KR100980098B1 - 음이온 채널을 통한 신경전달물질의 방출 조절 - Google Patents
음이온 채널을 통한 신경전달물질의 방출 조절 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 뉴런 및/또는 성상세포에서의 신경전달물질 방출 조절에 있어서의 음이온 채널, 보다 구체적으로 칼슘 이온에 의하여 활성화되는 음이온 채널 (Ca2 +-activated anion cannel, CAAC)의 신규한 용도와 관련된 것으로, CAAC 활성 조절제, CAAC를 포함하는 신경조절물질 방출 조절제, 및 CAAC를 타겟으로 하는 신경조절물질 방출 조절제의 스크리닝 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 뉴런 및/또는 성상세포에서의 신경전달물질 방출 조절에 있어서의 음이온 채널, 보다 구체적으로 칼슘이온에 의하여 활성화되는 음이온 채널 (Ca2 +-activated anion channel, CAAC)의 신규한 용도와 관련된 것으로, CAAC 활성 조절제, CAAC를 포함하는 신경조절물질 방출 조절제, 및 CAAC를 타겟으로 하는 신경조절물질 방출 조절제의 스크리닝 방법을 제공한다.
신경세포 간 신호를 전달하는 신경전달물질은 크게 아미노산류 (예컨대, 아세틸콜린, 글리신, 아스파라긴산, 글루타메이트 등), 아민류 (예컨대, 도파민, 아드레날린(에피네프린), 노르아드레날린, GABA(gamma-aminobutyric acid) 등), 펩타이드류 (예컨대, 바소프레신 등), 및 지방산류 (예컨대, 히스타민, 세로토닌 등) 등 4가지로 분류된다. 이러한 화학 물질이 신경의 시냅스(synapse)에서 분비되어 뉴런 간의 정보 전달에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 신경전달물질은 뉴런에서의 신호전달에 매우 중요한 역할을 하므로, 신경전달물질의 방출을 제어함으로써 신경 전달을 효과적으로 조절할 수 있다.
한편, 성상세포(astrocyte)는 뉴런에 구조적 골격 및 영양분을 제공하는 역할을 할 뿐 아니라 방출된 신경전달물질을 제거하는 작용도 한다. 최근, 성상세포가 감각 자극 (sensory stimulation) 또는 뇌허혈 (brain ischemia) 또는 염증과 같은 병리학적 증상에 의하여 활성화될 수 있음을 보고되어 있다. 이러한 자극들은 성상세포 내 칼슘이온 농도 증가를 유발하고, 이러한 세포내 칼슘이온 증가는 신경아교전달물질 (gliotransmitter)라고 불리는 활성물질의 방출을 유발한다. 이와 같이 방출된 신경아교 전달물질은 뉴런 시냅스 가소성 (neuronal synaptic plasticity) 및 시냅스 스케일링 (synaptic scaling)의 조절 또는 흥분독성 (excitotoxicity)에 관련된 것으로 알려져 있다.
최근 연구 결과는 성상세포가 뉴런 NMDA 수용체를 활성화시키는 글루타메이트와 같은 흥분성 아미노산 (excitatory amino acids, EAA) 등의 신경아교전달물질을 방출할 수 있다는 것에 근거하여 성상세포의 뉴런 시냅스 활성에 있어서의 새로운 역할을 제안하고 있다. 계속되는 연구의 결과로 성상세포로부터의 신경아교전달물질 방출을 위한 소포성 및 비소포성 기작이 제안되어 있지만, 정확한 분자적 관련성은 아직 알려지지 않고 있다.
뉴런과 유사하게, 성상세포도 소포 의존적 엑소사이토시스 (vesicle-dependent exocytosis)를 통하여 신경아교전달물질을 방출할 것이라고 여겨져 왔다. 그러나 최근, 소포성 엑소사이토시스로 설명되지 않은 성상세포의 신경아교전달물질 방출 현상이 관찰됨에 따라서, 성상세포에서의 신경아교전달물질 방출에 소 포성 엑소사이토시스를 통하지 않은 다른 경로가 있음이 간접적으로 보여지고 있다.
따라서, 신경아교전달물질을 포함하여 신경전달물질 방출 조절에 의한 뉴런 시냅스 가소성 (neuronal synaptic plasticity), 시냅스 스케일링 (synaptic scaling), 및 흥분독성 (excitotoxicity)과 관련된 병적 증상의 치료를 위하여, 뉴런 및/또는 성상세포로부터의 신경전달물질 방출 경로의 명확한 규명이 요구되고 있다.
상기와 같은 요구에 부응하기 위하여, 본 발명은 뉴런 및/또는 성상세포에서의 신경조절물질 방출 조절에 있어서 칼슘 이온에 의하여 활성화되는 음이온 채널 (Ca2 +-activated anion channel, CAAC)이 주요한 역할을 함을 발견하여, CAAC를 조절을 통하여 신경전달물질의 방출을 조절함으로써, 신경전달물질의 과다 또는 부족에 의하여 발생하는 다양한 병적 증상을 예방, 치료 또는 개선하는 기술을 제공하고자 한다.
본 발명은 뉴런 및/또는 성상세포로부터의 신경전달물질 방출 조절에 있어서의 CAAC의 신규한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 CAAC의 조절제를 포함하는 신경전달물질 방출 조절제 또는 신경 보호제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 CAAC를 타겟으로 하는 신경 보호제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 음이온 채널, 바람직하게는 CAAC의 뉴런 및/또는 성상세포로부터의 신경전달물질 방출 조절에 있어서의 신규한 용도를 제공한다. 본 발명의 구체예에서, CAAC가 뉴런 및/또는 성상세포에서 기능적으로 발현하고, 상기 CAAC가 흥분성 신경전달물질의 하나인 글루타메이트의 방출 통로로서 작용함을 밝힘으로써, CAAC의 신경전달물질 방출 통로로서의 역할을 확인하였다.
상기 신경전달물질은 뉴런에서 방출되는 것과 성상세포에서 방출되는 것을 모두 포함하여 신경의 전기적 신호를 전달하는데 관여하는 모든 물질을 의미하며, 바람직하게는 흥분성 신경전달물질을 의미하고, 예컨대, 아세틸콜린, 아스파라긴산, D-세린, 글루타메이트, 엔케팔린 (Enkephalin), 및 히스타민으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 상기 물질들은 대부분 음전하를 띠는 분자량 1,000 Da 이하의 소분자 (거대 음이온)이다. 본 발명의 구체예에서는 이들 소분자를 대표하여 글루타메이트의 음이온 채널을 통한 방출을 확인하였으며, 채널 매개 방출의 특성상, 글루타메이트의 방출은 상기에 열거한 바와 같은 음전하를 띠는 유사한 크기의 분자들에도 유사하게 적용될 것으로 예측 가능하다.
상기 CAAC는 칼슘 이온에 의하여 활성화가 조절되는 뉴런 및/또는 성상세포에 존재하는 모든 음이온 채널을 포함한다. 보다 구체적으로, 상기 CAAC는 칼슘 이온의 존재하에서 플루오르 이온, 브롬 이온, 클로라이드 이온, 요오드 이온 등의 다양한 음이온뿐 아니라 음전하성 아미노산, 이세치오네이트 등의 거대 음이온에 대하여 투과성을 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 구체예에서는 성상세포상에 발현하는 베스트로핀 1 (Best1) 유전자에 의하여 코딩되는 CAAC를 통하여 대표적인 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트가 방출됨을 확인하였다. 상기 베스트로핀 1은 클로라이드 이온 채널의 일종으로, CAAC가 신경전달물질에 대하여 투과성을 갖는다는 것을 보여주는 대표적인 예로서 사용되었다. 상기 베스트로핀 1 유전자는 포유류 유래, 바람직하게는 설치류 유래 또는 영장류 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, 마우스 베스트로핀 1 (mBest1) 유전자 (NM_011913, 서열번호 1) 또는 인간 베스트로핀 1 (hBest1) 유전자 (NM_004183, 서열번호 2)일 수 있다.
상기한 바와 같이 CAAC를 통하여 신경전달물질이 방출됨이 확인됨에 따라서, 뉴런 및/또는 성상세포에 존재하는 CAAC의 활성을 조절함으로써 이를 통한 흥분성 신경전달물질의 방출을 효과적으로 제어할 수 있다. 따라서, 본 발명은 뉴런 및/또는 성상세포 상의 CAAC 조절을 통한 흥분성 신경전달물질 방출 조절 방법, 및 CAAC 조절제를 유효성분으로 함유하는 뉴런 및/또는 성상세포에서의 흥분성 신경전달물질 방출 조절제를 제공한다.
예컨대, CAAC를 불활성화시킴으로써, 이를 통하여 방출되는 흥분성 신경전달물질의 과다 방출을 억제할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에 있어서, 알려진 모든 칼슘 이온 제거제, 칼슘 이온 농도 감소제 등을 이용하여 칼슘 이온을 제거하거나 농도를 낮춤으로써 CAAC를 불활성화시킬 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 알려진 모든 음이온 채널 차단제를 사용하여 CAAC를 불활성화시킬 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, CAAC 코딩 뉴클레오타이드 서열에 대한 shRNA (short hairpin RNA)를 사용하여 뉴런 및/또는 성상세포에서의 CAAC 발현을 억제하여 CAAC를 불활성화시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 공지된 방법으로 뉴런 및/또는 성상세포 상의 CAAC를 불활성화시킴으로써, 흥분성 신경전달물질의 방출 억제 방법, 및 공지된 칼슘 이온 제거제, 칼슘 이온 농도 감소제, 음이온 채널 차단제, 및 CAAC 코딩 뉴클레오타이드 서열에 대한 안티센스 RNA 또는 shRNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 물 질을 유효성분으로 함유하는 뉴런 및/또는 성상세포에서의 흥분성 신경전달물질 방출 억제제를 제공한다. 상기 신경전달물질 방출 억제제는 보다 효과적인 음이온 채널 활성 조절을 위하여, 유효성분으로서, 음이온 채널 차단제 및 CAAC 코딩 뉴클레오타이드 서열에 대한 안티센스 RNA 또는 shRNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하거나, 여기에 공지된 칼슘 이온 제거제 및 칼슘 이온 농도 감소제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 함유하는 것일 수 있다.
상기 칼슘이온 제거제, 칼슘이온 농도 감소제 및 음이온 채널 차단제는 공지된 모든 물질을 포함할 수 있으며, 예컨대, 상기 칼슘이온 제거제 및 칼슘이온 농도 감소제는 BAPTA-AM 등의 칼슘이온 킬레이터, 쌥시가르긴, 포스포리파아제 C 억제제 등을 포함할 수 있고, 상기 음이온 채널 차단제는 니플루믹산, 플루메나믹산, 5-니트로-2(3-페닐프로필아미노)-벤조산 [5-nitro-2(3-phenylpropylamino)-benzoic acid, NPPB], 4,4'-디이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디설폰산 (4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid, DIDS) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 CAAC 코딩 뉴클레오타이드는 베스트로핀 1 (Best1) 코딩 유전자일 수 있다. 상기 베스트로핀 1 유전자는 포유류 유래, 바람직하게는 설치류 및 영장류로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 예컨대, 마우스 베스트로핀 1 (mBest1) 유전자 (NM_011913, 서열번호 1) 또는 인간 베스트로핀 1 (hBest1) 유전자 (NM_004183, 서열번호 2)일 수 있다. 따라서, 상기 CAAC 코딩 뉴클레오타이드에 대한 안티센스 RNA는 서열번호 1 또는 서열번호 2에 기재된 DNA 서열에 대한 것 일 수 있다. 또한, 상기 CAAC 코딩 뉴클레오타이드에 대한 shRNA는 cDNA 서열로 나타낼 때 다음의 서열번호 3, 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다:
5'-GATCCCCTTGCCAACTTGTCAATGAATTCAAGAGATTCATTGACAAGTTGGCAATTTTTA-3' (서열번호 3),
3'-GGGAACGGTTGAACAGTTACTTAAGTTCTCTAAGTAACTGTTCAACCGTTAAAAATTCGA-5' (서열번호 4),
CAAC를 통한 신경전달물질의 과다 방출을 저지함으로써, 신경전달물질 과다로 인하여 유발되는 여러 가지 병적 증상을 예방, 치료 및/또는 개선할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기한 바와 같은 공지된 칼슘 이온 제거제, 칼슘 이온 농도 감소제, 음이온 채널 차단제, 및 CAAC 코딩 뉴클레오타이드 서열에 대한 안티센스 RNA 또는 shRNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 유효성분으로 함유하는, 신경전달물질 과다 방출로부터 신경을 보호하는 신경 보호제 또는 신경전달물질 과다방출에 의하여 유발되는 병적 증상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 뉴런 및/또는 성상세포 상의 CAAC를 불활성화시킴으로써 흥분성 신경전달물질 과다 방출로부터 신경을 보호하는 방법 또는 흥분성 신경전달물질 과다방출에 의하여 유발되는 병적 증상의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 신경보호제 또는 흥분성 신경전달물질 과다 방출에 의하여 유발되는 병적 증상의 예방 또는 치료용 조성물은 보다 효과적인 음이온 채널 활성 조절을 위 한 신경전달물질 방출 제어를 위하여, 유효성분으로서, 음이온 채널 차단제, 및 CAAC 코딩 뉴클레오타이드 서열에 대한 안티센스 RNA 또는 shRNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하거나, 여기에 공지된 칼슘 이온 제거제 및 칼슘 이온 농도 감소제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 함유하는 것일 수 있다. 칼슘 이온 제거제, 칼슘 이온 농도 감소제, 음이온 채널 차단제, 및 CAAC 코딩 뉴클레오타이드 서열에 대한 shRNA로서 사용 가능한 물질은 상기한 바와 같다. 상기 흥분성 신경전달물질 과다 방출에 의하여 유발되는 병적 증상은 기억과 관련된 질병 (알츠하이머, 노화성 기억 감퇴, 등), 발작(epileptic seizures), 신경전달물질 유발 흥분 독성 (excitotoxicity), 허혈 (ischemia), 뇌졸중, 뇌출혈, 간질, 뇌 외상, 저산소증 (hypoxia) 등일 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, CAAC 활성화를 통하여 신경전달물질 방출을 촉진하고, 신경 전달을 촉진할 수 있다. 따라서, 본 발명은 뉴런 및/또는 성상세포 상의 CAAC를 활성화시킴으로써, 신경전달을 촉진시키는 방법, 및 CAAC 활성화제를 유효성분으로 함유하는 신경전달물질 방출 촉진제를 제공한다. CAAC 활성화제는 CAAC를 직접 또는 간적적으로 활성 작용을 갖는 모든 물질을 포함하며, 예컨대, 펩타이드 TFLLR, 브래디키닌 (Bradykinin) 등과 같은 G-단백질 결합 수용체 (G-protein coupled receptor; GPCR) 아고니스트 등일 수 있다. 이와 같은 신경전달물질 방출 촉진은 시냅스 가소성(Synaptic plasticity)에 영향을 미치고, 방출 촉진된 신경전달물질에 의하여 매개되는 인지, 지각, 운동, 기억, 및/또는 학습 능력을 증진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 CAAC 활성화제를 유효성분으로 함유하는 인지, 지각, 운동, 기억, 및/또는 학습 능력 개선제를 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 베스트로핀 1 유전자의 신경전달물질 방출 통로로서의 CAAC를 코딩하는 새로운 용도를 밝혔다. 따라서, 본 발명은 베스트로핀 1 유전자를 포함하는 발현벡터 및 이를 사용하여 포유류의 뉴런 및/또는 성상세포에서 흥분성 신경전달물질 방출 통로로서 작용하는 CAAC를 발현시켜, 뉴런 및/또는 성상세포 상에 흥분성 신경전달물질 방출 통로를 제작하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 뉴런 및/또는 성상세포 상의 CAAC를 타겟으로 하여 신규한 신경 조절제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은
뉴런 및/또는 성상세포 샘플을 준비하는 단계,
신경 조절제 후보 물질을 상기 샘플과 접촉시키는 단계,
상기 뉴런 및/또는 성상세포 상의 CAAC 활성화 여부를 측정하는 단계, 및
CAAC가 활성화된 경우 상기 신경 조절제 후보 물질을 신경 전달 촉진제로서 결정하고, CAAC가 불활성화된 경우 상기 신경 조절제 후보물질을 신경 보호제로서 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 CAAC의 활성화 여부는 뉴런 및/또는 성상세포 상의 CAAC를 제외한 다른 채널 및 수용체를 불활성화 시킨 후 세포 내향 전류 변화를 측정하여 결정할 수 있다. 예컨대, 후보 물질 처리 후 세포 내향 전류값이 증가하면 CAAC가 활성화되었음을 의미하는 것이고, 세포 내향 전류값이 감소하면 CAAC가 불활성화되었음을 의미하는 것이다. 상기 다른 채널 및 수용체의 불활성화 및 내향 전류값 측정은 이 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 기술로서, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 용이하게 실시할 수 있다. 예컨대, 세포 내향 전류값 측정은 스니퍼 패치 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (Lee, C. J. et al. Astrocytic control of synaptic NMDA receptors. J Physiol 581, 1057-81 (2007) 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨).
본 발명에 따른 스크리닝 방법에 있어서, 상기 CAAC는 베스트로핀 1 유전자에 의하여 코딩되는 것일 수 있으며, 상기 베스트로핀 1 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 뉴런 및/또는 성상세포는 포유류 유래의 것, 바람직하게는 설치류 또는 영장류 유래의 것일 수 있다.
본 발명에 따른 신경전달물질 방출 조절 기술은, 신경전달물질 과방출과 관련된 질병의 예방 또는 치료, 또는 시냅스 가소성과 관련된 인지, 지각 또는 학습 능력의 개선 등에 유용하게 적용될 수 있다.
다음의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예
1:
HEK293T
세포와 마우스 대뇌피질 성상세포의 배양
1.1.
mBest1
클로닝
전장 마우스 bestrophin 1 (mBest1) cDNA를 클로닝하기 위하여, 전체 RNA를 성체 수컷 마우스(C57BL/6)로부터 얻은 정소 또는 배양된 성상세포로부터 분리하고, Super Script III reverse transcriptase (Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하고, NCBI 데이터 베이스 cDNA [GenBank accession numbers NM_011913 XM_129203, 서열번호 1]에 기초한 오픈 리딩 프레임 서열에 부합하는 개시 및 종결 프라이머 (21 bp)를 사용하는 PCR에 의하여 증폭시켰다. 얻어진 PCR 산물을 pGEM-T 이지 벡터 (Promega) 내로 클로닝하고 서열을 분석하였다.
상기 얻어진 cDNA로부터 mBest1, 2, 및 4의 발현을 확인하기 위하여 사용된 RT-PCR 프라이머는 다음과 같다:
mBest1-F: 5'-aggacgatgatgattttgag-3' (서열번호 5),
mBest1-R: 5'-ctttctggtttttctggttg-3' (서열번호 6);
mBest2-F: 5'-TCGTCTACACCCAGGTAGTC-3' (서열번호 7),
mBest2-R: 5'-GAAAGTTGGTCTCAAAGTCG-3' (서열번호 8);
mBest4-F: 5'-AAAGGCTACGTAGGACATGA-3' (서열번호 9),
mBest4-R: 5'-GAAAGGACGGTATGCAGTAG-3' (서열번호 10).
마우스 뇌 또는 성상세포에 다른 CAAC 후보가 존재하는지 여부를 시험하기 위하여, 다음의 프라이머 세트를 사용하였다:
mCLCA1, 2, 4-F: 5'-TTCAAGATCCAAAAGGAAAA-3' (서열번호 11),
mCLCA1, 2, 4-R: 5'-GCTCAGTCTGGTTTTGTTTC-3' (서열번호 12),
mCLCA5-F: 5'-TAAGATTCCAGGGACAGCTA-3' (서열번호 13),
mCLCA5-R: 5'-AAAGGAGGAAAAATACCTGG-3' (서열번호 14),
mTtyh1-F: 5'-AGACACCTATGTGCTGAACC-3' (서열번호 15),
mTtyh1-R: 5'-AGAAAAGAGCATCAGGAACA-3' (서열번호 16),
mTtyh2-F: 5'-CCAGCTTCTGCTAAACAACT-3' (서열번호 17),
mTtyh2-R: 5'-AATCTCTGTCCCTGTTGATG-3' (서열번호 18),
mTtyh3-F: 5'-CAGTACTGAGTGGGGACATT-3' (서열번호 19),
mTtyh3-R: 5'-CTGTGACAAAGGAGAAGAGG-3' (서열번호 20).
단일 세포 PCR을 위하여, 단일 성상세포 및 뉴런을 성체 마우스의 대뇌피질로부터 기계적으로 즉석 분리하고, 상기 분리된 단일 세포의 cDNA를 Sensicript RT 키트 (Qiagen)를 사용하여 증폭시켰다. 단일 세포에 대하여, 다음의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 이와 같은 PCR을 통하여 뉴런 특이적 에놀라이제 (NSE, 300bp) 및 신경교원섬유 산성단백질 (glial fibrillary acidic protein, GFAP; 360bp)의 존재를 확인하고, 수집된 세포 유형을 동정하였다.
mBest1 forward outer primer: 5'-aggacgatgatgattttgag (서열번호 21),
mBest1 forward inner primer: 5'-accttcaacatcagcctaaa (서열번호 22),
mBest1 reverse common primer: 5'-ctttctggtttttctggttg (서열번호 23),
NSE forward common primer: 5'-gctgcctctgagttttaccg (서열번호 24),
NSE reverse outer primer: 5'-gaaggggatcacagcacact (서열번호 25),
NSE reverse inner primer: 5'-ctgattg accttgagcagca (서열번호 26),
GFAP forward outer primer: 5'-gaggcagaagctccaagatg (서열번호 27),
GFAP forward inner primer: 5'-agaacaacctggctgcgtat (서열번호 28),
GFAP reverse common primer: 5'-cggcgatagtcgttagcttc (서열번호 29).
첫 번째 PCR 증폭은 다음과 같이 수행하였다. 시료를 94℃로 5분 동안 가열하였다. 각 사이클은 94℃에서 30초간 변성, 50℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 30초간 신장으로 구성하였다. 프로그래머블 써모사이클러 (Eppendorf)를 사용하여 42 사이클을 수행하였다. 두 번째 PCR 조건은 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 30초간 신장으로 하고, 42 사이클을 수행하였다. 모든 PCR 사이클을 완료한 후, 시료를 72℃로 10분간 가열하고, 이어서 4℃로 냉각하여 분석시까지 보관하였다.
1.2.
mBest1
플라스미드 구축 및 발현
포유류 세포에서 mBest1를 발현시키기 위하여, 상기 실시예 1.1에서 얻은 pGEM-T 이지 플라스미드 (6.65 kb, Promega)로부터 얻은 mBest1 전장 단편을 HindIII 부위 및 NotI 부위를 사용하여 pcDNA 3.1 (Invitrogen) 내로 서브클로닝하였다. 상기 플라스미드 구축물을 이펙틴 트랜스펙션 시약 (Effectene transfection reagent, Qiagen)를 사용하여 HEK293T 세포 (ATCC) 내로 형질감염시켰다. 전세포 패치 클램프 레코딩을 수행하기 위하여, 마우스 뇌 또는 배양된 성상세포에서 추출한 cDNA에서 PCR을 사용해 mBest1을 클로닝한 후 pcDNA3.1 플라스미드 (Invitrogen)에 서브클로닝하여 얻어진 플라스미드 1.5 내지 2 ug과 pEGFP-N1 (Clontech)을 사용하여 35 mm 배양 디쉬를 트랜스펙션시켰다. 형질전환 하루 후, 전기생리학적 레코딩을 위하여 세포들을 글래스 커버 슬립 상으로 이동시켰다. 트랜스펙션된 세포를 상기 pEGFP-N1에서 발현시킨 EGFP 형광물질을 이용하여 동정하고 24 내지 36 시간 내에 패치 크램프 실험에 사용하였다.
1.3.
mBest1
shRNA
및
렌티바이러스
생산
플라스미드 기초 shRNA 발현을 위하여, 다음과 같은 상보적 올리고뉴클레오타이드를 어닐링하고, pSUPER-GFP 벡터 (Oligo Engine)의 HindIII/BglII 부위에 삽입하였다:
5'-GATCCCCTTGCCAACTTGTCAATGAATTCAAGAGATTCATTGACAAGTTGGCAATTTTTA-3' (서열번호 3)
3'-GGGAACGGTTGAACAGTTACTTAAGTTCTCTAAGTAACTGTTCAACCGTTAAAAATTCGA-5' (서열번호 4),
(mBest1의 뉴클레오타이드 서열 (563-582)에 해당).
HEK293T 세포(ATCC)에서 이종 발현하는 mBest1 에 대한 상기 구축물의 mBest1 발현 억제 효율을 특정 CAAC 전류를 측정하여 시험하였다 (도 11 참조). 렌티바이러스 기초 shRNA 발현을 위하여, 합성 이중가닥 올리고뉴클레오타이드 5'-CGCTGCAGTTGCCAACTTGTCAATGAATTCAAGAGATTCATTGACAAGTTGGCAATTTTTGATATCTAGACA-3' (서열번호 30)를 shLenti2.4 CMV 렌티바이러스 벡터 (Macrogen)의 pstI-XbaI 제한효소 부위에 삽입하고, 서열 분석으로 확인하여, mBest1 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 구축하였다. 대조군으로서 스크램블된 올리고뉴클레오타이드가 삽 입된 shLenti 구축물 (Macrogen)을 사용하였다. 렌티바이러스 생산은 Macrogen Inc에 의뢰하여 수행하였다 (Dull, T. et al., A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol 72, 8463-71 (1998) 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨).
1.4.
In situ
혼성화
mBest1의 mRNA에 대한 특이적 리보프로브(riboprobe)를 제조하기 위하여, 배양된 마우스 대뇌피질 성상세포를 사용하는 RT-PCR을 사용하여 mBest1의 부분적 cDNA 절편을 클로닝하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다:
forward: 5'-ACCTTCAACATCAGCCTAAA-3' (서열번호 31),
reverse: 5'-CTTTCTGGTTTTTCTGGTTG-3' (서열번호 32).
플라스미드를 선형화하고 시험관내 전사 (Roche Dignostics)에 사용하여, RNA 프로브를 디곡시게닌-UTP (digoxigenin-UTP)로 표지하였다. 냉동시킨 성체 마우스 뇌를 저온유지장치 (cryostat) 상에서 20 um 두께로 절단하였다. 그리고 나서, 상기 얻어진 절편을 4% 파라포름알데하이드에서 고정시키고, PBS로 세척한 후, 10분간 아세틸화시켰다. 상기 절편을 혼성화 버퍼 (50% 포름아마이드, 4X SSC, 0.1% CHAPS, 5 mM EDTA, 0.1% Tween-20, 1.25 x Denhartdt's, 125 ug/ml 효모 tRNA, 50 ug/ml 헤파린) 및 디곡시게닌 표지된 프로브 (200 ng)와 함께 60 ℃에서 18시간동안 인큐베이팅하였다. 2X SSC에서 10분간 및 50 ℃의 0.1X SSC에서 15분간 세척하여 비특이적 혼성화 반응이 일어난 프로브를 제거하였다. 디곡시게닌 표지 된 하이브리드를 면역학적으로 검출하기 위하여, 상기 절편을 알칼라인 포르파타아제 (Roche Diagnostics)와 컨쥬게이트된 항디곡시게닌 항체와 함께 1시간동안 인큐베이팅하고, NBT/BCIP (4-니트로블루 테타르졸륨 클로라이드/브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트; Sigma)를 사용하여 발색 반응을 수행하였다. 절편을 탈수시키고 Vectamount (Vector Laboratory)를 사용하여 마운팅하였다.
실시예
2:
칼슘이온
및
글루타메이트
측정
2.1. 동시 칼슘 이온 영상화 및 천공 패치 클램프 (perforated patch clamp) 레코딩.
외부 용액으로서 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 및 5.5 mM 글루코오스를 함유하고 pH 7.3 (~320 mOsm)인 것을 사용하였다. 전압 클램프 레코딩용으로, 25 ㎍/ml 그라미시딘 D, 75 mM Cs2SO4, 10 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, 및 10 mM HEPES를 포함하고 pH 7.1 (~310 mOsm)인 내부 용액을 사용하였다. 전류 클램프 레코딩용으로, 25 ㎍/ml 그라미시딘 D, 75 mM K2SO4, 10 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 및 10 mM HEPES를 함유하고, pH 7.1 (~310 mOsm)인 내부 용액을 사용하였다. 피펫 저항 (pipette resistances)은 5 내지 8 MΩ으로 하였다. 적절한 천공을 얻기 위하여 최종 저항을 15 내지 40 MΩ으로 하여 천공 패치 클램프를 20 내지 30분간 수행하였다.
2.2.
전세포
패치 클램프
저항이 3-6 MΩ 패치 피펫을 표준 세포내 용액으로 충전하였다. -100 내지 +100 mV의 100- 또는 200-ms-지속 전압 램프를 적용하여 전류 전압 곡선을 얻었다. 상기 램프 지속기간은 10초로 하였다. 데이터는 Digidata 1322A 데이터 포착 (acquisition) 시스템 (Molecular Devices)을 통하여 Clampex 9.0에 의하여 조절되는 Axopatch 200A 증폭기를 사용하여 얻었다. 실험은 상온(20 ~ 24℃)에서 수행하였다. 상기 피펫을 충전한 표준 용액으로 146 mM CsCl, 2 mM MgCl2, 5 mM (Ca2 +)-EGTA, 8 mM HEPES, 및 10 mM 수크로오스를 함유하고, CsOH를 사용하여 pH가 7.3로 조절된 것을 사용하였다. 상기 용액 내 세포내 유리 칼슘 이온 농도 ([Ca2 +]i)를 측정하였다 (Kuruma, A. & Hartzell, H.C. Bimodal control of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel by difference Ca(2+) signals. J Gen Physiol 115, 59-80 (2000) 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다). 표준 세포외 용액은 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 15 mM 글루코오스 및 10 mM HEPES를 함유하고, NaCl을 사용하여 pH가 7.3으로 조절된 것을 사용하였다.
2.3.
스니퍼
패치에 의한
글루타메이트
투과 여부 측정
본 실시예에서의 글루타메이트 방출 여부 측정에 사용된 스니퍼 패치 기술은 'Lee, C. J. et al. Astrocytic control of synaptic NMDA receptors. J Physiol 581, 1057-81 (2007)'에 기재된 바에 따라서 수행하였으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
mBest1 채널이 글루타메이트 투과성인지 여부를 확인하기 위하여, 다음의 두 가지 세포쌍 실험을 수행하였다.
1. mBest1 (및 GFP) 발현 세포의 HEK293T-HEK293T 세포쌍의 경우, 글루타메이트 소스로서 mBest1 또는 GluR1 (L497Y) (및 DsRED)-발현 세포와, 디텍터로서 GluR1 (L497Y) (및 DsRED)-발현 세포를 사용하여 스니퍼 패치를 수행하였다. 상기 사용된 GluR1 (L497Y)는 'Lee, C. J. et al. Astrocytic control of synaptic NMDA receptors. J Physiol 581, 1057-81 (2007)' (상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 바와 같다. 두 인접하는 세포 상에서 두 피펫을 기가옴 실링 (gigaohm seal)한 후, GluR1 (L497Y)-발현 디텍터를 먼저 파열시킨 후, 대응하는 글루타메이트 소스 HEK293T 세포를 4.5 uM Ca2 + 및 145 mM 글루타메이트 (145 mM CsGlutamate, 5 mM Ca-EGTA-NMDG, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 및 10 mM 수크로오스, pH 7.3)를 포함하는 피펫을 사용하여 파열시켰다.
2. 성상세포-HEK293T 세포쌍을 사용하는 시험에 있어서, 글루타메이트 소스로서 (GFP와 함께) 변형되지 않은 (naive) 성상세포, 스크램블된- 또는 mBest1-특이적 shRNA를 발현하는 성상세포를, 디텍터로서 (DsRED와 함께) GluR1 (L497Y)를 발현하는 HEK293T 세포를 사용하였다. 기가옴 실링 후, GluR1 (L497Y)-발현 세포를 파열시킨 후, 대응 성상세포에 500 uM TFLLR를 사용하여 가압하여 성상세포 내 칼슘 이온 증가를 유발하고, 인접하는 HEK293T 세포 상으로의 글루타메이트 방출을 유발하였다.
110 mM CsGluconate, 30 mM CsCl, 5 mM HEPES, 4 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM EGTA 및 1 mM CaCl2를 함유하고 pH가 7.3인 피펫 용액을 사용하여 GluR1LY-발현 디텍터 세포를 패치하였다. 스니퍼 패치 측정에서의 GluR1 (L497Y) 전류의 전류 크기를 시료 세포에서의 완전히 활성화된 GluR1 (L497Y) 전류로 나누어 최대 활성화에 대한 GluR1 (L497Y)-매개 전류의 퍼센티지를 분석하였다.
실시예
3: 성상세포에서의 기능적
CAAC
발현 확인
P2Y 수용체, 브라디키닌 수용체, 및 프로테아제 활성화 수용체 1 (protease activated receptor-1, PAR1)와 같은 성상세포 Gq-결합 수용체들은 세포내 칼슘 이온 농도의 일시적 증가를 유발하는데, 이러한 칼슘 이온의 증가는 칼슘이온 의존적 기작에 의한 성상세포로부터의 글루타메이트 방출을 유발한다. 본 발명자들은, 이러한 방식에 의한 성상세포로부터 글루타메이트 방출은 NMDA 수용체의 마그네슘이온-의존적 포어 블록을 감소시킴으로써 시냅스 NMDA 수용체 기능을 강화시킨다는 것을 입증한 바 있다 (Lee, C. J. et al. Astrocytic control of synaptic NMDA receptors. J Physiol 581, 1057-81 (2007)). 그러나, PAR1 활성화가 성상세포내 칼슘이온을 증가시키고 글루타메이트 방출을 촉진시키는 기작은 아직 알려지지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 분자적 관련성을 확인하기 위하여, PAR1 활성화를 성상세포내 칼슘이온 증가의 선택적 유발에 대한 도구로서 사용하여, 글루타메이트 방출을 유발하는 칼슘이온 의존적 다운스트림 프로세스를 조사하였다.
최근 연구 보고에 따르면, PAR 활성화에 뒤따르는 배양된 성상세포로부터의 글루타메이트 방출은 음이온 채널 차단제에 의하여 억제되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 글루타메이트 방출에 음이온 채널이 관여함을 의미하는 것이라 할 수 있다. 특정 아고니스트 (예컨대, TFLLR) 에 의한 PAR 활성화가 성상세포로부터의 글루타메이트 방출에 기여하는 막전도성 변화를 유발하는지 여부를 시험하기 위하여, 그라미시딘-D (gramicidin-D) 관통 패치 컨피규레이션 하에서 배양된 성상세포에서의 세포내 칼슘 이온 반응과 전체 세포 전류를 동시에 기록하였다 (도 1a 참조). 이러한 기술에 의하여 세포내 이온의 투석을 최소화할 수 있게 되었다. 30 uM TFLLR (EC50의 ~3배)를 적용한 후, 칼슘이온 반응 시간에 따라서 전류가 불활성화되는 것을 관찰하였다 (154±16 pA. n=26, 도 1b).
다른 종류의 Gq 결합 수용체인 P2Y 수용체, 브라디키닌 수용체, 리소포스파티드산 (lysophosphatidic acid, LPA) 수용체, 및 프로스타글란딘 E2(PGE2) 수용체 등이 상응하는 선택적 아고니스트에 의하여 활성화될 때, 세포내 칼슘 이온과 내향 전류의 증가가 동시에 관찰되었으며 (도 5), 이러한 결과는 상기 전류 유도가 숙주세포의 성상세포 Gq 결합 수용체와 공통된 작용 기작에 의한 것임을 의미하는 것이다.
이러한 TFLLR 유도 전류는 칼슘이온 무첨가 배쓰에서 그대로 유지되며 (도1 c), 칼슘이온 킬레이터인 BAPTA-AM 50μM 처리에 의하여 TFLLR 유도 세포내 칼슘 이온 트랜지언트와 전류가 모두 감소됨이 확인되어 (도 1e), TFLLR 유도 전류는 세포내 칼슘 이온에 의존함이 입증되었다. 쌥시가르긴 (Tocris, 100nM) 또는 포스 포리파아제 C 억제제 U73122 (Tocris, 2μM) 적용에 의한 내부 저장소로부터의 칼슘 이온 방출 장애는 TFLLR 유도 칼슘 이온 증가와 내향 전류를 모두 감소시키는 것으로 나타났다 (도 1 d: 쌥시가르긴, 도 1f: U73122). 또한, 이러한 칼슘 이온에 의하여 활성화된 전류는 니플루믹산(niflumic acid, 100 μM), 플루페나믹산(flufenamic acid, 100 μM), 및 NPPB (100 μM)에 의하여 차단되며 (도 1 g, h), 이들은 모두 칼슘 이온에 의하여 활성화되는 음이온 채널에 대하여 잘 알려진 억제제들이다. 니플루믹산에 의하여 매개되는 TFLLR 유도 전류의 차단은 전압 의존적이며 (도 1i), IC50값이 9.8 uM으로 나타났다 (도 6d). 상기 수치는 Xenopus laevis 난자에서 발현되는 CAAC의 IC50값 (10.1 uM)과 실질적으로 동등한 수치이다.
이어서, 성상세포의 PAR1에 의하여 활성화되는 내향 전류가 부분적으로 클로라이드 이온에 의하여 전달되는 것인지 여부를 시험하였다. 150 nM NaCl을 함유하는 외부용액의 존재하에서 TFLLR 유도 전류에 대한 전류-전압 (I-V) 관계를 측정하고, 그 결과를 150 nM Na+-이세치오네이트 존재하에서 얻어진 I-V 곡선과 비교하였다. 클로라이드 이온을 이세치오네이트로 대체시킴에 의하여 역전전위 (reversal potential)는 오른쪽으로 상당히 이동하였다 (-13.2±1.9 내지 +5.4±1.5 mV, n=8 및 5, 각각 p<0.05, 도 1k). 이러한 결과는 클로라이드이온이 전류 포션을 전달한다는 것과 이세치오네이트가 클로라이드이온보다 투과성이 낮다는 것을 의미하는 것이다. 또 다른 실험에 있어서, 전세포 컨피규레이션 하에서의 TFLLR 유도 전류의 역전 전위는 약 -71±1.5 mV (n=4)인 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 내부 클로라이드 이온 7mM (CsGluconate 내부 용액)에 대하여 Nernst 방정식에 따라서 계산된 역전전위 -71 mV에 잘 부합하는 것이다. 또한, 이러한 결과들은 성상세포 CAACs이 PAR1 활성화에 따른 세포질 칼슘 이온 증가에 의하여 활성화된다는 것을 나타내는 것일 수 있다. 이와 대조적으로, 성상세포에 카베녹솔론 (carbenoxolone, 100 μM, Sigma) 또는 클로로톡신 (chlorotoxin, 1μM, Sigma)을 처리함으로써 CAAC에 의한 전류를 차단할 수 없으며, 이는 헤미-채널 (hemi-channel) 또는 클로로톡신 민감성 클로라이드 채널이 칼슘 이온에 의하여 활성화되는 클로라이드 이온 유량 (flux)에 수반되지 않는다는 것을 보여준다 (도 7). 이러한 결과들은 성상세포에서의 CAACs의 기능적 발현을 처음으로 입증하는 것이다.
실시예
4:
CAAC
의
글루타메이트
투과성 시험
CAACs는 다수의 음이온이 투과 가능하고, 알려진 칼슘 이온 농도의 내부 용액의 적용에 의하여 직접적으로 활성화될 수 있기 때문에, 본 발명에서는 성상세포 CAACs가 CAAC를 최대로 활성화시키는 4.5 uM 칼슘 이온을 함유하는 내부 용액을 직접 적용함으로써 글루타메이트가 투과 가능해질 수 있는지 여부를 시험하였다 (도 10). 성상세포 CAAC의 직접적 활성화가 탈감작화되지 않은 CAAC 전류를 나타낸다는 것이 관찰되었으며, 이는 니플루믹산에 의하여 쉽게 차단되었다 (도 6c). 외부 배쓰 용액의 음이온을 교환하는 일련의 이온 치환 실험에 의하여, 성상세포 CAAC의 I-V 관계가 외부 방향으로 정류하고, I->Br->Cl->F- 순으로 투과성을 보인다는 것을 밝혔다 (도 2a 내지 2c). 이러한 결과는 Xenopus 난자 및 포유류 세포에서 보고된 다른 CAAC의 기존의 알려진 물성과 일치하는 것이다.
놀랍게도, 클로라이드 이온을 글루타메이트 또는 이세치오네이트와 같은 거대 음이온으로 치환시, 양전위에서 상당한 외향 전류 (음이온 유동)이 유도되는 것이 관찰되었다 (도 2c 및 2d). 이러한 결과는 글루타메이트가 CAACs를 통하여 세포 외부에서 내부로 투과 가능하다는 것을 보여주는 것이다. 세포 내부로부터 외부로의 글루타메이트 유출 가능성을 시험하기 위하여, 세포내 칼슘 이온 4.5 μM에 의하여 직접적으로 활성화된 전류의 니플루믹산 민감성 성분 (도 2e, 오른쪽 패널)의 I-V 관계를 측정하였다. 칼슘 이온 4.5 μM과 단독 음이온으로서 글루타메이트 (145 mM)를 함유하는 내부 용액을 사용하면서, 니플루믹산 처리 전 (검은색 trace)과 후 (회색 trace)에 얻어진 I-V 관계를 공제하였다 (도 2e, 왼쪽 패널). 음전위에서 상당한 내부 전류가 관찰되었으며, 이는 CAACs를 통한 글루타메이트 유출을 나타내는 것이다 (도 2e 및 2g; red trace). 글루타메이트를 글루타메이트 골격에 벌크 방향족 고리가 융합되어 있는 글루타메이트 유사체인 페닐글리신-O-카르복실레이트 (phenylglycine-o-carboxylate)로 치환시, 글루타메이트와 비교하여 내향 전류 (음이온 유출)가 현저하게 감소하였다 (도 2f 및 2g). 이러한 데이터는 CAAC를 통한 글루타메이트 컨덕턴스 가능성을 보다 강력하게 뒷받침하는 것이다. 더욱이, 니플루믹산 또는 플루페나믹산 처리에 의하여 TFLLR에 의하여 유발된 [3H]-글루타메이트 로딩된 배양물로부터의 방사성 트레이서의 유출이 각각 69% 및 57% 억제 되었으며 (n=11 및 4), 이러한 결과는 이전 보고와 부합하는 것이다.
성상세포 CAAC를 통한 글루타메이트의 방출은 '스니퍼 패치 (sniffer-patch)' 기술을 이용하여 측정하여 배양된 성상세포로부터의 글루타메이트 방출을 실시간으로 기록하였다 (도 10a). 스니퍼 패치 기술을 이용하여, 탈감작화되지 않은 AMPA 수용체 서브유닛 GluR1 (L497Y) 뮤턴트를 발현하는 인접하는 HEK293T 세포에 대한 TFLLR 유도 성상세포의 글루타메이트 방출에 의하여 AMPA 수용체 길항제에 민감한 내향 전류가 유발된다는 것이 관찰되었으며, 이는 글루타메이트 방출을 반영하는 것이다. 형질전환된 HEK293T 세포에서의 전류 반응에 대한 TFLLR의 영향은 니플루믹산 처리에 의하여 차단된다 (니플루믹산에 의한 억제율(%)=66.6±5.7%; 도 10d, 10e, 10f). 상기 결과는 성상세포 CAAC가 글루타메이트 투과성이라는 가설에 부합하는 것이다. 또한, 상기 결과는 성상세포 CAAC의 포어가 글루타메이트 투과에 충분한 크기를 갖는다는 것을 보여주는 것이다.
성상세포에서 CAAC 의존성 글루타메이트 방출이 발생하고, 생체내에서 시냅스 전위를 증가시키는지 여부를 시험하기 위하여, 일련의 전류 클램프 실험을 수행하여 해마 절편에서 CA1 피라미드 뉴런 시냅스에 대한 섀퍼 곁가지 (Schaffer collateral)의 유발 EPSPs (eEPSPs)에 있어서의 CAAC 의존성 글루타메이트 방출의 영향을 직접적으로 측정하였다. 'Lee, C. J. et al. Astrocytic control of synaptic NMDA receptors. J Physiol 581, 1057-81 (2007)'에 기재된 것과 유사한 레코딩 조건하에서, TFLLR이 NMDA 수용체의 기여를 반영하는 느린 감소를 포함하는 유발 EPSPs 면적 및 크기(amplitude)를 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 eEPSP의 증가는 니플루믹산의 처리에 의하여 억제되었으며, 이는 글루타메이트가 생체내에서 성상세포 CAAC를 통한 투과에 의하여 방출되며, 뉴런의 시냅스 활성을 조절한다는 것을 보여주는 것이다 (도 2i 내지 2k). 이에 부합하여, 전압 클램프 하에서 기록되는 mEPSC 감소의 NMDA 수용체 (NMDAR) 매개 성분의 TFLLR 유도 연장 (prolongation) 또한 니플루믹산 처리에 대하여 민감한 것으로 나타났다. 니플루믹산이 NMDAR 매개 전류 크기에 최소의 영향을 미치는 것으로 나타났기 때문에 (도 10), 시냅스 전위 또는 전류에 대한 니플루믹산의 억제 효과는 뉴런 NMDARs에 대한 비특이적 영향에 의한 것으로 보이지 않는다.
실시예
5:
mBest1
이 성상세포
Ca
2
+
에 의하여 활성화되는 음이온 채널임을 확인하는 시험
CAACs의 분자적 확인은 오랫동안 달성되지 못했으며, 특이적인 차단제와 명확한 검정법의 없는 상태이다. 사실, CAAC는 매우 수가 적은 채널 중 하나이며, 아직까지 클로닝된 바 없다. 성상세포에서 CAAC를 코딩하는 유전자를 동정하기 위하여, 기존에 CAAC로서 제시되었던 Cl- 채널-칼슘 활성화 (Cl- channel-Calcium Activated, CLCA ), Drosophila tweety homolog ( Ttyh ), 및 bestrophin (Best) 계열 유전자 등과 같은 다양한 후보 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction)을 수행하였다. 상기 RT-PCR 분석 결과는 마우스 bestrophin 1 및 4 (mBest1 및 4)가 뇌에서 발현하며, 배양 성상세포에서 mBest4보다 mBest1이 보다 높은 수준으로 발현하는 것을 보여주 며, 이러한 결과는 mBest1 채널이 성상세포에서의 글루타메이트 투과성 CAAC 특성을 설명하는 것이다 (도 3a). 성상세포에서의 마우스 Ttyh 계열 유전자의 상당한 발현에도 불구하고 (도 11), 세포질 칼슘 이온에 의한 느린 채널 개방, 니플루믹산에 대한 둔감성 및 외향 정류 (outward rectification)와 같은 tweety 채널의 최근 보고된 특성에 의하여 이들 유전자들은 성상세포 CAAC 후보로서 고려되지 않았다. 베스트로핀 (Bestrophin) 채널은 CAAC와 유사한 특성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 후각 트랜스덕션 및 망막 퇴화에 각각 관여하는 후각 감각 뉴런의 섬모 및 망막 상피세포와 같은 주변 조직에서 발현하는 것으로 나타났다. 그러나, 중추 신경계에서의 베스트로핀 발현에 대한 직접적 증거 및 성상세포 베스트로핀 채널의 역할이 모두 아직 밝혀지지 않았다. 본 발명자들은 최초로 뇌 영역 내에서의 mBest1 발현 패턴을 세포 종류에 따라서 분석하였다. In situ hybridization analysis에 의하여 mBest1 mRNA의 발현 패턴이 광범위하게 분포함이 나타났으며 (도 3b), 이러한 결과는 mBest1이 뇌에서 주요 역할을 수행한다는 것을 보여주는 것이다. 성체 마우스의 대뇌피질로부터 즉석 절단된 성상세포 또는 뉴런의 cDNA 및 mBest1-특이적 프라이머를 사용하는 단세포 RT-PCR을 통하여, GFAP (glial fibrillary acidic protein) 발현 세포 유형 및 NSE (neuron specific enolase) 발현 세포 유형 모두에서의 mBest1 발현을 확인하였으며, 이는 mBest1이 성상세포 뿐 아니라 뉴런에서도 발현함을 보여주는 것이다.
mBest1 채널이 CAAC와 유사한 특성을 갖는지 여부를 분석하기 위하여, 전장 mBest1을 성상세포와 정소 cDNA 모두로부터 클로닝하여, HEK293T 세포에서 일시적 으로 발현시켰다. mBest1-발현 HEK293T 세포는 외향 정류, 칼슘 이온 의존성 채널 활성화 및 니플루믹산 민감성 등과 같은 성상세포의 CAAC와 유사한 특성을 나타내는 것으로 나타났다 (도 3d 및 도 11). 이와 대조적으로, GFP만으로 형질감염된 HEK293T 세포는 칼슘 이온에 의하여 활성화된 전류를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 mBest1이 글루타메이트 투과성 성상세포 CAAC에 대한 후보 분자로서 가능성이 있음을 제안하는 것이다.
그 다음으로 mBest1으로서의 성상세포 CAAC의 분자적 상동성을 확인하기 위하여, mBest1-특이적 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 설계하여 mBest1 발현을 특이적으로 넉다운시키고, 이의 CAAC에 대한 영향과 궁극적으로는 성상세포로부터의 글루타메이트 방출에 대한 영향을 측정하였다. 이러한 shRN에 의한 특이적으로 효과적인 mBest1 채널의 넉다운은 mBest1 cDNA로 형질감염된 HEK293T 세포에서 확인되었다 (도 3e). 이러한 shRNA를 이용하여 성상세포에서의 CAAC 전류가 성상세포에서의 mBest1-특이적 shRNA 발현에 의하여 현저하게 억제됨을 확인하였다 (도 3e; naive astrocytes: 221.3±16.4 pA, n=12; scrambled shRNA expressing astrocytes: 173.5±7.2 pA, n=10; mBest1 shRNA expressing astrocytes: 49.7±8.3 pA, n=11; One way ANOVA with Tukey's post hoc test; ***p<0.001 versus shRNA group). 이러한 결과는 mBest1이 성상세포에서 대다수의 CAAC를 코딩한다는 것을 의미하는 것이다.
실시예
6:
mBest1
채널을 통한
글루타메이트
방출 시험
mBest1 채널을 통한 글루타메이트의 방출은 칼슘이온과 글루타메이트를 포함 하는 패치피펫을 사용하여 멤브레인 break-through 시에 mBest1 채널을 직접적으로 활성화시키는 스니퍼 패치 기술을 사용하여 측정하였다 (도 4a 및 4b). mBest1 또는 GluR1 (L497Y)를 발현하지 않는 HEK293T 세포를 사용하는 대조군 실험에 있어서, break-through 시에 이웃하는 GluR1 (L497Y) 발현 HEK293T 세포 상에서 어떠한 전류도 검출되지 않았다 (naive cells: 46.0±20.6 pA, n=5; GluR1 (L497Y) expressing cells: 8.0±3.6 pA, n=5). 이와 대조적으로, mBest1 채널의 직접적 활성화는 mBest1-발현 HEK293T 세포로부터 상당한 대규모 글루타메이트 방출을 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 글루타메이트가 mBest1 채널을 통하여 투과한다는 것을 보여주는 것이다 (도 4c 및 4e; 770.0±344 pA, n=5, *p<0.05, **p<0.01, one way ANOVA with Tukey's post hoc test). 이러한 결과는 mBest1 채널이 글루타메이트 투과에 필요하고 이에 선택적으로 작용함을 직접적으로 입증하는 것이다.
마지막으로, 성상세포 mBest1 채널이 칼슘 이온 의존성 글루타메이트 방출에 반응성이 있는지를 확인하기 위하여, scrambled shRNA 또는 mBest1 shRNA를 발현하는 배양 성상세포와 GluR1 (L497Y) 발현 HEK293T 세포 간의 스니퍼 패치 실험을 수행하였다. 글루타메이트 방출은 성상세포에서 mBest1 shRNA에 의하여 상당히 감소하지만, shRNA에 의해서는 감소하지 않았다. 변형되지 않은 성상세포에서의 1mM 글루타메이트에 의하여 완전히 활성화된 GluR1 (L497Y) 전류에 대한 GluR1 (L497Y) 매개 전류의 퍼센트는 10.8±3.2% (n=11)이고, scrambled shRNA를 발현한 세포에서는 12.7±3.6% (n=11)이었으며, mBest1 shRNA 발현 세포에서는 4.2±1.2, n=14이었다 (*p<0.05, scrambled vs. mBest1 shRNA; unpaired t-test; 도 4f 내지 4h). 이와 같은 성상세포 내 칼슘 이온의 증가는 영향을 받지 않았다(unaffected). 이러한 데이터는 mBest1 채널이 직접적 투과에 의한 글루타메이트의 칼슘 이온 의존적 방출에 기여한다는 것을 강력하게 제안하는 것이다. mBest1 넉다운 (약 33%)에 의한 성상세포로부터의 글루타메이트 방출의 잔존하는 성분은 이전에 보고된 소포성 기작인 mBest4 또는 다른 알려지지 않은 기작의 모든 조합에 기인하는 것일 수 있다.
기존의 연구가 엑소사이토시스 의존적 EAA 방출의 매개자로서의 부피 민감성 채널의 존재에 대한 증거를 제시하고 있기 때문에, mBest1 채널이 성상세포에서의 부피 변화에 의하여 조절될 가능성이 있다. 이러한 가정에 따라서, 다음의 세 가지 독립적인 증거가 이러한 가능성을 뒷받침할 수 있다: 1) 인간 베스트로핀 채널 (hBest2)은 부피 민감성의 클로라이드 이온 투과성을 보임; 2) 세포내 칼슘이온 증가와 저장성(hypoosmotic) 용액의 처리에 의하여 성상세포로부터의 글루타메이트 방출이 현저하게 증가됨; 및 3) 본 발명자의 이전 연구에서의 mBest1-발현 HEK293T 세포의 분석이 저장성 용액 유발 음이온 전류를 보여줌 (도 12). 이들 데이터는 모두 mBest1이 칼슘 이온 증가와 부피 변화 모두에 의하여 활성화될 수 있음을 보여주는 것이며, 이는 칼슘 이온 의존성 및 부피 민감성을 설명하는 비소포성 글루타메이트 방출에 대한 통일된 가설을 제공한다.
이러한 결과는 mBest1이 마우스 중추신경계의 성상세포 및 뉴런에서 발현된다는 것을 보여주는 것이다. 본 발명자들은 또한 신경아교-뉴런 신경 전달에 있어서의 CAAC의 새로운 기능을 밝히고 mBest1과 성상세포의 CAAC의 분자 상동성을 제 안하였다. 또한, 성상세포의 mBest1 채널이 직접적 투과에 의하여 글루타메이트를 방출할 수 있음을 보였다. 이러한 결과들은 성상세포로부터의 수용체 매개, 칼슘 이온 의존적, 비소포성 및 채널 매개 글루타메이트 방출이 뉴런간의 시냅스 활성을 조절하는데 중요한 역할을 한다는 것을 보여주는 것이다. 최근들어, 말초 뉴런의 베스트로핀 채널이 칼슘 이온 활성화 클로라이드 이온 유출을 유도시킴으로써 탈분극을 증폭시키는데 기여한다는 것이 밝혀졌으며, 이는 뉴런의 베스트로핀 채널이 말초 신경계에서의 뉴런 흥분성의 광범위한 조절에 작용한다는 가능성을 높이는 것이다.
도 1 a 내지 k는 성상세포가 기능적 CAAC를 발현함을 보여주는 것으로,
1a는 배양물 내의 분리된 성상세포로부터 얻은 그라미시딘 천공 패치 클램프 이미지를 보여주는 것이고 (Scale bar= 20 ㎛),
1b는 배양된 성상세포에서의 30 μM TFLLR에 의하여 유도된 Ca2 + 트랜지언트 및 내향 전류에 대한 대표적인 동시 레코딩을 보여주는 것이며 (Vh=-70mV),
1c는 Ca2 + 무첨가 세포외용액에서의 TFLLR에 의하여 유도된 Ca2 + 및 전류 반응을 보여주는 것이고 (n=5),
1d 내지 1f는 TFLLR에 의하여 유도된 Ca2 + 및 전류 반응이 소정의 프리인큐베이팅에 의하여 억제됨을 보여주는 것으로, 1d는 100 nM 쌥시가르긴으로 5분간 프리인큐베이팅한 억제 결과를 보여주는 것이고 (n=5), 1e는 50 μM BAPTA-AM으로 30분간 프리인큐베이팅한 억제 결과를 보여주는 것이며(n=5), 1f는 2 μM U73122으로 10 분간 프리인큐베이팅한 억제 결과를 보여주는 것이고 (n=5)
(TFLLR가 적용된 시점을 ◆로 표시하였으며, 적용 지속 시간은 10초로 하였음),
1g는 TFLLR에 의하여 유도된 내향 전류 반응이 100 μM 니플루믹산에 의하여 억제됨을 보여주는 것으로, 니플루믹산은 TFLLR에 의하여 유도된 세포내 칼슘이온의 증가를 감쇄시키지만 차단하지는 않음을 보여주며 (n=5),
1h는 100 μM 니플루믹산, 100 μM 플루페나믹산 및 100 μM NPPB와 같은 다양한 음이온 채널 차단제들은 모두 TFLLR에 의하여 유도된 전류를 차단함을 보여주는 것이고 (여기서 각각의 막대는 평균±s.e.m.값을 나타내며; One way ANOVA with Tukey's post hoc test; *p<0.05 versus TFLLR-treated group)
1i는 100 μM 니플루믹산 처리를 한 경우와 하지 않은 경우의 TFLLR에 의하여 유도된 전류 반응을 보여주는 I-V 곡선이며,
1j는 내부 배쓰에서 클로라이드 이온(150 mM NaCl)을 이세치오네이트(150 mM Na-Isethionate)로 치환시킴에 의한 전류 반응에 대한 I-V 곡선의 변화를 보여주는 것이고,
1k는 TFLLR에 의하여 유도된 전류에 대하여 관찰되는 역전전위의 평균±s.e.m.값을 나타내는 막대그래프로서, 검정 막대 및 적색 막대는 각각 NaCl 함유 배쓰 용액 (n=8) 및 Na-Isethionate 함유 배쓰 용액 (n=5)에 대하여 측정된 역전전위를 나타내는 것이다(* p<0.05, versus NaCl group; unpaired t-test).
도 2는 세포내 칼슘 이온 증가에 의하여 성상세포 CAAC의 글루타메이트 투과성이 증가함을 보여주는 것으로,
2a 내지 2c는 세포외 배쓰에서 NaCl을 상이한 이온으로 치환시에 나타나는 I-V 곡선을 보여주는 것이고 (치환된 이온은 다음과 같음: I- (a), F- (b), 및 글루타메이트 (Glu; c),
2d는 세포외 배쓰에서 이세치오네이트 및 글루타메이트를 사용하여 측정된 값을 포함하여 상기 2a 내지 2c의 실험에서 얻어진 역전전위의 변화를 보여주는 것이며,
2e 및 2f는 Cs-글루타메이트 (e; CsGlu) 또는 벌키 글루타메이트 유사체 Cs-PGCA (f; CsPGCA)를 포함하는 피펫 용액을 사용하는 전세포 패치 클램프에 의하여 측정된 I-V 곡선을 보여주는 것이고 (왼쪽 패널: 니플루믹산 처리 전 (검은색 트래이스)과 후 (회색 트래이스)에 얻어진 I-V 곡선. 오른쪽 패널: 검은색 트래이스에서 회색 트래이스를 공제하여 얻어진 니플루믹산 민감성 성분의 I-V 곡선 (붉은색 트래이스)),
2g는 니플루믹산 민감성 전류의 평균값을 나타낸 것으로, PGCA와 글루타메이트의 화학적 구조가 나타나 있으며,
2h는 TFLLR (30 μM) 적용 전 (대조군)과 적용 동안의 평균 유발 EPSP (eEPSP)를 보여주는 것이며 (오른쪽 패널: 두 eEPSP의 겹친 트래이스),
2i는 30 μM 니플루믹산 존재하의 TFLLR 적용 전 (니플루믹) 및 TFLLR 적용 후 (니플루믹/TFLLR)의 평균 유발 EPSP (eEPSP)를 보여주는 것이고 (오른쪽 패널: 두 eEPSP의 겹친 트래이스),
2j의 왼쪽 패널은 TFLLR 적용시 (빈 동그라미) 또는 니플루믹/TFLLR 처리시 (검은 동그라미) 시간에 따른 평균 eEPSP 면적 (%)를 보여주는 것이며 (평균±s.e.m.), 오른쪽 패널은 평균 eEPSP 면적을 막대그래프로 나타낸 것이고 (*p<0.05 versus control; unpaired t- test), 이때, 니플루믹산과 TFLLR의 존재시에 관찰되는 eEPSP 면적의 감소는 통계학적으로 유의미하지 않음 (p>0.05 versus control; unpaired t- test).
도 3은 mBest1이 성상세포 Ca2 +에 의하여 활성화되는 음이온 채널임을 보여주는 것으로,
3a는 전체 뇌 (뇌 cDNA) 및 배양된 성상세포 (Astrocyte)에서의 마우스 bestrophin 유전자의 발현에 대한 RT-PCR 분석 결과로서, 베타 액틴 유전자를 대조군으로 사용하였으며,
3b는 mBest1 특이적 프로브에 대한 In situ 혼성화 (ISH)를 보여주는 것이고 (상단 왼쪽 및 하단 패널은 각각 안티센스 프로브를 사용하는 ISH의 관상단면 및 시상 단면을 보여주는 것이고, 상단 오른쪽 패널은 센스 프로브를 사용하는 ISH의 관상단면을 보여주는 것임),
3c는 즉석 분리된 뉴런 및 성상세포에 대한 단일 세포 RT-PCT 분석을 보여주는 것이며 (증폭에 사용된 프라이머: 뉴런 특이적 에놀라아제 (neuron-specific enolase, NSE; N); 신경교원섬유 산성단백질 (GFAP; G); mBest1 (B)),
3d는 전세포 패치 클램프 컨피규레이션을 이용하는 CAAC 활성화를 보여주는 것이고 (왼쪽 패널: GFP 및 mBest1를 발현하는 HEK293T 세포의 현미경 사진 (Scale bar=20㎛); 중간 상단 패널: 동일한 세포에서 나플루믹산 (100 μM) 존재시와 부재시의 반응을 나타낸 것으로, 전류는 -100 mV에서부터 +100 mV까지의 볼티지 스텝 의하여 유도됨; 중간 하단 패널: GFP 만으로 형질감염된 동일한 HEK293T 세포에서의 볼티지 스텝에 의하여 유도된 전류를 나타냄; 오른쪽 패널: -70 mV에서 기록된 정지전류 (holding current) 크기를 나타내는 막대 그래프 (mean±s.e.m; ***p<0.001, GFP versus mBest1, unpaired t-test, '-' 및 '+'는 각각 니플루믹산의 존재 또는 부재를 나타냄),
3e의 왼쪽 패널은 mBest1 shRNA 및 GFP를 발현하는 성상세포의 현미경 사진이고 (Scale bar=20㎛), 중간 패널은 공벡터 (empty vector) 또는 shRNA로 형질감염된 성상세포로부터의 반응을 보여주는 전류 레코딩을 보여주는 것이며, 오른쪽 패널은 각 군에서 mean±s.e.m.로 평균화된 전류 크기를 요약한 막대 그래프이다 (One way ANOVA with Tukey's post hoc test; *p<0.001 versus shRNA group).
도 4는 성상세포가 mBest1 채널을 통하여 글루타메이트를 방출한다는 것을 보여주는 것으로,
4a 및 4b의 상단 패널은 글루타메이트 스니퍼 패치 수행을 위한 레코딩 어레인지먼트를 보여주는 개략도이고, 하단 패널은 전세포 전압 클램프 하에서 레코딩된 HEK293T 세포 영상을 나타낸 것이며 (HEK293T 세포: GluR1 (L497Y) 및, DsRED 또는 mBest1, 및 EGFP 발현. Scale bar= 20㎛).
4c는 mBest1 및 GluR1 (L497Y) 발현 HEK293T 세포쌍에서의 스니퍼 패치 레코딩을 나타낸 것이고 (▲: 패치 클램프 실험 동안의 급격한 변화 (break-through) 시점을 나타냄),
4d는 변형이 가해지지 않은 HEK293T 세포 및 GluR1 (L497Y) 발현 HEK293T 세포 쌍의 레코딩 트레이스를 나타낸 것이며 (삽입 패널: 동일한 세포에 1 mM 글루타메이트를 배쓰 처리하여 완전히 활성화된 GluR1 (L497Y)의 트레이스),
4e는 스니퍼 패치 실험을 mean±s.e.m.로서 요약한 막대 그래프이고 (*p<0.05, **p<0.01, One way ANOVA with Tukey's post test versus mBest1-expressing group),
4f 내지 4h는 인접하는 GluR1 (L497Y)-발현 HEK293T 세포의 전류 및 성상세포 내 칼슘 이온의 스니퍼 패치 레코딩을 나타내는 것으로, 4f는 스크램블 shRNA의 렌티바이러스 발현 (scrambled), 4g는 mBest1 shRNA의 렌티 바이러스 발현(sh-mBest1)을 나타내며 (◆: TFLLR 처리 시점을 나타냄), 하단 삽입 도면은 동일한 세포에서 1 mM 글루타메이트 처리에 의한 GluR1 (L497Y)의 최대 반응을 나타낸 것이고, 4h는 상기 4f 및 4g에서의 스니퍼 패치 실험의 결과를 mean±s.e.m.로서 요약한 막대그래프이다 (*p<0.05 versus scrambled shRNA group; unpaired t-test).
<110> Korea Institute of Science and Technology
<120> REGULATION OF NEUROTRANSMITTER RELEASE THROUGH ANION CHANNELS
<130> DPP-2007-2259-KR
<160> 32
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1904
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse Bestrophin 1 gene (NM_011913)
<400> 1
gacccaagcc cacctactgc tgcccagtgc caagccatga ctatcaccta cacaaacaaa 60
gtagccaatg cccgcctcgg ttcgttctcg tccctcctcc tgtgctggcg aggcagcatc 120
tacaagctgc tgtatggaga attccttgtc ttcatattcc tctactattc catccgtgga 180
ctctacagaa tggttctctc gagtgatcag cagctgttgt ttgagaagct ggctctgtac 240
tgcgacagct acatccagct catccctata tccttcgttc tgggtttcta tgttacattg 300
gtggtgagcc gctggtggag ccagtacgag aacttgccgt ggcccgaccg cctcatgatc 360
caggtgtcta gcttcgtgga gggcaaggat gaggaaggcc gtttgctgcg gcgcacgctc 420
atccgctacg ccatcctggg ccaagtgctc atcctgcgca gcatcagcac ctcggtctac 480
aagcgctttc ccactcttca ccacctggtg ctagcaggtt ttatgaccca tggggaacat 540
aagcagttgc agaagttggg cctaccacac aacacattct gggtgccctg ggtgtggttt 600
gccaacttgt caatgaaggc ctatcttgga ggtcgaatcc gggacaccgt cctgctccag 660
agcctgatga atgaggtgtg tactttgcgt actcagtgtg gacagctgta tgcctacgac 720
tggataagta tcccattggt gtacacacag gtggtgacag tggcagtata cagctttttc 780
cttgcatgct tgatcgggaa gcagtttctg aacccaaaca aggactaccc aggccatgag 840
atggatctgg ttgtgcctgt cttcacaatc ctgcaattct tattctacat gggctggctg 900
aaggtggcag aacagctcat caaccccttc ggggaggacg atgatgattt tgagactaac 960
tggatcattg acagaaacct gcaggtgtcc ctgttgtccg tggatgggat gcaccagaac 1020
ttgcctccca tggaacgtga catgtactgg aacgaggcag cgcctcagcc gccctacaca 1080
gctgcttctg ccaggtctcg ccggcattcc ttcatgggct ccaccttcaa catcagccta 1140
aagaaagaag acttagagct ttggtcaaaa gaggaggctg acacggataa gaaagagagt 1200
ggctatagca gcaccatagg ctgcttctta ggactgcaac ccaaaaacta ccatcttccc 1260
ttgaaagact taaagaccaa actattgtgt tctaagaacc ccctcctcga aggccagtgt 1320
aaggatgcca accagaaaaa ccagaaagat gtctggaaat ttaagggtct ggacttcttg 1380
aaatgtgttc caaggtttaa gaggagaggc tcccattgtg gcccacaggc acccagcagc 1440
caccctactg agcagtcagc accctccagt tcagacacag gtgatgggcc ttccacagat 1500
taccaagaaa tctgtcacat gaaaaagaaa actgtggagt ttaacttgaa cattccagag 1560
agccccacag aacatcttca acagcgccgt ttggaccaga tgtcaaccaa tatacaggct 1620
ctaatgaagg agcatgcaga gtcctatccc tacagggatg aagctggcac caaacctgtt 1680
ctctatgagt gatgcctcac agcctggccc tgacttgcaa ggatgcccag cagggcactg 1740
acccagtcaa aggcacacaa gcagcgacac ccaggagtgt gttcccacga cagtctagca 1800
tgtaactcag aaccaagagt acttaatagt cctgcctgaa aacacctgta ttttacgatc 1860
tttcccaaac taaggagttt aataaacgtg aatattcttt tagg 1904
<210> 2
<211> 2673
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human bestrophin 1 gene (NM_004183)
<400> 2
cagggagtcc caccagccta gtcgccagac cttctgtggg atcatcggac ccacctggaa 60
ccccacctga cccaagccca cctgctgcag cccactgcct ggccatgacc atcacttaca 120
caagccaagt ggctaatgcc cgcttaggct ccttctcccg cctgctgctg tgctggcggg 180
gcagcatcta caagctgcta tatggcgagt tcttaatctt cctgctctgc tactacatca 240
tccgctttat ttataggctg gccctcacgg aagaacaaca gctgatgttt gagaaactga 300
ctctgtattg cgacagctac atccagctca tccccatttc cttcgtgctg ggcttctacg 360
tgacgctggt cgtgacccgc tggtggaacc agtacgagaa cctgccgtgg cccgaccgcc 420
tcatgagcct ggtgtcgggc ttcgtcgaag gcaaggacga gcaaggccgg ctgctgcggc 480
gcacgctcat ccgctacgcc aacctgggca acgtgctcat cctgcgcagc gtcagcaccg 540
cagtctacaa gcgcttcccc agcgcccagc acctggtgca agcaggcttt atgactccgg 600
cagaacacaa gcagttggag aaactgagcc taccacacaa catgttctgg gtgccctggg 660
tgtggtttgc caacctgtca atgaaggcgt ggcttggagg tcgaatccgg gaccctatcc 720
tgctccagag cctgctgaac gagatgaaca ccttgcgtac tcagtgtgga cacctgtatg 780
cctacgactg gattagtatc ccactggtgt atacacaggt ggtgactgtg gcggtgtaca 840
gcttcttcct gacttgtcta gttgggcggc agtttctgaa cccagccaag gcctaccctg 900
gccatgagct ggacctcgtt gtgcccgtct tcacgttcct gcagttcttc ttctatgttg 960
gctggctgaa ggtggcagag cagctcatca acccctttgg agaggatgat gatgattttg 1020
agaccaactg gattgtcgac aggaatttgc aggtgtccct gttggctgtg gatgagatgc 1080
accaggacct gcctcggatg gagccggaca tgtactggaa taagcccgag ccacagcccc 1140
cctacacagc tgcttccgcc cagttccgtc gagcctcctt tatgggctcc accttcaaca 1200
tcagcctgaa caaagaggag atggagttcc agcccaatca ggaggacgag gaggatgctc 1260
acgctggcat cattggccgc ttcctaggcc tgcagtccca tgatcaccat cctcccaggg 1320
caaactcaag gaccaaacta ctgtggccca agagggaatc ccttctccac gagggcctgc 1380
ccaaaaacca caaggcagcc aaacagaacg ttaggggcca ggaagacaac aaggcctgga 1440
agcttaaggc tgtggacgcc ttcaagtctg ccccactgta tcagaggcca ggctactaca 1500
gtgccccaca gacgcccctc agccccactc ccatgttctt ccccctagaa ccatcagcgc 1560
cgtcaaagct tcacagtgtc acaggcatag acaccaaaga caaaagctta aagactgtga 1620
gttctggggc caagaaaagt tttgaattgc tctcagagag cgatggggcc ttgatggagc 1680
acccagaagt atctcaagtg aggaggaaaa ctgtggagtt taacctgacg gatatgccag 1740
agatccccga aaatcacctc aaagaacctt tggaacaatc accaaccaac atacacacta 1800
cactcaaaga tcacatggat ccttattggg ccttggaaaa cagggatgaa gcacattcct 1860
aacctgcttc ctaatgggga tgcttcgcca gccaggtcct cacctgtgtg tacaccagca 1920
ggacactgat ccagtcacag ccatacagct gtccacactg aagaacatgt cctacaacag 1980
cctgaatcaa atggttagct taatagataa aaatcccaga ctacttcagc ctttaatgcc 2040
ttttattcat aaaaactgtg aaagctagac tgaaccattg gaaacattta actcagactc 2100
tggattcaga gtcgggaacc cttagttcta tctgaatcca agacagccac accttagtat 2160
actgcccaaa ctaatgagtt taataaatac aaatactcgt ttctttttga ttagtgtgat 2220
tagaactgaa caacggcact taaggaatct ggaagatagc ctggatagat ttctgattca 2280
tcccaagacc tcaaagacaa cacctgggta ccaaatttct ttatttgaag gaatggtaca 2340
aatcaaagaa cttaagtgga tgttttggta caacttatag aaaaggtaaa ggaaacccca 2400
acatgcatgc actgccttgg tgaccaggga agtcacccca cggctatggg gaaattagcc 2460
cgaggcttag ctttcattat cactgtctcc cagggtgtgc ttgtcaaaga gatattccgc 2520
caagccagat tcgggcgctc ccatcttgcg caagttggtc acgtggtcac ccaattcttt 2580
gatggctttc acctgctcat tcaggtaatg tgtctcaatg aagtcacaca actgcaaaac 2640
aatggggaag acagttagtg ggcagctttc cca 2673
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA for shRNA (5'->3') for Best1 gene
<400> 3
gatccccttg ccaacttgtc aatgaattca agagattcat tgacaagttg gcaattttta 60
60
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA for shRNA (3'->5') against Best1 gene
<400> 4
gggaacggtt gaacagttac ttaagttctc taagtaactg ttcaaccgtt aaaaattcga 60
60
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mBest1-F primer
<400> 5
aggacgatga tgattttgag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mBest1-R primer
<400> 6
ctttctggtt tttctggttg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mBest2-F primer
<400> 7
tcgtctacac ccaggtagtc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mBest2-R primer
<400> 8
gaaagttggt ctcaaagtcg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mBest4-F primer
<400> 9
aaaggctacg taggacatga 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mBest4-R primer
<400> 10
gaaaggacgg tatgcagtag 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCLCA1,2,4-F primer
<400> 11
ttcaagatcc aaaaggaaaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCLCA1,2,4-R primer
<400> 12
gctcagtctg gttttgtttc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCLCA5-F primer
<400> 13
taagattcca gggacagcta 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCLCA5-R primer
<400> 14
aaaggaggaa aaatacctgg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mTtyh1-F primer
<400> 15
agacacctat gtgctgaacc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mTtyh1-R primer
<400> 16
agaaaagagc atcaggaaca 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mTtyh2-F primer
<400> 17
ccagcttctg ctaaacaact 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mTtyh2-R primer
<400> 18
aatctctgtc cctgttgatg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mTtyh3-F primer
<400> 19
cagtactgag tggggacatt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mTtyh3-R primer
<400> 20
ctgtgacaaa ggagaagagg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mBest1 forward outer primer
<400> 21
aggacgatga tgattttgag 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mBest1 forward inner primer
<400> 22
accttcaaca tcagcctaaa 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mBest1 reverse common primer
<400> 23
ctttctggtt tttctggttg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NSE forward common primer
<400> 24
gctgcctctg agttttaccg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NSE reverse outer primer
<400> 25
gaaggggatc acagcacact 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NSE reverse inner primer
<400> 26
ctgattgacc ttgagcagca 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFAP forward outer primer
<400> 27
gaggcagaag ctccaagatg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFAP forward inner primer
<400> 28
agaacaacct ggctgcgtat 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFAP reverse common primer
<400> 29
cggcgatagt cgttagcttc 20
<210> 30
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic double-stranded oligonucleotide for lentivirus-based
expression of shRNA
<400> 30
cgctgcagtt gccaacttgt caatgaattc aagagattca ttgacaagtt ggcaattttt 60
gatatctaga ca 72
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for cloning of mBest1 cDNA fragment
<400> 31
accttcaaca tcagcctaaa 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for cloning of mBest1 cDNA fragment
<400> 32
ctttctggtt tttctggttg 20
Claims (18)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 3 및 4로 이루어진 군에서 선택된 염기서열에 대한 shRNA를 유효성분으로 함유하는, 발작(epileptic seizures), 신경전달물질 유발 흥분 독성 (excitotoxicity), 허혈 (ischemia), 뇌졸중, 뇌출혈, 간질, 뇌 외상, 및 저산소증 (hypoxia)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 흥분성 신경전달물질 과다 방출에 의하여 유발되는 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
- 삭제
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- 삭제
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- 삭제
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