KR100905627B1 - 활성제 전달 시스템 및 활성제의 보호 및 투여 방법 - Google Patents

Abstract

본원 발명은 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드에 공유 결합된 활성제를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드에 공유 결합된 활성제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에게 활성제를 전달하는 방법을 제공한다. 또한, 활성제를 폴리펩티드에 공유 결합시키는 것을 포함하는 분해로부터 활성제를 보호하는 방법을 제공한다. 또한, 활성제를 폴리펩티드에 공유 결합시키는 것을 포함하는, 폴리펩티드를 포함하는 조성물로부터 활성제의 방출을 조절하는 방법을 제공한다. (도 1)

폴리펩티드, 활성제, 공유 결합, 활성제의 방출, 전달 시스템, 효소 촉매

Description

활성제 전달 시스템 및 활성제의 보호 및 투여 방법 {Active Agent Delivery Systems and Methods for Protecting and Administering Active Agents}

본 발명은 활성제 전달 시스템, 보다 구체적으로는 활성제에 공유 결합된 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 활성제를 보호하고 투여하기 위한 방법에 관한 것이다.

생물학적으로 활성인 제제(활성제)를 적당한 표적으로 효과적으로 전달하기 위해 활성제 전달 시스템은 종종 중요하다. 이러한 시스템의 중요성은 환자 컴플라이언스 및 활성제 안정성이 고려될 때 확대된다. 예를 들어, 활성제를 주사법이나 또다른 투여 기술 대신에 경구로 투여한다면 환자 컴플라이언스가 두드러지게 증가할 것으로 예상된다. 활성제의 안정성, 예컨대 장기간의 저장 수명 또는 위에서의 잔존을 증가시킴으로써 투여 재현성을 보장하게 될 것이며, 아마도 심지어는 필요한 투여 횟수를 줄이게 되어 환자 컴플라이언스를 개선시킬 수 있을 것이다.

경구 투여된 활성제의 흡수는 심하게 산성인 위 환경, 위장관에서의 강력한 소화 효소, 세포막의 투과성 및 지질 이중층을 통한 이송능에 의해 종종 차단된다. 레조르시놀, 계면활성제, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 담즙산과 같은 부형제를 혼입하는 것이 세포막의 투과성을 향상시킨다. 프로테노이드 소구체, 리포좀 또는 다당류를 사용하여 활성제를 마이크로캡슐화하는 것이 활성제의 효소 분해를 줄이는 데 효과적이었다. 효소 분해를 막기 위해 효소 억제 부형제들이 또한 사용되어 왔다. 위에서의 약물의 보호제로서는 장용 제피가 사용되어 왔다.

활성제 전달 시스템은 또한 활성제의 배출을 조절할 수 있는 능력을 제공한다. 예를 들어, 디아제팜을 글루탐산과 아스파라긴산의 공중합체와 배합하여 활성제를 지연 방출시킬 수 있다. 또 다른 예로, 락트산과 글루타르산의 공중합체를 사용하여 인간 성장 호르몬의 정시 배출(timed-release)을 제공한다. 광범위한 약물들이 디카르복실산의 아미드류, 개질된 아미노산류 또는 열적 축합된 아미노산류에 활성제를 마이크로캡슐화하여 지연 방출을 제공하는 것으로 알려져 있다. 서방용 첨가제를 다양한 활성제와 정제 제형 내에서 혼합시킬 수도 있다.

이러한 각 기술들에 의해 활성제 물질에 개선된 안정성 및 정시 방출 특성이 부여된다. 불행히도, 이들 기술들은 몇몇 단점들이 있다. 활성제의 혼입은 종종 마이크로캡슐화 매트릭스로의 확산에 좌우되는데, 이는 정량적이지 않을 수 있으며 투여 재현성을 복잡하게 만들 수 있다. 또한, 캡슐화 약물들은 매트릭스의 확산에 의존하는데, 이것은 활성제의 수용해도에 크게 좌우된다. 역으로, 수용성 소구체는 무한대로 팽창하게 되고, 불행히도 활성제를 한꺼번에 방출하여 활성제가 지연 방출에 거의 이용될 수 없게 된다. 더우기, 일부 기술에서는 활성제 방출에 요구되는 분해 과정의 조절을 신뢰할 수가 없다. 예를 들어, 장용 제피된 활성제는 pH에 좌우되어 활성제를 방출시키는데, 이러한 경우 방출 속도를 조절하는 것은 어렵다.

과거에는, 활성제가 결합될 수 있는 펜던트기로 폴리펩티드류의 아미노산 측쇄가 사용되었다. 이들 기술은 전형적으로 아미노산 펜턴트기와 활성제 사이에 스페이서기를 사용하는 것이 필요하다. 이러한 부류의 약물 전달 시스템의 펩티드-약물 콘쥬게이트는 약물 방출을 위한 혈류에 있는 효소에 좌우되고, 이러한 경우 경구 투여에는 사용되지 않는다. 주사용 또는 피하용 약물의 정시 방출 및 표적 방출의 예로는, 히드록시프로필 스페이서를 통해 폴리글루탐산의 감마 카르복실레이트에 노레틴드론을 결합하는 것과 펩티드 스페이서를 통해 폴리글루타민의 감마 카르바미드에 질소 머스타드를 결합하는 것이 있다. 덱사메타손은 스페이서기 없이 폴리아스파라긴산의 베타 카르복실레이트에 직접 공유 결합하였다. 이러한 프로드럭 배합물은 대장에 존재하는 박테리아성 가수분해 효소에 의해 약물이 방출되는 결장-특이성 약물 전달 시스템으로 설계되었다. 방출되는 덱사메타손 활성제는 또한 대장 질환을 치료하도록 표적되었고, 혈류로는 흡수되지 않도록 하였다. 또다른 기술에서는 활성 성분이 펩티드 연결기를 통해 잘 정돈된 지질막 (HAR로 공지됨)에 결합되는 리포좀 제형과 약물의 공유 결합 이점을 조합하는 것이다. 따라서, 지금까지 보고된 약물 전달 시스템 중에는 활성 성분을 폴리펩티드 펜던트기에 결합시켜 경구 투여를 통해 혈류로 표적 전달을 하는 개념을 도입하는 약물 전달 시스템은 없었다.

활성제 전달 시스템의 분자량, 분자 크기 및 입자 크기를 조절하는 것도 중요하다. 변이성 분자량은 예측할 수 없는 확산 속도 및 약동학을 갖는다. 고분자량 담체는 박테리아성 효소에 의해 거의 주로 결장에서 소화되는 나프록센-결합 덱 스트란의 경우에서와 같이 느리거나 늦게 소화된다. 고분자량의 소구체는 보통 수분 함량이 큰데, 이는 물에서 불안정한 활성 성분이 있는 경우 문제가 될 수 있다. 입도는 HAR 적용의 경우와 같은 주사용 약물에서 문제가 될 뿐아니라, 장의 쇄자연막을 통한 흡수도 5 미크론 미만으로 제한된다.

<발명의 요약>

본 발명은 활성제의 펩티드 또는 아미노산의 중합체로의 공유 결합을 제공한다. 본 발명은 예를 들어 제약 제제 및 영양제를 포함하는 활성제를 본원에서 또한 캐리어 펩티드로서 언급되는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드의 N-말단, C-말단 또는 직접적으로 아미노산 측쇄에 공유 결합시킴으로써 상기 언급된 기술과 구별된다. 특정 적용에서, 폴리펩티드는 활성제를 주로 위에서 형태적 보호를 통해 안정화할 것이다. 이들 적용에서, 활성제의 운반은 부분적으로 캐리어 펩티드의 전개(unfolding)의 반응속도론에 의해 제어된다. 상부 장관에 도입시, 고유 효소는 캐리어 펩티드의 펩티드 결합을 선택적으로 가수분해함으로써 신체에 의한 흡수를 위한 활성 성분을 방출한다. 이 효소 작용은 2차 지속 방출 메카니즘을 도입한다.

본 발명은 폴리펩티드 및 폴리펩티드에 공유 결합된 활성제를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 (i) 올리고펩티드, (ii) 20종의 천연 아미노산(L 또는 D 이성질체), 그의 이성질체, 유사체 또는 유도체중 하나의 동종중합체, (iii) 2종 이상의 천연 아미노산(L 또는 D 이성질체), 그의 이성질체, 유사체 또는 유도체의 이종중합체, (iv) 합성 아미노산의 동종중합체, (v) 2종 이상 의 합성 아미노산의 이종중합체, 또는 (vi) 1종 이상의 천연 아미노산과 1종 이상의 합성 아미노산의 이종중합체이다.

활성제는 바람직하게는 폴리펩티드의 측쇄, N-말단 또는 C-말단에 공유 결합된다. 바람직한 실시 양태에서, 활성제는 카르복실산이고 폴리펩티드의 N-말단에 공유 결합된다. 또다른 바람직한 실시 양태에서, 활성제는 아민이고 폴리펩티드의 C-말단에 공유 결합된다. 또다른 바람직한 실시 양태에서, 활성제는 알콜이고 폴리펩티드의 C-말단에 공유 결합된다. 또다른 바람직한 실시 양태에서, 활성제는 알콜이고 폴리펩티드의 N-말단에 공유 결합된다.

또한, 본 발명의 조성물은 마이크로캡슐화제, 보조제 및 제약상 허용가능한 부형제중 하나 이상을 포함할 수 있다. 마이크로캡슐화제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 아미노산, 당 및 염으로부터 선택될 수 있다. 보조제가 조성물에 포함되는 경우, 보조제는 바람직하게는 장 수송기를 활성화한다.

바람직하게는, 본 발명의 조성물은 섭취가능한 정제, 정맥내 제제 또는 경구용 현탁액 형태이다. 활성제는 폴리펩티드를 활성제 주위로 접히도록 함으로써 형태적으로 보호될 수 있다. 또다른 실시 양태에서, 폴리펩티드는 pH 의존 방식으로 조성물로부터 활성제를 방출할 수 있다.

또한, 본 발명은 활성제를 폴리펩티드에 공유 결합시키는 것을 포함하는, 분해로부터의 활성제의 보호 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 활성제를 폴리펩티드에 공유 결합시키는 것을 포함하는, 폴리펩티드를 포함하는 조성물로부터의 활성제 방출의 제어 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 폴리펩티드 및 폴리펩티드에 공유 결합된 활성제를 포함하는 조성물을 사람 또는 사람이 아닌 동물인 환자에 투여하는 것을 포함하는, 환자에 활성제를 운반하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시 양태에서, 활성제는 효소 촉매된 방출에 의해 조성물로부터 방출된다. 또다른 바람직한 실시 양태에서, 활성제는 효소 촉매된 방출의 약리반응속도론에 기초하여 시간에 의존하는 방식으로 방출된다. 또다른 바람직한 실시 양태에서, 조성물은 마이크로캡슐화제를 더 포함하고 활성제는 마이크로캡슐화제의 용해에 의해 조성물로부터 방출된다. 또다른 바람직한 실시 양태에서, 활성제는 폴리펩티드의 pH 의존적 전개에 의해 조성물로부터 방출된다. 또다른 바람직한 실시 양태에서, 활성제는 조성물로부터 지속 방출로 방출된다. 또다른 바람직한 실시 양태에서, 조성물은 폴리펩티드에 공유 결합된 보조제를 더 포함하고 조성물로부터의 보조제의 방출은 폴리펩티드에 의해 제어된다. 보조제는 활성 성분의 2상 방출을 위해 캐리어 펩티드-약물 공액물중으로 마이크로캡슐화될 수 있다.

또한, 본 발명은 폴리펩티드 및 폴리펩티드에 공유 결합된 활성제를 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은

(a) 활성제를 아미노산의 측쇄에 부착시켜 활성제/아미노산 복합물을 형성하는 단계,

(b) 활성제/아미노산 복합물로부터 활성제/아미노산 복합물 N-카르복시안하이드라이드 (NCA)을 형성하는 단계, 및

(c) 활성제/아미노산 복합물 N-카르복시안하이드라이드(NCA)을 중합하는 단 계

를 포함한다.

또다른 바람직한 실시 양태에서, 활성제는 제약 제제 또는 보조제이다. 또다른 바람직한 실시 양태에서, 단계 (a) 및 (b)는 제2 활성제를 사용하여 단계 (c)전에 반복된다. 단계 (a) 및 (b)가 제2 제제를 사용하여 단계 (c)전에 반복되는 경우, 활성제 및 제2 활성제는 단계 (c)에서 공중합될 수 있다. 또다른 바람직한 실시 양태에서, 아미노산은 글루탐산이고 활성제는 폴리펩티드의 가수분해시 이량체로서 글루탐산으로부터 방출되고, 이 때 활성제는 동시적 분자내 아민교환반응에 의해 글루탐산으로부터 방출된다. 또다른 바람직한 실시 양태에서, 글루탐산은 아스파르트산, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 리신, 트레오닌 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산에 의해 대체되고, 이 때 활성제는 아미노산의 측쇄에 부착되어 아미드, 티오에스테르, 에스테르, 에테르, 우레탄, 카르보네이트, 무수물 또는 카르바메이트를 형성한다. 또다른 바람직한 실시 양태에서, 글루탐산은 아민, 알콜, 술프히드릴, 아미드, 우레아 또는 산 관능기를 포함하는 펜던트기를 갖는 합성 아미노산에 의해 대체된다.

상기 일반적 설명 및 하기 상세한 설명 모두는 예시적인 것이며 본 발명을 제한하기 위한 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.

본 발명은 하기 상세한 설명을 첨부된 도면과 연결하여 볼 때, 가장 잘 이해될 것이다. 도면에 포함된 것들은 다음의 도면이다.

도 1은 본 발명의 산 활성제/N-말단 반응식을 나타낸다.

도 2는 본 발명의 아민 활성제/C-말단 반응식을 나타낸다.

도 3은 본 발명의 알콜 활성제/N-말단 반응식을 나타낸다.

도 4는 본 발명의 알콜 활성제/글루탐산 이량체 제조 및 공액화 반응식을 나타낸다.

도 5는 글루탐산 이량체 반응식로부터의 알콜 활성제의 메카니즘을 나타낸다.

도 6은 장의 상피 세포 배양에 있어 폴리쓰로이드의 동일계 소화를 나타낸 다.

도 7은 기부측면의 T4 농도를 나타낸다.

도 8은 기부 대 기부측면의 폴리쓰로이드 농도를 나타낸다.

도 9는 위 시뮬레이터 대 장 시뮬레이터에 있어 T4 분석을 나타낸다.

도 10은 위 시뮬레이터 대 장 시뮬레이터에 있어 T3 분석을 나타낸다.

본 발명은 활성제 운반에 있어 몇가지 유리한 이점들을 제공한다. 첫째, 본 발명은 활성제를 안정화하고 위에서의 소화를 방지할 수 있다. 또한, 약물 효과는 활성제의 지연된 방출에 의해 연장할 수 있다. 더욱이, 활성제는 상승 효과를 내도록 조합될 수 있다. 또한, 장관에서 활성제 흡수가 증진될 수 있다. 또한,본 발명은 특정 작용 부위로 활성제의 표적화된 운반을 가능하게 한다.

본 발명의 조성은 폴리펩티드와 폴리펩티드에 공유 결합된 활성제를 포함한 다. 활성제는 표 1에 나타난 목록으로부터 단독으로 또는 목록상의 다른 제제와 조합하여 선택될 수 있다.

바람직하게, 폴리펩티드는 (i) 올리고펩티드, (ii) 천연 20 개의 아미노산(L 또는 D 이성체) 중 1 개, 또는 그의 이성체, 유사체 또는 유도체의 동종중합체, (iii) 천연 20 개의 아미노산(L 또는 D 이성체) 중 2 개 이상의 아미노산, 또는 그의 이성체, 유사체 또는 유도체의 이종중합체, (iv) 합성 아미노산의 동종중합체, (v) 2 개 이상의 합성 아미노산의 이종중합체, 또는 (vi) 1 개 이상의 천연 아미노산과 1개 이상의 합성 아미노산의 이종중합체이다.

단백질, 올리고펩티드 및 폴리펩티드는 1 차, 2 차 및 3 차 구조를 갖는 아미노산의 중합체이다. 단백질의 2 차 구조는 폴리펩티드 쇄의 지역적 형태이고 헬릭스(helice), 평판 시트(pleated sheet) 및 턴(turn)으로 구성되어 있다. 상기 단백질의 아미노산 서열과, 상기 쇄 형태에 대한 구조적 제한은 상기 분자의 공간적 배열을 결정한다. 2 차 구조의 접힘(folding)과 측쇄의 공간적 배열은 3 차 구조를 형성한다.

이웃한 단백질의 원자와 용매 분자간의 역학으로 인하여 단백질이 접히게 된 다. 단백질 접힘과 풀림(unfolding)의 열역학은, 특정 모델에 의존한 단백질의 특정 조건에서의 자유 에너지에 의해 제한된다. 단백질 접힘의 과정은 특히, 아미노산이 팩킹 (packing)되어 소수성 코어를 형성하는 것을 포함한다. 단백질 코어 내부의 아미노산 측쇄는 아미노산 결정에서와 같이 동일한 부피를 차지한다. 따라서, 접혀진 단백질 내부는 오일 방울보다 결정 고체와 유사하고, 상기 고체 기준 상태는 단백질 안정도에 관여하는 힘을 결정하기 위한 최적의 모델이다.

단백질 접힘의 열역학에 관여하는 주요 힘으로서는, 반데르 발스 상호작용, 수소결합, 정전기적 상호작용, 형태상의 엔트로피 및 소수성 효과가 있다. 단백질 안정도를 고려하여, 상기 소수성 효과는 단백질 내부로부터 비극성 기를 제거하고 이것을 물에 노출시킨 에너지적 결과를 말한다. 아미노산 가수분해 에너지와 고체 기준 상태의 단백질 접힘을 비교할 때, 소수성 효과가 우세적인 힘으로 작용한다. 수소결합은 단백질 접힘 과정동안 형성되고, 물과의 수소결합을 통해 분자내부결합이 형성된다. 물 분자는 팩킹된 소수성 단백질 코어에서 "방출"된다. 상기 모든 힘들이 결합되어 접혀진 단백질의 전반적인 안정도에 기여하고, 이상적 팩킹의 발생 정도가 단백질의 상대적인 안정도를 결정한다. 최대한의 팩킹 결과로 잔기 중심, 또는 용매로부터 최대한으로 차폐된 소수성 코어를 생성한다.

소수성 약제는 펩티드의 소수성 코어에 결합할 수 있기 때문에, 약제가 방출되기 전에 펩티드를 풀리도록 하는 에너지가 필요하다. 풀림 과정은 아미노산의 수화 또는 단백질 용융온도의 획득에 의해 소수성 효과를 극복하는 것이 필요하다. 수화 열은 단백질을 불안정화시킨다. 전형적으로, 단백질의 접힘 상태는 풀림 상 태보다 단지 5-15 kcal/mole의 에너지를 필요로 한다. 그럼에도 불구하고, 중성 pH와 실온에서의 단백질 풀림은 화학적 시약을 필요로 한다. 사실상, 단백질의 부분적 풀림은 비가역적인 화학 과정 또는 구조형성 과정의 시작 전에 자주 발견된다. 또한 단백질 구조는 일반적으로, 해로운 화학 반응의 속도와 정도를 조절한다.

단백질에 의한 활성제의 구조적 보호는, 단백질의 접혀진 상태의 안정도 및 시약 분해와 관련된 열역학에 의존한다. 시약 분해를 위해 필요한 조건은 단백질 풀림의 조건과 달라야 한다.

아미노산의 선택은 목적한 물리적 특성에 의존한다. 예를 들면, 부피 또는 친지성을 증가시키고자 할 경우, 폴리펩티드 담체에 하기 표의 아미노산을 첨가한다. 반면, 폴리펩티드의 친수성을 증가시키기 위해 극성 아미노산이 선택될 수 있다

pH로 조절되는 펩티드 풀림을 위해 이온화되는 아미노산이 선택될 수 있다. 아스파르트산, 글루탐산 및 티로신은 위에서 중성 전하를 갖지만, 장에서는 이온화된다. 반대로, 히스티딘, 리신 및 아르기닌과 같은 염기성 아미노산은 위에서 이온화되고, 알칼리 환경에서는 중성이다.

주어진 용도에 적합한 아미노산 서열을 선택하기 위해, 방향족 잔기 간의 π-π상호작용, 프롤린의 부가로 인한 펩티드 쇄의 비틀림(kinking), 이황 교차결합 및 수소결합과 같은 다른 요인들을 이용할 수 있다. 직선 서열의 순서는 상기 상호작용을 최대화하는 방법에 영향을 줄 수 있고, 폴리펩티드의 2 차 및 3 차 구 조 결정에 중요하다.

또한, 반응성의 측쇄를 지닌 아미노산(예를 들면, 글루탐산, 리신, 아스파르트산, 세린, 트레오닌 및 시스테인)은, 다양한 활성제 또는 보조제의 부착을 위해 동일한 담체 펩티드에 첨가될 수 있다. 이것은 2 개 이상의 활성제 간의 상승효과가 필요할 경우에 특히 유용하다.

상기 언급한 바와 같이, 다양한 분자량의 담체 화합물이 활성제 방출의 반응속도에 중대한 영향을 미칠 수 있다. 그 결과, 저분자량 활성제 전달 시스템이 바람직하다. 본 발명의 이점은 폴리펩티드의 쇄 길이 및 분자량이 원하는 구조 보호의 정도에 따라 최적화될 수 있다는 것이다. 이 특징은 제1차 방출 메카니즘에 관하여 최적화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 이점은 지연 방출 시간이 담체 폴리펩티드의 분자량 증가에 의해 영향받을 수 있다는 것이다. 본 발명의 또다른 중요한 이점은 활성제 방출의 반응속도가 주로 담체 펩티드와 활성제 사이에 존재하는 중요한 결합의 효소적 가수분해에 의해 제어된다는 것이다.

덱스트란은 결장 특이적 약물 전달에 있어 약물의 공유 결합에 대한 거대분자 담체로서 연구된 것으로 알려진 유일한 다당류이다. 일반적으로, 약물-덱스트란 접합체 총 중량의 최대 1/10까지만 약물을 로딩하는 것이 가능했다. 미리 언급한 바와 같이, 다당류는 주로 결장에서 소화되며, 약물 흡수는 주로 결장으로 제한된다. 본 발명은 덱스트란에 비해 2가지 주요 이점을 갖는다. 우선, 펩티드는 소장의 루멘 (lumen)에서 발견되거나 브러시-보더 (brush-border) 막에 결합된 여러 아미노펩티다제 중 어떤 것에 의해서도 가수분해되기 때문에, 활성제의 방출 및 그 후의 흡수가 공장 (jejunum) 또는 회장 (ileum)에서 발생할 수 있다. 두번째로, 담체 분자의 분자량은 조절이 가능하기 때문에, 활성제 로딩량도 조절할 수 있다.

실제적인 예로서, 하기 표는 친지성 아미노산 (1개 미만의 물 분자) 및 선택된 진통제와 비타민의 분자량에 대한 목록이다.

아미노산	분자량	활성제	분자량
글리신	57	아세트아미노펜	151
알라닌	71	비타민 B6 (피록시딘)	169
발린	99	비타민 C (아스코르브산)	176
루이신	113	아스피린	180
이소루이신	113	이부프로펜	206
페닐알라닌	147	레틴산	300
티로신	163	비타민 B2 (리보플라빈)	376
		비타민 D2	397
		비타민 E (토코페롤)	431

올리고펩티드에 대한 공유 결합의 용이함에 기초하여 선택된 활성제가 위를 통과할 때의 구조 보호가 중요하기 때문에, 친지성 아미노산이 바람직하다. 아미노산의 분자량으로부터 18을 감하였는데, 이는 아미노산들의 폴리펩티드로의 축합을 고려하였기 때문이다. 예를 들어, 아스피린에 연결된 글리신의 10량체 (분자량=588)는 총 분자량이 750이며, 아스피린은 활성제 전달 조성물 총 중량의 24％를 차지하거나, 또는 덱스트란의 최대 약물 하중량의 2배가 넘을 것이다. 이는 단지 N- 또는 C-말단에 적용하는 경우에 해당하며, 예를 들어 데카글루탐산의 펜던트 (pendant)기에 활성제가 결합되는 경우에는 분자량 180의 약물이, 전적으로 실행가능하지는 않지만, 58％의 하중량을 갖는 것으로 생각할 수 있다.

활성제의 알콜, 아민 또는 카르복실산기는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드의 N-말단, C-말단 또는 측쇄에 공유 결합된다. 결합의 위치는 어느정도 관능기의 선택에 좌우된다. 예를 들어, 활성제가 카르복실산 (예, 아스피린)인 경우에는, 도 1에 나타낸 바와 같이 올리고펩티드의 N-말단이 결합의 바람직한 지점이다. 활성제가 아민 (예, 앰피실린)인 경우에는, 도 2에 나타낸 바와 같이 안정한 펩티드 결합 활성제를 얻기 위해 C-말단이 바람직한 결합 지점이다. 상기 C- 및 N-말단 예에 있어서, 펩티드는 본질적으로 새로운 펩티드 결합을 형성하는 단량체 단위에 의해 연장된다. 활성제가 알콜인 경우, C-말단 또는 N-말단 중 어느 하나가 안정한 조성물을 얻기 위해 바람직한 결합 지점이다. 알콜, 노르에틴드론이 폴리(히드록시프로필글루타민)에 결합된 상기 예에서 나타낸 바와 같이, 알콜은 포스겐 (phosgen)을 사용하여 알킬클로로포르메이트로 전환될 수 있다. 따라서, 본 발명은 도 3에 나타낸 바와 같이 중요한 중간체와 펩티드 담체의 N-말단과의 반응에 관한 것이다. 또한, 도 1 내지 3은 소장 펩티다제에 의해 펩티드 담체로부터 활성 성분이 방출되는 것을 도시하고 있다.

알콜은 글루탐산의 감마 카르복실레이트에 선택적으로 결합할 수 있으며, 그 후에 이 접합체는 펩티드 담체의 C-말단에 공유 결합된다. 글루탐산-약물 접합체는 이량체로 간주될 수 있기 때문에, 이 생성물은 펩티드 담체의 C-말단에 2개의 단량체 단위를 부가하며, 여기서 글루탐산 잔기는 도 4에 나타낸 바와 같이 펩티드와 약물 사이의 스페이서로서 작용한다. 중요한 펩티드 결합의 소장 효소적 가수분해는 펩티드 담체로부터 글루탐산-약물 잔기를 방출한다. 새로이 형성된 글루탐산 잔기의 유리 아민은 그 후에 분자내 아민교환반응을 거침으로써, 도 5에 나타낸 바와 같이 피로글루탐산의 형성을 수반하여 활성제를 방출할 것이다. 별법으로, 글루탐산-약물 이량체는 글루탐산 N-카르복시안하이드라이드 에스테르로 전환될 수 있다. 그 후 이 중간체는, 도 4에 나타낸 바와 같은 적합한 개시제를 사용하여 상기 설명한 바와 같이 중합될 수 있다. 이 중합반응의 생성물은 다수의 펜던트기에 결합된 활성 성분과의 폴리글루탐산이다. 따라서, 담체 펩티드의 최대 약물 하중량이 달성될 수 있다. 또한, 다른 아미노산-NCA가 감마 에스테르 글루탐산 NCA와 공중합되어 약물 전달 시스템에 특정한 성질을 부여할 수 있다.

또한, 본 발명은 관능성 측쇄를 함유하는 다른 폴리펩티드에 대해 동일한 작용 메카니즘을 부여하는 방법을 제공한다. 그 예로는 폴리리신, 폴리아스파라긴, 폴리아르기닌, 폴리세린, 폴리시스테인, 폴리티로신, 폴리트레오닌 및 폴리글루타민이 포함되지만, 이것으로 한정되지는 않는다. 이 메카니즘은 펜던트기의 스페이서 또는 링커를 통해 이들 폴리펩티드에 관해 해석될 수 있으며, 이는 바람직하게는 글루탐산-약물 이량체에 의해 종결된다. 담체 펩티드-약물 접합체는, 약물 잔기의 1차 방출이 에스테라제에 의존하지 않고 펩티다제에 의존한다는 점에서 선행 기술과 구별된다. 별법으로, 활성제는 소화관 고유의 다른 몇몇 효소가 방출에 영향을 미칠 수 있는 펜던트기에 직접 결합될 수 있다.

활성제는 공지된 기술을 이용하여 N-말단, C-말단 또는 폴리펩티드의 측쇄에 공유 결합성으로 부착시킬 수 있다. N-말단형 펩티드에 유기 화합물을 연결하는 예로는 나프틸아세트산을 LH-RH에, 쿠마린산을 오피오이드 펩티드에, 그리고 1,3-디알킬-3-아실트리아젠을 테트라가스트린 및 펜타가스트린에 부착시키는 것이 있으 나 이에 한정되지는 않는다. 다른 예로서, 펩티드가 연결된 바이오틴 및 펩티드가 연결된 아크리딘을 형성하는 기술이 공지되어 있다.

폴리펩티드 담체는 종래 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직한 기술은 아미노산 N-카르복시안하이드라이드의 혼합물을 공중합시키는 것이다. 별법으로서, 특정한 배열을 희망하는 경우 고상 자동화 폴리펩티드 합성기를 사용할 수 있다.

안정화제를 조성물에 첨가함으로써 폴리펩티드를 추가로 안정화시킬 가능성이 있다. 당, 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 염과 같은 안정화제는 단백질 분해를 방지하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 다른 실시 양태에서, 다당류, 아미노산 복합 PEG 또는 염에 접합된 담체인 폴리펩티드-활성제를 마이크로 캡슐화하여 활성제의 제1 등급 이전의 방출성을 부여할 수 있다.

친수성 화합물이 특수화된 전달체에 의해 효과적으로 장의 상피를 통해 흡수된다는 증거가 있다. 전체 멤브레인 전달 시스템은 본질적으로 비대칭이며, 보조인자에 대해 비대칭적으로 반응한다. 따라서, 멤브레인 전달 시스템의 여기는 활성제의 국부화된 전달을 초래하는 일종의 특수화된 보조제와 관련됨을 예상할 수 있다. 전달된 기질의 물리적 특성에 따라 분류된 일곱 가지의 장 전달 시스템이 공지되어 있다. 이들은 아미노산, 올리고펩티드, 글루코스, 모노카르복시산, 포스페이트, 담즙산 및 P-글리코프로테인 전달 시스템을 포함하며, 각각은 그들 자신의 관련된 전달 메카니즘을 갖는다. 이 메카니즘은 수소 이온, 나트륨 이온, 결합 부위 또는 다른 보조 인자에 따라 달라질 수 있다. 본 발명은 또한 장 상피 전달 시 스템의 메카니즘의 표적화를 가능하게 하여 활성제의 흡수를 용이하게 한다.

본 발명의 다른 실시 양태에서, 조성물은 활성제의 생체 이용율을 증가시키기 위해 1종 이상의 보조제를 포함한다. 보조제의 첨가는, 첨가하지 않을 경우 불량하게 흡수되는 활성제를 사용하는 경우 특히 바람직하다. 적합한 보조제는 예를 들어 아미노펩티다제-N의 촉매 도메인을 루멘으로 방출하기 위한 파파인; BBM 내의 엔자임을 활성화시키는 글리코레코그나이저; 펩티드에 부착하여 펩티드의 흡착을 향상시키는 담즙산을 포함한다.

바람직하게는, 생성되는 펩티드-활성제 결합물은 적합한 부형제를 사용하여 정제로 제형되며 습식 미립화 또는 건식 압밀화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 본질적으로 산과 아민으로부터의 아미드의 형성으로서, 하기 실시예로 제조할 수 있다.

산/N-말단 컨쥬게이트 (도 1 참조)

산 생체 활성제는 질소 및 0 ℃로 냉각하에 DMF 중에 용해될 수 있다. 이어서 용액은 디이소프로필카르보디이미드 및 히드록시벤조트리아졸로 처리한 후 아민 펩티드 담체로 처리할 수 있다. 이어서 반응물을 실온하에 7 시간 동안 교반하고 우레아 부생성물을 여과하여 제거한 후, 에테르 중에 침전된 생성물을 겔 투과 크로마토그래피 (GPC) 또는 투석으로 정제시켰다.

아민/C-말단 컨쥬게이트 (도 2 참조)

펩티드 담체는 질소 및 0 ℃로 냉각하에 DMF 중에 용해될 수 있다. 이어서 용액은 디이소프로필카르보디이미드 및 히드록시벤조트리아졸로 처리한 후 아민 생 체 활성제로 처리할 수 있다. 이어서 반응물을 실온하에 7 시간 동안 교반하고 우레아 부생성물을 여과하여 제거한 후, 에테르 중에 침전된 생성물을 GPC 또는 투석으로 정제시켰다.

알콜/N-말단 컨쥬게이트 (도 3 참조)

이하의 실시예에서 알콜과 트리포스겐을 배합하여 클로로포르메이트를 제조하고, 이를 펩티드의 N-말단과 반응시키는 경우 카르바메이트를 제조하였다. 이에 따라, 알콜 생체 활성제를 질소하의 무수 DMF 중의 트리포스겐으로 처리할 수 있다. 이어서 적절하게 보호된 펩티드 담체를 서서히 첨가하고 용액을 실온하에 7 시간 동안 교반하였다. 이어서 생성물을 에테르 중에서 침전시켰다. 조 생성물을 적절하게 탈보호시키고 GPC로 정제하였다.

다른 용매, 활성제, 조촉매 및 염기를 사용할 수 있다. 다른 용매의 예로는 디메틸술폭시드, 에테르, 예컨대 테트라히드로푸란 또는 염소화 용매, 예컨대 클로로포름을 들 수 있다. 다른 활성제의 예로는 디시클로헥실카르보디이미드 또는 티오닐 클로라이드가 있다. 다른 조촉매의 예로는 N-히드록시숙신이미드가 있다. 염기의 예로는 피롤리디노피리딘, 디메틸아미노피리딘, 트리에틸아민 또는 트리부틸아민을 들 수 있다.

γ-알킬 글루타메이트의 제조 (도 4 참조)

정선한 알콜 약물에 적합할 수 있는 30종의 상이한 γ-알킬 글루타메이트가 존재한다. 예를 들어 글루탐산, 알콜 및 진한 염산의 현탁물을 제조하여 수 시간 동안 가열할 수 있다. γ-알킬 글루타메이트 생성물은 아세톤에 침전시켜 여과하 고 건조한 후 뜨거운 물로 재결정할 수 있다.

γ-알킬 글루타메이트/C-말단 컨쥬게이트 (도 4 참조)

펩티드 담체는 질소 및 0 ℃로 냉각하에 DMF 중에 용해될 수 있다. 이어서 용액은 디이소프로필카르보디이미드 및 히드록시벤조트리아졸로 처리한 후 γ-알킬 글루타메이트 생체 활성제로 처리할 수 있다. 이어서 반응물을 실온하에 7 시간 동안 교반하고 우레아 부생성물을 여과하여 제거한 후, 에테르 중에 침전된 생성물을 GPC 또는 투석으로 정제시켰다.

γ-알킬 글루타메이트-NCA의 제조

γ-알킬 글루타메이트는 트리포스겐이 첨가된 무수 THF 중에 현탁시킬 수 있으며, 혼합물이 균질화될 때까지 혼합물을 질소 대기하에 환류시킬 수 있다. 용액을 헵탄에 부어 NCA 생성물을 침전시키고, 이를 여과하고 건조한 후 적합한 용매로 재결정할 수 있다.

폴리[γ-알킬 글루타메이트]의 제조

γ-알킬 글루타메이트-NCA를 건조 DMF에 용해시킬 수 있고, 이 용액에 촉매량의 1차 아민을 점성이 될때까지 (전형적으로는 철야로) 첨가할 수 있다. 용액을 물에 붓고 여과함으로써 용액으로부터 생성물을 단리시킬 수 있다. GPC 또는 투석에 의해 생성물을 정제할 수 있다.

실시예 1

폴리글루탐산의 N-말단에 공유 결합된 T₃ 및 T₄의 공중합체를 포함하는 캡핑된 요오 도티로닌 조성물의 제조

글루탐산의 합성은 각종의 보고된 방법에 의해 널리 알려져 있다. 본 실시예에서는, 벤질 글루탐산 NCA (BnGlu-NCA) 단량체의 활성화에 의해 폴리글루탐산을 합성하였다. 이어서, BnGlu-NCA를 중합화하고 브롬화수소로 벤질기를 제거하였다. 폴리글루탐산을 캡핑할 때, 유리 카르복실산에 바람직하지 않은 친핵성을 부여하지 않고 브롬화수소 복합물 N-말단 아미노기를 유리하는 것이 중요하다. 탄산나트륨, 중탄산나트륨 및 아세트산나트륨을 사용한 반응에 의해 T₄ 및 T₃ 혼입이 감소되고 pKb가 증가된 글루탐산/T₄/T₃ 공중합체가 생성되었다. 아세트산나트륨은 그 pKb가 브롬화나트륨, 폴리글루탐산 및 나트륨 염의 pKa의 사이에 있기 때문에 바람직한 시약이다. 염기성 알루미나를 사용한 반응은 T₄-NCA 및 T₃-NCA를 식별할만한 캐핑 또는 자체 중합화없이 그대로 유지시켰다. T₄-NCA 및 T₃-NCA의 안정성은 글루탐산/T₄/T₃ 공중합체의 상업적 제조에 영향을 줄 것이다. 아세트산나트륨이 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 프로피온산나트륨, 부티르산나트륨, 피발산나트륨, 염기성 알루미나, 또는 아미노기와 착화된 브롬화수소를 중화시킬 수 있는 임의의 다른 약염기로 대체될 수 있다.

글루탐산/T₄/T₃ 공중합체의 합성은 벤질글루탐산, 티록신 및 트리요오도티로닌에 의해 개시되었다. 이들 각 신톤(synthon)은 적합한 유기 용매 중에서 트리포스겐과 독립적으로 반응하였다. BnGlu-NCA는 테트라히드로푸란(THF) 중에서 개 시제인 메톡시화나트륨과 중합화하였다. 폴리벤질글루탐산이 아세트산 중의 15％ 염화수소에 의해 탈보호되었다. 이 생성물은 DMF중에 용해되고 아세트산나트륨으로 처리된 비착화 염화수소로부터 유리될 필요가 있다. 미리 제조된 T₄-NCA 및 T₃-NCA를 혼합하여 용액에 첨가하였다. 이어서, 박막 크로마토그래피 (TLC)에 의해 T₄-NCA 및 T₃-NCA가 더이상 검출되지 않을 때까지 반응물을 교반하였다. 최종 생성물을 물에 첨가하고 침전물을 물로 세척하고 진공 건조하여 백색 비정질 분말을 얻었다.

수개의 약염기에 의한 실험은 폴리글루탐산의 캡핑에 카르복실산의 수종의 나트륨염이 작용한다는 것을 보여주었다. 이 반응 실험은 아세트산나트륨 대신에 프로피온산나트륨, 부티르산나트륨 및 피발산나트륨을 사용하여 행하였고, 모든 경우에 실질적으로 동일한 결과가 얻어졌다.

벤질글루탐산-NCA의 제조

질소하에서 400 mL 무수 에틸 아세테이트 중에 벤질글루탐산 (25 g)을 현탁시켰다. 혼합물을 가열 환류시키고, 트리포스겐 30 g을 6회로 동일하게 나누어 첨가하였다. 반응물을 균질화될때까지 3 시간 동안 환류시켰다. 용액을 실온으로 냉각하고, 여과하고, 진공 농축하였다. 백색 분말을 고온 무수 아세트산에틸로부터 재결정화하여 백색 분말 17.4 g (63％)을 얻었다.

T₄-NCA의 제조

질소 유입구가 장착된 둥근 바닥 플라스크에서, 티로신 5 g을 테트라히드로 푸란(THF) 25 mL 및 트리포스겐 1.3 g과 교반하고, 이 혼합물을 균질화될때까지 4 시간 동안 환류하였다. 용액을 실온으로 냉각하고, 교반하면서 헵탄 200 mL에 적가하였다. 결정을 여과하고 진공 건조하여 회백색 분말 4.72 g (91％)를 얻었다.

T₃-NCA의 제조

질소 유입구가 장착된 둥근 바닥 플라스크에서, 트리요오도티로닌 4.29 g을 테트라히드로푸란(THF) 20 mL 및 트리포스겐 1.45 g과 교반하고, 이 혼합물을 균질화될때까지 4 시간 동안 환류하였다. 용액을 실온으로 냉각하고, 교반하면서 헵탄 200 mL에 적가하였다. 황색 검으로부터 액체를 기울여 따라내고, 황색 검을 무수 에틸 아세테이트와 헥산으로부터 재결정화하여 백색 분말 2.5 g (56％)을 얻고, 고진공하에서 건조하였다.

폴리벤질글루탐산의 제조

벤질글루탐산 (17.4 g)을 질소하에서 무수 테트라히드로푸란 (THF)에 용해하고, 여기에 메톡시화나트륨 238 mg을 일부분씩 나누어 첨가하였다. 용액을 2일 동안 교반하였고, 점도가 현저히 증가하였다. 용액을 교반하면서 페트로륨 에테르 1.5 L에 부었다. 페트로륨 에테르를 기울여 따라내고, 1L의 추가의 페트로륨 에테르를 다시 첨가하였다. 혼합물을 수동 교반하고, 페트로륨 에테르를 기울여 따라내고, 페트로륨 에테르 500 mL로 이 공정을 반복하였다. 백색 고상물을 공기 건조하고, 이어서 진공 건조하여 백색 솜털 종이형 고체 14.7 (95％)를 얻었다.

폴리글루탐산의 제조

아세트산 (10 mL)을 아세트산 중의 30 중량％ 브롬화수소 (HBr) 0 mL와 교반하였는데, 이 때 폴리벤질글루탐산 1.96을 손으로 첨가하였다. 혼합물을 하루 동안 실온에서 교반한 후, 에테르 50 mL에 첨가하였다. 백색 침전물을 여과하여 에테르 4 X 30 mL로 세척하고, 고진공하에 건조하여 백색 분말 1.11 g (97％)을 생성하였다.

글루탐산/T₄/T₃ 공중합체의 제조

폴리글루탐산 (375 mg)을 3 mL의 DMF 중에 용해시켰다. 아세트산나트륨 (24 mg)을 첨가한 후, T₄-NCA 105 mg과 T₃-NCA 8 mg의 블렌드를 첨가하였다. 이 용액을 2일 동안 교반하였는데, TLC는 티로닌 출발 물질의 부재를 보여주였다. 이 용액을 물 30 mL에 쏟아부어, 10 ℃에서 철야 냉각시켰다. 침전물을 여과하고, 물로 세척하고, 고진공하에 건조시켜 밝은 베이지색의 분말 413 mg (85％)을 얻었다. 양성자 NMR은, 폴리글루탐산의 N 말단에 T₃과 T₄의 공중합체가 공유 결합되어 있음을 나타내었는데, 이 공중합체는 프로나제 효소계에 의해 2 시간 안에 사실상 완전히 분해되었다.

실시예 2

펩티드 중합체의 제조

폴리아스파르트산: Asp(OtBu) (13 mg, 0.07 mmol) 및 Asp(OtBu)-NCA (200 mg, 0.93 mmol)을 무수 DMF (5 ml) 중에 용해시키고, 이 용액을 아르곤 분위기하에 실온에서 철야 교반시켰다. 다음날 아침, 반응 혼합물 2.5 ml를 별도의 플라스크 (플라스크 B)에 옮겼다. T₄-NCA (27 mg, 0.03 mmol)을 본래의 플라스크 (플라스크 A)에 첨가하고, 상기 두 용액을 아르곤 하에 추가의 24 시간 동안 계속해서 교반시켰다. 물 (30 ml)을 각 플라스크에 첨가하여, 중합체를 침전시켰다. 생성된 고상물을 여과 수집하여 진공하에 철야 건조시켰다.

이어서, 건조된 Asp(OtBu)_n (플라스크 B) 및 T₄-Asp(OtBu)_n (플라스크 A)를 물 (3 ml) 중의 95％ 트리플루오로아세트산 중에 용해시키고, 실온에서 2 시간 동안 교반시켰다. 이어서, 에틸 에테르 (10 ml)를 첨가한 후, 현탁액을 4 ℃에서 2 시간 동안 저장하여, 탈보호된 중합체를 침전시켰다. 이어서, 각각의 중합체를 여과 수집하고, 고상물을 진공하에 철야 건조시켰다. 이로써, Asp_n (플라스크 B) 48 ml 및 T₄-Asp_n (플라스크 A)가 제공되었다. MALDI는 다양한 길이의 중합체들의 혼합물로 구성된 T₄-Asp_n (플라스크 A)이 T₄-Asp_3-12임을 나타내었다.

폴리세린 및 폴리트레오닌도 이러한 프로토콜을 사용하여 제조하였다. 세린 반응 혼합물은 N-메틸모르폴린 (1.1 당량)을 함유하였다.

아미노산 유도체	중합체	단리량(mg)	％수율	질량 범위
Asp(OtBu)	Asp(OtBu)n	48	84％	측정불가
	T4-Asp(OtBu)n	12	14％	T4-Asp3-12
Ser(OtBu)	Ser(OtBu)n	73	101％3	Ser7-8
	T4-Ser(OtBu)n	50	43％	T4-Ser4-9
Thr(OtBu)	Thr(OtBu)n	29	20％	Thr7-8
	T4-Thr(OtBu)n	66	24％	T4-Thr1-8

％수율은 반응을 분할(splitting)하기 전에 원래 반응 중의 아미노산 총함량을 기 초로 하여 계산하였다. 질량 범위는 MALDI로부터 측정하였다. 100％를 초과하는 수율은 염이 존재하거나 또는 반응 혼합물이 분할되었을 때 고르지 못한 분포를 반영할 수 있다.

HPLC 및 프로나제 실험은 T₄-Asp_3-12, T₄-Ser_4-9, 및 T₄ -Thr_1-8 샘플 중에 T₄가 거의 존재하지 않거나 또는 전혀 존재하지 않음을 나타내고, 분해시 T₄가 유리되었음을 나타낸다.

N-카르복시안하이드라이드

이하에 기입되어 있는 아미노산의 N-카르복시안하이드라이드 (NCA's)은 글루탐산에 대해 보고된 프로토콜과 유사한 프로토콜을 사용하여 제조하였다. 최종 작업에 있어서는 약간의 변경만 이하에 기록한다.

아미노산	NCA에 있어서의 화학 이동
	α	β	γ	기타 (OtBu)
알라닌	4.41 (q, 1H)	1.57 (d, 3H)
발린	4.20 (d, 1H)	2.28-2.19 (m, 1H)	1.08 (d, 3H) 1.02 (d, 3H)
세린 (OtBu)	4.58 (m, 1H)	3.62 (dd, 1H) 3.50 (dd, 1H)		1.10 (s, 9H)
아스파르트산 (OtBu)	4.51 (dd, 1H)	2.93 (dd, 1H) 2.73 (dd, 1H)		1.44 (s, 9H)
글루탐산 (OtBu)	4.34 (dd, 1H)	2.28-2.20 (m, 1H) 2.09-1.99 (m, 1H)	2.45 (t, 2H)	1.44 (s, 9H)

아미노산	NCA의 단리
알라닌	헥산중의 침전물 68％ 수율
발린	헥산중의 침전물 89％ 수율
세린 (OtBu)	이소프로판올중의 현탁액 및 헥산중의 침전물 83％ 수율
아스파르트산 (OtBu)	이소프로판올중의 현탁액 및 헥산중의 침전물 55％ 수율
글루탐산 (OtBu)	이소프로판올중의 현탁액 및 헥산중의 침전물 77％ 수율

실시예 3

(Glu)_n-셉할렉신의 제조

Glu(OtBu)NCA (1.000 g, 4.4 mmol) 및 셉할렉신·HCl (0.106 g, 0.3 mmol)을 무수 DMF (5 ml) 중에 용해시켰다. 이어서, 반응물을 아르곤하에 실온에서 교반시켰다. 3일 후, 용매를 진공하에 회전식 증발에 의해 제거하였다. 이어서, 생성된 고상물을 아르곤하에 두고, 이어서 디옥산 (2 ml) 중의 4N HCl 중에 용해시킨 후, 아르곤 블랭킷하에 실온에서 교반시켰다. 1 시간 후, 진공하에 회전식 증발에 의해 디옥산 및 HCl을 제거하였다. 이어서, 고상물을 메탄올 (2 ml) 중에 현탁시키고, 잔존하는 HCl 및 디옥산을 제거하기 위해 회전식 증발에 의해 다시 한번 건조시켰다. 이어서, 이 물질을 메탄올 (2 ml) 중에 재현탁시키고, 물 (20 ml)을 가하여 침전시켰다. 이어서, 수현탁액을 4 ℃에서 4 시간 동안 저하고, 고상물을 원심분리법에 의해 단리시켰다. 이어서, 펠렛화된 물질을 진공하에 철야 건조시켰다. MALDI에 의해 측정한 바와 같이, 이 공정에 의해 (Glu)_n과 (Glu)_n-셉할렉신 (464 mg)의 혼합물이 제공되었다. MALDI는 중합체 (Glu)_7-13과 (Glu)_5-14-셉할렉신의 혼합물을 나타낸다. 다른 길이의 쇄가 존재할 수 있지만, 이들은 MALDI 스펙트라에서 명백하게 보이지 않았다. 역상 HPLC (265 nm 검출, C18 컬럼, 16％ MeOH/4％ THF/80％ 물 이동상)는 단리된 물질중에 유리 셉할렉신이 전혀 존재하지 않음을 나타내었다. HPLC 에서 "물"이라 함은 실제로 0.1％ 헵탄술폰산과 1.5％ 트리에틸아민의 수성 완충액을 칭한다.

실시예 4

날트렉손 유도체:

3-메틸-날트렉손: 날트렉손 (6.0 g, 16.5 mmol)을 100 ml의 증류수에 용해하였다. 용액을 1N NaOH을 사용하여 11.8의 최종 pH로 분쇄하였다. 분쇄하는 동안, 용액으로부터 중성 날트렉손이 침전된 후 용액으로 다시 용해되었다. pH 11.8에 도달하였을때, 용매를 진공하에서 회전-증발에 의해 제거하고 얻어진 고체를 실온의 진공하에서 밤새 보관하였다. 이어서 고체를 무수 테트라히드로푸란 (200 ml)에 현탁/용해시키고 아르곤하 실온에서 교반하였다. 50 ml의 테트라히드로푸란 중 요오도메탄 (2.1 mg, 33 mmol)의 용액을 30 분에 걸쳐 적가하였다. 그 후, 반응을 아르곤하 실온에서 3 시간 더 교반하였다. 이어서 용매를 감압하에서 회전-증발에 의해 제거하였다. 잔류하는 고체를 40 ml의 CHCl₃에 용해하고 유기 용액을 30 ml의 포화 NaCl, 3 x 30 ml의 1N NaOH로 세척하고, 마지막으로 30 ml의 포화 수성 NaCl로 2 회 더 세척하였다. 유기 용액을 수거하고 황산나트륨상에서 건조시켰다. 용매를 회전-증발에 의해 제거하고 진공하에서 밤새 건조시켜 순수한 3-메틸날트렉손 (5.6 g, 15.8 mmol, 96 ％ 수율)을 갈색 잔류물로 얻었고, 그 조성을 TLC 및 ¹H-NMR에 의해 결정하였다. 날트렉손의 스펙트럼과의 비교에 의해 화합물을 확인하기 위해 사용한 특징: ¹H-NMR (360 MHz, CDCl₃) δ 6.677 (d, 1H, 날트렉손 방향족), 6.591 (d, 1H, 날트렉손 방향족), 3.874 (s, 3H, 메톡시기), 0.6-0.5 ppm (m, 2H, 날트렉손 시클로프로필) 및 0.2-0.1 ppm (m, 2H, 날트렉손 시클로프로필).

Boc-Glu(Nal)-OtBu: 고체 Boc-Glu-OtBu (0.96 g, 3.18 mmol), 날트렉손 (1.00 g, 2.65 mmol) 및 PyBrop (1.73 g, 3.71 mmol)을 5 ml의 무수 DMF에 용해하고 아르곤하 실온에서 교반하였다. 무수 N-메틸모르폴린 (1.08 ml, 9.81 mmol)을 첨가하고 반응을 아르곤하 실온에서 계속 교반하였다. 2 일 후 추가의 Boc-Glu-OtBu (0.096 g, 0.32 mmol), PyBrop (0.173 g, 0.37 mmol) 및 N-메틸모르폴린 (0.10 ml, 0.981 mmol)을 첨가하였다. 2 일이 더 지난 후, 용매를 회전-증발에 의해 높은 진공하에서 제거하였다. 이어서 얻어진 잔류물을 CHCl₃에 용해하고, 얻어진 유기 용액을 2 x 20 ml의 포화 NaCl, 3 x 20 ml의 10 ％ Na₂CO₃로 추출하고 마지막으로 20 ml의 포화 수성 NaCl로 세척하였다. 유기 용액을 수거하고 황산나트륨상에서 건조시킨 후, 실리카 상에 흡착시켰다. 그 후, 아미노산과 콘쥬게이트된 순수한 날트렉손 (0.486 g, 0.78 mmol, 29 ％)을 플래시 크로마토그래피 (CHCl₃ 중 0-1.5 ％ CH₃OH의 구배)에 의해 단리시켰다. 단리된 물질의 순수도를 TLC (6:1 CH₃OH/CHCl₃)에 의해 결정하고, 아미노산 잔기 및 날트렉손 둘 다의 존재를 ¹ H-NMR에 의해 확인하였다. 표시된 양성자 (Indicative proton): ¹H-NMR (360 MHz, CDCl₃) δ 6.81 (d, 1H, 날트렉손 방향족), 6.63 (d, 1H, 날트렉손 방향족), 4.3-4.2 (m, 1H, 글루탐산 α-양성자), 1.7-1.3 (한쌍의 bs, 18H, Boc 및 OtBu 기), 0.6-0.4 ppm (m, 2H, 날트렉손 시클로프로필) 및 0.2-0.0 ppm (m, 2H, 날트렉손 시클로프로필).

Boc-Asp(Nal)-OtBu: 유사한 프로토콜을 사용하여 Boc-Asp(Nal)-OtBu를 41％ 단리 수율로 얻었다. 표시된 양성자: ¹H-NMR (360 MHz, CDCl₃): δ 6.84 (d, 1H, 날트렉손 방향족), 6.66 (d, 1H, 날트렉손 방향족), 4.6-4.5 (m, 1H, 아스파르트산 α-양성자), 1.6-1.3 (한 쌍의 bs, 18H, Boc 및 OtBu 기), 0.7-0.5 ppm (m, 2H, 날트렉손 시클로프로필) 및 0.4-0.1 ppm (m, 2H, 날트렉손 시클로프로필).

NMR 특성:

날트렉손은 복잡한 NMR 스펙트럼을 갖지만, 몇몇 주요한 양성자는 독특한 화 학적 이동을 갖고 날트렉손에 대해 특이하다.

실시예 5

폴리-Glu (아시클로버 (Acyclovir))

DMF (25 ml) 중 폴리-glu₁₅ (0.600 g, 0.310 mmol)의 용액에 EDCI (2.07 g, 10.8 mmol)을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 주위 온도에서 1 시간 동안 교반하였 다. 이어서, N-메틸 모르폴린 (0.51 ml, 4.7 mmol)에 이어 아시클로버 (1.74 g, 7.75 mmol), DMF (25 ml) 및 N-메틸 모르폴린 (0.85 ml)의 혼합물을 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 4 일 동안 교반하였다. 그 후, 물 (50 ml)을 첨가하고 모든 용매를 제거하였다. 건조된 혼합물에 물 (100 ml)을 첨가하고 미반응 아시클로버의 침전물이 형성되었다. 고체를 원심분리하고 초여과에 의해 (YM1 막) 상청액을 정제하였다. 약 300 ml의 물을 막을 통해 통과시켰다. NMR은 예상치 못했던 알킬-우레아 측쇄 불순물이 부착되어 있음을 나타내었다. 폴리-glu (아시클로버) (0.970 g)을 연황색 고체로 얻었다: ¹H NMR (D₂O) δ 1.11 (br m, 4H, 우레아), 2.01 (br m, 2H, Glu-βH), 2.39 (br m, 2H, Glu-γH), 2.72 (br m, 2H, 우레아), 3.32 (br m, 6H, 아시클로버 CH₂ 및 우레아), 3.83 (br m, 3H, 우레아), 4.38 (br d, 3H, Glu-α H), 5.47 (br s, 2H, 아시클로버 1' CH₂), 7.94 (br s, 1H, 아시클로버 8 CH).

실시예 6

폴리-Glu (펙소페나딘 (Fexofenadine))

DMF (5㎖) 중의 폴리-Glu₁₅ (0.078g, 0. 040mmol)의 용액에 EDCI (0.035g, 0.18mmol)을 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, N-메틸 모르폴린 (0.03㎖, 0.24mmol)을 첨가하였다. 10분 동안 교반한 후, 펙소페나딘 (0.100g, 0.20mmol), N-메틸 모르폴린 (0.07㎖, 0.60mmol) 및 DMF (5㎖)의 용액을 주사기를 통해 첨가하였다. 상온에서 3일 동안 교반 반응시킨 후, 시료를 물 (25㎖)에 용해시켰다. 약물-공액이면서 펙소페나딘이 없는 고체 침전물이 형성되었다. 물을 산성화시키고, 모든 고체를 용해시켰다. 한외여과 (YM1 후에 YM3) 및 pH 7에서 세파덱스-25를 사 용한 크기 배제 크로마토그래피를 사용한 정제로 백색 고체로서의 폴리-Glu(펙소페나딘) (0.010g)을 수득하였다. ¹H NMR (D₂O) δ1.37 (s, 8H, 펙소페나딘 CH₂ 및 CH₃), 1.58 (br m, 5H, 펙소페나딘 CH 및 CH₂), 1.99 (br m, 24H, Glu-βH), 2.31 (br m, 24H, Glu-γH), 2.70 (br m, 10H, 펙소페나딘 CH 및 CH₂), 4.14 (br m, 26H, Glu-αH), 7.25 (br m, 14H, 펙소페나딘 방향족 H)

H).

실시예 7

폴리-Glu(잘시타빈)

DMF (8㎖) 중의 폴리-Glu₁₅ (0.123g, 0.060mmol)의 용액에 EDCI (0.403g, 2.10mmol)을 첨가하였다. 30 분 후, N-메틸 모르폴린 (0.13㎖, 1.2mmol)을 첨가하였다. 35분 후, 잘시타빈 (0.200g, 0.95mmol), N-메틸 모르폴린 (0.l0㎖, 0.9mmol) 및 DMF (2㎖)의 용액을 주사기를 통해 첨가하였다. 생성된 혼합물을 상온에서 48 시간 동안 교반하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 물 (15㎖)에 용해시켰다. 한외여과 (YM1 후에 YM3) 및 pH 7에서 세파덱스-25를 사용한 크기 배제 크로마토그래피로 밝은 황색 고체로서의 폴리-Glu(잘시타빈) (0.083g)을 수득하였다. ¹H NMR (DMSO-d₆ w/D₂O) δ1.14 (br m, 20H, 우레아), 1.90 (br m, 잘시타빈 중의 30H, Glu-βH, Glu-γH 및 CH₂), 2.66 (br m, 4H, 우레아), 3.24 (br m, 36H, 잘시타빈 중의 우레아, CH 및 CH₂), 4.29 (br m, 8H, Glu-αH), 5.87 (br s, 1H, 잘시타빈 1 'CH), 7.18 (br s, 1.19H, 잘시타빈 NH₂), 8.52 (br s, 1H, 잘시타빈 6 CH).

실시예 8

폴리-Glu(스타부딘)

폴리-Glu(잘시타빈)과 유사하게 제조하였다. 한외여과(YM1)을 사용한 정제로 백색 고상물로서의 폴리-Glu(스타부딘) (0.089g)을 수득하였다. ¹H NMR (D₂O) δ1.87 (s, 3H, 스타부딘 5 CH₃), 2.06 (br m, 38H, Glu-βH 및 Glu-γH), 2.49 (br m, 12H, Glu-γH), 3.75 (br m, 12H, 우레아 및 스타부딘 5' CH₂), 3.96 (br m, 12H, 우레아), 4.45 (br d, 13H, Glu-αH), 5.98 (d, 1H, 스타부딘 1' CH), 6.48 (d, 1H, 스타부딘 3' CH), 6.96 (d, 1H, 스타부딘 2' CH), 7.63 (s, 1H, 스타부딘 6 CH).

실시예 9

폴리-Glu(메트로니다졸)

폴리-Glu(잘시타빈)과 유사하게 제조하였다. 한외여과(YM1)을 사용한 정제로 황색 고체로서의 폴리-Glu(메트로니다졸) (0.326 g)을 수득하였다. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ1.18 (br d, 13H, 우레아), 1.93 (br s, 17H, Glu-βH 및 Glu-γH), 2.71 (br s, 16H, 우레아), 4.01 (br m, 18H, Glu-αH 및 메트로니다졸 CH₂), 4.58 (br s, 2H, 메트로니다졸 CH₂), 8.05 (br s, 1H, 메트로니다졸 2 CH).

실시예 10

메틸 날트렉손-글루코스 케탈 컨쥬게이트

디옥산 (20 ml) 중 메틸 날트렉손 (0.200 g, 0.56 mmol)의 용액에 D-α-글루코스 (2.02 g, 11.2 mmol), 트리플루오로메탄술폰산 (0.05 ml, 0.62 mmol) 및 CuS0₄ (1.OO g)를 첨가했다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 4 일 동안 교반했다. 이어서, 반응물을 여과하고 NaHCO₃ (포화)로 중화시켜 다시 여과했다. 디옥산 및 물을 제거하고, 잔류물을 CHCl₃ 중에 취하여 물로 추출 (3 ×100 ml)했다. 유기층을 MgS0₄상에서 건조시키고 용매를 감압하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카겔 (CHCl₃ 중 0 내지 10 ％ MeOH)상에서 정제하여 케탈 컨쥬게이트 (O.O1O g)를 유리 메틸 날트렉손과의 1 : 1 혼합물로서 수득했다: ¹H NMR (CDCl₃) δ 0.14 (br s, 4H, 날트렉손 시클로프로필), 0.53 (br m, 4H, 날트렉손 시클로프로필), 0.90 (m, 2H, 날트렉손 시클로프로필), 1.48 (m, 6H, 날트렉손), 2.19-2.78 (m, 12H, 날트렉손), 3.03 (m, 2H, 날트렉손), 3.75 (q, 2H, 글루코스), 3.87 (m, 8H, 날트렉손 CH₃ 및 글루코스), 3.97 (q, 2H, 글루코스), 4.14 (q, 1H. 글루코스), 4.33 (t, 1H, 글루코스), 4.66 (s, 1H, 날트렉손), 6.65 (m, 4H, 날트렉손).

실시예 11

2-아미노-펜타네디오산 5-(4-아세틸아미노-페닐) 에스테르 또는 Glu(아세트아미노펜)

THF (15 ml) 중 Boc-Glu(OSuc)-OtBu (0.500 g, 1.25 mmol) 및 아세트아미노펜 (0.944 g, 6.25 mmol)의 용액에 N-메틸 모르폴린 (1.40 ml, 12.5 mmol)을 첨가했다. 상기 반응물을 환류 가열하고 환류하에 밤새 교반했다. 이어서, 용매를 제거하고 조 화합물을 실리카겔 (헥산 중 50 내지 75 ％ 에틸 아세테이트)상에서 정 제하여 Boc-Glu(아세트아미노펜)-OtBu (0.432 g, 0.900 mmol, 72 ％)을 수득했다: ¹H NMR (CDCl₃) δ 1.43 (d, 18H, t-Bu), 1.97 (m, 1H, Glu-βH), 2.12 (s, 3H, 아세트아미노펜 CH₃), 2.25 (m, 1H, Glu-βH), 2.60 (m, 2H, Glu-γH), 4.25 (m, 1H, Glu-αH), 7.04 (d, 2H, 아세트아미노펜 방향족), 7.48 (d, 2H, 아세트아미노펜 방향족).

디옥산 (10 ml) 중 4 N HCl 중 Boc-Glu(아세트아미노펜)-OtBu (0.097 g, 0.20 mmol)의 용액을 상온에서 2 시간 동안 교반했다. 용매를 제거하여 glu(아세트아미노펜) (0.90 g)을 HCl 염으로서 수득했다: ¹H NMR (D₂0) δ 2.19 (s, 3H, 아세트아미노펜 CH₃), 2.41 (m, 2H, Glu-βH), 2.97 (t, 2H, Glu-γH), 4.18 (t, 1H, Glu-αH), 7.19 (d, 2H, 아세트아미노펜 방향족), 7.51 (d, 2H, 아세트아미노펜 방향족); ¹³C NMR (DMSO) δ 23.80, 29.25, 51.00, 66.24, 119.68, 121.69, 137.00, 145.35, 168.23, 170.42, 170.79.

3-(2,5-디옥소-옥사졸리딘-4-일)-프로피온산 4-아세틸아미노페닐 에스테르 또는 Glu(아세트아미노펜) NCA

THF (40 ml) 중 2-아미노-펜타네디오산 5-(4-아세틸아미노-페닐)에스테르 (1.54 g, 4.29 mmol)의 혼합물에 트리포스겐 (1.02 g, 3.43 mmol)을 첨가했다. 생성된 용액을 3 시간 동안 환류하에 교반했다. 반응 동안, 생성물이 침전되었고 이를 여과하여 glu(아세트아미노펜)의 NCA를 회백색 고체로서 수득했다 (1.02 g, 2.64 mmol, 62 ％): ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2.01 (s, 3H, 아세트아미노펜 CH₃), 2.15 (m, 2H, Glu-βH), 2.81 (m, 2H, Glu-γH), 3.76 (t, 1H, Glu-αH), 7.06 (d, 2H, 아세트아미노펜 방향족), 7.63 (d, 2H, 아세트아미노펜 방향족), 8.57 (br s, 1H, 아미드), 10.19 (s, 1H, 아미드) ; ¹³C NMR (DMSO) δ 23.81, 29.25, 52.13, 54.62, 119.66, 121.71, 136.98, 145.35, 167.44, 168.19, 170.46, 170.77.

실시예 12

Glu(디피리마돌)

THF (35 ml) 중 디피리마돌 (0.500 g, 0.990 mmol) 및 Boc-Glu(OSuc)-OtBu (3.96 g, 9.91 mmol)의 용액에 DMAP (0.072 g, 0.60 mmol) 및 N-메틸 모르폴린 (0.22 ml, 1.98 mmol)을 첨가했다. 이어서, 상기 용액을 48 시간 동안 환류시켰다. 이어서, 용매를 제거하고 조 생성물을 실리카겔 (헥산 중 25 내지 50 ％ 에틸 아세테이트)상에서 정제했다. 2가지 주요 생성물을 단리했으며, 이 중 하나는 R = 2-3 (0.57 g)이었고, 다른 하나는 R = 3-4 (2.80 g)였으며 밝은 황색 오일이었다: [R = 2-3인 경우, ¹H NMR (CDCl₃) δ 1.41 (s, 42H, t-Bu), 1.64 (br s, 5H, 디피리마돌), 1.85 (m, 2H, Glu-βH), 2.07 (m, 2H, Glu-βH), 2.37 (m, 4H, Glu-γH), 3.60-4.24 (m, 12H, Glu-αH 및 디피리마돌)]; [R = 3-4인 경우, 1.44 (s, 56H, t-Bu)를 제외하고는 상기와 유사함].

Boc-Glu(디피리마돌)-OtBu (R = 2-3, 0.57 g) 및 디옥산 (20 ml) 중 4 N HCl의 용액을 상온에서 2.5 시간 동안 교반했다. 용매를 제거하였으며, 생성물 (0.280 g)은 밝은 황색 고체였다: ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 1.65 (br m, 4H, Glu-βH 및 디피리마돌), 2.04 (br m, 2H, Glu-βH), 2.40 (br m, 4H, Glu-γH), 3.75 (br m, 8H, 디피리마돌), 3.91 (br m, 2H, Glu-αH), 8.55 (br m, 2H, 아미드 H).

실시예 13

Glu(AZT)

디옥산 (75 ml) 중 지도부딘 (1.OO g, 3.75 mmol) 및 Boc-Glu(OSuc)-OtBu (3.00 g, 7.49 mmol)의 용액에 DMAP (0.137 g, 1.13 mmol) 및 N-메틸 모르폴린 (0.82 ml, 7.49 mmol)을 첨가했다. 상기 용액을 6 시간 동안 환류 가열하고 70 ℃에서 12 시간 동안 가열했다. 이어서, 용매를 제거하고 조 생성물을 실리카겔 (100 ％ CHCl₃)상에서 정제하여 Boc-Glu(AZT)-OtBu (1.09 g, 1.91 mmol, 51 ％)를 황색 포움으로서 수득했다: ¹H NMR (CDCL₃) δ 1.40 (d, 32H, t-Bu), 1.86 (s, 3H, AZT CH₃), 2.11 (m, 2H, Glu-βH), 2.38 (m, 4H, Glu-γH 및 AZT 2'CH₂), 4.00-4.31 (m, 4H, AZT 4'CH, 5'CH₂ 및 Glu-αH), 5.21 (d, 1H, AZT 3'CH), 6.01 (t, 1H, AZT 1'CH), 7.16 (s, 1H, AZT 6CH).

디옥산 (20 ml) 중 4 N HCl 중 Boc-Glu(AZT)-OtBu (1.09 g, 1.91 mmol)의 용 액을 4 시간 동안 교반하고 용매를 제거했다. 생성물인 Glu(AZT) (0.89 g, 1.99 mmol, 정량)을 황색 유리로서 수득했다: ¹H NMR (D₂0) δ 1.89 (s. 3H, AZT CH₃ ), 2.21 (m, 4H, Glu-βH 및 AZT 2'CH₂), 2.58 (m, 2H, Glu-γH), 3.70 (t, 1H, Glu-αH), 4.05-4.41 (m, 4H, AZT 4'CH, 3'CH 및 5'CH₂), 6.18 (t, 1H, AZT 1'CH), 7.51 (s, 1H, AZT 6CH).

실시예 14

트레오닌 NCA

THF (25 ml) 중 Thr-OtBu (0.500 g, 2.85 mmol)의 혼합물에 트리포스겐 (0.677 g, 2.28 mmol)을 첨가했다. 생성된 용액을 3 시간 동안 환류 교반했다. 상기 용액을 건조될 때까지 증발시켜 Thr-NCA를 백색 고체로서 수득했다 (0.500 g, 2.48 mmol, 87 ％). Thr-NCA를 추가의 특성화 없이 사용했다.

실시예 15

중합용 출발 합성 대등체로서 DRUG-GLU 접합체의 제조

비1급 아민 약물 후보자로서, Drug-poly-Glu 접합체의 형성은 문제점이 많은 것으로 입증될 수 있다. 이러한 곤란성을 극복하기 위하여, 약물을 우선 Glu와 접합시키고, 이어서 이 합성 대등체를 개시된 커플링에 사용하는 다음과 같은 계획을 사용하였다. 프로토콜을 세르트랄린 및 메토클로프라미드에 성공적으로 적용하였다.

Boc-Glu(OtBu)-OH와 세르트랄린의 커플링을 위한 프로토콜

1. Boc-Glu(OtBu)-OH (0.44 g, 1.46 mmol) 및 PyBOP (0.84 g, 1.60 mmol)을 교반하며 무수 DMF (15 mL)에 용해하였다.

2. DIEA (0.31 mL, 1.75 mmol)을 첨가하고 아미노산 유도체를 15분 동안 활성화하였다.

3. 세르트랄린 히드로클로라이드 (0.50 g, 1.46 mmol)를 교반중인 혼합물에 첨가한 후, 추가로 DIEA 0.31 mL를 첨가하였다.

4. 혼합물을 16시간 동안 교반하였다.

5. 용액을 제거하여 갈색 오일을 얻었다.

6. 오일을 EtOAc (100 mL)에 용해하고 생성된 용액을 10 ％ HCl (3 x 30 mL), 포화 NaHCO₃, 4M NaHS0₄ 및 식염수 (2 x 30 mL, 각각)로 세척하였다.

7. 용액을 MgS0₄로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 용매를 회전 증발기로 제거하여 밝은 갈색 오일을 얻었다.

8. 오일을 진공 다기관 상에서 건조하고 생성물을 실리카겔 상에서 EtOAc/헥산 1:5 내지 1:4 용매 시스템을 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다.

9. 생성물 분획을 고이게 하고 용매를 회전 증발기에 의해 재차 제거하여 최종 생성물인 세르트랄린-NH-C(O)-Glu-NH3+ 0.85 g (99％)를 얻었다.

10. 제제를 진공 다기관 상에서 건조시켰다.

실시예 16

폴리-라이신-이부프로펜의 합성

I. 이부프로펜-O-숙신이미드 (RI-172)의 제조 (Grafe & Hoffman, Pharmazie 55 : 286-292, 2000)

실온에서 디옥산 5 mL 중 이부프로펜 (2.06 g, 10 mmol)의 교반중인 용액에 디옥산 25 mL 중 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 2.27 g, 11 mmol) 용액을 첨가하였다. 10분 후, 디옥산 15 mL 중 N-히드록시숙신이미드 (NHS, 1.16 g, 10 mmol) 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반한 후, 하소 유리 깔대기를 통해 여과하여 디시클로헥실우레아 (DCU)를 제거하였다. 회전 증발시킨 후, 생성물을 메틸렌 클로라이드/헥산에서 결정화하여 무색 고체 2.36 g (78％)을 얻었다. ¹H-NMR (dmso-d6): δ0.86 (d, 6, CH₃), 1.49 (d, 3, α-CH₃), 1.81 (m, 1, CH), 2.43 (d, 2, CH₂), 3.33 (m, 4, CH₂CH₂), 4.22 (q, 1, CH), 7.16 (d, 2, ArH), 7.28 (d, s, ArH).

II. 폴리-라이신과 이부프로펜-O-숙신이미드 (RI-197)의 접합

폴리-라이신-HBr (Sigma, 100 mg, 34.5 nmol)를 중탄산 나트륨을 사용하여 pH 8로 만든 물 1 mL에 용해하고 실온에서 교반하였다. 이 용액에 디옥산 2 mL 중 이부프로펜-O-숙신이미드 (116 mg, 380 nmol) 용액을 첨가하였다. 하룻밤 동안 교반한 후, 디옥산을 회전 증발시켜 제거하고 pH 8의 물 중 중탄산 나트륨 10 mL를 사용하여 희석시켰다. 침전된 생성물을 하소 유리 깔대기를 통해 여과하고 물 3 X 10 mL 및 디에틸 에테르 4 X 10 mL로 세척하였다. 고진공에 의해 하룻밤 동안 건조시킨 후, 고체 생성물 105 mg (62％)을 긁어내어 얻었다. ¹H-NMR (dmso-d6): δ 0.85 (br s, 6, CH₃), 1.27 (br s, 3, α-CH₃), 1.40-1.79 (m, 5, 이부 및 라이신의 CH, γ 및 δ CH₂CH₂), 2.31 (d, 2, βCH₂), 2.41-2.52, dmso 하 (m, 2, βCH₂), 2.73-3.01 (m, 2, εCH₂), 3.51-3.85 (m, 1 이부 CH), 4.01-4.43 (m, 1, αCH), 7.14 (d, 2, ArH), 7.6 (d, 2, ArH), 7.90-8.06 (m, 2, NH).

실시예 17

[리신]_xx, [겜피브로질 또는 나프록센] 또는 [Glu]_xx L-DOPA의 합성 요약

[Glu]₁₅-L-디히드록시페닐알라닌 또는 [Glu]₁₅-L-DOPA의 합성

L-DOPA (0.050 g, 254 μmol) 및 GluNCA (0.666 g, 3.85 mmol)을 DMF 6 ㎖에 용해시켰다. 아르곤하에 밤새 교반한 후, 반응물을 박층 크로마토그래피 (9:1 H₂0: HOAc)하여 반응물이 특정 유리 약물 (R_f=0.70) 및 중합체일 것으로 추정되는 더욱 극성인 점 (R_f=0.27)으로 나타남을 검사하였다. 반응물을 H₂O 12 ㎖를 첨가하여 급냉시켰다. pH를 1N HCl을 이용하여 pH 1 내지 2로 조절하였다. 용매를 회전 증발기로 제거하고, 점성의 잔류물을 진공하에 건조시켰다. 생성된 시럽을 H₂O가 들어 있는 새로운 용기에 옮기고, 동결건조시켰다. 생성된 결정은 회백색 내지 밝은 갈색이었다. 수율: 0.470 g, 62％. ¹H NMR은 피로글루탐산 혼합물을 나타냈다: 그러므로, 물질을 H₂O에 현탁시키고, 한외여과 (밀리포어 제조, 재생 셀룰로스, YM1, NMWL=1,000)시키고, 보유물을 진공하에 건조시켰다. 수율: 0.298 g. ¹H NMR (500 MHz, DMSO)은 상대 비율 30:1의 Glu:L-DOPA, 6.6 (L-DOPA 방향족), 6.4 (L-DOPA 방향족), 4.1 (Glu, α) 1.85 (Glu, β), 2.25 (Glu, γ, L-DOPA), 2.3 (L-DOPA, 벤질), 12.4-11.5 (Glu, CO₂H), 8.0 (Glu, 아미드)를 나타냈다.

[Glu]₁₀-L-DOPA의 합성

GluNCA를 0.439 g 사용하는 것을 제외하고는 [Glu]₁₅-L-DOPA의 합성에서와 같 았다. 정제한 물질의 최종 수율은 0.007 g였다. ¹H NMR (500 MHz, DMSO)은 8:1 Glu:L-DOPA를 나타냈다.

나프록센-숙신이미드의 합성

디옥산 5 ㎖ 중의 나프록센 (2.303 g, 10 mmol)에 디옥산 15 ㎖에 용해시킨 N-히드록시숙신이미드 (1.16 g, 10 mmol) 및 디옥산 25 ㎖에 용해시킨 디시클로헥실카르보디이미드 (2.27 g, 11 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 밤새 교반하고, 불용성 디시클로헥실우레아를 여과하여 제거하였다. 용매를 회전 증발기로 제거하고, 잔류물을 CH₂Cl₂ 30 내지 40 ㎖에 용해시켰다. 헥산 약 10 ㎖를 첨가하고, 혼합물을 4 ℃에서 2 시간 동안 냉각시켰다. 작은 평면상 결정이 형성되기 시작할 때까지 헥산을 추가로 적가하고, 활성화 에스테르를 수거하고, 헥산으로 세척하고, 진공하에 건조시켰다 (2.30 g, 70.0 ％). ¹H NMR (500 MHz, DMSO) 1.70 (d, 3H, CH₃), 2.9 (s, 4H, 숙신이미드), 3.91 (s, 3H, OCH₃), 4.18 (q, 1H, 메틴) 7.75-7.12 (m, 6H, 방향족).

폴리리신-나프록센의 합성

H₂O 1 ㎖ (10 mg/㎖ Na₂C0₃ 함유) 중의 [Lys]₁₄· 14 ·HBr (0.100 g, 35 mmol)에 디옥산 2 ㎖ 중의 나프록센-숙신이미드 (0.124 g, 379 mmol)를 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 침전물이 형성되었다. H₂0 30 내지 40 ㎖ (10 mg/㎖ Na₂CO₃ 함유)를 첨가하여 더욱 침전시키고, 여과시켜 단리하고, Et₂0 50 ㎖로 세척하였다. 백색 미분체를 건조시켰다 (0.095 g, 53％) : ¹H NMR (500 MHz, DMSO) 8.1 (m, 1H, 리신; 아미드), 7.8-7.0 (m, 6H, 방향족), 4.4-4.1 (m, 2H, α 메틴), 3.3 (s, 3H, OCH₃), 2.8 (m, 2H, ε), 1.7-1.0 (m, 9H, β, γ, δ, CH₃).

겜피브로질-숙신이미드의 합성

디옥산 30 ㎖ 중의 겜피브로질 (GEM) (5.0 g, 20.0 mmol)에 디옥산 20 ㎖ 중의 N-히드록시숙신이미드 (2.3 g, 20.0 mmol) 및 디옥산 50 ㎖ 중의 디시클로헥실카르보디이미드 (4.5 g, 22.0 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 밤새 교반하고, 불용성 디시클로헥실우레아를 여과하여 제거하였다. 용매를 회전 증발기로 제거하고, 잔류물을 CH₂Cl₂ 15 내지 20 ㎖에 용해시켰다. 결정이 형성되는 것이 보일 때까지 헥산을 적가하고, 혼합물을 4 ℃에서 밤새 냉각시켰다. n-헥산 약 3 ㎖를 추가로 첨가하고, 혼합물을 -20 ℃에서 밤새 냉각시켰다. 활성화 에스테르가 작은 평면상 결정으로 형성되었고, 이를 수거하고, 헥산으로 세척하고, 진공하에 건조시켰다 (5.8 g, 80％) : ¹H NMR (500 MHz, DMSO) 1.2, 1.3 (s, 6H, CH₃), 1.8-1.5 (m, 6H, GEM CH₂), 2.3-2.1 (s, 6H, 방향족 CH₃) 2.85-2.7 (d, 4H, 숙신이미드 CH₂), 7.0-6.6 (m, 3H, 방향족).

폴리리신-겜피브로질의 합성

H₂0 1 ㎖ (10 mg/㎖ Na₂C0₃ 함유) 중의 [Lys]₁₁·11· HBr (0.100 g, 43.5 μmol)에 디옥산 2 ㎖ 중의 겜피브로질-숙신이미드 (0.094 g, 261.1 μmol)를 첨가 하였다. 밤새 교반한 후, 침전물이 형성되었다. H₂0 30 ㎖ (10 mg/㎖ Na₂CO₃ 함유)를 첨가하여 더욱 침전시키고, 단리하고, Et₂0 50 ㎖로 세척하였다. 백색 미분체를 건조시켰다 (0.019 g, 1％) : ¹H NMR (500 MHz, DMSO) 1.5-1.0 (m, 12H, β, γ, δ, CH₃), 1.85-1.5 (m, 4H, CH₂), 2.3, 2.1 (s, 6H, 방향족 CH₃), 3.35 (s, 2H, ε), 3.85 (s, 2H, OCH₂), 4.05 (s, 1H, α), 5.6 (d, 1H, 카르바메이트), 7.0-6.7 (m, 3H, 방향족), 8.0 (d, 1H, 아미드).

실시예 18

모든 시약을 용인된 바와 같이 사용하였다. 내부 표준으로서 테트라메틸실란을 사용하여 ¹H NMR을 브루커 300 MHz (300) 또는 JEOL 500 MHz (500) NMR 분광계에서 수행하였다. 실리카 겔 60 F₂₅₄로 미리 코팅시킨 판을 사용하여 박층 크로마토그래피를 수행하였다. 실리카 겔 60 (230-400 메시)을 사용하여 플래시 크로마토그래피를 수행하였다.

폴리Arg의 제조

방법 1

건조 DMSO 3.0 ml 중 H-Arg(Z)₂-OH (0.300 g, 0.68 mmol)에 디페닐포스포릴아지드 (219 ㎕, 1.02 mmol) 및 트리에틸아민 (236 ㎕, 1.69 mmol)을 첨가하였다.

반응물을 48 시간 동안 아르곤하에 교반한 후, 용액을 H₂O 100 ml에 부었다. 생성된 불균질 용액을 원심분리하여 백색 침전물을 단리하였고, 이를 H₂O 100 ml로 3회, CH₂OH 100 ml로 3회 및 Et₂O 100 ml로 세척한 다음, 진공 건조하여, 회백색 고체 172 mg을 수득하였다: ¹H NMR (500 MHz, DMSO) 7.31 (m, 10H), 5.21 (m, 1H, 벤질), 5.01 (m, 1H, 벤질), 3.83 (m, 1H, α), 3.34 (m, 2H, δ), 1.54 (m, 4H, β, γ).

이 물질을 건조 아니솔 1.5 ml에 용해시키고, 무수 메탄술폰산 0.3 ml과 함께 3 시간 동안 교반한 다음, 추가의 무수 메탄술폰산 0.3 ml을 첨가하고, 용액을 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 Et₂O 6 ml에 붓고, 15 분 동안 냉장하였다. 불균질 이염기성 혼합물을 회전식 증발에 의해 0.5 ml로 농축시켰다. 추가의 Et₂O 8 ml을 3회 첨가하고, 이염기성 혼합물을 원심분리하고, 상청액을 제거하여, 황색 검이 잔류하였다. 이 잔류물을 아세톤 6 ml로 2회 세척하고, 원심분리하고, 상청액을 폐기하여, 황백색 잔류물이 잔류하였다. 잔류물을 H₂O 0.3 ml에 용해시키고, 앰버라이트(Amberlite) IRA-400으로 진탕시켰다. 수지를 여과 제거하고, H₂O 3 ml로 세척하였다. 합한 용출물 및 세척물을 진공 건조하여, 황색 필름 0.063 g (90％ 수율)을 수득하였다: ¹H NMR (500 MHz, D₂0) 4.37 (m, 1H, α), 3.22 (m, 2H, δ), 1.94-1.66 (m, 4H, β, γ); MALDI-MS는 6 내지 14개 잔기로 다양한 중합도를 나타내었다.

방법 2

건조 DMSO 3.0 ml 중 Boc-Arg(Z)₂-OH (0.025 g, 0.05 mmol) 및 H-Arg(Z)₂-OH (0.280 g, 0.63 mmol)에 디페닐포스포릴아지드 (219 ㎕, 1.02 mmol) 및 트리에틸아민 (236 ㎕, 1.69 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 48 시간 동안 교반한 다음, H₂O 100 ml에 부었다. 불균질 용액을 원심분리하고, 침전물을 H₂O 100 ml로 3회, CH₃0H 100 ml로 3회 및 Et₂O 100 ml로 세척한 다음, 진공 건조하여, 고체 132 mg을 수득하였다: ¹H NMR (500 MHz, DMSO) 7.31 (m, 10H), 5.21 (m, 1H, 벤질), 5.01 (m, 1H, 벤질), 3.83 (m, 1H, α), 3.34 (m, 2H, δ), 1.54 (m, 4H, β, γ).

보호된 중합체를 건조 아니솔 1.5 ml에 용해시키고, 무수 메탄술폰산 1.3 ml과 함께 4 시간 동안 교반하였다. 용액을 회전식 증발에 의해 0.5 ml로 농축시켰다. Et₂O (8 ml)를 첨가하고, 이염기성계를 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 아세톤 10 ml을 3회 첨가하고, 용액을 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 펠렛을 밤새 진공 건조한 다음, H₂O 0.3 ml에 용해시키고, 앰버라이트 IRA-400으로 진탕시켰다. 수지를 여과 제거하고, H₂O 3 ml로 세척하였다. 합한 용출물 및 세척물을 진공 건조하여, 황색 필름 0.019 g (24％ 수율)을 수득하였다; ¹H NMR (500 MHz, D₂0) 4.37 (m, 1H, α), 3.22 (m, 2H, δ), 1.94-1.66 (m, 4H, β, γ); MALDI-MS는 5 내지 7개 잔기로 다양한 중합도를 나타내었다.

T4 컨쥬게이트의 제조

아미노산 중합체와 컨쥬게이트된 T4는, (보호된) T4와 시판되는 아미노산 동종중합체의 커플링에 의해 또는 T4 잔기와 상응하는 N-카르복시안하이드라이드 아미노산의 중합에 의해 제조하였다.

T4와 예비 형성한 동종중합체의 컨쥬게이트

건조 DMF 1 ml 중 N-TeocT4 (0.017 g, 17 μmol)에 디시클로헥실카르보디이미드 (0.004 g, 18 μmol)를 첨가하였다. 30 분 동안 교반한 후, 디에틸-4-아미노피리딘 (0.004 g, 36 μmol) 및 Gly₁₈ (0.017 g, 17 μmol)을 첨가하고, 반응물을 밤새 교반하였다. 흐린 용액을 H₂O 20 ml에 붓고, CH₂Cl₂ 10 ml로 2회 추출하였다. 수성 성분을 1 N HCl에 의해 pH 3으로 산성화시키고, 4 ℃로 냉각시켰다. 이 물질을 원심분리에 의해 단리하고, 펠렛을 H₂O 8 ml로 3회 세척하였다. 이 펠렛을 진공 건조하여, 디시클로헥실우레아 및 N-TeocT4-Gly₁₈을 수득하였다: ¹H NMR (500 DMSO) 7.8 (T4 방향족), 7.1 (T4 방향족), 4.1 (α).

비순수한 보호된 중합체에 트리플루오로아세트산 2 ml을 첨가하였다. 반응물을 2 시간 동안 교반하고, 용매를 회전식 증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 DMF 1 ml에 용해시키고, 불용성 물질을 여과 제거하였다. DMF를 회전식 증발에 의해 제거하고, 진공 건조하여, 백색 물질 (0.012 g, 40％)을 수득하였다: ¹H NMR (500 DMSO) 7.75 (T4 방향족), 7.08 (T4 방향족), 4.11 (bs, α).

아미노산 NCA의 제조

건조 THF 100 ml 중 L-아미노산 (1.5 g)에 트리포스겐 (0.8 당량)을 첨가하였다. 환류 응축기 및 NaOH 트랩이 장착된 반응 용기를 3 시간 동안 환류 가열하였다. 용매를 회전식 증발에 의해 제거하고, 잔류물을 헥산으로 세척하여, 백색 잔류물로서 아미노산 NCA를 수득하였다.

LeuNCA: ¹H NMR (500 CDCl₃) 6.65 (s, 1H, NH), 4.33 (dd, 1H, α), 1.82 (m, 2H, β), 1.68 (m, 1H, γ), 0.98 (dd, 6H, δ).

PheNCA: ¹H NMR (500 CDCl₃) 7.36-7.18 (m, 5H), 5.84 (s, 1H, NH), 4.53 (dd, 1H), 3.28 (dd, 1H, α), 2.98 (dd, 1H, β).

Trp(Boc)NCA: : ¹H NMR (500 CDCl₃) 8.14 (d, 1H), 7.49 (d, 2H), 7.36 (t, 1H), 7.27 (m, 1H), 5.90 (s, 1H, NH), 4.59 (dd, 1H, α), 3.41 (dd, 1H, β), 3.07 (dd, 1H, β), 1. 67 (s, 9H, t-Bu).

IleNCA : ¹H NMR (300 CDCl₃) 6.65 (s, 1H, NH), 4.25 (d, 1H, α), 1.94 (m, 1H, β), 1.43 (dm, 2H, γ-CH₂), 1.03 (d, 3H, γ-CH₃), 0.94 (t, 3H, δ).

Lys(Boc)NCA : ¹H NMR (500 CDCl₃) 6.65 (bs, 1H, N_tH), 4.64 (s, 1H, 카르바메이트 NH), 4.31 (t, 1H, α), 3.13 (s, 2H, ε), 2.04 (m, 2H, β), 1.84 (m, 2H, δ), 1.48 (m, 11H, γ, t-Bu).

MetNCA : ¹H NMR (500 CDCl₃) 6.89 (s, 1H, NH), 4.50 (dd, 1H, α), 2.69 (t, 2H, γ), 2.10 (m, 1H, 3), 2.08 (m, 4H, β, δ).

T4 N-캡핑된 동종중합체의 전형적인 제조법:

T4-Leu₁₅

DMF 2.5 ml중의 IleNCA (0.200 g, 1.3 μmol)에 이소루신 (0.012 g, 0.1 mol)을 첨가하였다. Ar하에 밤새 교반한 후에, T4-NCA (0.037 g, 0.050 μmol)를 첨가하고, 반응물을 추가로 72 시간 동안 교반하였다. 백색 용액을 H₂O 8 ml에 첨가하였다. 불균질한 용액을 4 ℃으로 냉각시키고, 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 펠렛을 H₂O 8 ml로 세척하였다. 건조시킨 잔사를 에탄올 50 ml로 세척하고, 50 ℃로 가온하여 건조시킨 후에 백색 분말 (0.124 g, 55％)을 수득하였다: ¹H NMR (500 DMSO) 7.75 (s, T4 방향족), 7.08 (s, T4 방향족), 4.11 (dd, α), 1.77 (m, β), 1.38 (m, β, γ-CH), 0.91 (m, γ-CH, γ-CH₃, δ).

T4-Phe₁₅

백색 분말 (58％) : ¹H NMR (360 MHz, DMSO) 7.0-8.1 (NH, 방향족), 4.5 (α), 3.0 (β) ; MALDI-MS는 T4-Phe_1-5를 나타냈다.

T4-Met₁₅

백색 분말 (10％) : ¹H NMR (500MHz, DMSO) 8.0-8.5 (아미드 NH), 4.4 (α) 2.5 (γ), 2.05(ε), 2.0-1.7 (β),

T4-Val₁₅

백색 분말 (14％) : ¹H NMR (500MHz, DMSO) 7.75 (T4 방향족), 7.08 (T4 방향족), 4.35 (α), 3.45 (β), 1.05 (γ).

보호된 NCA를 사용하는 이들 컨쥬게이트의 경우에, 추가로 개별적인 탈보호화 단계가 필수적이었다:

CH₂Cl₂ 10 ml중의 T4-[Lys(Boc)]₁₅ (0.256 g, 61 μmol)을 트리플루오로아세트산 (10 ml)과 함께 2 시간 동안 교반하였다. 용매를 회전식 증발로 제거하고, 잔사를 H₂O 3 ml중에 용해시키고, 한외여과하였다 (아미콘(Amicon) 재생 셀룰로오스, YM1, NMWL 1000, pH 5 H₂O 30 ml로 세척함). 잔류액을 진공중에서 제거하여 담갈색 잔사를 수득하였다: ¹H NMR (500 D₂0) 7.82 (s, T4 방향족), 7.41 (s, T4 방향족), 4.29 (bs, α), 3.00 (bs, ε), 2.13-1.70 (m, β, δ, γ); MALDI-MS는 T4-Lys_4-11 범위를 나타냈다.

T4-Trp_l5 : ¹H NMR (500 DMSO) 8.25-6.80 (m, 방향족), 4.50 (bs, α), 3.40 (bs, β), 3.00 (bs, β).

T4 C-캡핑된 동종중합체의 전형적인 제조법:

10 ml 무수 DMF중의 T4 (0.078 g, 100 μmol)에 Trp(Boc)NCA (0.500 g, 1.514 mmol)를 첨가하였다. Ar하에 64 시간 동안 교반한 후에, 반응물을 H₂O 30 ml를 첨가하여 급랭시켰다. 불투명 백색 용액을 4 ℃로 냉각시키고, 원심분리하고, 펠렛을 H₂O 25 ml로 3회 세척하였다. 잔사를 진공중에서 건조시켜 Trp(Boc)₁₅-T4를 갈색 고상물로서 제공하였다. 이 물질을 추가로 한외여과 (아미콘 재생 셀룰로오스, YM1, NMWL 1000, pH 5 H₂O 30 ml로 세척함)에 의해 정제하여 [Trp(Boc)]₁₅-T4 (0.400 g, 79％)를 갈색-금색 고상물로서 제공하였다: ¹H NMR (500 DMSO) 8.25-6.80 (m, 방향족), 4.50 (bs, α), 3.40 (bs, β), 3.00 (bs, β), 1.50 (bs, t-Bu).

CH₂Cl₂:트리플루오로아세트산 (1:1) 8 ml중의 [Trp(Boc)]₁₅-T4 (0.509 g)를 1.5 시간 동안 교반하였다. 용매을 회전식 증발로 제거하고, 잔사를 진공중에서 건조시켜 갈색 고상물 (0.347 g, 97％)을 수득하였다: ¹H NMR (500 DMSO) 8.25-6.80 (m, 방향족), 4.50 (bs, β), 3.40 (bs, α), 3.00 (bs, β).

[Lys(Boc)]₁₅-T4: ¹H NMR (500 D₂0) 7.82 (s, T4 방향족), 7.41 (s, T4 방향족), 4.29 (bs, α), 3.00 (bs, ε), 2.13-1.70 (m, β, δ, γ).

Lys₁₅-T4 : ¹H NMR (500 D₂0) 7.82 (s, T4 방향족), 7.41 (s, T4 방향족), 4.29 (bs, α), 3.00 (bs, ε), 2.13-1.70 (m, β, δ, γ).

랜덤 T4/동종중합체의 전형적인 제조법:

T4NCA (0.065 g, 0.1 mmol) 및 Trp(Boc)NCA (0.400 g, 1.2 mmol)를 무수 DMF 4 ml와 합하였다. 트리에틸아민 (11 ㎕, 0.1 mmol)을 첨가하고, 반응물을 44 시간 동안 Ar하에서 교반하였다. H₂O 10 ml를 첨가하여 급랭시킨 후에, 불균질한 혼합물을 4 ℃로 냉각시키고, 원심분리하였다. 펠렛을 단리하고, H₂0 10 ml로 3회 세척하고, 진공중에서 건조시켰다.

랜덤 T4/[Trp(Boc)]₁₅ 중합체에 CH₂Cl₂:트리플루오로아세트산 (1:1) 10 ml를 첨가하고, 반응물을 1 시간 동안 교반하였다. 용매를 회전식 증발로 제거하여 탈보호화된 중합체를 갈색 고상물 (0.262 g, 91％)로서 제공하고, 추가로 한외여과로 정제하였다 (아미콘 재생 셀룰로오스, YM1, NMWL 1000, pH 5 H₂0 30 ml로 세척함 ) : ¹H NMR (500 DMSO), 8.25-6.80 (m, 방향족), 4.50 (bs, α), 3.40 (bs, β), 3.00 (bs, β).

랜덤 T4/Lys_l5 : ¹H NMR (500 D₂0) ; 7.82 (s, T4 방향족), 7.41 (s, T4 방향족), 4.29 (bs, α), 3.00 (bs, ε), 2.13-1.70 (m, β, δ, γ).

폴리리신 데파코트의 제조

N-히드록시숙신이미드 (0.8 g, 6.9 mmol), 디시클로헥실카르보디이미드 (1.6 g, 7.6 mmol) 및 트리에틸아민 (0.9 g, 8.9 mmol)을 CH₂Cl₂:DMF (6:1) 14 ml 중 발프로산 (1.0 g, 6.9 mmol)에 가하였다. 반응물을 60 시간 동안 교반한 후에, 용액을 여과하여 백색 침전물을 제거하고, 회전 증발기로 용매를 제거하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (10:1-2:1 헥산:EtOAc)로 정제하여 숙신이미딜 에스테르를 투명한 오일 (1.0 g, 59 ％)로서 얻었다: R_f (3:1 헥산:EtOAc) 0.43; ¹H NMR (300 MHz, CDC1₃) 2.76 (s, 4H, 숙신이미드), 2.61 (m, 1H, 메틴), 1.65-1.19 (m, 8H, 메틸렌), 0.88 (t, 6H, 메틸).

THF 0.4 ml 중에 용해된 발프로산 숙신이미딜 에스테르 (0.104 g, 431 μmol)를 H₂0 0.8 ml 중 Lys_14'HBr (0.106 g, 37 μmol) (pH 8)에 가하였다. 반응물을 밤새도록 교반한 후에 H₂0 8 ml를 가하였다. 6 M HC1을 사용하여 이 혼합물의 pH를 3으로 산성화하고, CH₂C1₂ 2 ml로 2회 추출하였다. 수성층을 건조하고, 잔류물을 H₂0 1 ml에 용해시켰다. 용액을 SEC (G-15, 10 ml 건조 부피)로 정제하고, 물로 용출시켰다. 컨쥬케이트를 함유한 상기 분획을 합하고 건조시켜 백색 고형분 (0.176 mg)을 수득하였으며, NMR에서 1개의 약물 분자마다 28개의 리신이 나타났다; ¹H NMR (D₂0) 4.29 (m, 1H, α), 3.00 (m, 2H, ε), 1.87-1.68 (m, 4H, β, δ), 1.43 (m, γ, 메틸렌), 0.85 (t, 메틸).

폴리Glu 메바스타틴의 제조

AcNGlu₁₅(3-메바스타틴)₂

피리딘 1 ml 및 아세트산 무수물 (20 μl, 207 μmol)을 무수 DMF 3 ml 중 폴리Glu₁₅ (0.116 g, 69 μumol)에 가하였다. 21 시간 동안 교반한 후, 6 N HC1로 혼합물의 pH를 1까지 산성화한 다음 4 ℃로 냉각하였다. 백색 침전물을 원심분리로 수집하고, H₂0로 3회 세척한 다음 진공 하에서 건조시켜 N-아세틸화 폴리Glu₁₅ 11 mg을 수득하였다.

디시클로헥실카르보디이미드 (0.022 g, 108 μmol)를 무수 DMF 4.8 ml 중 N-아세틸화 폴리Glu₁₅ (0.011 g, 7 αmol)에 가하였다. 20분 동안 교반한 후, 불균일 용액을 여과하여 불용성 디시클로헥실우레아를 제거하고, 메바스타틴 (0.042 g, 108 μmol) 및 N-디메틸-4-아미노피리딘 (0.013 g, 108 μmol)과 함께 합하였다. 이 혼합물을 23 시간 동안 교반한 후, H₂0 20 ml를 가하여 반응을 켄칭시켰다. 용액을 CHCl₃ 10 ml로 2회 추출하였다. 1 N HCl을 사용하여 수성 성분의 pH를 3으로 조정하고, 4 ℃로 냉각하였다. 생성된 백색 침전물을 원심분리로 단리하고, H₂0 8 ml로 3회 세척하였다. 고형분을 H₂0 1 ml 중에 용해시키고, CH₂Cl₂ 1 ml로 세척하고, EtOAc 2 ml로 2회 세척하였다. 1 N HCl을 사용하여 수성층의 pH를 3으로 산성화하고, 4 ℃로 냉각하고, 침전물을 원심분리로 단리하고, H₂0 2 ml로 2회 세척하였 다. ¹H NMR에서, 건조된 컨쥬케이트 (2 mg)가 2개의 메바스타틴 분자마다 Glu 15개를 함유하는 것으로 나타났다: ¹H NMR (500 MHz, DMSO) 5.92 (5' 메바스타틴), 5.72 (3' 메바스타틴), 5.19 (4' 메바스타틴), 5.17 (8' 메바스타틴), 5.12 (3 메바스타틴), 4.41 (5 메바스타틴), 4.03 (α, Glu), 2.25 (γ, Glu), 1.88 (β, Glu), 0.82 (4",2' 알릴 메틸 메바스타틴), 1.17 (2" 메바스타틴).

Glu₁₅(3-메바스타틴) (160)

디시클로헥실카르보디이미드 (0.239 g, 1.159 mmol)를 무수 DMF 3 ml 중 Glu₁₅ (0.151 g, 77 μmol)에 가하고, 반응물을 4 시간 동안 Ar 하에서 교반하였다. 백색 침전물을 제거하고, CHCl₃ 10 ml에 용해된 N-디메틸-4-아미노피리딘 (0.141 g, 1.159 mmol) 및 메바스타틴 (0.222 g, 0.569 mmol)을 가하였다. 반응물을 Ar 하에서 21 시간 동안 교반한 후, 침전물을 제거하였다. 회전 증발기에 의해 용액을 농축하고, pH 8로 조정된 포화 NaCl (aq) 40 ml에 가하였다. 불균일 용액을 CHCl₃ 20 ml로 3회 추출한 다음 초여과하였다 (아미콘(Amicon) 재생 셀룰로스, YM1, NMWL 1,000). 재생물을 진공에서 건조하여 백색 잔류물 8 mg을 수득하였으며, 이는 ¹H NMR에서 메바스타틴 1개에 대해 글루탐산 15개의 비로 나타났다: ¹H NMR (500 D₂0); 5.92 (5' 메바스타틴), 5.72 (3' 메바스타틴), 5.19 (4' 메바스타틴), 5.17 (8' 메바스타틴), 5.12 (3 메바스타틴), 4.41 (5 메바스타틴), 4.03 (α, Glu), 2.25 ( γ, Glu), 1.88 (β, Glu), 0.82 (4",2' 알릴 메틸 메바스타틴), 1.17 (2" 메바스타틴).

BocGlu(3-메바스타틴)O-t-Bu

N-디메틸-4-아미노피리딘 (0.055 g, 453 μmol)을 CHCl₃ 40 ml 중 BocGlu(OSu)O-t-Bu (0.181 g, 453 αmol) 및 메바스타틴 (0.177 g, 453 μmol)에 가하였다. 반응물을 7 시간 동안 Ar 하에서 환류 가열한 다음 20 ℃에서 8 시간 동안 교반하였다. 회전 증발기로 용매를 제거하고, 플래쉬 크로마토그래피 (8:1-1:1 헥산:EtOAc)로 잔류물을 정제하여 컨쥬케이트를 투명한 필름으로 얻었다 (0.038 g, 11 ％): R_f (3:1 헥산:EtOAc) 0.22; ¹H NMR (CDCl₃ 500 MHz) 5.97 (d, 1H, 5'), 5.73 (dd, 1H, 3'), 5.55 (s, 1H, 4'), 5.32 (s, 1H, 8'), 5.24 (dd, 1H, 3), 5.09 (d, 1H, NH), 4.48 (m, 1H, 5), 4.20 (m, 1H, α), 2.78 (m, 2H, 2), 2.37 (m, 4H, 2', 2", y), 1.45 (s, 18H, t-Bu), 1.12 (d, 3H, 2"-CH₃), 0.88 (m, 6H, 4", 2'-CH₃).

폴리Glu 프레드니손의 제조

BocGlu(21-프레드니손)O-t-Bu

디시클로헥실카르보디이미드 (0.544 g, 2.64 mmol)를 CHCl₃ 20 ml 중 BocGlu-O-t-Bu (0.400 g, 1.32 mmol)에 가하였다. 반응물을 1 시간 동안 교반하고 여과하여 불용성 디시클로헥실우레아를 제거하였다. N-디메틸-4-아미노피리딘 (0.320 g, 2.64 mmol) 및 프레드니손 (0.472 g, 1.32 mmol)을 가하였다. 반응물을 60 시간 동안 교반하고 여과하였다. 회전 증발기에 의해 용매를 제거하고, 플래쉬 크로마토그래피 (10:1-0:1 헥산:EtOAc)로 잔류물을 정제하여 표적물을 투명한 필름으로 얻었다 (0.256 g, 31 ％): R_f (6:1 CHCl₃:MeOH) 0.54; ¹H NMR (CDC1 ₃ 500 MHz) 7.68 (d, 1H, 1), 6.16 (d, 1H, 2), 6.04 (s, 1H, 4), 5.15 (d, 1H, NH), 5.03 (d, 1H, 21), 4.71 (d, 1H, 21), 4.08 (t, 1H, α), 1.40 (s, 18H, t-Bu).

Glu(21-프레드니손)

트리플루오로아세트산 (1.5 ml)을 CH₂Cl₂ 15 ml 중 BocGlu(21-프레드니손)O-t-Bu (0.060 g, 93 μmol)과 함께 1 시간 동안 교반하였다. 회전 증발기로 용매를 제거하고, 플래쉬 크로마토그래피 (8:1 CHCl₃:MeOH)로 잔류물을 정제하여 투명한 필름을 얻었다: R_f (6:1 CHCl₃:MeOH) 0.13 ¹H NMR (CDCl₃ 500 MHz) 7.72 (d, 1H, 1), 6.25 (d, 1H, 2), 6.14 (s, 1H, 4), 5.14 (d, 1H, 21), 4.75 (d, 1H, 21), 4.10 (t, 1H, α).

실시예 19

아민-개시에 의한 L-글루탐산 NCA의 중합

하기 방법을 이용하여 아테놀롤의 폴리글루탐산 컨쥬게이트를 성공적으로 합 성하였다.

MW (g/mol) 266.3 173 1538 (n=10)

질량 (mg) 77 500 446 = 100％

mmol 0.29 2.89 0.29

당량 1 10 1

DMF는 무수 디메틸포름아미드이며, 알드리치 (Aldrich)사로부터 구입하였다.

유리제품은 사용에 앞서 오븐에서 건조하였다.

1. Glu-NCA (500 mg, 2.89 mmol)를 DMF 4 mL 중에 용해시키고, 가스 유입관을 장착한 15 mL 원형 바닥 플라스크에서 Ar하에 교반하였다.

2. DMF 1 mL 중에 용해시킨 아테놀롤을 이 Glu-NCA 용액에 가하고, 실온에서 72시간 동안 교반하였다. 일반적으로, 반응은 tlc에 의해 유리 아민 개시제가 없을 때까지 수행할 수 있다. 이 반응의 경우, 실리카 플레이트를 사용하여 tlc를 수행하고, 에틸 아세테이트 중 20％ 메탄올로 용출시켰다.

3. 물 중 10％ 중탄산나트륨 (pH = 8) 20 mL을 부어 반응을 켄칭하였다.

4. 물을 염화메틸렌 3 ×20 mL 및 에틸 아세테이트 3 ×20 mL로 세척하였다.

5. 6N HCl을 사용하여 모아진 수층의 pH를 6으로 만들고, 회전 증발시켜 부피를 약 20 mL로 감소시켰다. 이어서, 이 용액을 냉장고에서 3시간 넘게 냉각시켰 다.

6. 중합 생성물을 침전시키기 위해, 6N HCl을 사용하여 수용액을 대략 pH 2로 산성화하고, 냉장고에 다시 1 내지 2시간 동안 두었다.

7. 현탁액을 10 mL 시험관에 나누어 넣고, 침천물이 시험관 바닥에서 고체 덩어리를 형성할 때까지 15분 동안 원심분리한 다음, 물을 따라내었다 (상기 방법의 이 시점에서, 여과 깔때기를 통해 고체를 여과하고, 산성의 물로 세척하는 것이 바람직하다. 이 고체는 여과하기가 너무 어렵기 때문에 아테놀롤을 원심분리하였다).

8. 이어서, 고체를 산성의 물 (약 pH 2)에 재현탁시키고 볼텍싱한 다음, 다시 원심분리하고 물을 따라내었다. 이 방법을 한번 이상 반복하여 총 3회 세척하였다.

9. 이후, 고체를 고 진공하에서 밤새 건조시켜 중합체 262 mg (59％)을 얻었다. NMR 분석 결과, Glu/아테놀롤 비율은 약 30/1인 것으로 나타났다.

실시예 20

카코 (Caco-2) 인간 장 상피 세포의 단층은 경구로 전달되는 약물의 흡수를 예측하기 위해 점점 더 많이 사용되고 있다. 본 발명자들은 카코-2 트랜스웰 시스템 및 다른 시험관내 분석을 이용하여 폴리쓰로이드 (Polythroid)의 수행성을 평가하였다. 이 결과는 폴리쓰로이드가 갑상선 호르몬의 경구 전달을 증가시켜 갑상선기능저하 질환을 치료할 수 있음을 암시한다.

시험관내 수행

Caco-2 인간 장 상피 세포 분석

Caco-2 세포를, 콜라겐으로 코팅된 24웰 형태의 웰 표면에서 생장시켜, 장의 작은 단편을 나타내는 전면배양 단층을 형성시켰다. 웰은 탈착가능한 것이며, 상단측부 (apical side) (장의 루멘을 향함)를 나타내는 상부 챔버 (top chamber) 및 기저측부 (basolateral side)를 나타내는 하부 챔버 (bottom chamber)를 포함하였다. 상피 벽의 일체성은 단층을 통한 전기 저항성을 시험하여 모니터링하였다. 약물의 흡수성은 샘플을 상단측부에 가하고, 인큐베이션 이후에 기저측부 챔버내의 약물의 농도를 분석하여 연구할 수 있었다.

장 상피 세포 프로테아제 절단 폴리쓰로이드

폴리쓰로이드는 펩티드 결합 연결에 의해 공유적으로 부착된 T4 및 T3를 갖는 글루탐산의 합성 중합체이다. 중합체는 갑상선 호르몬을 위한 전달 비히클이며, 소장의 벽 자체를 통과하지 않도록 설계하였다. 오히려, 시간 의존적인 방식으로 T4 및 T3를 방출하도록 설계하였다. 갑상선 호르몬의 방출은 글루탐산 중합체의 효소 절단에 의존한다. 이론적으로, 이는 장관을 내려감에 따라 단백질분해 효소를 만나는 폴리쓰로이드로부터 발생할 것이다. 단백질은 위의 펩신 및 소장으로 분비되는 췌장 효소에 의해 작은 폴리펩티드로 절단된다. 이후, 소장 상피 세포는 작은 폴리펩티드를 더 절단하는 기능을 한다. 이는 세포 표면에 부착된 브러쉬 보더 (brush border) 프로테아제로 불리는 단백질분해 효소에 의해 달성된다.

폴리쓰로이드에 대한 솔모양가장자리 펩티다제의 효과를 모니터링하기 위해서는 폴리글루탐산 및 갑상선 호르몬으로부터 폴리쓰로이드를 특이적으로 구별하내 는 분석법을 개발할 필요가 있다. 따라서, 본 발명자들은 폴리쓰로이드를 특이적으로 인식하는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)을 개발하였다. 이 분석법은 폴리쓰로이드를 포획하기 위한 글루탐산 중합체에 대한 항체, 및 폴리쓰로이드의 존재를 검출하기 위한 T4 또는 T3에 대한 항체를 이용한다. 상기 분석법은 폴리글루탐산 또는 갑상선 호르몬 자체와의 교차반응성을 갖지 않는다. 따라서, 폴리쓰로이드의 단백질분해는 상기 중합체로부터 T4 및 T3를 방출시키고 ELISA 반응성을 상응하게 감소시킨다. 그러므로, 폴리쓰로이드 특이적 ELISA는 폴리쓰로이드의 분해를 모니터링하는 데 사용할 수 있다.

폴리쓰로이드 특이적 분석법은 Caco-2 세포 배양물 중의 폴리쓰로이드의 동일계 분해를 분석하는 데 사용하였다. 다양한 농도의 폴리쓰로이드를 Caco-2 세포의 상부에 가하고 37℃의 PBS 중에서 4시간 동안 인큐베이션하였다 (n = 4). 상부 폴리쓰로이드 농도는 4시간 인큐베이션 전 및 후에 폴리쓰로이드 특이적 ELISA로 측정하였다 (도 6). 100 마이크로그램의 비교적 고농도에서 26％의 폴리쓰로이드가 분해된 반면, 10배 더 낮은 농도에서 84％의 폴리쓰로이드가 분해되었다. (정상 인간 투여량에서 장에 있은 농도와 보다 더 가까운 농도인) 0.5 마이크로그램의 농도가 첨가될 때, 인큐베이션 4시간 후 남아있는 폴리쓰로이드의 양은 ELISA (10 ng)의 검출 한계 미만이었고, 이는 본질적으로 완전한 분해를 의미한 다. 기저외측 챔버가 임의의 실험에서 검출가능한 폴리쓰로이드를 함유하지 않았기 때문에, 상부 챔버에서의 중합체의 손실은 단층을 가로지르는 폴리쓰로이드의 흡수로 인한 것이 아니었다 (하기 참조). 본 발명자들은 폴리쓰로이드의 세포내 흡수를 배제할 수 없지만, 아마도 효소적 분해 때문에 상부의 폴리쓰로이드 농도가 모두는 아닐지라도 대부분 감소하는 것으로 보인다. 보다 높은 농도에서, 세포내 흡수가 남아있는 폴리쓰로이드에서의 이러한 큰 차이의 원인이라고 생각하기는 어려울 것이다.

폴리쓰로이드는 Caco-2 단층을 가로지르는 T4의 흡수를 상승시킨다.

T4의 흡수는 Caco-2 트랜스웰 (transwell) 시스템에서 관찰되었다 (n = 4). 폴리쓰로이드 (10 마이크로그램)를 트랜스웰의 상부에 가하였다. T4를 폴리쓰로이드의 T4 농도와 동일한 농도로 상부에 가하였다. T4용 시판 ELISA를 사용하여, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후 기저외측 챔버내의 T4 농도를 측정하였다 (도 7). 훨씬 더 많은 양의 T4가 중합체에 함유된 T4와 동일한 양의 T4와 함께 인큐베이션된 Caco-2 세포에 비해 폴리쓰로이드로부터 흡수되었다.

폴리쓰로이드는 Caco-2 단층을 횡단하지 않는다.

폴리쓰로이드 자체가 Caco-2 단층을 횡단하는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 고농도 (100 마이크로그램)에서 폴리쓰로이드와 함께 인큐베이션한 후 기저외측 챔버에서 중합체의 양을 측정하기 위해 폴리쓰로이드 특이적 ELISA를 이용하였다. 4시간 동안 인큐베이션한 후, 기저외측으로부터 얻은 샘플 (n = 4)은 이 ELISA에서 반응성을 전혀 보이지 않았다 (도 8). 폴리쓰로이드에 대한 검출 한계는 10 ng이고, 따라서 1/10,000 미만의 폴리쓰로이드가 흡수되었다. 결론적으로, 폴리쓰로이드는 ELISA 검출 한계 내에서 Caco-2 단층을 횡단하지 못하였다.

위 및 장 시뮬레이터에서의 폴리쓰로이드의 분해

위 점막에 의해 분비되는 펩신은 위의 산성 조건 하에서 활성을 나타내는 유 일한 프로테아제이다. 췌장은 단백질 및 폴리펩티드를 분해하는 다수의 단백질분해 효소들을 장으로 분비한다. 이론적으로, 이들 내재 프로테아제는 중합체가 소화관으로 내려갈 때 폴리쓰로이드로부터의 T4 및 T3의 방출에 관여할 것이다.

본 발명자들은 USP 위 시뮬레이터 및 USP 장 시뮬레이터에서 폴리쓰로이드를 시험하고 다른 방법으로 합성된 폴리쓰로이드에 대한 소화도를 비교하였다. 폴리쓰로이드의 샘플은 갑상선 호르몬 부착 부위에 위치에서 다르다. 샘플을 펩신이 함유된 위 시뮬레이터 완충제 또는 췌장 효소 추출물 (판크레아틴)이 함유된 장 시뮬레이터 완충제에 녹이고 37℃에서 24시간동안 인큐베이션하였다. 소화 후, 방출된 단량체 T4 및 T3의 함유량에 대해 HPLC로 샘플을 분석하였다. 도 9 및 10은 위 및 장 시뮬레이터에서 소화된 후에 T4 및 T3의 수준을 보여준인다. 방출은 갑상선 호르몬 부착 위치에 따라서 다양하였다. C-말단 (C-캡핑된)에 부착된 T4 및 T3를 갖는 폴리쓰로이드는 가장 높은 소화도를 보였다. 반면에, N-말단(N-캡핑된)에 부착된 폴리쓰로이드는 위 시뮬레이터에서 소화되지 않았고, 장 시뮬레이터에서도 비교적 낮은 소화량을 보였다. 무작위적으로 부착된 폴리쓰로이드는 위 시뮬레이터에서는 단지 최저 소화도만을 보였고 장 시뮬레이터에서는 중간 소화도를 보였다. 결론적으로, 폴리쓰로이드로부터의 갑상선 호르몬의 방출은 합성 방법에 따라서 다양하다. 이러한 사실은 경구 전달의 시간 방출을 조절할 수 있는 (정확하게 조율할 수 있는) 수단을 제공한다.

결론 및 요약

하기의 결론은 시험관내 수행 분석법으로부터 얻어질 수 있다:

* T4 및 T3는 췌장 및 장 세포 프로테아제에 의해 폴리쓰로이드로부터 가 방출 된다.

* 폴리쓰로이드로부터 방출된 T4 및 T3는 장 단층을 가로질러 흡수된다.

* 폴리쓰로이드는 시험관내에서 장 상피를 가로지르는 T4의 흡수를 상승시킨다.

* 폴리쓰로이드 자체는 시험관내에서 장 상피벽을 통과하지 못한다.

* 시간 방출의 속도는 폴리쓰로이드 합성 방법에 의해 조절될 수 있다.

폴리펩티드에 대한 T4 및 T3의 공유 결합은 티로신 호르몬 대체 요법을 위한 경구 전달에 많은 잠재적 장점을 제공한다. 췌장과 장 상피 세포에 의해 생산되는 단백질분해 효소는 폴리쓰로이드로부터 T4 및 T3를 방출시킨다. 따라서, T4 및 T3는 그들이 소화관으로 내려감에 따라 시간 의존적 방식으로 방출되어야 한다. 선일단 방출된 갑상선 호르몬은 Caco-2 세포 모델에서 장 상피를 통과하여 흡수된다. 추가적으로, 시험관내 장 상피세포 모델로부터 얻은 데이타는 글루탐산의 중함체에의 T4의 부착은 아마도 제2 흡수 메카니즘을 제공하고(하거나) 갑상선 호르몬의 용해도를 상승시킴으로써 갑상선 호르몬의 흡수를 상승시킬 수 있다. 폴리쓰로이드 자체는 시험관내 Caco-2 모델에서 장 상피벽을 통과하지 못한다. 따라서, 중합체는 혈류내로 흡수되지 않기 때문에, 중합체의 전신 효과에 대한 임의의 우려가 최소화된다.

특정한 실시양태에 대해 상기와 같이 설명하고 기술하였지만, 본 발명은 그럼에도 불구하고 상술된 세부사항으로 제한되는 것이 아니다. 오히려, 진의를 벗 어나지 않으면서 청구범위와 동일한 범주 및 범위내에서 세부적으로 다양하게 변형시킬 수 있다.

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50. 폴리펩티드, 및

    아미노산 이외의 활성제

    를 포함하며, 상기 활성제는 경구 투여 후 세포외(extracellular) 효소에 의해 약물이 혈류로 방출되도록 아민을 통하여 상기 폴리펩티드에 공유 결합되어 있는 아민 약물인, 경구로 섭취가능한 정제, 캡슐제 또는 경구용 현탁액 형태의 경구 투여용 조성물.
51. 제50항에 있어서, 폴리펩티드가 20종의 천연 아미노산 중 하나 이상으로 이루어진 것인 조성물.
52. 제50항에 있어서, 폴리펩티드가 글루탐산, 아스파르트산, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 리신, 트레오닌 및 세린에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 이루어진 것인 조성물.
53. 제52항에 있어서, 폴리펩티드가 글루탐산으로 이루어진 것인 조성물.
54. 제52항에 있어서, 폴리펩티드가 세린으로 이루어진 것인 조성물.
55. 제52항에 있어서, 폴리펩티드가 리신으로 이루어진 것인 조성물.
56. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 약물이 C-말단에 결합된 것인 조성물.
57. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 약물이 N-말단에 결합된 것인 조성물.
58. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 약물이 아미노산의 측쇄에 결합된 것인 조성물.
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