KR100927211B1

KR100927211B1 - 선천적 면역반응에 관여하는 초파리 폴리뉴클레오타이드 및그 용도

Info

Publication number: KR100927211B1
Application number: KR1020060084687A
Authority: KR
Inventors: 김영준; 하정실; 김려화; 심재원; 윤준선; 김병일; 이선민; 김지현
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2006-09-04
Filing date: 2006-09-04
Publication date: 2009-11-16
Also published as: KR20080021355A

Abstract

본 발명은 초파리를 모델로 한, 선천적 면역 반응에 관여하는 폴리뉴클레오타이드 및 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 항원으로 하는 항체, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 칩, 상기 DNA 칩을 포함하는 키트, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 이용한 면역반응 조절 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 규명된 선천적 면역반응에 관여하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 면역반응의 이상으로 인해 야기되는 수많은 질병에 대하여, 신규하거나 보다 향상된 치료방법 및 치료제의 개발은 물론, 후천적 면역 반응의 활성화를 유도하는 면역 활성 증강제의 개발에 사용될 수 있으며,대식작용 활성제 및 치료제의 표적으로도 활용될 수 있다. 아울러, 이러한 유전자의 규명은 대부분 선천적 면역만이 존재하는 다양한 해충의 방제에 유용하게 사용될 수 있는 친환경적 살충제 등의 개발을 위해서도 또한 유용하게 사용될 수 있다.

면역세포, 초파리, 면역반응, 항원, 항체, 마이크로어레이

Description

선천적 면역반응에 관여하는 초파리 폴리뉴클레오타이드 및 그 용도 {POLYNUCLEOTIDES RESPONSIBLE FOR INNATE IMMUNE RESPONSE IN DROSOPHILA AND USE THEREOF}

도 1은 선천적 면역반응에 관여하는 폴리펩타이드에 돌연변이가 발생한 초파리 돌연변이체 중에서, 곰팡이에 감염된 경우, 야생형 초파리(W118)와 비교하여 생존율이 50%이상 감소되는 16개 초파리 주에 대한 생존율을 보여주는 그래프(위) 및 상기 그래프를 수치로 나타낸 표(아래)이다. D0, D3 및 D6은 각각, 감염 시, 감염 후 3일 및 6일의 경과시점을 나타낸다.

도 2는 P-element가 제거된 초파리주 (precise excision line)를 제조한 후 이를 PCR(polymerase Chain Reaction)로 확인한 결과이다. 오른쪽의 그림은 PCR에 사용된 각 프라이머 세트의 위치를 P-element의 삽입 위치를 기준으로 도식적으로 나타낸 것이다. W는 야생형, M은 돌연변이체를 나타낸다

도 3은 본 발명에서 규명된 선천적 면역반응에 관여하는 폴리뉴클레오타이드가 결손된 초파리의 생체내에서의 식균작용을 분석한 결과 (In vivo Phagocytosis Assay)이다.

도 4는 본 발명에서 규명된 선천적 면역반응에 관여하는 폴리뉴클레오타이드가 결손된, 초파리 세포주에서의 식균작용을 분석한 결과 (In vitro Phagocytosis Assay)이다.

도 5는 본 발명에서 규명된 선천적 면역반응에 관여하는 폴리뉴클레오타이드가 결손된 초파리에서의 병원균 감염 후, 항균 펩타이드(AMP, Antimicrobial Peptide) 생성 정도를 분석한 결과이다.

본 발명은 일반적으로 분자생물학, 세포생물학 및 약학 분야에 속한다. 보다 특히, 본 발명은 초파리 (Drosophila melanogaster)를 모델로 하여, 선천적 면역반응에 관여하는 폴리뉴클레오타이드 및 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드, 및 상기 규명된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 이용한, 이들의 발현 또는 활성에 영향을 미치는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 상기 규명된 폴리뉴클레오타이드를 항원으로 하는 항체, DNA 칩 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

모든 생명체들은 외부로부터 침입하는 병원균 등의 이물질에 대하여 자신을 방어하기 위해 이들에 대하여 면역반응을 유도할 수 있는 면역체계를 가지고 있다. 이러한 면역 반응은 크게 선천적 면역 반응과 후천적 면역 반응으로 나눌 수 있으며, 이들 간의 주된 차이는 체내에 침입한 이물질을 인식하는 방법이다.

선천성 면역 반응은 최전방의 방어시스템으로서, 숙주세포에는 존재하지 않으나, 미생물을 포함하는 병원균 등의 이물질만이 갖는 특정의 공통 구조만을 선택 적으로 인식함으로써 유도 및 활성화되는 면역 반응이다. 반면, 후천성 면역 반응은 개별적 이물질 각각이 갖는 특정의 구조 등이 항원으로 작용하는 것으로, 이에 대하여 활성화된 면역반응을 일컫는 것이다.

선천적 면역반응에 있어, 이물질로서, 특히 병원성 미생물만이 가진 특정 구조를 병원균연관분자패턴 (pathogen-associated molecular pattern, PAMP)이라 하며, 대표적인 PAMP로는 그람음성 박테리아의 세포벽 성분인 LPS, 그람양성 박테리아의 세포벽 성분인 펩티도글리칸 (PGN), 곰팡이의 베타-1,3-글루칸 등의 당 성분, 바이러스의 CpG 단편구조, 및 박테리아의 플라젤린 (flagellin) 등이 있다. 일반적으로, 선천적 면역 반응은 후천적 면역 반응에 비해, 자기(self)와 비자기(non-self)에 대한 구별능력, 즉 이물질이 침입한 경우와 자기-항원과 같이 면역 반응을 필요로 하지 않는 경우와의 구별 능력이 부족하여, 이로 인해 자가면역 질환이 발생되기도 한다 (Janeway CA Jr, Medzhitov R., Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20:197-216, 2002). 한편, 최근 연구 결과에 의하면, 포유동물의 선천적 면역 반응이 후천적 면역반응에 관여하는 B-림포사이트 및 T 림포사이트의 항원 선택에 중요한 역할을 한다는 사실이 또한 보고되었다 (Turelli P. and Trono D., Science 307 (5712):1061-5, 2005)

이러한 면역체계의 이상/결핍은 수많은 질환의 발생/진행과 관련되어 있다는 것은 공지의 사실이며, 이는 크게 선천적 면역결핍증과 후천적 면역결핍증으로 나눌 수 있다.

선천적 면역결핍증은 면역에 관여하는 세포 구성성분의 결핍여부에 따라 다 시 B 세포 결핍증, T 세포 결핍증 및 복합면역결핍증 등으로 나눌 수 있다. 이들의 예로는 무감마글로블린 혈증, 저감마글로블린혈증 (B 세포결핍), 디죠오지(Digeorge syndrome) (T 세포 결핍증), 무표지림프증후군(bare lymphocyte syndrome) (이하 복합면역결핍증),　중증합병면역결핍증(SCID), 비스코트-올드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 세디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome)을 들 수 있다. 그 외 관련된 질환으로 자가면역 질환이 있으며, 이는 자기항체와 자가인식 T 세포의 생성 및 기능장애로 인한 것으로 생각되며, 이의 예로는 에디슨병, 그래이브병, 루마티스관절염, 쇼그렌증후군, 전신성홍반성낭창을 들 수 있다. 후천적 면역결핍증의 대표적인 예로는 레트로바이러스에 의해 유발되는 AIDS (acquired immunodeficiency syndrome)를 들 수 있다.

상기 선천적 면역결핍 질환의 통상적 치료법으로는 원인이 되는 유전자 자체를 정상 유전자로 대체하는 유전자 치료법, 이상이 있는 유전자의 기능을 보충하는 항체, 줄기세포 등을 이용한 세포치료법, 항미생물제를 사용한 치료법, 및 골수 이식법 등이 있다. 그러나 유전자 치료는 치료의 표적이 될 수 있는 유전자의 종류 및 수가 소수에 불과할 뿐 아니라, 임상 적용시는 실험동물에서와 달리, 그 효과가 작으며, 나아가 표적세포로의 특이적 전달이 어려운 단점으로 인해 극히 제한적으로만 사용되고 있으며, 그 외의 치료법 또한 치료효과가 낮고 부작용이 심하다는 단점이 있다.

이에, 선천적 면역반응 기전의 정확한 이해에 기반을 둔, 유전자치료의 활성화 및 이들 유전자의 기능을 조절/보충할 수 있는 약물의 개발을 위해 선천적 면역 에 관여하는 보다 많은 유전자의 규명이 시급한 실정이다. 아울러, 이러한 유전자의 규명은 대부분 선천적 면역만이 존재하는 다양한 해충의 방제에 사용될 수 있는 환경적으로 유용한 살충제 등의 개발을 위해서도 필요하다.

그러나, 현재, 선천적 면역반응에 관여하는 유전자를 종합적으로 규명하여 이의 발현 양상을 분석하고 이를 응용한 기술은 전무하다. 선천적 면역반응에 관여하는 유전자를 포함하는 다양한 요소에 대한 보다 깊은 이해는 선천적 면역반응의 이상으로 인해 야기되는 수많은 질병에 대한 신규하거나 보다 향상된 치료법 및 치료제의 개발을 가능하게 할 것이다.

이에, 본 발명은 초파리 시스템에 기반으로 하여 선천적 면역반응에 관여하는 폴리뉴클레오타이드를 규명하고, 상기 규명된 폴리뉴클레오타이드 및 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 이용하여, 이의 발현 또는 활성에 영향을 미치는 선천적 면역반응 조절 물질을 규명하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 나아가, 본 발명은 상기 규명된 폴리뉴클레오타이드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 항원으로 하는 항체, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 칩 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적 달성을 위해, 본 발명은,

(a) 진핵 세포를 후보물질과 접촉하는 단계;

(b) 상기 후보물질이 표 1a 및 1b 로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체에 의해 코딩되는 산물의 발현 또는 활성에 미치는 영향을 측정하는 단계를 포함하며,

상기 후보물질과 접촉하지 않은 진핵 세포에서의 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체 산물의 발현 또는 활성과 대비하여, 상기 후보물질과 접촉한 진핵 세포에서의 상기 폴리뉴클레오타이드 산물의 발현 또는 활성이 변화되는 경우에, 상기 후보물질이 면역반응 조절 물질인 것으로 판단되는 것을 특징으로 하는, 면역반응 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에서, 상기 진핵세포는 면역관련 세포인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태에서, 상기 면역관련 진핵세포는 초파리 유래인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태에서, 상기 초파리세포로서, 면역과 관련된 SL2, SL2*, Mbn-2 세포주를 포함하는 초파리세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태에서, 상기 초파리세포로서, 살아 있는 초파리에 위치한 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체 산물은 mRNA인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체 산물은 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태에서, 상기 mRNA는 mRNA의 농도 또는 전환율(turn over)로 발현이 측정되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 농도로 발현이 측정되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태에서, 상기 mRNA 농도는 정량적 RT-PCR, 마이크로어레이분석, 노던블롯 중 하나 이상을 사용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태에서, 상기 폴리펩타이드 농도는 웨스턴블롯 또는 ELISA를 사용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체 산물의 활성은 효소로서의 기능분석 또는 결합력 분석을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 CG7263, Spen, Jhi-21, Inv, CG12744, Pcl, Coro, shg, loco, Rab35, DDB1, Jumeau, Lmpt, Rab6, Trx-2 또는 CG7510, 또는 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 표 1 a 및 1b에 기재된 선천적 면역반 응 조절에 관여하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 딘편 또는 변이체를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 또다른 양태에서, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 항원으로 하는 항체를 제공한다.

본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명은 표 1a 및 1b의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체, 또는 이에 상보적인 서열을 프로브로서 포함하는 DNA 칩을 제공한다.

본 발명의 또다른 측면에서, 상기 DNA 칩, 및 상기 DNA 칩 상의 프로브와 혼성화된 시료를 탐지하기 위한 시료의 표지수단을 포함하는 면역반응 관련 폴리뉴클레오티드의 발현 양상 분석 키트를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

의약의 개발을 포함하는 많은 중요한 생물학적 발견이 초파리 및 다른 무척추동물의 연구를 통하여 이루어졌으며, 기타 진핵세포에서의 상응하는 발견을 가능하게 하였다. 예를 들면, 초파리의 배 발생에 관여하는 유전자의 규명(Nusslein-Volhard, C. and Wieschaus, E., Nature 287:795-801, 1980), 초기 세포사멸과 관련된 유전자의 규명 (White, K., Grether, M.E., Abrams, J.M., Young, L., Farrell, K., and Steller, H., Science 264:677-683, 1994), 및 신경계생성과 관 련된 기전의 규명 (Artavanis-Tsakonas, S., Muskavitch, M. A., and Yedvobnick, B., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:1977-1981, 1983)을 통하여 인간에서의 상응하는 유전자 및 그 기전의 연구가 이루어져 왔다.

선천적 면역반응의 연구에 있어서도, 초파리를 포함하는 몇몇 곤충의 면역체계에서 척추동물과 비교시 상당히 많은 유사점이 발견되면서, 곤충의 면역반응이 선천적 면역 반응연구의 좋은 모델로 사용되어 왔다. 곤충의 선천적 면역반응은 크게 체액성 방어 반응과 세포성 반응으로 나눌 수 있다.

세포성 면역반응은 곤충의 체내로 크기가 작은 외부 이물질, 예를 들어 박테리아나 진균 등이 들어온 경우 식균작용(phagocytosis)으로 이를 제거하거나, 진균의 균사나 기생충과 같이 세포보다 그 크기가 월등히 큰 이물질의 경우는 여러 개의 혈구세포가 주변을 완전히 둘러싸는 피포형성(encapsulation) 반응을 통하여 이물질을 제거한다. 이러한 초파리의 병원균 인식 경로는, 크게 그람양성균 또는 곰팡이를 인식하는 Toll 경로와, 그람음성균을 선택적으로 인식하는 Imd (immunodeficiency) 경로로 나누어진다. 전자가 활성화되면 드로소마이신(drosomycin) 등과 같은 항균 펩타이드가 분비되고, 후자의 경로가 활성화되면 어테신(Attachin) 및 디프테리신(diptericin) 등과 같은 항균 펩타이드가 분비되어 항균 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 한 구현예에서는 본 발명에서 규명된 폴리뉴클레오타이드의 결손 시, 상기 경로에서 통상적으로 활성화되는 항균 펩타이드의 발현 감소를 확인하였으며, 이는 본원 발명의 폴리뉴클레오타이드의 선천적 면역반응에의 직접적 관련성을 나타낸다 (도 5 참조).

일반적으로 밝혀진 사실에 의하면, Toll 경로에서, PGRP-SA (Peptidoglycan Recognition Protein)등에 의해 인식된 그람양성균은 Spatzle과 Persephone 단백질 등과 함께 Toll에 결합하게 된다. 결합된 Toll은 이어서 활성화되어, MyD88을 활성화 시키고, 이는 Tube, Pelle 단백질을 활성화한다. 이는 Cactus 단백질과 결합하고 있어 활성을 띠고 있지 않던 NF-kB의 한 종류인 Dif를 활성화시켜, 핵안으로 이동할 수 있게 하고, Dif는 드로소마이신(drosomycin)이라는 항균 펩타이드의 전사가 일어나게 한다. 한편, Imd의 일반적 경로는 다음과 같다. 세포막에 존재하는 수용체인 PGRP-LC에 의해 인식된 그람음성균은 PGRP-LC를 활성화하고, 이는 Imd의 활성을 유도한다. Imd는 Tak1과 Dredd를 각각 활성화하고, Tak1은 IKK를 활성화한다. 활성화된 IKK는 NK-kB의 한 종류인 Relish를 인산화시키고, 인산화된 Relish는 Dredd에 의해 잘려서 핵안으로 이동, 디프테리신(diptericin) 이라는 항균 펩타이드의 전사를 일으킨다.

이에, 본 발명자들은 진핵세포에서의 면역반응 기전을 연구하던 중, 대표적인 면역반응 유발 물질인 LPS 및 커드란을 면역반응 유발물질로 사용하여, 초파리 유전자의 마이크로어레이 분석을 통하여(실시예 1 참조) 선천적 면역반응과 관련되어 있을 것으로 판단되는 다양한 신규의 폴리뉴클레오타이드를 발견하였다.

따라서, 본 발명의 한 양태에서 본 발명은 선천적 면역반응과 연관된 신규한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체를 제공하며, 이를 하기 표 1a 및 1b에 열거한다.

상기 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 LPS 및 커드란에 반응하여, 50% 이상의 발현 변화를 나타낸다. 상기 표 1a 및 1b에서 제시한 모든 값들은 마이크로어레이의 해당 스팟에서 각 염료의 세기를 측정하여 처리군과 비처리군간의 비를 밑이 2인 로그로 변환한 값이다(실시예 참조). 표 1-a에서 LPS와 r-LPS 칼럼은 LPS의 처리 유무에 따른 SL2* 세포주에서의 유전자 발현의 변화 정도를 나타낸다. r-LPS는 마이크로어레이 실험시 염료 맞바꿈(dye swaping) 실험을 의미한다.

또한, 본 발명의 한 구현예에서는 본 발명에서 발견된 폴리뉴클레오타이드의 선천적 면역반응에 관련된 반응 경로와의 관련성을 확인하기 위하여, Imd 경로, STAT 경로, AP-1 경로에 관여하는 대표적인 유전자인, pgrp-lc, imd, jnk, stat, rel, dredd, p38a, p38b의 발현 결손에 따른 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 발현 변화를 관찰한 결과, 이들 경로에 관여하는 것임을 확인하였다. 상기 표 1a에서 pgrp-lc, imd, jnk, stat, rel, dredd, p38a, p38b 칼럼은 이들 각각의 유전자에 해당하는 이중가닥 RNA를 넣어줌으로써 세포내에서 RNAi (RNA interference, Taeil Kim, Nature Immunology, 6:211, 2005)가 유도된 세포주에 LPS를 처리했을 때 일어나는 상기 각 유전자 발현 변화의 양상을 보여준다. 상기 실험의 결과는 본 발명에서 발견된 폴리뉴클레오타이드가 LPS의 처리에 대응하여, 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만, 선천적 면역반응에 관련된 Imd, STAT, AP-1 경로 등의 반응 경로를 통해서 그 발현 양상이 조절되고 있음을 분명하게 나타낸다. 예를 들어, 초파리의 여러 항균 펩타이드 가운데 하나인 어테신 A (AttA)는 대장균 같은 그람음성 미생물 침입시 PGRP-LC, Imd, Rel 등의 순으로 이어지는 신호전달경로를 통해서 그 발현이 유도됨은 잘 알려진 사실이다 (Kwang-Min Choe et al., Science, 296:359-362, 2002). 상기 표 1a의 세 번째 열에 제시되어 있는 마이크로어레이 결과를 살펴보면, AttA는 LPS의 처리에 의해서 그 발현이 강하게 유도되지만 PGRP-LC, Imd, Rel가 RNAi에 의해서 결손될 경우 LPS를 처리하더라도 그 발현이 전혀 유도되지 않았음을 확인할 수 있다. 따라서, 이와 같은 결과는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드들이 초파리에서의 선천적 면역반응에 실질적으로 관여하고 있음을 보여주는 것이다.

표 1-b에서 curdlan과 r-curdlan 칼럼은 표 1-a에서와 마찬가지로 커드란의 처리 유무에 따른 SL2* 세포주의 유전자 발현 변화를 염료를 맞바꿔 가며 반복해서 확인한 결과이다. 표 1의 모든 clone ID는 Berkley Drosophila Genome Project(BDGP)의 cDNA clone에 관한 것으로, 이 clone ID는 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 GenBank database로부터 해당 유전자에 대한 유전자 정보 등을 찾는데 그대로 이용될 수 있으므로, 당업자라면, 이러한 ID 번호로 상기 데이터베이스를 조회하여 각 폴리뉴클레오타이드 서열을 용이하게 입수할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산 (핵산분자)"는 유전자를 포함하는 개념으로, 두 개 이상의 뉴클레오타이드가 연결된 분자를 의미하는 것으로 RNA, DNA를 모두 포함하는 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질, 또는 기능적 또는 구조적 RNA 분자를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 임의의 개수의 아미노산이 연결된 사슬을 의미하며, 글리코실화 또는 인산화와 같은 후 번역에 의해 변형된 것을 포함하는 것이다.

선천적 면역반응에 있어, 이물질로서, 특히 병원성 미생물만이 가진 특정 구조를 병원균연관분자패턴 (pathogen-associated molecular pattern, PAMP)이라 하며, 대표적인 PAMP로는 그람음성 박테리아의 세포벽 성분인 LPS, 그람양성 박테리아의 세포벽 성분인 펩티도글리칸 (PGN), 곰팡이의 커드란(베타-1,3-글루칸) 등의 당 성분, 바이러스의 CpG 단편구조, 및 박테리아의 프라제린 (flagellin) 등이 있다. 이들은 모두 초파리에서 선천적 면역반응을 유도할 수 있는 물질로서, 상술한 바대로, 이들 PAMP는 Toll 경로 또는 Imd 경로를 통한 항균 펩타이드 합성을 비롯한 여러 가지 선천적 면역반응을 유도한다. 본 발명에서 면역반응 유도 물질로 사용한 LPS 및 커드란은 가장 대표적인 PAMP로서 이에 의해 유도되는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 일반적인 선천적 면역반응에 의해 유발되는 폴리펩타이드를 가장 잘 대표할 수 있는 것으로 판단된다. 이들은 상술한 바대로 초파리에의 선천적 면역반응을 활성화하는 물질로서, 당업계에서 활발히 사용되는 것이며, 이에 의해 유도된 선천적 면역반응은 천연의 그람음성 박테리아, 혹은 곰팡이가 일으키는 선천적 면역반응과 다를 바 없음이 많은 연구 논문을 통해서 잘 알려져 있다 (예를 들어, LPS 관련: Miller SI et al., Nat Rev Microbiol.3(1):36-46, 2005 ; Ulevitch RJ et al., Vaccine 22 Suppl 1:S25-30, 2004.; Miyake K., Trends Microbiol.12(4):186-92, 2004; Curdlan 관련: Keiko Kataoka et al., J Biol Chem., 277(39):36825-36831, 2002; Gordon D. Brown et al., Immunity, 19:311-315, 2003 참조). 따라서, 당업자라면, 본 발명에서 발견된 폴리뉴클레오타이드는 선천적 면역반응관련 유전자를 가장 잘 대표할 것임을 이해할 수 있을 것이다.

상기 폴리뉴클레오타이드는, 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체를 포함하는 것으로서, 인간을 포함하는 다른 종의 세포에서 발견되는 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 표 1a 및 1b의 폴리뉴클레오타이드는 PAMP에 반응하여 mRNA 발현 수준에 50% 이상의 차이를 보인 것들로서, 당업자라면, 단백질 수준의 변화도 이에 상응할 수 있음을 이해할 것이다.

따라서, 본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드, 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "기능적으로 동등한 단편 또는 변이체"는 상기 표 1a 및 1b에 열거된 폴리뉴클레오타이드 또는 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 세포내에서의 생물학적 특성은 유지하지만, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 각각을 구성하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 서열 변이체 또는 상동체를 의미하는 것이다.

상기 폴리뉴클레오타이드의 서열 변이체 또는 상동체는 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어, 부위-유도성 돌연변이법(site-directed mutagenesis, Kramer, W. & Fritz, H-J. Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplux DNA. Methods in Enzymology 154:350-367, 1987) 등에 의해 제조될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 서열 변이체는 자연적으로도 발생한다.

폴리뉴클레오타이드의 서열 변이체는 폴리펩타이드를 구성하는 아미노산 서열 변이를 수반하거나 또는 수반하지 않을 수도 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드의 서열 변이가 아미노산의 변이를 수반하지 않는, 축중변이가 있으며, 이러한 축중변이체(degeneracy mutants)도 본 발명에 포함된다.

이러한 변이체 또는 상동체는 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 혼성화 기술(Southern, E.M., Journal of Molecular Biology, 98, 503, 1975)이나 PCR 방법(Saiki et al., Science, 230: 1350-1354, 1985; Saiki et al., Science, 239: 487-491, 1988)을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 당업자라면 상기 열거한 폴리뉴클레오타이드의 서열부터 이에 특이적으로 혼성화될 수 있는 프라이머를 고안하여 다양한 유래의 종 (예를 들면, 토끼, 마우스, 래트 및 인간 등)으로부터 이와 높은 상동성을 가지는 유전자를 분리할 수 있을 것이다. 이렇게 분리된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드는 아미노산 수준에 있어서, 원래의 폴리펩타이드와 높은 상동성을 갖는다. 높은 상동성이란 아미노산 서열 전체에서, 50% 이상, 특히 70% 이상, 보다 특히 90% 이상(예를 들어, 95% 이상)의 서열의 동일성을 가리킨다.

폴리펩타이드 서열이나 폴리뉴클레오타이드 서열의 상동성은 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993)에 기초하여 개발된 BLASTN 이나 BLASTX라 불리는 프로그램(Altschul et al, J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990)을 사용하여 분석될 수 있으며 구체적인 방법은 다음의 웹사이트에 공지되어 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

본 명세서에 사용된 용어“단편”은 폴리뉴클레오타이드 또는 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 일부에 해당하는 서열로서, 폴리뉴클레오타이드의 경우, 물리적, 엔도뉴클리에이즈 또는 화학적으로 절단한 것을 포함하며, 폴리펩타이드의 경우, 프로테이즈로 절단한 것이나, 화학적으로 절단한 것을 모두 포함한다. 나아가 폴리펩타이드의 경우, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 안전성, 저장성, 용해도 등의 변경을 위한 변이체, 또는 상호작용하는 다른 폴리펩타이드와의 상호작용의 변경을 위한 변이체도 상기 변이체에 포함된다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 이의 단편 또는 변이체는 본 발명의 목적 달성을 위해, 그 자체로 또는 벡터에 포함되어 사용될 수 있으며, 벡터로의 DNA 도입방법은 당업계에 공지되어 있다 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.,Sambrook and Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; Current Protocols in Molecular Biology Ausubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith and Stuhl eds, Greene Publ.Assoc., Wiley-Interscience,1992).

폴리뉴클레오타이드의 세포에서의 발현 및/또는 증폭에 사용되거나, 또는 다른 면에서는 세포의 염색체내로 도입 또는 염색체와 독립적으로 세포에 존재할 수 있는 다양한 벡터가 공지되어 있으며, 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 형태의 벡터, 또는 그 외 목적달성에 적합한 임의의 벡터를 포함한다. 나아가, 이러한 벡터는 세포표면에 수용체에 대한 리간드 또는 핵산결합 모이어티 (예를 들면 폴리리신 결합 부위) 등을 포함하는 (예를 들면, WO 93/04701에 기술된 것) 화학적 컨쥬게이트 벡터, 바이러스 벡터 (예를 들면, DNA 또는 RNA 바이러스), 도입된 단백질과 융합되어 발현되는 융합단백질 모이어티(예를 들면, 세포의 항원을 인식하는 항체 모이어티, 분리 및 검출의 용이성을 위한 Glutathione S-transferase 또는 형광단백질 모이어티)를 포함하는 융합 단백질발현 벡터를 포함하며, 목적에 적절한 벡터의 선택은 당업자에게 명확할 것이다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 공지의 유기화학적 방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 또한 목적하는 전장 길이의 서열을 얻기 위하여 단편으로 합성된 서열들을 서로 결합할 수 있다(The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1-9, Gross, Udenfriend and Meienhofer Ed. 1979-1987, Academic Press Inc.). 특히, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 이의 단편, 또는 변이체는 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 적당한 숙주세포에서 발현시킨 후 세포의 융해물(lysate)을 만들거나, 또는 그 mRNA를 시험관내에서 번역한 후, 당업계의 공지된 단백질 분리방법에 의해 정제할 수 있으며, 일반적인 유전자 재조합 기술 및 단백질 정제방법은 예를 들면 문헌 (Sambrook et al., Molecular Clonning: A Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al Ed., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1991)을 참조하면 된다. 이러한 본 발명의 폴리펩타이드는 예를 들면 정제된 단백질, 수용성 단백질, 또는 표적 세포로의 전달 또는 투여를 위해 담체에 결합된 형태의 단백질 또는 아미노산 잔기와 융합된 형태의 것을 포함하는 것이다.

또 다른 양태에서 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체를 항원으로 하여 생산된 항체를 제공한다. 본 발명의 이러한 항체는 당업계에 공지된 표준 면역화학분석방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴블롯, 및 조직 염색 및 기타 항원에 특이적 항체를 이용하는 기타 방법에 유용하게 사용될 수 있다 (예를 들면 Sambrook et al, ibid; Current Protocols in Molecular Biology, ibid ).

본 발명의 항체는 표 1a 및 1b의 폴리뉴클레오타이드, 이의 단편, 또는 변이체에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 에피토프로 하여 생산된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 포함한다.

폴리클로날 항체는 기술분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 예를 들면 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 항원조성물을 동물에게 투여한 후, 이 동물의 혈청을 수집하여 제조될 수 있다. 다양한 종류의 동물을 이러한 항체생산에 사용될 수 있으며, 전형적으로, 비인간 포유류인 토끼, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지 또는 말이 사용된다. 토끼의 경우, 혈액의 양이 많아 항체생산에 바람직한 동물이다.

항원조성물은 면역원성에 따라 다양한 특성을 가질 수 있다. 통상적으로 숙주의 면역원성을 증강시키기(boost)하기 위하여 폴리펩타이드를 담체와 함께 사용할 수 있다. 예를 들면, 전형적으로, 키홀림펫해모시아닌(Keyhole limpet hemocyanin, KLH) 및 소태아혈청(Bovine serum albumin, BSA)이 사용되며, 그 외 알부민으로서, 난알부민, 마우스혈청알부민, 또는 토끼 혈청알부민이 또한 사용될 수 있다. 담체와 폴리펩타이드의 컨쥬게이트는 공지된 기술분야의 표준기술을 사용하여 만들 수 있으며, 예를 들면, 글루타알데하이드, 카르보이미드 등을 사용하여 만들 수 있다.

항체의 생산에 사용되는 항원조성물의 양은 면역원성물질의 종류/특성 및 사용하는 동물에 따라 달라질 수 있다. 항원조성물을 다양한 투여 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들면, 피하주사, 근육주사, 정맥 및 복강주사를 포함한다. 폴리클로날 항체의 생산은, 항원조성물 투여 후 다양한 시점에서 혈액을 채취하여, 항체의 생산을 모니터링 할 수 있으며, 항체생산의 부스터로서, 항원조성물을 추가로 투여를 할 수 있다.

모노클로날 항체는 예를 들면 미국특허 제4,196,265호를 참조하여, 기술분야의 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 모노클로날 항체 제조기술에서, 면역원성 조성물, 예를 들면 정제 또는 부분적으로 정제된 폴리펩타이드를 동물에게 투여한다. 면역원성 조성물은 사용하는 동물에 따라 항체의 생산을 최대로 할 수 있는 경로로 투여된다. 래트 또는 마우스와 같은 설취류의 사용이 바람직하나, 이로 제한 하는 것은 아니다. 고수율의 안정된 융합이 가능한 BALB/c 마우스가 특히 바람직하다.

면역화 후에, 항체생산 가능성이 있는 체세포, 특히 B-림포사이트(B-세포)를 선별한다. 상기 세포는 지라, 편도선 또는 림프절, 또는 말초혈액에서도 채취가능하다. 특히, 지라는 세포의 수가 풍부하고, 말초혈액은 접근성이 우수한 장점이 있어 바람직하다.

이어서, 상기 채취한 B-세포를 무한증식성 골수종 세포와 융합시킨다. 골수종세포는 비항체생산 세포로서, 융합이 용이하며, 융합된 세포만의 성장을 가능할 수 있도록, 특정 배지에서는 성장할 수 없는 특성을 가진다. 세포의 융합효율은 대체적으로 낮은 편이지만, 특정 배지에서의 성장이 가능하기 때문에 선별이 용이하다. 선별된 융합세포인, 하이브리도마를 단계희석하여, 단일세포 유래의 모노클로날 항체생산 세포주를 만든다. 생선된 세포주는 동물에 주사하여, 종양생성 및 항체생성 여부를 확인하고, 적합한 경우, 세포배양을 하여, 배양물 중의 배지로 분비되는 항체를 수집한다. 수집한 항체는 목적에 따라. 여과, 농축, 크로마토그래피를 사용한 다양한 분리방법을 사용하여 정제될 수 있다.

상기와 같이 제조된 폴리 또는 모노클로날 항체는 다양한 구현예에 사용될 수 있다. 예를 들면, 다른 종에서 선천적 면역과 관련된, 유사한 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 또는 cDNA 클로닝에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 폴리펩타이드의 분리 정제에도 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 예를 들면, 시간의 경과 또는 특정 물질에 반응하여 변화하는, 본 발명의 폴리펩타이드의 조직 특이적, 분포 분석을 위한 면역화학염색방법에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 살충 조성물 중의 한 성분으로서 포함되어, 곤충의 체내에서의 면역반응 불활성화를 통한 살충 유효성분으로서 사용될 수 있다.

또 다른 양태에서 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체, 또는 이에 상보적인 서열을 프로브로서 포함하는 DNA 칩을 제공한다.

DNA 칩의 제조공정은 기술분야에 주지되어 있으며, 이러한 기술분야에 공지된 표준방법을 사용하여 제조될 수 있다 (Cheung VG et al, Nat Genet., 21(1 Suppl):15-19, 1999). 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 대표할 수 있는 그 일부 서열로 구성되는 서열의 5’말단에 아민이 결합된 DNA 프로브를 제작하는 공정; 상기 제작된 DNA 프로브를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 결합시키는 공정; 및 상기 DNA 프로브가 결합된 고체표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시키는 공정을 포함한다. 이를 상세히 단계별로 나누어 설명하면 다음과 같다.

제 1 공정: 프로브의 제작

폴리뉴클레오타이드를 대표하는 서열 또는 해당 유전자 전체를 공지된 바대로 PCR(Polymerase Chain Reaction) 등의 방법으로 증폭하여 사용하며, 이의 5’말단에 염기서열이 고체의 표면에 결합될 수 있도록 아민이 결합된 DNA 프로브를 제작한다.

제 2 공정: 프로브의 고정화

상기 제작된 DNA 프로브를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 결합시킨다. 이때, 고체는 특별히 제한되는 것은 아니나, 유리인 것이 바람직하고, 고체 표면의 알데히드는 이 분야에서 알려진 방법, 즉 프로브의 5’말단에 결합된 아민과 30 내지 40℃의 온도 조건 그리고 70 내지 100%의 습도조건에서 시프염기반응(Schiffs base reaction)을 수행하여 고체표면에 프로브를 결합시킨다.

제 3 공정: DNA 칩의 제조

전기 프로브가 결합된 고체표면에 존재하는 아민과 결합하지 않은 알데히드를 환원시켜서, DNA 칩을 제조한다. 이때, 알데히드의 환원조건이 특별히 제한되는 것은 아니나, NaBH₄ 등의 환원제를 사용함이 바람직하다.

상기와 같이 제조된 DNA 칩은 다양한 응용분야에 사용될 수 있다. 예를 들면, 시료로부터 채취한 RNA를 cDNA로 역전사한 후 이를 PCR 방법으로 증폭하고, 표지를 부착한 후 DNA 칩에 표준의 방법대로 혼성화하여, 예를 들면, 선천적 면역과정에 관여하는 특정 물질 또는 특정 환경에 반응하여 변화하는 다수 유전자의 활성 및 발현 양상을 분석할 수 있다.

칩의 분석에 사용되는 핵산(nucleic acids)은 당업계에 공지되어 있으며, 이러한 방법을 사용하여 증폭 및 표지 될 수 있다(EP1553189; van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D. and Eberwine, J. H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1663-1667, 1990; Wang, E., Miller, L. D., Ohnmacht, G. A., Liu, E. T. and Marincola, F. M. Nature Biotechnol. 18:457-459, 2000; Smith, L., Underhill, P., Pritchard, C., Tymowska-Lalanne, Z., Abdul-Hussein, S., Hilton, H., Winchester, L., Williams, D., Freeman, T., Webb, S. and Greenfield, A. Nucleic Acids Res. 31, E9, 2003 등 참조).

핵산의 표지에 사용하는 염색물질로는 Cy5, 바이오틴 결합 화합물, Cy3, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 또는 텍사스 레드(Texas red) 등을 포함하나, 이로 한정하는 것은 아니다. 바람직하게는 Cy5 및 바이오틴-결합 물질이 사용된다. 표지물질의 검출수단으로, 예를 들면 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner)를 사용하여 스캐닝하여 이미지를 읽은 후, 다양한 분석 소프트웨어, 예를 들면, National Cancer Institute의 BRB ARRAY TOOL 버전 3.0 소프트웨어 등을 사용하여 수집한 데이터를 분석한다.

본 발명의 또다른 양태에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 이용한 칩은 선천적 면역관련 유전자의 발현양상 분석에 사용될 수 있음은 물론, 예를 들어 특정 유전자의 발현을 RNAi등의 방법을 사용하여 억제시킨 후, 억제되지 않은 세포와 비교를 해보면, 특정 유전자와 연관된 다른 유전자들의 발현양상 분석을 통하여, 유전자간의 상호작용 분석에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 칩, 상기 DNA 칩 상의 프로브와 혼성화된 증폭된 DNA를 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 선천적 면역반응 분석 키트를 제공한다.

상기 키트는 분석될 세포 또는 조직 유래의 다양한 시료로부터, 예를 들면, 총 RNA, mRNA, cRNA, cDNA 또는 gDNA를 공지의 방법대로 추출 또는 제조하여 그 자체로 또는 이를 PCR 또는 다양한 선형 증폭 방법 (예를 들면, WO 2002/072772; US6,251,639B1; WO 2006/033487; 또는 Low RNA input Linear Amplification kit from Agilent, TrueLabeling-AMP^TM Linear RNA Amplification kit from Superarray을 사용한 방법)을 사용하여 증폭한 후 칩 상의 프로브와의 혼성화에 사용될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 상기 칩은 시료의 증폭에 필요한 수단, 예를 들면 프라이머, 폴리머라제(RNA, DNA 중합효소, 역전사 효소, Taq 등)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트에 사용될 수 있는 표지 수단 및 염료에 관하여는 상기 칩과 관련한 기술을 참조하면 된다.

다른 측면에서, 본 발명은 선천적 면역반응 조절 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 진핵 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 후보물질이 표 1a 및 표1b로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체에 의해 코딩되는 산물의 발현 또는 활성에 미치는 영향을 측정하는 단계를 포함하며,

상기 후보물질과 접촉하지 않은 진핵 세포에서의 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체 산물의 발현 또는 활성과 대비한, 상기 후보물질과 접촉한 진핵 세포에서의 상기 폴리뉴클레오타이드 산물의 발현 또는 활성의 변화는 상기 후보물질이 면역반응 조절 물질임을 나타내는 것을 특징으로 하는, 면역반응 조절 물질의 스크리닝 방법인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 다양한 스크리닝 기술에 접목되어 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 후보물질 라이브러리의 스크리닝을 위한 고용량(high-throughput) 스크리닝 방법, 또는 특정 부류의 화합물만을 포함하는, 특정 군의 화합물에 초점을 맞춘 스크리닝 방법 등에 적용될 수 있다. 나아가, 이러한 스크리닝 방법은 세포를 사용 또는 사용하지 않은 시스템, 시험관내 분석, 생체내 분석 등을 포함하는 기술분야의 공지된 분석방법에 적용될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 상기 진핵 세포는 면역관련 세포이며, 특히 초파리 유래의 면역기원세포이나 다른 종 유래의 진핵 세포의 사용을 배제하는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용된 용어 "면역관련 세포"란 당업계에서 널리 사용되는 용어로서, 특정 또는 불특정 다수의 항원에 반응하여 체액성 또는 세포성 면역반응을 유발할 수 있는 세포를 일컫는 것이다. 상기 초파리 세포는 시험관내 배양되는 세포 또는 초파리 자체에 위치하는 세포를 모두 포함하는 것으로, 이러한 세포를 이용하여, 시험관내 또는 생체내 분석이 가능하다. 상기 세포는 특히, 면역관련 세포, 예를 들면 당업계에 널리 알려진 SL2, SL2* 및 mbn-2 세포 등 (Schneider I. J. Embrylol Exp Morphol., 27(2):353-65, 1972; Jean-Luc Dimarcq et al., Insect Biochem. Molec. Biol., 27(10):877-886, 1997) 이 사용될 수 있으나, 기타 면역세포의 사용을 배제하는 것은 아니다.

선천적 면역반응의 변화를 유도하여 이를 조절할 수 있는 후보 물질은 개체의 이물질에 대한 면역반응을 상향 또는 상승, 또는 하향 또는 억제할 수 있는 천연 또는 합성의 화합물을 의미한다. 천연물질은 기원에 따라, 동물, 박테리아, 곰팡이, 식물, 해양생물 등 다양한 유래의 화합물을 포함한다. 나아가, 상기 후보 물질은 선천적 면역반응을 조절할 수 있는 물질로서, 핵산(예를 들면, 안티센스 RNA 분자, 리보자임, 올리고뉴클레오타이드 등), 다양한 길이의 폴리펩타이드, 펩디드모방체(peptidomimetics), 소분자(small molecule), 항체 등을 포함한다. 상기 후보물질은 다양한 구입처로부터 구입할 수 있으며, 소분자의 경우, 조합성(combinatorial library) 라이브러리를 사용할 수 있으며, 라이브러리의 스크리닝은 다수의 연관된 물질의 활성의 검색에 유용한 방법이다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 규명된 화합물은 핵산, 다양한 길이의 폴리펩타이드, 소분자 등을 포함한다.

상기 후보 물질은 표 1a 및 1b에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 산물의 발현 또는 활성에 대한 영향을 평가하여 선별된다. 이러한 발현 또는 활성에 대한 평가는 당업계의 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 진핵 세포를 후보 물질로 처리한 후, 예를 들면, 상기 세포에서 추출한 mRNA, 또는 단백질의 발현 변화를 전자는 PCR, 노던블롯, 실시간 정량 PCR, 마이크로어레이 분석 등을 사용하여, 후자의 경우는 웨스턴블롯, ELISA(Emzyme Linked ImmunoSorbent Assay), 마이크로어레이 분석 등을 사용하여 달성될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드 산물의 발현 또는 활성의 변화를 측정하는 것으로, 상기 변화는 발현 또는 활성의 상승 또는 억제를 모두 포함하는 것으로 해석된다. 상기 상승 및 억제에 수반되는 변화는 대조군과 비교하여, 활성 또는 발현의 변화가, 10%이상, 특히 20% 이상, 더욱 특히는 30% 이상, 더더욱 특히는 40% 이상, 가장 특히는 50% 이상을 일컫는 것이다. 본 발명의 한 구현예에서, 결손 시 면역반응의 저하로 인하여, 곰팡이 감염에 대한 생존률을 50% 이상 감소시키는 유전자는 CG7263, Spen, Jhi-21, Inv, CG12744, Pcl, Coro, shg, loco, Rab35, DDB1, Jumeau, Lmpt, Rab6, Trx-2 또는 CG7510, 또는 이의 기능적으로 동등한 단편 또는 변이체를 포함하나, 이로 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 폴리뉴클레오타이드 산물은 mRNA 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 산물의 활성의 측정은 단백질 또는 기능적 RNA의 효소로서의 기능, 예를 들면, 촉매로서의 기능분석 또는 이들의, 예를 들면, 리간드, 핵산 또는 폴리펩타이드에의 결합활성을 공지의 방법대로 측정하여 달성될 수 있다 (Doudna, J. A., and T.R.Cech., Nature 418:222-228, 2002). 본 발명의 한 구현예에서, 상기 mRNA의 폴리뉴클레오타이드 발현은 mRNA의 농도 또는 전환율(turn over), 예를 들면 반감기로 측정되며, 상기 폴리펩타이드의 발현은 단백질의 농도로 측정된다. 상기 mRNA 농도 및 전환율 (Moore, M. J., Cell 108: 431-434, 2002)측정은 기술분야에 공지된 방법, 예를 들면, 정량적 RT-PCR (Reverse Transcription PCR), 마이크로어레이분석, 및 노던블롯 중 하나 이상을 사용하여 수행될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다 (Kotewicz ML., D'Alessio JM., Driftmier KM., Blodgett KP and Gerard GF. Gene 35: 249, 1985); Kim T., Yoon J., Cho H., Lee WB., Kim J., Song YH., Kim SN., Yoon JH., Kim-Ha J., Kim YJ. Nat Immunol, 6(2):211-8, 2005; 및 Irwin N., Janssen KA. Molecular Cloning, 3rd edition, 2001 등 참조) 상기 단백질 농도 측정은 기술분야에 공지된 방법, 예를 들면, 웨스턴블롯 및/또는 ELISA 방법을 사용하여 수행될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

다음은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 좀 더 상세하게 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 초파리 면역반응에 관여하는 폴리뉴클레오타이드의 규명 및 상기 폴리뉴클레오타이드가 결손된 돌연변이 초파리주 선정

A. 선천적 면역반응 관련 폴리뉴클레오타이드의 규명

Imd 경로와 Toll 경로로 대표되는 초파리 선천적 면역반응에 관여하는 유전자군을 찾기 위하여 5,405개의 상이한 유전자를 대표하는 5,925개의 초파리 유래 cDNA를 포함하는 디지털지노믹스(서울, 한국)의 6K twin array cDNA 칩을 사용하여, 실질적으로 제조자의 사용방법에 따라 마이크로어레이 실험을 수행하였다.

요약하면, 초파리 배(embryo) 유래의 Schneider's Drosophila line2 (SL2*) 세포주 (American Type Culture Collection, CRL-1963; 배양조건 - Schneider's Drosophila Medium 90%, heat-inactivated fetal bovine serum 10%, 24℃, no CO₂)에 면역 유도 물질인 LPS (리포폴리사카라이드) 또는 커드란 (베타-1,3-글루칸) 을 10㎍/ml의 농도로 1시간 동안 처리해준 후 RNA를 분리하여 Cy-5 염료로 표지하고, 음성대조군으로서, 처리하지 않은 SL2* 세포주에서 분리한 RNA는 Cy-3 염료로 표지한 후, 이들을 상기 6K 칩에 경쟁적으로 혼성화 시킨 후, 다음과 같이 결과를 분석하였다.

트윈칩 (같은 세트의 유전자가 두 번 심어져 있는 DNA 칩)과 염료 맞바꿈(Dye swaping) 실험으로부터 각각의 면역 유도 물질당 4개 세트의 마이크로어레이 데이터를 얻어서 이들을 제조자의 방법에 따라 one-class response format의 SAM (significance analysis of microarrays)으로 분석하였다. 상기 각 물질에 대하여 유의성 있는 발현의 변화를 나타낸 것으로서, 5%의 q value를 차단값 (cutoff)로 하여 발현에 있어 1.5배 이상 상승되거나 억제된 유전자를 선택하였다.

단, LPS 반응 실험의 경우는, 상기와 같은 정상의 SL2* 세포주를 사용한 것 이외에, Imd 경로상의 중요한 유전자들 각각이 RNAi(RNA interference, 실시예 5의 방법, Taeil Kim, Nature Immunology, 6:211, 2005 참조) 방법에 의해 결손된 SL2* 세포주를 사용하여 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. LPS를 처리한 후 추출한 RNA 및 대조군으로서 루시퍼라제(luciferase) 유전자를 RNAi 방법으로 결손시킨 SL2* 세포주에 LPS를 처리한 후 추출한 RNA를 상기와 동일한 칩에 경쟁적으로 혼성화시킨 후 결과를 분석하였다.

수득한 마이크로어레이 칩 데이터를 National Cancer Institute의 BRB ARRAY TOOL 버전 3.0 소프트웨어를 사용하여 계층적 클러스터링 방법으로 종합적으로 분석하였다(RNAi 타겟 유전자는 표 1 참조). 분석 결과, LPS 반응 폴리뉴클레오타이드들의 경우 그 신호전달경로에 있어서 중요한 유전자인 pgrp-lc, imd, jnk, stat, rel, dredd, p38a, p38b에 각각에 의해 혹은 중첩적으로 영향을 받는 폴리뉴클레오타이드들이 총 242개로, 커드란에 반응하는 유전자들의 경우 이의 신호전달경로에 중요하다고 알려진 유전자들에 대한 RNAi 실험을 배제한 상황에서 발현이 단순히 상승되거나 억제되는 유전자들이 총 387개로 나타났다. 자세한 유전자 리스트는 상기 표 1a 및 표 1b에 기재한 바와 같다.

B. 상기 규명된 유전자가 결손된 초파리 주의 선별

위 실험을 통해서 얻은 유전자 리스트를 토대로, 제넥셀(Genexel)(대전, 한국)의 제니시스 데이터베이스 (http://www.genexel.com/02_bio/genis01.php)를 검색하여 EP-element가 삽입되어 있는 초파리(Drosophila melanogaster) 라이브러리 중 특정 유전자의 특정 위치에 P-element를 갖고 있는 초파리주를 선별하였다. 자세한 선별 과정은 아래와 같다.

우선, LPS와 커드란에 의해서 유의성 있는 발현 수준의 변화를 나타낸 각 폴리펩타이드들의 CG(Computed Gene)넘버를 질의어로 사용하여 제니시스 데이터베이스를 탐색하였다. 이때 해당 유전자 부위에 P-element가 삽입되어 있는 초파리 라인의 존재가 확인되면 flybase (http://flybase.bio.indiana.edu/)의 해당 유전자에 대한 유전체의 서열과 비교하여, 정확한 삽입위치를 확인하였다. 이러한 방식으로, 해당 유전자의 5' UTR (untranslated region, 비코딩영역) 또는 CDS (coding sequence, 코딩영역)에 P-element가 삽입되어 있는 초파리주를 선별하였다. 위의 조건을 만족시키는 초파리 주가 복수로 존재할 경우는, 필요에 따라 Gal4 드라이버로 해당 유전자의 과발현 효과 측정이 가능한 5' UTR에 P-element가 삽입되어 있는 주를 우선적으로 선별하였다. 그외, 3' UTR이나 인트론에 P-element가 삽입되어 있는 초파리 주들은 그 삽입에 의한 유전자의 결손(knock-down) 효과가 충분하지 않을 것으로 예상되어 선택에서 제외하였다.

각각의 유전자에 대하여 상기의 조건을 토대로 선별된, P-element가 삽입된 초파리 주를 탐색한 결과, LPS에 반응하는 247개의 유전자 중 64개, 커드란에 반응하는 387개의 유전자 중 104개의 상이한 유전자에 P-element가 삽입되어 있는 초파리 주들을 선택할 수 있었으며, 이를 이후의 인젝션 스크리닝에서 사용하였다. 자세한 초파리 라인의 정보는 하기 표 2와 같다.

LPS 반응 폴리뉴클레오타이드에 대한 P-element 삽입 초파리주
명칭	돌연변이 초파리주
A	GE10629
betaggt-II	GE11329
CG2803	GE11356
CG11242	GE12121
Dap160	GE12746
Spir	GE12916
CG10916	GE12966
Rab6	GE13031
CG10376	GE13244
Cdk4	GE13908
CG6860	GE13920
CG8445	GE14545
Cysteine proteinase-1	GE14676
Trx-2	GE14911
CG17019	GE15010
CycE	GE15032
Rab14	GE15354
Sktl	GE15474
CG18445	GE15548
Imd	GE15713
CG12065	GE1665
CG10973	GE20174
l(3)05822	GE20465
Psa	GE20505
String	GE20632
CG7816	GE20868
BcDNA:GH11973	GE21628
Pak3	GE21734
RhoL	GE22072
Darkener of apricot	GE22556
CG8485	GE23555
Mo25	GE23606
AnnIX	GE23783
CG17273	GE24452
CG32380	GE24706
CG9796	GE24851
CG12004	GE25730
PGRP-LF	GE25940
Cortactin	GE26277
cher	GE26571
CG7510	GE26605
Ack	GE26763
Syx1A	GE26822
Ncd	GE26827
CG9139	GE27081
CG7546	GE27337
Lmpt	GE27535
jumeau	GE27806
CG31216	GE28314
DDB1	GE28589
Syx13	GE28721
Calpain-B	GE28771
CG32479	GE29824
CG17723	GE30117
CG9086	GE3015
endoA	GE30275
CG6454	GE31915
orb	GE32120
period	GE3236
flap wing	GE3638
Fimbrin	GE4612
NetB	GE4922
Ptp4E	GE5196
Trxr-1	GE8513

커드란 반응 유전자에 대한 P-element 삽입 초파리주
명칭	돌연변이주
CG2264	GE10107
CG6181	GE10187
spen	GE10359
CG2790	GE10412
Liprin-alpha	GE10464
px	GE10466
inv	GE10665
AGO1	GE10983
CG31731	GE11069
Sin3A	GE11260
CycB	GE11269
shot	GE11785
B4	GE11847
CG10249	GE12377
CG30372	GE12559
CG5004	GE1276
wun	GE12763
CG32529	GE1283
CG5543	GE12862
cnk	GE13177
CG12744	GE13306
CG6860	GE13736
shg	GE13814
sbb	GE13841
CG8079	GE13917
pcs	GE14175
CG1440	GE1457
Prosap	GE14702
Myo31DF	GE14771
CG12238	GE1493
Prosbeta5	GE14932
CG7263	GE14994
JhI-21	GE15185
olf186-F	GE15261
Pcl	GE15295
Fs(2)Ket	GE15496
coro	GE15547
da	GE15558
CG3800	GE15642
Cas	GE15792
CG8677	GE16082
CG10444	GE16394
CG5036	GE16639
CG4119	GE1666
MAPk-Ak2	GE1680
lethal (2) 35Df	GE16991
CG5742	GE17167
Adk2	GE17716
CG3829	GE18501
kuz	GE18574
Aats-glupro	GE20332
CG31037	GE20468
CG31163	GE21205
ssh	GE21467
mbc	GE21710
Dl	GE21750
RpS3	GE21971
endoA	GE22171
Gef64C	GE22464
blot	GE22641
trio	GE23171
ttk	GE23411
CG13610	GE23479
Myo61F	GE23557
CG7971	GE23564
CG7752	GE23983
awd	GE24086
ImpL2	GE24463
CG6833	GE24544
CG32697	GE2477
loco	GE24954
CG7946	GE25187
GlcAT-P	GE25459
sqd	GE25546
zfh1	GE25783
CG17383	GE25859
CG1841	GE2680
CG32702	GE2696
CG3308	GE27064
CG7879	GE27632
CG1090	GE28008
Trc8	GE28803
CG6325	GE29021
CG5916	GE29383
CG17090	GE29453
Rep2	GE29902
vib	GE29940
CG6204	GE31890
Ubc-E2H	GE3206
Fas1	GE32201
Ranbp21	GE353
mbt	GE3935
Mer	GE3945
sesB	GE4009
CG6227	GE4262
CG12204	GE43
norpA	GE4305
su(w[a])	GE4328
sqh	GE4507
Rab35	GE5258
Flo-2	GE672
Dsor1	GE8094
elav	GE8483
Ntf-2	GE8561

상기 표 2에서 명칭 칼럼은 각 폴리펩타이드의 약어를 나타내고, 돌연변이주 칼럼은 해당 폴리뉴클레오타이드에 P-element가 삽입되어 있는 초파리주의 고유번호를 나타낸다. 이 라인 번호들은 제넥셀의 P-element 삽입 초파리주 라이브러리에서 유래한 것이다.

실시예 2 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 결손이 곰팡이 감염에 의한 생존율에 미치는 영향

병원균 감염 시 초파리의 생존율의 변화 측정은 복합적인 현상이 관여하는 면역반응의 정상적 기능여부를 종합적으로 측정할 수 있는 척도이다. 따라서, 실시예 1에서 선별된 초파리를 사용하여, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 결손이 초파리의 생존율에 미치는 영향을 조사하여, 이들의 선천적 면역반응 관여 여부를 확인하였다.

실시예 1에서 선별된 초파리는, 초파리의 사육(배양)에 통상적으로 사용되는 옥수수 전분, 한천, 설탕, 이스트 추출물을 포함하는 배지를 바이알이나 병에 넣어서 25℃의 온도와 70% 습도를 유지하는 초파리 배양실에서 배양하였다.

초파리의 감염에 사용할 곰팡이 균주로서는 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana)를 사용하였다. 상기 곰팡이는 리터당 덱스트로스 10g, 펩톤 2.5g, 이스트추출물 5g이 들어있는 배지를 사용하여, 25℃, 250rpm에서 교반하면서 36시간 동안 배양하였다. 배양된 곰팡이는 원심분리 후 일정한 농도로 농축하여 사용하였다. 초파리에 병원균을 감염시키기 위하여 상기 농축한 곰팡이를 수지침에 묻힌 후, 현미경을 이용하여 초파리 다리에 상처를 내면서 동시에 곰팡이를 멸균상태에서 감염시켰다. 외부병원균에 대한 저항성은 개체간 차이가 있으므로 각 돌연변이 라인에 대하여 각각 30마리씩의 야생형 초파리 W¹¹¹⁸를 대조군으로서 사용하여, 동일한 방법으로 멸균상태에서 곰팡이로 감염시켰다. 상기 감염된 초파리를 새로운 vi바이알에 옮긴 후, 3일 간격으로 살아남은 개체 수를 세고, 초파리가 배지에 빠져 죽는 것을 막하기 위하여 새로운 바이알로 옮겨주었다.

이런 방법으로 모두 169개의 돌연변이 초파리를 스크리닝한 결과 본원 발명의 폴리뉴클레오타이드가 결손된 대부분의 초파리 주에서 생존율 감소가 관찰되었으며, W¹¹¹⁸과 비교하여 특히 생존율이 50%이상 감소되는 초파리주을 분석한 결과 (3번 이상의 독립적인 곰팡이 감염 결과를 평균한 수치), 이들 초파리주가 16개 유전자, CG7263, Spen, JhI-21, Inv, CG12744, Pcl, Coro, shg, loco, Rab35, DDB1, Jumeau, Lmpt, Rab6, Trx-2 및 CG7510에 대한 돌연변이를 갖고 있는 것을 확인하였으며, 결과는 도 1에 나타내었다. 그 외의 본원 발명의 폴리뉴클레오타이드의 경우, 50% 미만의 생존률 감소를 나타내었으며, 이도 선천적 면역반응 조절에 관여하는 것으로서, 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 결과는 16개 유전자가, 50% 미만의 생존율 감소를 나타내는 본 발명에서 발견된 다른 유전자와 비교하여, 곰팡이 감염에 의한 선천적 면역반응에 특히 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.

실시예 3 P-element가 제거된 초파리 주 (excision line)의 제조

실시예 1 및 2에서 선별 및 사용된 제넥셀의 돌연변이 초파리는 P-element가 삽입된 돌연변이체이므로 특정 유전자의 발현 수준이 정상적인 초파리에 비하여 낮은 편이어서 곰팡이 같은 병원균에 감염되었을 때 생존률이 현저하게 감소될 수 있다. 따라서, 상기 실시예 2에서 관찰한 생존율 저하 현상이 P-element에 의한 특정유전자 발현이 감소 되어서인지 혹은 염색체상의 다른 부위의 제2 돌연변이에 의한 것인지 여부를 확인하기 위하여 유전자전위효소(transposase)를 이용하여 상기 16개 돌연변이체에 대하여, 이에 포함된 P-element를 다른 부위로 이동시켰다 (J Kim-Ha, J Kim and YJ Kim, Mol. Cell. Biol., 19:2505-2514, 1999).

P-element에는 빨간 눈을 갖게 하는 white gene이 있어서 P-element가 정확하게 빠져나갈 경우, 초파리의 표현형이 야생형과 같이 다시 흰눈이 된다.

유전자전위효소 처리 후, P-element가 완전히 제거된 복귀돌연변이체(revertant)를 찾기 위하여 유전자전위효소로 처리된 각 초파리에서 유전체 DNA(genomic DNA, gDNA)를 추출하여 PCR을 수행하였다. gDNA 추출은 10마리의 초파리를 1.5ml의 에펜돌프튜브에 넣고 완충액 E (10% Sucrose, 10mM Tris-Cl pH8.0, 1mM CaCl₂) 0.5ml를 넣어준 후 작은공이(pestle)로 곱게 갈은 후, 이를 유리솜을 넣은 1ml 주사기에 통과시켜 시료의 파편찌거기를 제거하였다. 이어 상기 시료를 실온에서 13,000rpm으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 펠렛에 완충액 E 용액 100μL를 넣고 잘 풀어준 후, Bender A (0.1M NaCl, 0.2M Sucrose, 30mM Tris-Cl pH8.0, 10mM EDTA) 용액 300μL와 Bender B (2.5% SDS, 0.5M Tris-Cl pH9.2, 0.25M EDTA) 용액 100μL를 넣고 잘 섞어 준 후 65℃에서 20분간 인큐배이션하였다. 이어, 5M 아세트산칼륨 120μL를 넣어 잘 섞어주고 20분간 얼음에 둔 후, 실온에서 13,000rpm으로 5분간 원심분리 한 다음 상층 액을 새 튜브로 옮겨주고 상층 액과 같은 부피의 100% 에탄올을 넣어준 후 13,000rpm으로 5분간 실온에서 원심분리하였다. 이어, 상층액을 버리고 펠렛에 0.2μL RNase (10mg/ml)를 포함하는 탈이온증류수 50μL를 넣어 gDNA를 용해하였다.

이어서, 상기 수득한 gDNA를 주형으로 하여 각 DNA에 대하여 상이한 프라이머 두 세트의 프라이머 쌍(#1과 #3 및 #2와 #3, 표3 참조)을 사용하여 두 번의 PCR을 수행하였다.

유전자 명칭	프라이머 #1	프라이머 #3
CG7263 spen JhI-21 Inv CG12744 Pcl Coro shg loco Rab35 DDB1 Jumeau Lmpt Rab6 Trx-2 CG7510 P-element 프라이머 #2	GTCACCTACTCCGCAGCCA (서열번호 1) ATACAGGGCCTAGCATAGACC (서열번호 3) AGCCGTTTTGTTGTGTCC (서열번호 5) GCTGATTGGATGTTCGAAAA (서열번호 7) CTTGTAACCGAATGGAACACTT (서열번호 9) AAGGCGCCAGATTAATGA (서열번호 11) GGTGAACGTGAACGCGA (서열번호 13) TCGCCAGAAAGTACAAGTTC (서열번호 15) ACCTGGCTTCCAGCGAA (서열번호 17) GCGAGGGAGTCGAGCTT (서열번호 19) AGGAAACATTTTAGCGCGT (서열번호 21) TTATCATTGCTCCGCGACT (서열번호 23) TTAGTTTGCGCGGCAA (서열번호 25) TCACACAGCAACTGACTCAGA (서열번호 27) CCTCCTACCGGTAAGAAACT (서열번호 29) ACAAAACGCATCGGCG (서열번호 31) CAATCATATCGCTGTCTCACTCA (서열번호 33)	GTATGCCGGCGGCGA (서열번호 2) AAACTCTGGTGCAGAGTGAAAT (서열번호 4) CTAATGGCGAATAGCGC (서열번호 6) GTTAATCCGCTCGTCCGT (서열번호 8) AGTTGCACTTCAGCCAACG (서열번호 10) TGTGTGTGCGTGCTAGATG (서열번호 12) GCATTCAGCGGGATTCAA (서열번호 14) GGCACTCTCTTTCTCCGTT (서열번호 16) CATCTATTGATTCTACGTCTCG (서열번호 18) ATGTAAGTGTTGTTGCCGC (서열번호 20) GATCCGTGGGCGAGGT (서열번호 22) GCGAAGATTTCACCGGAA (서열번호 24) CGCATGCAAGAACCCAA (서열번호 26) TGCCAAAATCTCCGGAT (서열번호 28) CAAAATGAGCACGTCGC (서열번호 30) TCGAAAATCGCAATGCC (서열번호 32)

PCR 최종부피는 25μL로 하여, 95℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분을 1주기로 하여 30주기를 수행하였다. 첫 번째 PCR에서는 각 유전자에 P-element가 삽입된 위치를 포함해서 약 150bp 길이의 DNA를 증폭시키는 프라이머 세트(#1 및 #3)를 사용하였으며, 두 번째 PCR에서는 P-element 3' 쪽 서열과 P-element가 삽입된 위치에서 각 유전자의 3' 쪽으로 약 150bp 길이의 DNA를 증폭하는 프라이머 세트(#2 및 #3)를 제작하여 사용하였다. 각각의 PCR에 사용되는 프라이머의 위치는 도 2에 나타낸 바와 같다.

P-element가 완전히 빠져나간 돌연변이체에서는 첫 번째 PCR 결과 야생형과 똑 같은 길이의 PCR 산물이 생산되며, 두 번째 PCR에서는 야생형 및 P-element가 빠져나간 복귀돌연변이체 모두 밴드가 생성되지 않는다. 결과는 도 2에 나타낸다. 이런 방법으로 각 돌연변이체에 대하여, P-element가 완전히 빠져나간 복귀 돌연변이체를 수득하였다. 이는 다시 PCR 을 사용하여 재확인하였으며, 복귀 돌연변이체는 해당유전자의 발현이 야생형에 거의 동등한 수준임을 확인하였다 (결과는 나타내지 않음). 따라서, 상기 실시예 2에서 관찰한 생존율 저하 현상은, P-element에 의한 본원 발명에서 규명된 특정 유전자의 결손에 의한 결과임을 직접적으로 증명하는 것이다.

실시예 4 초파리를 사용한 생체내 식균작용 분석 실험 (in vivo Phagocytosis Assay)

선천적 면역시스템의 대표적인 반응으로서, 실시예 1에서 선별된 돌연변이 초파리 주들의 식균작용(Phagocytosis) 능력을 테스트하였다.

살아있는 돌연변이 초파리 주에 형광표식이 된 죽은 대장균(FITC labeled E.coli extract, Invitrogen, U.S.A.)을 주입하였다. 주입 방법은 다음과 같다. 인젝터(Picospritzer III injector, Parker Com. U.S.A.)를 이용해 초파리 성체 수컷의 배쪽으로 1mg/ml 농도의 형광표식 대장균을 초파리 한 마리당 50 nL를 주입하였다. 그 후, 초파리를 25℃, 70% 습도에서 15분 동안 두어, 헤모사이트(Hemocyte)에 의한 식균작용이 일어나도록 하였다. 이어, 식균작용에 의해 제거되지 않고 남은 형광표식 대장균을 제거하기 위해, 4% 트리판블루(4% Trypan Blue Solution, Sigma, U.S.A.) 용액 5μL를 초파리에 주입한 후, 두 종류의 필터(형광 (FITC) 필터 및 가시광선 (DIC) 필터)를 사용하여 형광현미경으로 초파리의 배 부분을 등쪽에서 관찰하여 세포에 의한 대장균의 식균작용 능력을 분석하였다.

그 결과, CG7263, loco, Spen, JhI-21, Pcl, Coro, Shg, Rab35, Rab6, CG7510의 유전자에 돌연변이가 있는 초파리 돌연변이 주에서 식균작용이 감소되는 것을 관찰하였다. 한편, Inv, DDB1, Jumeau, Lmpt, Trx-2 유전자의 돌연변이 초파리에서는 대조군과 큰 차이를 볼 수 없었다. 결과는 도 3에 나타내었다. 이러한 결과는 면역반응 조절에 관여하는 각 유전자의 구체적인 기능의 차이를 반영한다. 초파리의 면역반응은 세포성 반응과 체액성 반응의 두 가지로 나누어지는데, 전자는 병원균의 식균작용, 즉 멜라닌화와 캡슐화이며, 후자는 초파리의 지방체가 활성화되어 대량의 항미생물성 펩타이드를 만들어 방어기능을 한다. 이중 한가지만 정상적으로 작용을 하지 않으면 병원균에 감염되었을 때 초파리에 치명적인 영향을 줄 수 있다. 그러므로 상기 5개의 대조군과 차이가 없는 돌연변이체의 경우 식균작용은 정상적으로 작동하지만, 선천적 면역반응에 관여하는 다른 기능에 이상을 초래하여 실시예 1에서 관찰한 바와 같은 생존률 감소를 초래하는 것으로 생각된다.

실시예 5. 초파리 세포주 ( SL2 * cell line )를 사용한 식균작용 분석 실험 (in vitro Phagocytosis Assay )

면역반응 현상의 하나인 식균작용에 관여하는 선천적 면역 유전자의 결손 효과를 초파리 세포주에서도 조사하였으며, 병원균 감염시 초파리의 생존율을 50% 이상 감소시키는 것으로 밝혀진 실시예 1의 16개 유전자(실시예 2 참조)의 발현이 차단된 세포주를 다음과 같이 제조하였다.

A. RNAi 방법에 의해 특정 유전자 발현이 차단된 SL2 * 세포주의 제조

우선, 실시예 1의 SL2* 세포주에 대하여 RNAi 방법을 사용하여 각 면역관련 유전자의 발현을 차단하였다.

특정 유전자의 발현을 억제하는 RNAi 방법을 다음과 같이 실시하였다.

우선, dsRNA (이중가닥 RNA)의 수득을 위한 DNA 주형을 얻기 위한 클로닝을 수행하였다. 성체 초파리로부터 PCR을 사용한 공지의 방법을 사용하여 수득한 cDNA로부터 실시예 2에서 규명된 16개의 유전자를 이에 특이적인 프라이머 (하기 표 4 참조)로 증폭시켜 각 유전자 단편을 수득하였다. 이때 사용하는 프라이머(Primer)의 말단은 제한효소 인식부위를 포함하도록 제작하였다. 이렇게 얻어진 증폭된 각 유전자 DNA를, 제한효소로 처리하여 pBluescript SK(+) (Stratagene, U.S.A.) 벡터에 클로닝하였다. 이어서, 목적하는 각 유전자를 포함하는 pBluescript SK(+) 클론을 주형으로 하여, 5’-말단의 T7 프로모터와 3’-말단의 T3 프로모터 지역에 상보적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 통상의 표준방법에 따라 PCR 반응을 수행하였다. 이때 사용한 3' 말단 T3 프로모터 프라이머는 그 말단에 T7 프로모터 염기서열을 포함한다. 상기 PCR을 통해 증폭된 유전자 DNA의 양 말단은 모두 T7 프로모터 염기 서열을 포함하며, 이를 하기와 같이 이용하여 시험관내 전사(in vitro transcription)를 수행하였다.

rATP, rCTP, rGTP, rUTP 각각 100mM, 주형 DNA 5㎍, 10X 완충액(Biostream, Seoul), 100 Unit의 T7 RNA 중합효소(T7 RNA polymerase, Biostream, Seoul)를 RNA 분해효소결여(RNA nuclease free) 증류수에 총 부피 50ul로 혼합한 후, 37℃에서 6시간 동안 효소반응을 진행시켰다. 반응 후 효소의 활성을 없애주기 위해서 65℃에서 30분간 인큐배이션하였다. 이어서, 전사된 각 RNA 나선을 이중나선으로 만들기 위해서 65℃부터 시작하여, 0.5℃/분의 비율로 온도를 4℃까지 낮추어 이중나선 RNA를 수득하였다. 반응 후 남은 효소는 페놀/클로로포름 추출(Phenol/Chloroform extraction)법으로 제거하였다. 구체적으로, 상기와 같이 전사된 50ul의 반응물을, 뉴클리에이즈프리 증류수를 250μL 더 첨가하여 300ul로 희석시켰다. 여기에 300ul의 페놀/클로로포름 용액(Sigma, U.S.A.)을 첨가한 후 충분히 혼합하여 잘 섞어주고 13,000 rpm으로 원심분리 한 후 상층액을 새로운 시험관에 옮겨주었다. 상층액에, 상층액의 1/4 부피의 10M 암모늄아세테이트와 2.5배의 100% 에탄올을 첨가한 후 잘 섞어서 -20℃에 30분간 둔 후, 13,000rpm으로 30분간 원심분리하고, dsRNA에 잔류하는 염을 75% 에탄올로 씻어 제거한 후, 건조시켜 dsRNA를 제조하였다.

이어서, 상기 수득한 각 유전자에 대한 dsRNA 50㎍을 무혈청 배지 중의 SL2* 세포주 3x10⁶개/ml에 첨가하여 3시간 동안 둔 후, 이어, 혈청이 들어간 배지로 교환 후 3일간 배양하여 특정 유전자의 발현을 억제하였다. 유전자의 발현이 억제된 정도는 공지의 방법을 사용하여 RT-PCR이나 웨스턴블롯을 통해 확인하였다 (결과는 나타내지 않음).

RNAi 실험 수행을 위한 클로닝 제작에 사용된 PCR용 프라이머
폴리펩타이드 명칭	5' 프라이머	3' 프라이머
CG7263 spen JhI-21 Inv CG12744 Pcl Coro shg loco Rab35 DDB1 Jumeau Lmpt Rab6 Trx-2 CG7510	GTGAATCTCGAACAGTTTGGCCA (서열번호 34) GACAGTAGCGATGACAATCAG (서열번호 36) GTTAATAGCCTCATTCGATT (서열번호 38) AGCGGTATCGTCGAGTGGTTG (서열번호 40) GAAGTGCAACTTTCCTGTCT (서열번호 42) ATTTCCAAGCAATCCAATCG (서열번호 44) TACTTGTGTGGAAAAGGTGAC (서열번호 46) CGTTGTCTAAACGGAGGAT (서열번호 48) TTATAGCCAAGTTAAAAGCGG (서열번호 50) GGCTTCGATCATCTATTCAA (서열번호 52) ATTCTTGACGACGATACGTT (서열번호 54) TATCCTCAGCATCTGGAGTC (서열번호 56) CAAGAAGGCCAAGGATAATA (서열번호 58) AAGTTCAAGCTCGTCTTCCT (서열번호 60) TGGTGTACCAGGTGAAAGAT (서열번호 62) ATCAGAACAGAAGGGGACTT (서열번호 64)	CTGCTGGGCAGGCGACGGGTG (서열번호 35) CAACAGCAGGAACATCTGCCA (서열번호 37) TTCGCTACTGGGGCTCAGGA (서열번호 39) GTGGATCTGGTCAAGTCGCC (서열번호 41) GATACTTCCTCTTTGGTGGA (서열번호 43) CCTCCAAGGAGCAGCCGCGCA (서열번호 45) CATCGCTTCCATTCTTGTT (서열번호 47) CTGCTCGTTAATTGTCAGGTT (서열번호 49) GATCCAGTGGTATTTTGCTC (서열번호 51) CTTGTGATCGAGCACCTGTC (서열번호 53) TCCTCGACGATCTTTATGAC (서열번호 55) GTCTGACTTGCTGCACCTTCA (서열번호 57) ATCCTCAAACGATATGAAGC (서열번호 59) TGAGTCCTTTAGCACAACCT (서열번호 61) TGCTGGAGATGTTGTATTCC (서열번호 63) AGCAGCTTATCCTCAAAGTG (서열번호 65)

B. 상기 제조된 세포주의 식균작용

상기와 같이 제조된 세포주의 식균작용을 대장균을 사용하여 분석하였다. 상기 언급한 대로 식균작용은 최전방의 대표적 선천적 면역작용이다.

각 분석에는, A에서 제조된, 특정 유전자의 발현이 억제된 약 3x10⁶개의 세포/ml를 사용하였다. 분석 3시간 전에, 상기 세포들을 배지 중에서 안정화시킨 후, 세포를 4℃에서 30분간 두어 냉각시켰다. 이어, 형광 표지된 대장균을 5㎍/ml의 농도로 첨가한 냉각 배지를 세포에 넣어 주고, 4℃에서 30분간 추가로 두어 형광 표지된 대장균과 세포간의 충분한 접촉이 가능하도록 하였다. 이후, 배양온도를 25℃로 올려 15분간 추가로 배양하여 대장균의 식균이 일어나도록 하였다.

15분 후, 냉각 PBS (Phosphate Buffered Saline)로 세포를 씻어, 남아있는 대장균을 없애주었다. 이때 세포의 표면에 붙은 형광대장균의 효과를 없애기 위해서 0.4% 트리판블루 용액을 FACS 사용직전에 넣어 주었다. 이어, 다시 냉각 PBS 1mL에 세포를 현탁한 후, FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter)를 이용하여, 세포주에 의한 대장균의 식균능려긍ㄹ 관찰하였다.

결과는 도 4 및 표 5에 나타내었다. SL2* 세포주에 luciferase dsRNA를 처리하여 대조군으로 사용한 세포(Luc)에서는, 형광표지 대장균을 식균한 세포의 비율이 81.29% 이었다. 식균작용에 영향을 준다고 이미 알려진 SRC1 유전자의 경우, 이에 대한 dsRNA를 처리하여 한 세포의 경우, 식균한 세포의 비율이 68.67%로 줄어든다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 이를 기준으로 한 경우, 세포주 실험에서는 Rab6, Rab35 유전자가 식균작용의 감소를 초래하는 것으로 나타났으며, 이 경우, Rab6, Rab35 유전자의 발현이 억제된 세포주에서, 대장균을 식균한 세포의 비율은 각각 63.23%, 62.12%로 줄어들었다. 면역반응은 다양한 현상이 복합적으로 작용하여 나타나는 결과로서, 상기 결과는 선천적 면역반응에 영향을 주는 본 발명에서 규명된 폴리뉴클레오타이드 간의 선천적 면역반응에서의 구체적 기능의 차이를 나타낸다.

시험관내 파고사이토시스 어세이 분석표
RNAi- 처리된 유전자	Region(%)	M1	M2	M3
Luc		8.49	10.30	81.29
SRC1		15.74	15.73	68.67
Rab6		20.15	16.84	63.23
Rab35		21.31	15.71	62.12

상기 표 5에서, 초파리 세포주는 자체가 자가형광을 띠기 때문에 상기 M1은 자가 형광부위를 나타내는(즉, 형광 대장균을 가지고 있지 않은 초파리세포) 비율, M2는 형광 대장균이 세포의 표면에 붙어 있어서 형광을 띠고 있지만, 트리판-블루 용액을 처리함으로써 형광의 세기가 줄어들어 있는 영역의 비율을 나타낸다. M3는 형광표지 대장균을 식균한 세포로써 형광을 많이 띠고 있는 영역의 비율을 나타낸다. 살아있는 세포로는 트리판-블루 용액이 들어갈 수 없기 때문에 M2와 구분이 가능하다.

실시예 6. 항균 펩타이드(AMP, Antimicrobial Peptide) 생성 정도 분석 실험

외부로부터 항원이 침입하면, 면역반응의 하나로서, 외부항원에 대항하는 항균 펩타이드를 생성하게 된다. 이 항균 펩타이드는 항원의 옵소닌화(Opsonization)를 하여 식균작용이 일어나기 쉽게 하거나 또한 그 자체가 박테리아들의 세포벽을 약하게 하는 역할을 하기도 하기 때문에 선천적 면역반응 활성화 측정의 좋은 척도가 된다. 전술한 바대로 병원균 인식경로인 Imd 및 Toll 경로에 따라 발현되는 항박테이라 펩타이드의 종류가 달라지는데, 본 실시예에서는 실시예 2에서 확인된 16개 유전자에 대한 돌연변이 초파리에서, Imd 경로에 속하는 어테신 A(Attacin A; AttA), 어테신 B (Attacin B; AttB)과 디프테리신(Diptericin; Dpt)및 Imd와 Toll 경로에 모두 속하는 세크로핀 A1(Cecropin A1), 세크로핀 A2(Cecropin A2), 세크로핀 C(Cecropin C)의 생성 여부 및 그 정도를 다음과 같이 확인하였다.

시기가 동일한 초파리 성체 10마리를 마취한 후, 1.5ml 에펜도르프 튜브에 넣어주었다. 액체 질소를 튜브 안에 넣어주어 초파리를 순간적으로 얼리면서 작은공이를 사용하여 초파리를 곱게 갈았다. 이어서, 여기에 1mL의 트라이졸(Trizol, Invitrogen, U.S.A.)을 넣어 5분간 섞어준 후, 150μL 클로로포름을 넣고, 볼텍스를 1분간 하여 잘 섞었다. 이후, 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심분리를 하여 상층액을 새 튜브로 옮겼다. 옮긴 상층액과 동일 부피의 페놀 클로로포름을 넣어주고 볼텍스하여 두 층이 완전히 섞이게 하고, 다시 4℃, 13,000 rpm으로 15분간 원심분리를 하여 상층액을 새 튜브로 옮겨준다. 여기에 350μL의 아이소프로판을 넣고 잘 섞은 후, 실온에서 10분간 인큐베이션 한다. 4℃, 13,000 rpm으로 30분간 원심분리를 하여 상층액을 버리고 75% 에탄올로 RNA을 씻어준 후, 4℃, 13,000 rpm으로 5분간 원심분리를 하고 잘 말려서 30μL의 뉴클리에이즈프리(Nuclease free) 증류수에 용해하였다.

이렇게 추출된 RNA 5㎍을 역전사 반응을 통해 cDNA로 만들었다. 구체적으로 RNA 5㎍에 0.5㎍/μL 농도의 Oligo dT, 1μL, 10mM dNTP 1μL를 넣고 65℃에서 5분간 인큐베이션한 후, 4℃에서 2분간 두었다. 그 후, 여기에 5X First-Strand buffer 4μL (Invitrogen), 0.1M DTT 2μL (Invitrogen), RNasin 1μL (Promega, U.S.A.), 역전사효소 (SuperScript II, Invitrogen, U.S.A.)를 넣고, 42℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 65℃에서 15분 두어 반응을 정지하였다.

이렇게 만들어진 cDNA를 주형으로 하여, 표 6의 각 항균 펩타이드에 특이적 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 각 초파리에서의 항균 펩타이드(AMP, Antimicrobacterial Peptide)의 발현 정도를 조사하였다. 상기 수득한 cDNA에 180ul의 증류수를 넣어 희석하여 주형으로 사용하였다. 희석된 cDNA 5μL, 2.5mM dNTP 1μL, 2unit Taq DNA 중합효소 (DNA polymerase), 프라이머 쌍 각 10pmole/μL 2μL를 넣고, 총 부피 25μL에서, 95℃ 30초, 50℃ 1분 30초, 72℃ 1분을 1주기로 하여 20 주기를 반복하였다.

항균펩타이드(AMP) 확인용 프라이머
AMP	5' 프라이머	3' 프라이머
Attacin A	AGGTTCCTTAACCTCCAATC (서열번호 66)	CATGACCAGCATTGTTGTAG (서열번호 67)
Attacin B	GTGCTAATCTCTGGTCATC (서열번호 68)	GGGTAATATTTAACCGAAGT (서열번호 69)
Cecropin A1	ATGAACTTCTACAACATCTT (서열번호 70)	GGCAGTTGCGGCGACATTGG (서열번호 71)
Cecropin A2	ATTAGATAGTCATCGTGGTT (서열번호 72)	GTGTTGGTCAGCACACT (서열번호 73)
Cecropin C	GATGAGCCTTTAATGTCC (서열번호 74)	TGTAAGCTAGTTTATTTCTA (서열번호 75)
Diptericin	ATGCAGTTCACCATTGCCGTC (서열번호 76)	TCCAGCTCGGTTCTGAGTTG (서열번호 77)

결과는 도 5에 있다. Lmpt를 제외한 테스트한 모든, 폴리뉴클레오타이드가 결손된 초파리에서, 특히 박테리아의 감염에 대한 항균펩타이드의 발현이 낮아지는 결과를 확인했다. 상기 결과는 본원 발명에서 규명된 폴리펩타이드의 대부분이 항균펩타이드 합성과 관련된 신호전달체계에서 기능함을 나타낸다. 이러한 결과는 또한 상기 언급한 바대로, 복합적 현상을 수반하는 선천적 면역반응에 작용하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 구체적 작용의 차이를 나타내는 것으로서, 본 발명에서 규명된 폴리뉴클레오타이드들은 식균작용 및 항미생물성 펩타이드의 합성 등의 작용을 통하여 복합적 현상인 선천적 면역반응에서 기능하는 것으로 판단된다.

본 발명에서 발견된, 선천적 면역반응에 관여하여 이를 조절하는 폴리뉴클레오타이드는 면역반응의 이상으로 인해 야기되는 수많은 질병에 대한 신규하거나 보다 향상된 치료법 및 치료제의 개발은 물론, 후천적 면역 반응의 활성화를 유도하는 면역 활성 증강제로 사용할 수 있고, 나아가 대식작용에 활성제로서 및 치료제의 타깃으로 활용될 수 있다. 아울러, 이러한 유전자의 규명은 대부분 선천적 면역만이 존재하는 다양한 해충의 방제에 사용될 수 있는 환경적으로 유용한 살충제 등의 개발을 위해서도 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> POLYNUCLEOTIDES RESPONSIBLE FOR INNATE IMMUNE RESPONSE IN DROSOPHILA AND USE THEREOF <140> 10-2006-0084687 <141> 2006-09-04 <160> 77 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer #1 for CG7263 <400> 1 gtcacctact ccgcagcca 19 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer #3 for CG7263 <400> 2 gtatgccggc ggcga 15 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer #1 for spen <400> 3 atacagggcc tagcatagac c 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer #3 for spen <400> 4 aaactctggt gcagagtgaa at 22 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer #1 for JhI-21 <400> 5 agccgttttg ttgtgtcc 18 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer #3 for JhI-21 <400> 6 ctaatggcga atagcgc 17 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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<210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer #2 for P-element <400> 33 caatcatatc gctgtctcac tca 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for CG7263 <400> 34 gtgaatctcg aacagtttgg cca 23 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for CG7263 <400> 35 ctgctgggca ggcgacgggt g 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for spen <400> 36 gacagtagcg atgacaatca g 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for spen <400> 37 caacagcagg aacatctgcc a 21 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for JhI-21 <400> 38 gttaatagcc tcattcgatt 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for JhI-21 <400> 39 ttcgctactg gggctcagga 20 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for Inv <400> 40 agcggtatcg tcgagtggtt g 21 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for Inv <400> 41 gtggatctgg tcaagtcgcc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for CG12744 <400> 42 gaagtgcaac tttcctgtct 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for CG12744 <400> 43 gatacttcct ctttggtgga 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for Pc1 <400> 44 atttccaagc aatccaatcg 20 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for Pc1 <400> 45 cctccaagga gcagccgcgc a 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for Coro <400> 46 tacttgtgtg gaaaaggtga c 21 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for Coro <400> 47 catcgcttcc attcttgtt 19 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for Shg <400> 48 cgttgtctaa acggaggat 19 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for Shg <400> 49 ctgctcgtta attgtcaggt t 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for loco <400> 50 ttatagccaa gttaaaagcg g 21 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for loco <400> 51 gatccagtgg tattttgctc 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for Rab35 <400> 52 ggcttcgatc atctattcaa 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for Rab35 <400> 53 cttgtgatcg agcacctgtc 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for DDB1 <400> 54 attcttgacg acgatacgtt 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for DDB1 <400> 55 tcctcgacga tctttatgac 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for Jumeau <400> 56 tatcctcagc atctggagtc 20 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for Jumeau <400> 57 gtctgacttg ctgcaccttc a 21 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for Lmpt <400> 58 caagaaggcc aaggataata 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for Lmpt <400> 59 atcctcaaac gatatgaagc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for Rab6 <400> 60 aagttcaagc tcgtcttcct 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for Rab6 <400> 61 tgagtccttt agcacaacct 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for Trx-2 <400> 62 tggtgtacca ggtgaaagat 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for Trx-2 <400> 63 tgctggagat gttgtattcc 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for CG7510 <400> 64 atcagaacag aaggggactt 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for CG7510 <400> 65 agcagcttat cctcaaagtg 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for detection of Attacin A <400> 66 aggttcctta acctccaatc 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for detection of Attacin A <400> 67 catgaccagc attgttgtag 20 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for detection of Attacin B <400> 68 gtgctaatct ctggtcatc 19 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for detection of Attacin B <400> 69 gggtaatatt taaccgaagt 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for detection of Cecropin A1 <400> 70 atgaacttct acaacatctt 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for detection of Cecropin A1 <400> 71 ggcagttgcg gcgacattgg 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for detection of Cecropin A2 <400> 72 attagatagt catcgtggtt 20 <210> 73 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for detection of Cecropin A2 <400> 73 gtgttggtca gcacact 17 <210> 74 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for detection iof Cecropin C <400> 74 gatgagcctt taatgtcc 18 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for detection of Cecropin C <400> 75 tgtaagctag tttatttcta 20 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' Primer for detection of Diptericin <400> 76 atgcagttca ccattgccgt c 21 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' Primer for detection of Diptericin <400> 77 tccagctcgg ttctgagttg 20

Claims

하기의 단계를 포함하는 면역반응 조절 물질의 스크리닝 방법:

(a) 진핵 세포를 후보물질과 접촉하는 단계;

(b) 상기 후보물질이 하기 표 1a 및 1b로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 산물의 발현 또는 활성에 미치는 영향을 측정하는 단계를 포함하며,

상기 후보물질과 접촉하지 않은 진핵 세포에서의 상기 폴리뉴클레오타이드 산물의 발현 또는 활성과 대비하여, 상기 후보물질과 접촉한 진핵 세포에서의 상기 폴리뉴클레오타이드 산물의 발현 또는 활성이 변화되는 경우에, 상기 후보물질이 면역반응 조절 물질인 것으로 판단되는 것을 특징으로 하는, 면역반응 조절 물질의 스크리닝 방법:

[표 1a]

[표 1b]
제 1 항에 있어서, 상기 진핵세포는 면역관련 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 면역관련 진핵세포는 초파리 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 면역관련 초파리 유래 진핵세포로서 SL2, SL2*, 및Mbn-2 세포주로 이루어진 군에서 선택되는 초파리 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 면역관련 초파리 유래 진핵세포로서, 살아 있는 초파리에 위치한 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 산물은 mRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 산물은 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 mRNA는 mRNA의 농도 또는 전환율(turn over)로 발현이 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 농도로 발현이 측정 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 mRNA 농도 또는 전환율 측정은 정량적 RT-PCR, 마이크로어레이분석, 및 노던블롯으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 농도는 웨스턴블롯 또는 ELISA를 사용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 산물의 활성은 이의 효소로서의 기능분석 또는 결합력 분석법으로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 CG7263, Spen, Jhi-21, Inv, CG12744, Pcl, Coro, shg, loco, Rab35, DDB1, Jumeau, Lmpt, Rab6, Trx-2 또는 CG7510인 것을 특징으로 하는 방법.
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표 1a 및 1b로부터 선택된 서열, 또는 이에 상보적인 서열을 프로브로서 포함하는 DNA 칩.
제 17 항에 따른 칩, 및 상기 DNA 칩 상의 프로브와 혼성화된 시료를 탐지하기 위한 시료의 표지수단을 포함하는, 면역반응 관련 폴리뉴클레오티드의 발현 양상 분석 키트.