KR100981597B1

KR100981597B1 - 상피세포성장인자의 안정성을 증진시키는 계면활성형펩타이드 및 그 용도

Info

Publication number: KR100981597B1
Application number: KR1020080062257A
Authority: KR
Inventors: 정대현; 이정훈; 김수정; 서효현; 정애진; 임창일; 배연자; 모지홍
Original assignee: (주)바이오에프디엔씨
Priority date: 2008-06-30
Filing date: 2008-06-30
Publication date: 2010-09-13
Also published as: KR20100002388A

Abstract

본 발명은 상피세포성장인자(EGF)의 안정성을 증진시키는 계면활성형 펩타이드 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 상기 계면활성형 펩타이드 및 상기 펩타이드의 화장품학적 유효량 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물에 관한 것으로, 상기 펩타이드의 자기조립화에 의해 상피세포성장인자의 온도변화에 따른 안정성이 증진시킴으로써, EGF 활성이 요구되는 피부 상태를 개선할 수 있는 화장품 또는 의약품 제조에 유리하게 적용될 수 있다.

상피세포성장인자, 펩타이드, 자기조립성

Description

상피세포성장인자의 안정성을 증진시키는 계면활성형 펩타이드 및 그 용도{Surfactant-like peptide enhancing a stability of epidermal growth factor and Use thereof}

본 발명은 상피세포성장인자의 온도변화에 따른 안정성을 증진시키는 계면활성형 펩타이드 및 그 용도에 관한 것이다.

상피세포성장인자(EGF)는 사람 몸속에 존재하는 천연의 상처치료물질로 피부 등에 상처가 나면 혈액이나 땀, 침을 통해 공급돼 상처가 흉터 없이 자연적으로 아물게 하는 작용을 하는 물질로서, 인간상피세포성장인자(hEGF)는 53개의 아미노산으로 구성되어 있다. 미국의 스탠리 코헨 박사에 의해서 쥐의 턱밑샘으로부터 최초 분리되었고, 이 물질을 바로 태어난 쥐 등에 처리하였을 때 눈꺼풀이 정상적인 쥐보다 빨리 열리는 것을 실험적으로 증명하였으며, '상피세포의 성장을 촉진하는 인자'라는 의미로 Epidermal Growth Factor라 명명하였다(Cohen, S. (1962) J. Biol. Chem. 237, 1555-1562).

EGF는 구조적으로 3개의 이황화(disulfide) 결합을 가지는 폴리펩타이드(Savage, C.t., Jr. et al., (1973) J. Biol. Chem. 248, 7669-7672; Savage, C.R., Jr. et al.,(1972) J. Biol. Chem. 247, 7612-7621)로 상피세포의 성장을 촉진하는 인자로서 세포막에 있는 EGF 수용체를 통하여 신호를 전달함으로써 포유류의 세포, 특히 상피 및 피부세포의 성장 및 분열을 유도하여 상피세포의 성장을 촉진을 하는 것으로 밝혀져 있다(Sporn, M. B. et al., (1985) Nature(London) 313, 745-747; Sporn M.B. et al., (1980) N. Engl. J. Med. 303, 878-880).

또한, EGF는 상처 치료(Buckley, A. et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 7340-7344) 등의 과정에서, 분자수준에서의 조절에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. EGF는 침, 소변, 모유, 눈물, 혈액 등에 고농도로 존재하고 상처가 났을 때 혈액으로부터 공급이 되어 흉터 없이 상처를 아물게 하는 작용을 한다. 이외에도 다양한 작용을 하고 있는데, 여성호르몬 분비를 촉진하는 FSH(Follicle stimulating hormone)과 함께 자궁속의 수정란을 성숙시키고, 혈관이 없어서 변질되기 쉬운 각막의 재생을 돕는다.

아울러, 상피세포 및 내피세포의 세포증식 촉진, 진피의 구성성분인 콜라겐을 합성하는 섬유아세포의 세포증식 촉진. 피부 손상부위의 혈관 신생촉진 및 기타 재생 촉진인자의 분비유도, 피부조직이 질서 있게 방향을 잡으며 망을 형성하게 하는 물질인 피브로넥틴의 합성 촉진 등 피부재생에 핵심적 역할을 담당한다. 인체는 EGF를 손상된 조직에 적절하게 공급하여 정상적으로 회복되도록 자율적으로 조절을 하지만 EGF가 제대로 공급되지 않을 경우 외부에서 공급을 해주어 정상적으로 회복 되도록 해야 한다. 이런 측면에서 EGF는 다양하게 이용될 수 있다. 예를 들어, 당뇨성 족부궤양, 화상, 창상, 각막손상, 복부절개 수술, 미용목적의 박피수술, 노화된 피부의 개선 등에 이용이 가능하며, 또한, hEGF는 상피세포의 분화촉진 능력과는 별도로 위장관내에서 위산의 분비억제 능력도 나타내고 있어, 위궤양 등의 질병치료에도 매우 유용하게 응용될 수 있는 것으로 보고 되어 있다(Gregory, H., (1985) J. Cell Sci. Suppl. 3, 11-17).

그러나 이러한 EGF는 산업적으로 이용 가능할 만큼 충분한 양을 유전공학적 기술로 수득하기 어렵고, 생물학적으로 불안정하며 물리화학적으로도 불균질하여 치료 등에 사용하기에 그 효과가 감소되는 경우가 있다. 따라서 이러한 EGF의 안정성을 증진시킬 수 있는 노력이 절실히 요구된다.

한편, '자기조립'은 나노기술의 원천기술로서, 분자들 간에 서로 밀치거나 당기는 힘을 인위적으로 조작하여 재현 가능한 나노구조를 자발적으로 형성하도록 하는 것이며, 이러한 자기조립기술은 질병진단에 응용되는 바이오칩, 나노튜브를 비롯한 전자재료 및 신소재분야, 고집적 반도체의 제조에 필요한 나노구조체 제조 등에서 서로 기술적으로 융합되어 발전될 가능성이 높은 분야이다.

이러한 자기조립기술의 응용분야 중 자기조립 성질을 가진 계면활성형 펩타이드는 친수성 부분과 소수성부분을 한 분자에 동시에 가지고 있는 여러 분자가 수계에서 모여서 특정의 형태로 조립하여 형성되도록 함을 기본으로 하고 있으며, 다른 표면처리에 비해서 현저히 많은 양의 펩타이드가 단위 구조체에 함유되어 있으므로 초기 세포와의 상호작용을 현격히 증가시킬 수 있다.

이러한 계면활성형 펩타이드와 관련하여, 여러 연구가 진행 중에 있으며, 그 중 펩타이드의 한 종류로 펩타이드가 가진 그 서열내의 아미노산의 분포에 따라 극성변화 등으로 인한 자기조립성질에 의해 나노소낭 혹은 나노튜브를 형성한다는 보고가 있는데 (Proc Natl Acad Sci, S. Vauthey et al., 99:5355-5360, 2002; J. AM. CHEM. SOC. Keyes-Baig et al, 126, 7522-7532, 2004), 이에 의하면 펩타이드를 구성하는 아미노산 서열을 조절하여 고차구조의 자기조립체 형성을 유도할 수 있다.

본 발명의 목적은 상피세포성장인자 (EGF)의 안정성을 증진시키는 계면활성형 펩타이드 및 이를 포함하는 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 다음 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, 상피세포성장인자 (EGF)의 안정성을 증진시키는 계면활성형 펩타이드를 제공한다:

일반식 1

(α)_m(β)_n

여기서, 상기 α는 이소류신 또는 알라닌이고, 상기 β는 글루탐산 또는 아스파르트산이고, 상기 m은 6 내지 10의 정수, n은 2 내지 6의 정수이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 α는 알라닌이고, 상기 β는 글루탐산이며, 상기 m은 6 내지 8이고, n은 2 내지 4일 수 있다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 펩타이드의 화장품학적 유효량 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민 안료 및 향료로 이루어진 군으로부터 선택된 보조제를 더 포함하는 것 일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 피부 상태의 개선 효능 또는 활성을 가지는 것일 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 계면활성형 펩타이드의 자기조립화에 의해 상피세포성장인자의 온도변화에 따른 안정성이 증진됨으로써, EGF 활성이 요구되는 질환 또는 상태를 개선할 수 있는 화장품, 의약품의 제조에 유리하게 적용될 수 있다.

본 발명은 스스로 형성되는 고차구조의 자기조립체를 이용하여 상피세포성장인자의 안정성을 증진시키는 계면활성형 펩타이드에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 계면활성형 펩타이드는 일 실시예에 따르면, 다음 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며 상피세포성장인자(EGF) 안정성을 증진시키는 계면활성형 펩타이드를 제공한다:

일반식 1

(α)_m(β)_n

여기서, 상기 α 및 β는 각각 아미노산으로, 바람직하게, α는 이소류신 또 는 알라닌이고, 상기 β는 글루탐산 또는 아스파르트산이고, 상기 m은 6 내지 10의 정수, n은 2 내지 6의 정수이다.

또한, 상기 m이 6 내지 10의 범위를 초과하는 경우, 펩타이드 합성 및 정제면에서 바람직하지 않고, 미만인 경우 고차구조의 자기조립체 생성 면에서 바람직하지 않다. 상기 n이 2 내지 6의 범위를 초과하는 경우, 펩타이드 합성 및 정제면에서 바람직하지 않고, 미만인 경우 적정크기의 자기조립체 형성면에서 바람직하지 않다.

참고로, 대표적인 아미노산과 각각의 약어는, 알라닌(Ala, A), 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 발린(Val, V), 아스파라긴(Asn, N), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글리신(Gly, G), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 티로신(Try, Y), 아스파르트산 (Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H), 리신(Lys, K)과 같다.

본 발명에서, 계면활성형 펩타이드의 일 구현예로써, A6E2는 AAAAAAEE의 아미노산 서열을 가지고 있으며, 소수성 부분인 알라닌(A)으로 구성되는 부분과 친수성 부분인 글루탐산(E)으로 구성되어 있다.

본 발명에서, "펩타이드"란 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.

본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis technique)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

여기에서, 계면활성형 펩타이드란 분자 내에 소수성과 친수성이 동시에 존재하는 계면활성제와 같은 양친매성 성질을 나타내는 펩타이드를 일컫는다 (Vauthey, S. et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 5355-5360). 본 발명에서는 양친매성으로 인한 극성용매인 물분자들 사이에서 계면활성형 펩타이드 (예컨대, A6E2) 자체가 스스로 다른 동일한 분자들과 소수성 부분의 반데르발스 인력과 친수성 부분의 전기적 척력으로 인해 상기 계면활성형 펩타이드 분자들과의 상호작용으로 직경은 약 수십나노미터, 길이는 수백나노미터에서 수마이크로미터 크기의 고차구조 자기조립체를 형성할 수 있다.

여기에서, "안정성"이란, 온도변화에 따른 상피세포성장인자의 변형에 관련한 안정성을 의미하는 것으로, 인 비보 (In vivo) 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다.

본 명세서에서 "화장품학적 유효량"은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어,용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운 데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 피부 상태의 개선 효능 또는 활성을 가지는 것일 수 있다. 계면활성형 펩타이드, 예컨대, A6E2에 의해 증대된 EGF의 안정성으로 인하여 이러한 A6E2와 함께 처리된 EGF를 포함하는 화장품 조성물을 사용할 경우 그렇지 않은 경우보다 지속적인 EGF의 활성 효과를 기대할 수 있다.

보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 피부 상태의 개선의 효능 또는 활성을 갖는다. 특히, 본 발명의 조성물에 의한 피부 상태의 개선은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 검버섯 제거, 여드름 치료, 상처제거 및 피부재생 효과이며, 가장 바람직하게는, 주름개선, 피부탄력 개선, 피 부노화 방지, 상처제거 및 피부재생 효과이다.

예를 들어, 본 발명에서 유효성분으로 이용되는 펩타이드는 각질세포의 증식을 촉진하고, 이들 세포로부터 프로 콜라겐 및 피브로넥틴의 합성 증가를 유도하며, EGF의 안정성을 증가시킴으로써 피부의 각질세포층, 상피층 및 진피층을 재생 또는 성장시켜, 결국 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부 보습 개선, 상처제거 및 피부재생 효과 등의 효능을 발휘한다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 상세히 설명하겠으나, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명에 따른 상피세포성장인자 안정화 활성을 가지는 펩타이드(A6E2)의 제조

본 발명에 따른 계면활성형 펩타이드의 일 예인 (Ala)₆(Glu)₂ 즉, A6E2 (AAAAAAEE, 서열번호 1)를 고체상(Solid-phase) 방법으로 아래와 같이 합성하였다.

구체적으로, 0.06 mmol의 글루탐산-Wang 레진을 표준 반응용기 (Standard reaction vessel)에 넣고, 레진의 Fmoc을 염기(20% 피페리딘)로 제거하고, 합성하려는 펩타이드의 카르복시 말단의 Fmoc-아미노산을 넣고 1-히드록시-벤조트리아졸(HOBT), 디아이소프로필 카보다이이미드(DIC)을 혼합하여 활성시킨후 합성을 시작하였다. 이후 같은 방법으로 아미노산 배열 순서대로 합성을 하고, 커플링이 끝 난 후 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄으로 여러 번 세척한 다음 건조시켰다. 여기에 트리플루오로아세트산 : 페놀 : 티오아니솔 : 물 : 에탄디티올 (Trifluoroacetic acid : Phenol :Thioanisole : H2O : Ethandithiol)의 82.5 : 5: 5 : 5: 2.5 (v/v)용액으로 2 내지 3시간 반응시켜 펩타이드의 보호기를 제거하고, 레진으로부터 펩타이드를 분리한 후 용액에 차가운 에틸에테르를 첨가하여 흰색 침전된 펩타이드를 얻었다.

이렇게 하여 얻어진 펩타이드를 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 정제하였고, 이때 칼럼은 C4 semi-prep column(Phenomenex)을 사용하였으며, 완충용액 A는 물 및 0.1 % TFA를 사용하여 평형화시키고, 완충용액 B는 아세토나이트릴 및 0.1 % TFA를 사용하여 펩타이드를 용출하였다.

상기와 같이 합성된 A6E2는 다음의 구조식을 가지며, 3차원 구조는 도 1과 같았다.

아울러, 상기 합성된 펩타이드의 HPLC 결과는 도 2와 같이 나타났는데, 도 2에 나타난 수치는 각 시간대별로 A6E2 펩타이드의 용출시간(retention time)을 의미하며, 용출시간 20.354분에서부터 34.707분까지 A6E2 펩타이드를 포함하고 있는 피크(peak)를 의미한다.

실험예 1: 본 발명에 따른 펩타이드의 자기조립된 형태의 입자 크기 및 분산 정도 관측

실시예 1에 따라 제조된 펩타이드 A6E2를 준비하고, 동결건조 형태의 A6E2 펩타이드를 식염수를 이용하여 각각 0.3mg/mL로 E-tube에 녹여 샘플 용액을 만들었다. 분자 사이즈 장치(Molecular Sizing Instrument)인 PROTEIN SOLUTIONS라는 DLS (Dynamic Light Scattering) 장비의 전원 스위치를 켜고, 연결된 컴퓨터를 부팅시켰다. DLS 장비의 인젝터(injector)를 이용하여 준비된 A6E2 펩타이드 용액을 20 ㎕를 취한 다음, D.W.로 세척한 큐벳으로 옮긴 다음, 그 큐벳을 검출되는 DLS 장비의 정위치에 넣고, 컴퓨터 상의 Dynamics V5 프로그램을 켠 다음, 수치를 읽었고, 그 결과는 도 3과 같이 나타났다.

실험예 2: 본 발명에 따른 펩타이드의 자기조립된 형태의 모양 관측

본 발명에 따라 계면활성형 펩타이드의 실제의 모양 형태를 관측하기 위하여 투과전자현미경(TEM)을 이용한 실험을 수행하였다. 전자현미경 사진을 찍기 위해 사용된 Grid 명은 200메쉬용 Cu-Grid 탄소 기질을 이용했다.

실시예 1에서 제조된 A6E2 펩타이드를 준비하고, 동결건조 형태의 A6E2 펩타이드를 증류수를 이용하여 각각 0.3mg/mL로 E-tube에 녹여 샘플 용액을 만들고, 클린 벤치 내에서 가로, 세로 각각 4cm, 2cm 크기의 파라필름을 깔았다. 준비된 A6E2 펩타이드 용액을 10 ㎕ 및 2% 우라닐 아세테이트 용액 10 ㎕을 파라필름에 각각 일정 간격으로 떨어뜨리고, 탄소 코팅된 Cu-Grid를 파라필름 상의 A6E2 펩타이드 용액 위에 조심스럽게 올려놓고 30초간 반응시켰다. 이 때, 탄소 코팅된 면을 용액에 닿게 한다. 거름종이로 Cu-Grid 상의 여분 수분을 조심스럽게 제거하고, A6E2 펩타이드 용액을 30초간 반응시킨 Cu-Grid를 파라필름상의 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate) 10 ㎕ 용액으로 옮겨, 30초 동안 반응시켰다. 이 때, 마찬가지로 탄소 코팅된 면을 닿게 한 다음, 거름종이로 Cu-Grid 상의 여분 수분을 제거하고, 37 ℃ 인큐베이터에서 10분 동안 건조시켰다. 이렇게 준비된 Cu-Grid 샘플을 TEM 장비에 넣고 작동시켜서 전자현미경 사진을 찍었고, 그 결과는 도 4와 같았다.

실험예 3: 본 발명에 따른 펩타이드를 이용한 인간 섬유아세포 배양 및 세포 증식 시험

(1) 인간 섬유아세포인 Human Epidermal Fibroblast 세포주(HCC-CCD-986SK, ATTC, USA)는 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양되었다. 배양 용기의 85 ~ 90%의 면적만큼의 배양도를 보이면, 트립신처리로 세포를 탈착시켜 계수 후, 5 × 10³ cells/cm²으로 계대 배양하였다. 세포의 배양에는 10% 우태혈청 (FBS, GIBCO, Cat. No., 26140-079, USA)과 100 ㎍/ml 암피실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 Delbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, Cat. No. 11995-065, USA)을 사용하였다. 계대 배양을 위하여 75 T-flask (NUNC, Cat. No. 156499, Danmark)가 사 용되었으며, 세포 성장 및 증식에 미치는 시험을 위해서는 24 웰 플레이트 (NUNC, Cat. No., 142475, Danmark)가 사용되었다.

(2) 실시예 1에서 제조된 A6E2 펩타이드에 의한 상피세포성장인자(EGF)의 열에 대한 안정화 효과를 확인하기 위하여, 상기 배양된 인간 섬유아세포에 대한 세포 성장 및 증식을 MTT 분석법을 이용하여 시험하였다. MTT 분석법은 살아있는 세포에서만 활성을 보이는 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용을 이용하여 최종적으로 포르마잔(formazan)이라는 색소 산물을 형성시켜 그것을 측정함으로 시험물질의 세포 독성 정도를 측정하는 방법이다.

인간 섬유아세포를 24 웰 플레이트에 5 × 10³ cells/well씩 동일하게 헤마사이토미터를 이용하여 계수한 후 분주하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 25 ~ 30%만큼 배양되면, PBS(Phosphate Buffered Saline pH 7.4), 1μM A6E2, 1nM EGF, 1μM A6E2와 1nM EGF의 혼합이 함유된 FBS-free DMEM으로 교체한 후, 각각을 37 ℃에서 24시간 더 배양하고, 45 ℃에서 1시간 반응시킨 후 다시 37℃에서 24시간 더 배양, 60 ℃에서 1시간 반응시킨 후 다시 37℃에서 24시간 더 배양하였다.

배양 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브롬화물 (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/ml)을 50㎕ 첨가하고 3시간 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200㎕의 디메틸 설폭시드 (DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 웰 당 200㎕ 처리하여 교반한 후, 100㎕ 씩을 96 웰로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 성장 및 증식 정도는 PBS를 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였고, 그 결과는 아래 표 1 및 도 5에 나타난 바와 같다.

[ 표 1]

도 5에 나타난 것처럼, PBS만을 처리한 군과, A6E2만을 처리한 군은 대조군이고, EGF만을 단독 처리한 군에 비해 EGF와 A6E2를 함께 처리한 군의 경우, 온도가 증가되어도 증식 효율이 훨씬 높아 EGF의 안정화에 큰 기여를 하는 것으로 나타났다. EGF가 60℃에서 한 시간 정도만 지나더라도 세포 증식능이 거의 없음을 알 수 있으며, A6E2와 함께 처리될 경우 섬유아세포의 증식능을 10% 이상 향상시킬 수 있는 활성을 보임을 알 수 있다.

도 6은 37℃, 45℃, 60℃로 온도가 변화함에 따라 본 발명에 따른 상피세포성장인자(EGF)를 단독으로 처리했을 때와 계면활성형 A6E2 펩타이드와 상피세포성장인자(EGF)와 함께 처리했을 때의 배양된 섬유아세포의 이미지를 나타낸 것이다. 상피세포성장인자를 단독으로 60℃에서 한 시간 반응 후 처리된 경우보다 A6E2 펩타이드와 함께 60℃에서 한 시간 반응 후 처리된 경우가 섬유아세포의 세포수가 현저히 증가되었음을 볼 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 A6E2 펩타이드의 3차원 입체구조를 나타낸 이미지이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 A6E2 펩타이드의 분획물을 HPLC 상에서 보이는 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 고차구조의 펩타이드의 크기를 DLS(Dynamic Light Scattering) 장비를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 고차구조의 펩타이드를 투과전자현미경을 이용하여 얻은 이미지이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 고차구조의 펩타이드를 온도변화에 따라 상피세포성장인자(EGF)와 함께 처리했을 때, EGF의 안정성 증대를 통한 세포증식 효과를 알아보는 MTT 어세이 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 고차구조의 펩타이드를 온도변화에 따라 상피세포성장인자와 함께 처리한 경우와 상피세포성장인자 단독처리한 경우, 배양된 섬유아세포의 이미지를 각각 나타내는 것이다.

<110> Biofdnc <120> Surfactant-like peptide enhancing a stability of epidermal growth factor and Use thereof <130> ID080627001 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A6E2 <400> 1 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Glu 1 5

Claims

다음 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, 상피세포 성장인자 (EGF)의 안정성을 증진시키는 계면활성형 펩타이드:

일반식 1

(α)_m(β)_n

여기서, 상기 α는 이소류신 또는 알라닌이고, 상기 β는 글루탐산 또는 아스파르트산이고, 상기 m은 6 내지 10의 정수, n은 2 내지 6의 정수이다.
제1항에 있어서, 상기 α는 알라닌이고, 상기 β는 글루탐산인 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 m은 6 내지 8이고, 상기 n은 2 내지 6인 것인 펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 펩타이드의 화장품학적 유효량 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민 안료 및 향료로 이루어진 군으로부터 선택된 보조제를 더 포함하는 것인 화장품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 피부 상태의 개선 효능 또는 활성을 가지는 것인 화장품 조성물.