin N et al., FASEB J 9, 541-546, 1995). 간세포에서 ACC의 불활성화는 지방산 미토콘드리아로 들어가게 하는 역할을 하는 CPT-1(carnithine palmitoyltransferasee-1)을 강력하게 억제하며 지방산 산화에 큰 영향을 주는 말로닐(malonyl)-CoA와 같은 ACC 대사산물의 농도 저하를 초래하게 된다(MaGarry JD, Am J Clin Nutr 67(Suppl.3), 500s-504s, 1998; McGarry JD et al., Eur J Biochem 244, 1-14, 1997). 대표적인 AMPK 활성물질인 AICAR(AICA-riboside)와 간세포를 배양하면 지방산 산화가 증가하고 CPT-1 활성도가 증가하며 이와 같은 CPT-1의 변화는 말로닐-CoA의 농도가 감소하기 때문이다. 또한 분리된 쥐의 지방세포에서 AICAR에 의해 AMPK가 활성화되면 ACC의 인산화에 의해 지질합성의 억제가 관찰된다(Sullivan JE, FEBS Lett 353, 33-36, 1994).

한편, AMPK는 에너지 감지 효소로서, 운동으로 인한 에너지가 고갈되어 ATP/AMP 또는 포스포크레아틴/크레아틴(phosphocreatin/creatine) 비율이 감소하게 되면, ATP 소비경로를 차단하고 ATP 생성경로를 열게 된다(Musi N et al., Biochemical society transactions 31, 161-195, 2002). 특히 운동 후 혈중 글루코스가 근육조직으로 유입되어 소비되게 하는 게이트역할을 가진 GLUT-4 발현이 AMPK 활성도와 함께 증가함이 보고되어, 운동이나 트레이닝에 다른 GLUT-4 발현은 AMPK에 의해 유도되고 있음을 제시하고 있다(Lonford J et al., Scand J Med Sci Spport 13, 169-174, 2003). 이는 인슐린의 신호전달체계는 운동에 크게 영향을 받지 않지만, 운동이 인슐린 신호체계에 미치는 영향을 배제할 수 없다고 하면서 그 영향은 신호전달물질의 공간적 배열과 잘 알려지지 않은 신호매개체인 AMPK의 영향을 말한다고 보고되고 있다(Wojataszewski JF et al., J Appl Physiol 93, 384-392, 2000).

AMPK는 운동 중 유도된 지방산 산화에 기여하게 되는데(Musi N et al., Biochemical society transactions 31, 161-195, 2002), 쥐의 골격근에서 운동 중 활성화된 AMPK는 ACC-2를 인산화에 의한 불활성화시켜 근육에서의 말로닐-CoA 함량을 감소시켜 지방산을 미토콘드리아 안으로 유입시키게 된다. 사람의 골격근에 관한 연구에서도, 운동은 ACC-2를 인산화시키고(Chen Z et al., Am J Physiol 279, E1202-E1206, 2000), 그에 따라 비활성화시킴으로써 보다 높은 지방산화를 유발하는 것으로 보고되었다(Dean D et al., Diabetes, 49(8), 1295-300, 2000).

상기와 같이 AMPK는 세포 내 에너지가 부족한 상태에서 활성화되는 효소로서 다양한 대사 조절 기능을 통하여 에너지 부족상태로부터 회복을 도와 준다. 즉, 운동과 같은 세포 내 ATP 수준이 저하되는 것과 같은 상황 하에 있어서 활성이 상승하고, 그 결과 대사를 촉진하여 ATP 합성을 재촉하는 "대사적 센서(metabolic sensor)"로서 기능하게 된다. 또한, AMPK의 활성화는 에너지 생성을 항진하므로, 운동 시와 같은 에너지를 필요로 하는 상황, 또는 일상 생활에 있어서 에너지의 생성을 촉진함으로써, 운동 능력의 향상이나 피로의 경감도 가능하게 된다. 따라서 AMPK 활성화제는 지구력 향상제, 피로 예방ㆍ개선제로서 식품 또는 의약품의 소재가 될 수 있다.

하기는 간, 지방조직, 근육대사, 이자섬에서 AMPK의 멀티플 효과를 도식화한 것이다(Winder et al, 1999).

한편, 제 2형 당뇨병의 대표적인 항당뇨병 제제인 메트포르민(metformin)은 인슐린저항성 개선을 통한 혈당조절 목적으로 널리 이용되고 있음에도 불구하고 세포 내 작용 기전은 분명치 않으나 메트포르민의 일부 인슐린저항성 개선효과는 AMPK의 활성화를 통해 일어나는 것으로 설명되고 있다(Zhou G et al., J Clin Invest 108, 1167-1174, 2001; Musi N et al., Diabetes 51, 2074-2081, 2002). 또 한 PPAR-γ를 통해 인슐린 감수성을 증가시키는 것으로 알려진 티아졸이딘디오넨(thiazolidinedionen)계 항당뇨병 제제인 로지글리타존(rosiglitazone) 역시 AMPK를 활성화시키는 것으로 알려지고 있다(Fryer LGD et al., J Biol Chem 277, 25226-25232, 2002). 에탄올에 의한 간세포 내 AMPK 및 ACC 활성변화를 실험한 보고에서 쥐의 간세포는 에탄올 경구투여에 의해 AMPK 활성이 감소되며 ACC 활성이 증가되는 현상을 보였다. 또한 쥐 헤파토마 H4IIEC3을 이용한 실험에서 대표적 AMPK 활성화 물질인 AICAR는 에탄올로 유도된 스테롤 합성인자인 SREBP-1을 억제하는 것으로 밝혀져 AMPK 활성화에 의해 에탄올에 의한 지방 합성을 억제하는 것으로 보여진다.

그러나, 상기와 같이 기능이 다양하고 용도가 큰 AMPK 활성에 대한 키토올리고당의 영향에 대해서는 알려진 바가 없는 실정이다.

이에 본 발명자들은 AMPK 활성에 대한 키토올리고당의 영향에 대해 예의 연구한 결과, 키토산올리고당의 AMPK 활성 및 에너지 대사 관련 효소에 미치는 영향을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 키토산올리고당을 이용한 피로 개선용 조성물 및 AMPK 활성 촉진용 조성물을 제공하는데 있다.

상기한 목적에 따라, 본 발명은 키토올리고당을 유효성분으로 함유하는 피로 개선용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 키토 올리고당을 유효성분으로 함유하는 AMPK 활성 촉진용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 키토올리고당은 게, 새우껍질 등을 분쇄, 탈염, 단백질 제거 및 불순물 제거 공정에 의해 키틴으로 분리 정제한 후 탈아세틸화하여 키토산을 제조한 다음, 상기 키토산을 염산 등 무기산을 이용한 화학적 분해방법 또는 효소를 이용한 분해방법을 이용하여 얻을 수 있다.

구체적으로 상기 효소를 이용한 분해방법은 키토산에 정제수를 첨가한 후 염산을 2~3% 첨가하고, 40~60℃의 온도에서 교반하여 고형분 5~10%의 염산이 함유된 키토산 분산액을 만든다. 완전히 용해된 후, pH를 4~6으로 조정하고 키토산 분해 효소인 셀룰라아제를 정제수에 용해하여 투입한다. 이후 40~60℃에서 14~20시간 가수분해한 후, 80℃에서 30분간 열처리하여 효소를 실활한 후 여과 건조과정을 거쳐 키토산올리고당을 얻는다.

상기의 제조공정 중 셀룰라아제의 첨가량에 따라 키토올리고당의 분자량이 변화된다. 효소 투입량 기준으로 키토산의 10%는 분자량 1000이하로, 키토산의 6%는 분자량 1500-2000으로, 키토산의 3%는 분자량 7000-10000의 키토올리고당을 얻을 수 있다. 본 발명에서는 키토산 중량의 3 ~ 10%에 해당하는 효소를 투입하여 분자량 700~9000의 키토올리고당을 얻을 수 있었다.

상기 키토올리고당은 조성물 총 중량에 대하여 10 ~ 90 중량% 범위로 함유하는 것이 바람직하다. 이는 정제 및 연질캡슐 제조 시, 분말 및 기능성 성분의 함량이 10 ~ 60%, 하드캡슐의 제조 시, 10 ~ 90% 함유가 가능한 점을 고려하여 상기 조성물로서 10 ~ 90%를 함유하는 건강기능식품을 제시할 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 방법으로 제조된 키토올리고당을 포함하는 건강식품 조성물을 제공한다. 상기 건강식품으로는 분말, 과립, 정제, 캡슐제 및 드링크 등과 같은 각종 형태의 건강식품이 포함된다. 이러한 조성물은 단위투여 제형으로 되는 것이 바람직하며, 이때 각 투여 제형은 소정량의 유효성분과 함께 보조성분을 함유시키는데, 이밖에도 통상적인 제형 방법에 따라 적당한 희석제, 담체 또는 기타 부형제를 선택하여 함께 혼합시켜 제형화 할 수 있다.

또한, 건강식품 조성물에는, 필요에 따라서 하기의 첨가제의 1종 또는 2종 이상을 첨가 배합할 수도 있다. 상기 첨가제로는, 예를 들어 그레이프프루트, 사과, 오렌지, 레몬, 파인애플, 바나나, 배 등의 각종 과즙(농축 과즙, 분말 과즙 등이어도 좋다); 비타민류(팔미트산 레티놀, 리보플라빈, 피리독신, 시아노코발아민(cyanocobalamine), 아스코르빈산 나트륨, 니코틴산 아미드, 판토텐산 칼슘, 엽산, 비오틴, 콜레칼시페롤(cholecalciferol), 중주석산 콜린, 토코페롤, β-카로틴 등의 수용성 및 지용성 비타민류); 향미료(레몬플레이버, 오렌지플레이버, 딸리플레이버, 그레이프프루트플레이버, 바닐라 에센스 등); 아미노산, 핵산 및 그들의 염류(글루탐산, 글루탐산나트륨, 글리신, 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴산 나트륨, 이노신산 등); 식물 섬유(폴리덱스트로오즈, 펙틴, 크산탄 고무, 글루코만 난, 알긴산 등); 미네랄류(염화 나트륨, 초산 나트륨, 황산 마그네슘, 염화 칼륨, 염화 마그네슘, 탄산 마그네슘, 염화 칼슘, 인산 2칼륨, 인산 1나트륨, 글리세로 인산 칼슘, 구연산제1철 나트륨, 구연산철 암모늄, 구연산철, 황산망간, 황산구리, 요오드화나트륨, 솔빈산칼륨, 아연, 망간, 구리, 요오드, 코발트 등) 등이 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 연질 캡슐의 제조

키토올리고당 80mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 팜유 2mg, 식물성 경화유 8mg, 황납 4mg 및 레시틴 9mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 혼합하여 연질캡슐 충진액을 제조하였다. 1 캡슐당 400㎎씩 충진하여 연질캡슐을 제조하였다. 그리고, 상기와 별도로 젤라틴 66 중량부, 글리세린 24 중량부 및 솔비톨액 10 중량부의 비율로 연질캡슐시트를 제조하고 상기 충진액을 충진시켜 본 발명에 따른 조성물 400mg이 함유된 연질캡슐을 제조하였다.

[실시예 2] 정제의 제조

키토올리고당 80mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 갈락토올리고당 200㎎, 유당 60㎎ 및 맥아당 140㎎을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립한 후 당 에스 테르(sugar ester) 6㎎을 첨가하였다. 이들 조성물 504mg을 통상의 방법으로 타정하여 정제를 제조하였다.

[실시예 3] 드링크제의 제조

키토올리고당 80mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 포도당 10g, 구연산 0.6g, 및 액상 올리고당 25g을 혼합한 후 정제수 300㎖를 가하여 각 병에 200㎖씩 되게 충진하였다. 병에 충진한 후 130℃에서 4∼5 초간 살균하여 음료를 제조하였다.

[실시예 4] 과립의 제조

키토올리고당 80mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 무수결정 포도당 250㎎ 및 전분 550㎎을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하여 제조하였다.

한편, AMPK는 세포 내 에너지가 부족한 상태에서 활성화되는 효소로서 다양한 대사 조절 기능을 통하여 에너지 부족상태로부터 회복을 도와준다. 본 발명에서는 in vitro 실험을 통해서 간세포에서의 키토올리고당 투여가 AMPK 활성변화에 미치는 영향을 분석하였다. 활성화된 AMPK에 의해 간세포에서 ACC가 불활성화되고 이는 지방산이 미토콘드리아로 들어가게 하는 역할을 하는 CPT-1(carnithine palmitoyltransferasee-1)의 강력한 억제제인 말로닐-CoA와 같은 ACC 대사산물의 농도 저하를 초래하게 된다. 이를 검토하기 위해서 키토올리고당 첨가에 의한 ACC 변화를 비교 검토하였다. 또한, ACC 활성이 저해됨에 따라 CPT-1의 억제능이 저하되어 지방산 산화를 촉진할 수 있다. 이에, 키토올리고당 투여에 따른 지방산 산화 정도를 측정하였다.

또한, AMPK는 에너지 감지 효소로서 운동으로 인한 에너지가 고갈되어 ATP/AMP 또는 포스포그레아틴/크레아틴(phosphocreatin/creatine) 비율이 감소하게 되면, ATP 소비경로를 차단하고 ATP 생성경로를 열게 된다. 이를 토대로 AMPK 활성의 증가에 따른 세포내 ATP 함량 증가를 분석하였다.

[시험예 1] AMPK 활성화에 대한 영향 평가

분자량 2000 및 9000의 키토올리고당(100, 500ppm) 및 AICAR(1mM)를 처리한 간세포(HepG2)에 라이시스(lysis) 버퍼(50mM 트리스-HCl, pH7.4, 150mM NaCl, 0.1% SDS, 1.0% 트리톤 X-100. 0.25% 데옥시콜레이트(Deoxycholate), 1mM EDTA, 1mM PMSF)를 가하여 세포를 파쇄하였다. 이렇게 얻어진 균질액을 12000 rpm 15분 동안 원심분리하여 단백질 층을 얻었으며, 웨스턴 블럿(western blot) 방법을 이용하여 ACC 및 p-ACC 단백질의 발현정도를 측정하였다. 50μg의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 젤(SDS-polyacrylamide gel)에 주입하여 전기영동한 후 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)에 트렌스퍼하였다. 막(Membrane)을 블록킹 솔루션(5% 탈지유(skim milk), 10mM 트리스, pH7.5, 10mM NaCl, 0.1% 트윈 20)에 1시간 반응시켜 비특이 바인딩(nonspecific binding)을 배제한 후 AMKP 및 p-AMPK 단백질의 1차 항체(primary antibody)를 넣고 4℃에서 밤새 방치하였다. 블록킹 솔루션(Blocking solution)을 이용하여 10분간 3번 씻어준 후 2차 항체(secondary antibody)를 넣고 1시간 반응시키고 위와 같은 방법으로 세척하였다. ECL 용액을 가한 막(membrane)을 X-레이 필름에 노출시킨 후 단백질 변화량을 확인하였다. 변화량은 이미지 분석기(image analyzer)를 이용하여 광학밀도(optical density)로 산출하였다.

도 1은 간세포에 키토올리고당을 처리하여 배양했을 때 AMPK 단백질 발현량의 변화를 측정한 결과이다. AMPK 활성제로 알려진 AICAR을 투여하였을 때 활성형인 포스포-AMPK 발현이 2배 이상 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한 키토올리고당 처리에 의해서도 p-AMPK 단백질 발현이 증가하였으며, 분자량 2000의 키토올리고당은 AICAR와 비슷한 수준의 활성을 나타내었다. 총 AMPK 발현은 각 처리군 간에 큰 차이를 나타내지 않았다. 상기의 실험으로, 본 발명의 키토올리고당이 AMPK 발현 증가를 촉진한다는 사실을 알 수 있었다.

[시험예 2] ACC 활성화에 대한 영향 평가

분자량 2000 및 9000의 키토올리고당(100, 500ppm) 및 AICAR(1mM)를 처리한 간세포(HepG2)에 라이시스 버퍼(50mM 트리스-HCl, pH7.4, 150mM NaCl, 0.1% SDS, 1.0% 트리톤 X-100. 0.25% 데옥시콜레이트, 1mM EDTA, 1mM PMSF)를 가하여 세포를 파쇄하였다. 이렇게 얻어진 균질액을 12000 rpm 15분 동안 원심분리하여 단백질 층을 얻었으며, 웨스턴 블럿 방법을 이용하여 ACC 및 p-ACC 단백질의 발현정도를 측정하였다. 50μg의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 젤에 주입하여 전기영동한 후 니트로셀룰로스막에 트렌스퍼하였다. 막을 블록킹 솔루션(5% 탈지유, 10 mM 트리스, pH 7.5, 10 mM NaCl, 0.1% 트윈 20)에 1시간 반응시켜 비특이 바인딩을 배제한 후 ACC 및 p-ACC 단백질의 1차 항체를 넣고 4℃에서 밤새 방치하였다. 블록킹 솔루션을 이용하여 10분간 3번 씻어준 후 2차 항체를 넣고 1시간 반응시키고 위와 같은 방법으로 세척하였다. ECL 용액을 가한 막을 X-레이 필름에 노출시킨 후 단백질 변화량을 확인하였다. 변화량은 이미지 분석기를 이용하여 광학밀도로 산출하였다.

도 2에 나타난 결과와 같이 총 ACC 단백질 양은 AICAR와 키토올리고당 처리에 의하여 변화가 없었으나 p-ACC 단백질은 약물 처리에 의하여 뚜렷한 변화를 나타내었다. AICAR의 경우 간세포에서 p-ACC 단백질 발현량을 두배까지 증가시켰으며, 키토올리고당 처리군도 p-ACC 단백질을 증가 효능을 나타내었다. 더욱이 분자량 2000은 농도 의존적으로 p-ACC 발현을 증가시켰으며 100ppm에서는 AICAR와 비슷한 활성을, 500ppm에서는 AICAR 보다 더 큰 활성을 나타내었다. 분자량 9000은 2000에 비해서는 낮은 활성을 보였으나, 100ppm에서 p-ACC를 1.5배까지 증가시켰다.

이로써 AICAR와 키토올리고당이 ACC의 비활성형인 p-ACC 발현을 증가시켜 아세틸-CoA가 말로닐-CoA로 전환되는 것을 억제한다는 것을 알 수 있다. 이는 키토올리고당이 간세포 내 AMPK 활성이 증가시키고 AMPK에 의해 조절되는 단백질인 ACC 활성을 저해함으로써, 지방산 합성의 억제능이 있음을 시사한다.

[시험예 3] 지방산 산화에 미치는 영향

간세포의 지방산 산화(fatty acid oxidation) 정도를 측정하기 위해 HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 분주하여 안정화 시킨 후 AICAR 및 키토올리고당을 농도별(100, 500ppm)로 투여하였다. 6시간 배양 후 세포에 에세이 버퍼(20mM HEPES, 25mM NaHCO₃, 1.2mM KH₂PO₄, 3mM 글루코오스, 114mM NaCl, 4.7mM KCl, 1.2mM MgSO₄, 2.5mM CaCl₂, 1% 울트라 지방산-유리 BSA) 7ml를 첨가하였다. 30분간 반응시킨 후, [1-¹⁴C]-팔미테이트(3.4μCi; 1.0μCi/μ몰)를 첨가하여 2시간 동안 표지하였다. 5% 페르클로릭산(perchloric aicd)을 투여하여 반응을 종결시킨 후 방사선량을 측정하였다.

도 3에서 보는 바와 같이 양성대조군 그룹인 AICAR를 처리한 군에서 지방산 산화 35% 정도 증가하였으며, 키토올리고당 투여에 의해 농도 의존적으로 지방산 산화가 증가하였다. 키토올리고당 500ppm 처리 군에서 AICAR와 비슷한 정도로 지방산 산화를 촉진하는 것을 알 수 있다. ACC 효소 및 ACC에 의해 생성되는 말로닐-coA는 지방산산화에 관여하는 중요한 효소인 CPT-1의 활성을 억제하는 효과를 갖는다. 그러나 키토올리고당 투여에 의해 ACC의 비활성형태인 p-ACC의 발현이 증가하면서 CPT-1에 대한 억제 작용이 감소하여 지방산 산화를 촉진했음을 알 수 있다.

[시험예 4] APT 생성에 미치는 영향

AMPK 활성화에 따른 간세포 내 ATP 생성 정도를 ATP 측정 키트(Promega)를 사용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트에 HepG2 세포를 분주하여 안정화시킨 후 AICAR 및 키토올리고당을 농도별(5-500ppm)로 투여하였다. 24시간 배양 후 기질과 버퍼를 혼합하여 제조한 시약을 각 웰에 넣고 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 오비탈 쉐이커(Orbital shaker)에서 2분간 믹스하여 세포를 파쇄하고 10분간 반응을 안정화한 뒤 발광(luminescence)을 측정하였다.

그 결과, 도 4에서 보는 것과 같이 AMPK 활성제로 알려진 AICAR는 세포 내 ATP 생성을 두배까지 증가시키는 것으로 나타났다. 또한 키토올리고당을 처리하였을 경우도 농도 의존적으로 간세포 내 ATP 발생량이 증가하였으며, 키토올리고당 500ppm 처리 시 1.5배 까지 ATP 생성을 증가시켜, 키토올리고당에 의한 간세포의 에너지대사 활성화를 확인하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 키토올리고당을 이용하여 AMPK 및 지방대사 관련 효소에 영향을 주어 간세포에서의 에너지 대사를 촉진함으로써, 에너지 생성을 항진하므로, 운동 시와 같은 에너지를 필요로 하는 상황, 또는 일상 생활에 있어서 에너지의 생성을 촉진하고, 운동 능력의 향상이나 피로를 경감시켜주어, 지구력 향상제, 피로 예방ㆍ개선제로서 식품 또는 의약품의 소재로 제공될 수 있는 효과가 있다.

Claims (12)

1. 분자량 700 내지 9000의 키토올리고당을 유효성분으로 함유하는 피로 개선용 건강식품 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 ACC 활성 억제용 또는 지방산 산화 촉진용임을 특징으로 하는 건강식품 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 간세포에서의 ATP 생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 키토올리고당은 전체 조성물 중량에 대하여 10 ~ 90중량% 범위로 포함되는 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 AMPK(AMP-activated protein kinase) 활성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물.
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11. 삭제
12. 삭제

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