CN1476325B - 活性物质的输送系统和活性物质的保护和施用方法 - Google Patents

Abstract

一种包含有多肽和与此多肽共价连接的活性物质的组合物。还提供了一种将活性物质输送到病人体内的方法，其包含了向病人施用一种包含有多肽和与此多肽共价连接的活性物质的组合物。还提供了一种保护活性物质免于降解的方法，其包含将此活性物质与多肽共价连接。还提供了一种将活性物质从组合物中进行控释的方法，包括将此活性物质与多肽共价连接(图1)。

Description

活性物质的输送系统和活性物质的保护和施用方法

发明领域

本发明是有关于活性物质的输送系统，更具体地涉及包含与活性物质共价连接的多肽的组合物以及保护和施用活性物质的方法。

发明背景

活性物质的输送系统对于一种生物活性物质(活性物质)向合适的靶位的有效输送常常是很关键的。当考虑病人的顺应性和活性物质的稳定性时，这些系统的重要性就变得明显。例如，一种活性物质以口服给药代替注射或其他侵入性技术时，可以预见病人的顺应性会明显地提高。提高活性物质的稳定性，如延长有效期或胃内留存时间，会保证剂量的再现性，并且或许甚至可减少所需的剂量以提高病人的顺应性。

口服活性物质的吸收常常被胃液的酸性、胃肠道内强大的消化酶、细胞膜的渗透性和穿过脂双层的转运所阻断。与佐剂如：间苯二酚、表面活性剂、聚乙二醇(PEG)或胆汁酸合用增加细胞膜的通透性。通过类蛋白微球体，脂质体或多糖将活性物质进行微囊化可有效地减轻酶对活性物质的降解。酶抑制性佐剂也用于防止酶降解。肠溶包衣也已用作药物在胃中的保护物。

活性物质输送系统还能控制活性物质的释放，例如用谷氨酸和天冬氨酸共聚物制成的地西泮制剂可使活性物质持续释放。如另一个例子，乳酸和戊二酸的共聚物可使人生长激素按时间释放。很多药物据称可通过与二羧酸，修饰的氨基酸或热缩合氨基酸的酰胺化将活性物质微囊化从而进行持续释放。缓释添加剂可与很多种活性物质在片剂中混合。

上述每一技术均使活性物质的稳定性和释放-时间特性得以提高。可惜的是：这些技术受困于几个缺点。掺入活性物质常常依赖于其向微囊介质中的扩散情况，这或许非定量的并使剂量再现性变得复杂。另外经包囊的药物有赖于其从基质外扩散出来的情况，这很大程度上有赖于活性物质的水溶性。与之相反，水溶性微球体会以不确定的速率溶胀，令人遗憾的是，这会使活性物质突然大量释放，而只有少量的活性物质能进行持续释放。另外还有，这某些技术中，活性物质释放所需的对降解过程的控制是不可靠的，例如：肠溶包衣的活性物质释放有赖于pH值，同样的，难以控制释放的速率。

过去，曾利用多肽中氨基酸的侧链作为侧基用于连接活性物质。这些技术一般需要在氨基酸侧基和活性物质之间使用间隔基团。这类药物输送系统中的多肽-药物偶联物有赖于血液中的酶来释放药物，也就是不能通过口服给药。按时间和定点释放这些注射用或皮下用药的例子是：将炔诺酮，通过一个羟丙基接头，与聚谷氨酸的γ-位羧基连接；将氮芥通过一个肽间隔物，与

该系统中通过寄居在大肠中细菌的水解酶作用释放药物。接着，所释放的地塞米松活性物质定位于治疗大肠失调而还有其他技术将药物共价结合与脂质体制剂的优点结合起来，它们将活性成分通过肽接头与高度有序的脂质膜(称为“HAR”)连接。这样，至今为止，尚无以下这样的药物输送系统的报道，该系统包含的概念是将活性成分与多肽侧基相连接，其目

分子大小和微球体大小也是重要的。分子量的不均一会造成不可预见的扩散速率和药物动力学。高分子量的载体消化缓慢和延迟，如在连接有萘普生的葡聚糖的例子中，它几乎完全在结肠中被细菌酶所消化。大分子量的微球体通常水分含量高，这对于水不稳定的活性物质会产生问题。颗粒大小不仅在注射用药如：HAR的运用中产生问题，而且通过肠纹缘膜进行吸收就限于小于5微米。

发明简述

本发明提供了将活性物质共价连接于肽或氨基酸的聚合物。本发明与前

这些应用中，活性物质的输送是部分通过载体肽的去折叠动力学来控制。一旦进入肠道上端，通过各种固有的酶的选择性水解载体肽的肽键使活性物质释放以被机体吸收。这类酶作用引入了二级缓释机制。

本发明提供了包含有一种组合物，它含有多肽和与多肽共价连接的活性物质。较佳地，该多肽是(i)寡肽，(ii)由20种天然存在的氨基酸(L或D型)或其异构物、同系物、或其衍生物中的一种氨基酸所形成的均聚物，(iii)由两种或多种天然存在的氨基酸(L或D型)或其异构物、同系物、或其衍生物中的氨基酸所形成的杂聚物，(iv)合成氨基酸的均聚物，(v)两种或多种的合成氨基酸所形成的杂聚物，(vi)由一种或多种天然氨基酸与一种或多种合成氨基酸所形成的杂聚物。

活性物质优选地与多肽的氨基酸侧链、N端或C端共价连接。在一个优选的实施例中，活性物质是羧酸，与多肽的N端共价连接。在另一个优选的实施例中，活性物质是胺，与多肽的C端共价连接。在另一个优选的实施例中，活性物质是醇，与多肽的C端共价连接。在另一个优选的实施例中，活性物质是醇，与多肽的N端共价连接。

本发明的组合物可以还包括一种或多种微囊剂，佐剂和药学上可接受的赋形剂。微囊剂可选自聚乙二醇(PEG)，氨基酸，糖或盐。当组合物中包含有佐剂，佐剂宜激活肠道转运剂。

较佳地，本发明组合物是

活性物质可由在活性物质周围的多肽折叠以构象形式进行保护。在另一个实施例

本发明还提供一种用于保护活性物质免受降解的方法，其包含将活性物质与多肽共价连接。

本发明还提供一种用于控制活性物质从组合物中释放的方法，此处的组合物包含多肽，此方法包含将活性物质与多肽共价连接。

本发明还提供一种用于将活性物质输送给患者的方法，患者是指人或非人动物，该方法包括向患者施用一种组合物，其包含有多肽和与多肽共价连接的活性物质。在一个优选的实施例中，活性物质通过酶催化从组合物中释放。在另一个优选的实施例中，活性物质以依赖于时间的方式进行释放，基于酶催化释放的药物动力学。在另一个优选的实施例中，组合物还含有一种微囊剂，而且活性物质的释放是通过微囊剂的溶解。在另一个优选的实施例中，活性物质通过依赖于pH的多肽去折叠而从组合物中释放。在另一个优选的实施例中，活性物质从组合物中缓释。在还有一个优选的实施例中，组合物还含有一个与多肽共价连接的佐剂，佐剂从组合物中的释放受控于多肽。佐剂可微囊化于载体肽-药物偶联物中以使活性成分进行双相释放。

本发明还提供一种方法用于制备一种组合物，其包含有一种多肽和一种与多肽共价连接的活性物质。此方法包含以下步骤：

(a)将活性剂与氨基酸的侧链连接形成活性剂/氨基酸复合物；

(b)从活性剂/氨基酸复合物制备活性剂/氨基酸复合物N-酸酐(NCA)；和

(c)将活性剂/氨基酸复合物N-酸酐(NCA)聚合。

在一个优选的实施例中，活性物质是药物或佐剂。在另一个优选的实施例中，在步骤(c)之前用第二种活性物质重复步骤(a)和步骤(b)。当在步骤(c)之前用第二种活性物质重复步骤(a)和步骤(b)时，这种活性物质与第二种活性物质就能在步骤(c)中共聚。在另一个优选的实施例中，氨基酸是谷氨酸，而活性物质从在肽水解时以二聚物形式从谷氨酸上释放下来，此处活性物质的释放是由于同时进行的分子内的转氨作用。在另一个优选的实施例中，谷氨酸被选自由天冬氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸和丝氨酸组成的一组氨基酸中的一个氨基酸所取代，其中活性物质与氨基酸的侧链相连，形成酰胺、硫酯、酯、醚、尿烷、碳酸酯、酸酐或氨基甲酸酯。在另一个优选实施例中，谷氨酸被人工合成的氨基酸代替，该氨基酸侧基含有胺、醇、巯基、酰胺、脲或酸功能团。

应了解前述的概述和后文的详细描述对本发明是示例性的，而不是限制性的。

附图简述

当后续的详细描述与附图一起阅读，会更好地理解本发明，在附图中包括下列图表：

图1：显示了本发明的酸性活性物质/N-端方案。

图2：显示了本发明的胺活性物质/C-端方案。

图3：显示了本发明的醇活性物质/N-端方案。

图4：显示了本发明的醇活性物质/谷氨酸二聚物的制备和偶联方案。

图6：显示了宝力士德(polythroid)在肠道上皮细胞培养中的原位消化。

图7：表示基侧的T4浓度。

图8：表示宝力士德基底浓度与基侧浓度的比较。

图9：表示在胃模拟器与肠模拟器中T4分析的比较。

图10：表示在胃模拟器与肠模拟器中T3分析的比较。

发明详述

本发明为活性物质的输送提供了多个益处。首先，本发明可使活性物质稳定而在胃中免受消化。另外，由于活性物质释放的延迟，药物效应可延长。再者，活性物质还可组合起来以产生协同效应。同样，活性物质在肠道内的吸收增强了。本发明还可使活性物质能定点输送到特定的作用位点。

本发明的组合物含有一个多肽和一个多肽共价连接的活性物质。活性物质可从表1中选择，既可单独也可以表中的其他物质组合。

表1：

硫酸阿巴卡韦(abacavir)

阿巴瑞克(abarelix)

阿卡波糖

对乙酰氨基酚

对乙酰氨基酚；醋氢可待因磷酸盐

对乙酰氨基酚；右丙氧芬萘磺酸盐

乙酰水杨酸

阿维a

活化的蛋白c

阿昔洛韦

阿德福韦二新戊酰氧甲酯(adefovir dipivoxil)

腺苷

促肾上腺皮质激素

沙丁胺醇

阿仑膦酸钠

别嘌呤醇(allopurinal)

α1蛋白酶抑制剂

阿普唑仑(alprazolam)

前列地尔

阿汀克林(altinicline)

氨磷汀

胺碘酮

盐酸阿米替林

苯磺酸氨氯地平

苯磺酸氨氯地平；盐酸贝那普利

阿莫西林

阿莫西林；克拉维酸钾

安泼那韦

盐酸阿那格雷

阿那立肽

阿那曲唑

反义寡核苷酸

阿立哌唑

阿司咪唑

阿替洛尔

阿伐他汀钙

阿托伐醌

阿伐西迈(avasimibe)

硫唑嘌呤

盐酸氮卓斯汀

阿奇毒素二水合物

巴氯芬

贝氟沙通

盐酸贝那普利

甲磺酸苯扎托品

倍他米松

比卡鲁胺

比索洛尔/氢氯噻嗪

波生坦

溴隐亭

盐酸安非他酮

丁螺环酮

酒石酸布托啡诺

卡麦角林

咖啡因

骨化三醇

坎地沙坦西赖替安酯(cilexetil)

坎沙曲

卡培他滨

卡托普利

卡马西平

卡比多巴/左旋多巴

卡铂

卡立普多

卡维地洛

凯普真菌素(caspofungin)

头孢克洛

头孢羟氨苄；头孢羟氨苄半水合物

头孢唑林钠

头孢地尼

头孢克肟

1555；1555U88

头孢氨噻钠

头孢替坦二钠

头孢西丁钠

头孢泊肟

头孢丙烯

头孢他啶

头孢布烯二水合物

264W94

头孢呋辛乙酰氧乙酯

头孢呋辛钠

塞乐可西(celecoxib)

头孢氨苄

西立伐他汀钠

盐酸西替利嗪

氯氮卓盐储存物

甲氨二氮卓

环索奈德

西兰司琼

西司他丁钠；亚胺培南

西洛米拉(cilomilast)

西眯替丁

环丙沙星

西沙必利

苯碳酸顺阿曲库胺

顺铂

氢溴酸西酞普兰

克拉霉素

氯米帕明

氯硝西泮

盐酸苯可乐定

氯吡格雷硫酸氢盐

4030W92

鞣酸扑尔敏(chlorpheniramine tannate)

氯氮平

盐酸考来替泊

松柏维坦(conivaptan)

盐酸环苯扎林

环磷酰胺

环孢霉素

达特肝素钠

达匹坦

醋酸去氨加压素

去氧孕烯；乙炔基雌二醇

硫酸右旋苯丙胺

右美沙芬

地西泮

ABT 594

双氯芬酸钠

双氯芬酸钠；米索前列醇

盐酸双环维林

地丹诺辛

地高辛

盐酸硫氮卓酮

双嘧达莫

双丙戊酸钠

d-哌醋甲酯

甲磺酸多拉司琼单水合物

盐酸多奈哌齐

多巴胺/D5W

多沙唑嗪

盐酸多柔比星

度洛西汀

度塔司提(dutasteride)

右卡多曲

伊可匹泮(ecopipam)

α依度地轻(edodekin)(白细胞介素12)

依发韦仑(efavirenz)

ABT 773

依米草碱(emivirine)

依那普利

马来酸依那普利(enalapril)

氢氯噻嗪

依尼尿嘧啶(eniluracil)

依诺肝素钠

重组α红细胞生成素

依替非巴得(eptifibatide)

酒石酸麦角胺

红霉素b

ALT 711

艾沙替洛尔(esatenolol)

酯化雌激素；甲睾酮

偶联的雌激素

偶联的雌激素

醋酸甲羟孕酮

硫酸雌酮哌嗪

艾塔西普(etanercept)

乙炔基雌二醇/炔诺酮

BMS CW189921

乙炔基雌二醇；双醋炔诺醇

乙炔基雌二醇；左炔诺孕酮

乙炔基雌二醇；炔诺酮

乙炔基雌二醇；醋酸炔诺酮

乙炔基雌二醇；诺孕酯

乙炔基雌二醇；炔诺孕酮

羟乙二磷酸二钠

依托度酸

依托泊苷

埃托可西(etoricoxib)

艾可善丁-4(exendin-4)

泛昔洛韦

法莫替丁

非洛地平

非诺贝特

芬维A胺

芬太尼

盐酸非索非那定

非格司亭SD01

非那雄胺

醋酸氟卡尼

氟康唑

醋酸氟氢可的松

氟马西尼

氟西汀

氟他胺

氟伐他汀

马来酸氟伏沙明

α/β促卵泡素

福莫特罗

福辛普利

磷苯妥英钠

呋塞米

加巴喷丁

钆双胺

钆喷酸二葡甲胺

钆特醇

加那索龙(ganaxolone)

更昔洛韦

干特非班(gantofiban)

胃液素CW17免疫原

盐酸吉西他滨

吉非贝齐

等渗庆大霉素

盐酸吉哌隆

盐酸葛来塔马(glatiramer)

格列美脲

格列吡嗪

盐酸高血糖素

格列本脲

盐酸格拉司琼

氟哌啶醇

BMS 284756

氢氯噻嗪

氢氯噻嗪；氨苯蝶啶

盐酸氢吗啡酮

硫酸羟氯喹

布洛芬

盐酸伊达比星

伊德介素(ilodecakin)

伊洛马司他

伊米苷酶

盐酸丙米嗪

硫酸茚地那韦

英弗单抗(infliximab)

赖脯胰岛素

干扰素αcon-1

干扰素β-1a

白细胞介素-2

碘克沙醇

碘普胺

碘克沙酸葡甲胺；碘克沙酸钠

异丙托铵

厄贝沙坦

盐酸伊立替康

硝酸异山梨酯

异维a酸

伊拉地平

伊他司琼

伊曲康唑

酮康唑

酮洛芬

酮咯酸

酮替芬

盐酸拉贝洛尔

拉米夫定

拉米夫定；齐多夫定

拉莫三嗪

兰索拉唑

兰索拉唑，阿莫西林，

克拉霉素

来氟米特

来索吡琼

亮氨酰脯氨酸醋酸盐

左卡尼汀

左西替利嗪

左氧氟沙星

左甲状腺素

林替单抗(lintuzumab)

赖诺普利

赖诺普利；氢氯噻嗪

CS 834

盐酸洛哌丁胺

氯碳头孢

氯雷他定

劳拉西泮

氯沙坦钾

氯沙坦钾；

氢氯噻嗪

洛伐他汀，

马立马司他

美卡舍明

醋酸甲羟孕酮

盐酸甲氟喹

醋酸甲地孕酮

CVT CW 124

巯嘌呤

美罗培南

氨基水杨酸

美司钠

美他沙酮

二甲双胍

EM 800

盐酸哌甲酯

醋酸甲泼尼龙

FK 463

美托拉宗

琥珀酸盐美托洛尔

MK 826

甲硝唑

乳酸米力农

盐酸米诺环素

米氮平

米索前列醇

米格列奈(mitiglinide)

盐酸米托蒽醌

米库氯铵

莫达非尼

盐酸莫昔普利

孟鲁司特钠

硫酸吗啡

麦考酚酸莫伏替(mycophenolate mofetil)

萘丁美酮

纳多洛尔

萘普生钠

盐酸那拉曲坦

盐酸奈法唑酮

那乐拉滨(nelarabine)

甲磺酸那非那韦

那沙立肽(nesiritide)

奈韦拉平

硝苯地平

尼莫地平

尼索地平

呋喃妥因，呋喃妥因

大晶体

硝酸甘油

尼扎替丁

降阿司咪唑(norastemizole)

炔诺酮

诺氟沙星

盐酸去甲替林

醋酸奥曲肽

羟考酮/APAP

氧氟沙星

奥氮平

奥美拉唑

盐酸昂丹司琼

奥普维轻(opreivekin)

奥利司他

奥芬那君枸橼酸盐

奥沙普秦

奥沙西泮

氯化奥昔布宁

盐酸氧可酮

GM 611

M-CSF

帕戈隆

帕利弗单抗(palivizumab)

帕屈膦酸二钠

哌钙特洛(paricalcitrol)

盐酸帕罗西汀

匹米曲塞(pemetrexed)

匹莫林

青霉素V

木聚硫钠

己酮可可碱

培高利特

NE 0080

苯巴比妥

苯妥英钠

盐酸匹格列酮

哌拉西林钠

普克那利(pleconaril)

泊洛沙姆CW188

泊沙康唑(posaconazole)

NN 304

二盐酸普拉克索

普伐他汀钠

泼尼松

普加巴林(pregabalin)

扑米酮

普林马司他(prinomastat)

马来酸丙氯拉嗪

盐酸异丙嗪

PD 135158

右丙氧芬-N/APAP

盐酸普萘洛尔

前尿激酶

富马酸喹硫平

盐酸喹那普利

雷贝拉唑钠

盐酸雷洛昔芬

雷米普利

雷尼替丁

盐酸雷诺嗪

松弛素

立马醋胺

瑞格列奈

瑞品坦(repinotan)

利巴韦林+猪干扰素α-2b

利鲁唑

盐酸金刚乙胺

利培酮

利托那韦

苯甲酸利扎曲普坦

罗库溴铵

罗非可西(rofecoxib)

盐酸罗平尼咯

马来酸罗西格列酮(rosiglitazone maleate)

戈舍瑞林

鲁比替康(rubitecan)

沙莫司亭

沙奎那韦

多西他赛

沙曲铂(satraplatin)

盐酸塞利吉林

盐酸舍曲林

盐酸沙弗乐姆

司韦单抗

盐酸西布曲明

柠檬酸西地那非

辛伐他汀

信那普肽(sinapultide)

西他沙星

聚苯乙烯磺酸钠

盐酸索他洛尔

斯帕弗酸(sparfosic acid)

螺内酯

斯塔夫定

硫糖铝

舒马普坦

塔比莫瑞林(tabimorelin)

他莫昔芬枸橼酸盐

盐酸坦舒洛辛

替马西泮

替诺福韦(tenofovir)地索普西(disoproxil)

替泊沙林

盐酸特拉唑嗪

盐酸特比萘芬

硫酸特布他林

特立帕肽

四环素

沙利度胺

茶碱

塞替派

血小板生成素，TPO

噻加宾盐酸

盐酸噻氯匹定

替法可近(tifacogin)

替拉扎明

盐酸替罗非班

盐酸替扎尼定

硫酸妥布霉素

酒石酸托特罗定

托莫西汀

托吡酯

盐酸拓扑替康(topotecan)

托拉塞米

tPA类似物

盐酸曲马多

群多普利

曲土单抗(trastuzumab)

盐酸曲马沙酮(trazadone)

氨苯蝶啶/HCTZ

曲格列酮

甲磺酸曲伐沙星

尿激酶

乌索二醇(ursodiol)

盐酸伐昔洛韦

韦德可西

丙戊酸

缬沙坦，氢氯噻嗪

缬沙泊达(valspodar)

盐酸万古霉素

维库溴铵

盐酸顽发克星

盐酸维拉帕米

酒石酸长春瑞滨

维生素B12

维生素C

弗利康唑(voriconazole)

华法林钠

沙里罗酸(xaliproden)

扎鲁司特

扎来普隆

折那司他

齐多夫定

佐米曲坦

唑吡坦

博来霉素

植物甾醇

紫杉醇

氟替卡松(fluticasone)

氟尿嘧啶

伪麻黄碱

A 78773

AGI 1067

BCX CW1812

BMS CW188667

BMS CW193884

BMS CW204352

BPI21

CD11a

CEB 925

丙泊酚

GT 102279

重组肝炎疫苗

L159282

LFA3TIP

日用复合维生素

红霉素/硫酸盐

乙炔基雌二醇；去氧孕烯

碳酸锂

LYM1

甲泼尼龙琥珀酸钠

轮状病毒疫苗

甲磺酸沙奎那韦

精氨酸

肝素

α胸腺素

孟鲁司特钠和

盐酸非索非那定

碘甲状腺原氨酸

碘甲状腺原氨酸和四碘甲腺氨酸

可待因

乙基吗啡

二乙酰吗啡

氢吗啡酮

氢可酮

羟吗啡酮

双氢可待因

双氢吗啡

甲氢吗啡酮

可待因和异丙嗪

可待因，苯福林和

异丙嗪

可待因和愈创甘油醚

可待因，愈创甘油醚和

伪麻黄碱

阿司匹林，卡立普多和可待因

后马托品溴甲烷和

重酒石酸氢可酮

重酒石酸氢可酮和

苯丙醇胺

对乙酰氨基酚和重酒石酸氢可酮

马来酸氯苯，

重酒石酸氢可酮和

伪麻黄碱

愈创甘油醚和氢可酮

布洛芬和氢可酮

氯苯那敏多腾喜龙(polistirex)和

氢可酮多腾喜龙(polystirex)

纳曲酮

优选地，多肽是(i)寡肽，(ii)由20种天然存在的氨基酸(L或D型)、或其异构物、同系物、或其衍生物中的一种所形成的均聚物，(iii)由两种或多种天然存在的氨基酸(L或D型)、或其异构物、同系物、或其衍生物所形成的杂聚物，(iv)合成氨基酸的均聚物，(v)两种或多种的合成氨基酸所形成的杂聚物，(vi)由一种或多种天然氨基酸与一种或多种合成氨基酸所形成的杂聚物。

蛋白质、寡肽和多肽是氨基酸的聚合物，含有一级，二级和三级结构。蛋白质的二级结构是多肽链的局部构象，包括螺旋，片层和转角。蛋白质的氨基酸顺序和链构象上的结构限制决定了分子的空间排列。二级结构的折叠和侧链的空间排列形成了三级结构。

蛋白质的折叠是由于蛋白质上的原子与邻近的溶剂分子有关的动力学。蛋白质折叠和去折叠的热力学是由依赖于特定模型的蛋白质特定条件下的自由能所决定的。其中，蛋白质的折叠过程涉及氨基酸残基装进疏水内核中。蛋白质内核中的氨基酸侧链与他们在氨基酸结晶中占有同样的体积。已折叠的蛋白质内部更象一个固态的晶体而不是油滴，所以用于确定对蛋白质稳定性有贡献的力的最好模型是固体参照态。

对蛋白质折叠热力学有贡献的主要的力是范德华力，氢键，静电相互作用，构型的熵和疏水效应。考虑蛋白质的稳定性，疏水效应是指能量效应将非极性基团从蛋白质内部移去而将它们暴露在水中。将处于固态参照态的去折叠蛋白质的能量与氨基酸水解能量相比较，疏水效应是主要的力。氢键是在蛋白质折叠过程中建立的，而分子内键的形成依靠与水的氢键。水分子被从组装的蛋白质疏水内核中“挤出去”。所有这些力组合在一起，并对折叠的蛋白质整体稳定性有贡献。其中组装的理想程度决定了蛋白质相对稳定性的程度。最大程度组装的结果是形成一个残基的中心或疏水内核，该内核能最大程度地起屏蔽溶剂的作用。

既然亲脂类药物会存在于在肽的疏水内核中，那么在药物被释放前，肽的去折叠将需要能量。去折叠过程通过氨基酸水化或达到蛋白质的融点温度来克服疏水效应。水化产生的热量对蛋白质而言是有不稳定作用。通常，蛋白质的折叠态宜仅比去折叠态高5-15kcal/mole。而且，在中性pH和室温条件下蛋白质的去折叠要有化学试剂。实际上，在开始不可逆的化学或构象过程前常常可见蛋白质部分去折叠。而且，蛋白质的构象通常控制着有害化学反应的速率及程度。

蛋白质对活性物质的构象性保护取决于蛋白质折叠状态的稳定性和与活性物质分解有关的热力学。活性物质分解的必需条件应与蛋白质去折叠条件不同。

氨基酸的选择取决于所需要的物理性质。例如，需要增加体积或亲脂性，那么载体肽应富含下表所列的氨基酸。极性氨基酸，在另一方面，能选作提高多肽的亲水性。

离子化氨基酸可选作用于pH控制的多肽去折叠。天冬氨酸，谷氨酸和酪氨酸在胃中带电为中性，但进入肠道就离子化。与之相反，碱性氨基酸，如组氨酸，赖氨酸和精氨酸，在胃中离子化而在碱性环境下呈中性。

其他因素如芳香残基之间的π-π相互作用，引入脯氨酸产生的转角，二硫键的交联和氢键可被都用于针对指定用途的最佳氨基酸序列的选择。一级序列的次序可以影响这些相互作用如何最大化，并对于指导多肽的二级结构和三级结构很重要。

还有，带有反应性侧链的氨基酸(如谷氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，丝氨酸，苏氨酸和半胱氨酸)可用于在同一载体蛋白上连接多种活性物质或佐剂。这对于需要有两种或多种活性物质的协同效应是特别有用。

如上所述，载体化合物分子量的不同会对活性物质释放动力学有复杂的

质的释放动力学主要由载体肽和活性物质之间关键的键合的酶水解来控制。

葡聚糖是唯一已知的开发成为药物共价结合的大分子载体用于结肠特异性药物输送的多糖。通常它只可能携带多达1/10药物-葡聚糖偶联物总重量的药物。如前述，多糖主要在结肠中消化，而药物的吸收主要限于结肠。与葡聚糖相比，本发明有两个主要的优点。第一，肽可被在肠腔和纹缘膜中发现的几种氨肽酶的任一种水解，因此活性物质的释放及后续的吸收可在空肠或回肠中进行。第二，载体分子的分子量可控，活性物质的载量也可控。

作为一个实际的例子，下表列出亲脂性氨基酸的分子量(少一个水分子)和所选的止痛药和维生素。

表2：

氨基酸     分子量  活性物质    分子量

甘氨酸     57      醋氨酚      151

丙氨酸     71      维生素B6    169

缬氨酸     99      维生素C     176

亮氨酸     113     阿斯匹林    180

异亮氨酸   113     布洛芬      206

苯丙氨酸   147     视黄酸      300

酪氨酸     163     维生素B2    376

                   维生素D2    397

                   维生素E     431

亲脂性氨基酸是优选的，对于所选的活性物质，穿过胃的构象保护是重要的，这些物质的选择是基于易于与寡肽共价连接。氨基酸分子量中减去18，这样已经考虑了

聚甘氨酸(MW＝588)与阿斯匹林相连，总分子量为750，阿斯匹林占总活性物质输送系统组合物总重量的24％，或是葡聚糖最大载量的2倍。这只是对于N-和C-端应用，对于那些连接在十聚谷氨酸的侧基的活性物质，例如药物的分子量是180，可得出载量是58％，虽然这可能并不完全是实际情况。

活性物质的醇、胺或羧基与寡肽或多肽的N端、C端或侧链相共价连接，附加物的位置一定程度上取决于功能团的选择。例如，如果活性药物是羧酸(如：阿斯匹林)，那么寡肽链的N端是一个优选的位点，如图1所示。如果活性药物是胺(如：氨苄青霉素)，那么多肽链的C端是一个优选的位点以获得稳定的与肽相连的活性物质，如图2所示。在N端和C端的例子中，基本上是延长一个单体单元，从而形成一个新的肽键。如果活性物质是醇，C端和N端都是优选的连接位点以得到稳定的组合物。在上述的例子中(其中醇，炔诺酮被共价连接在聚羟丙基谷氨酰胺上)，醇可用光气制成氯甲酸烷基酯。那么本发明适用于用图3中所示的载体肽的N端与这关键中间体反应。图1至图3也阐述了由肠肽酶将活性成分从载体肽上释放出来。

醇可选择性与谷氨酸的γ-羧基连接，然后这个偶联物再与载体肽的C端共价连接。因为谷氨酸-药物的偶联物可视为一种二聚物，这个产物在端添上了2个单体，其中谷氨酸部分作为肽和药物之间的间隔物，如图4所示。

然后新产生的谷氨酸残基上的游离胺发生分子内的转氨反应，从而释放活性物质并同时产生焦谷氨酸，如图5所示。另外，谷氨酸-药物二聚体能转化成谷氨酸N-酸酐的γ-酯。如上所述，在使用任何如图4所示适当的引发剂，这个中间体可聚合。这样聚合成的产物是多聚谷氨酸，活性物质结合于多个侧基。这样就能获得载体肽的最大药物载量。另外，其他氨基酸NCA也可与谷氨酸N-酸酐的γ-酯共聚，以使药物输送系统能有特殊的性能。

本发明还提供了一种使其他带功能性侧链的多肽具有相同作用机理的方法，例子包括(但不限于)：半胱氨酸、聚酪氨酸、聚苏氨酸和聚谷氨酰胺。该机理的解释是通过在侧基上

酯酶。另外，活消化道的某些固有的酶可影响释放。

香豆酸与阿片肽连接及1，3-二烷基-3-酰基-氮三烯与胃泌素四肽和胃泌素五肽相联。另一例子是已知的将形成生物素偶联的多肽和与肽连接的吖啶技术。

多肽载体可用常规方法制备，优选的方法是氨基酸N-酸酐混合物的共聚。另外，若需要一段特定的序列，也可用固相自动肽合成仪。

往组合物中加

多肽。稳定剂如蔗糖、氨基酸、聚乙二醇(PEG)和盐能防止蛋白质去折叠。在本发明的另一实施例中，通过将载体多肽-活性剂偶联物微包囊于多糖、氨基酸复合物、PEG或盐，以获得活性物质的在一级释放之前的释放。

有证据表明亲水化合物通过一种特殊的转运子经肠道上皮能有效地吸收。整个膜转运系统本身就是非对称的，并且非对称地对辅助因子有响应。这样，可以预见，膜转运系统地活化需要一些特殊的佐剂从而导致活性物质定点输送。根据被转运基质的物理性质，可将肠道膜转运系统分为七种。它们包括氨基酸、寡肽、葡萄糖、单羧酸、磷酸盐、胆汁酸和P-糖蛋白转运系统，并且每种都有自己相关的转运机制。这些机制可依赖氢离子，钠离子，结合位点或其它的辅助因子。本发明专注于肠道上皮转运系统以促进活性物质的吸收。

在本发明的另已实施例中，组合物中含有一种或一种以上的佐剂以提高活性物质的生物利用度。当使用一种吸收很差的活性物质时，佐剂的添加是尤为优选的。合适的佐剂包括，例如：木瓜蛋白酶，这是一种强有力将氨肽酶-N催化结构域释放到肠腔中的酶；糖识别子，它能激活在纹缘膜中的酶；以及胆汁酸，它可与肽结合以促进肽的吸收。

优选的，所得的肽-活性物质偶联物用合适的赋形剂，并用湿法制粒或干法压制成片剂。

本发明的组合物，基本上由酸和胺形成的酰胺，并可以下列实例制得。

酸/N-端的偶联(图1)

一个酸性的生物活性物质在氮气下溶解在DMF中，并冷却至0℃。溶液用二异丙基碳二亚胺和羟基苯并三唑处理，再加胺肽载体，室温下搅拌反应数小时，滤除副产物脲，用醚沉淀产物，再用凝胶渗透色谱(GPC)或透析纯化。

胺/C-端的偶联(图2)

载体肽在氮气下溶解在DMF中，并冷却至0℃。溶液用二异丙基碳二亚胺和羟基苯并三唑处理，再加胺生物活性物质，室温下搅拌反应数小时，滤除副产物脲，用醚沉淀产物，再用凝胶渗透色谱或透析纯化。

醇/N端的偶联(图3)

再下述例子中，将醇和光气混合产生氯甲酸酯，再与肽的N端反应生成氨基甲酸酯。按照这点，醇性的活性物质在氮气下在无水DMF中用光气处理。然后缓慢加入已保护好的载体肽，溶液在室温下搅拌反应数小时。用醚沉淀产品，粗品去保护再用GPC纯化。

也可以使用其它溶剂、激活剂、共催化剂和碱。其它溶剂的例子包括二甲基亚砜，醚如四氢呋喃或氯化试剂如氯仿。其它激活剂的例子包括二环己基碳二亚胺或亚硫酰氯。其它共催化剂的例子是N-羟基琥珀酰胺。碱的例子包括吡咯烷基吡啶，二甲氨基吡啶，三乙胺或三丁胺。

谷氨酸γ-烷基酯的制备(图4)

已制备了30种不同的谷氨酸γ-烷基酯，其中任一种都适用于所选择的药物醇。例如，制备谷氨酸、醇和浓盐酸的混悬液并加热数小时，用丙酮沉淀谷氨酸γ-烷基酯产物，过滤，干燥和在热水中重结晶。

谷氨酸γ-烷基酯/C端偶联物(图4)

载体肽在氮气下溶解在DMF中，并冷却至0℃。溶液用二异丙基碳二亚胺和羟基苯并三唑处理，再加谷氨酸γ-烷基酯生物活性物质，室温下搅拌反应数小时，滤除副产物脲，用醚沉淀产物，再用凝胶渗透色谱或透析纯化。

谷氨酸γ-烷基酯

谷氨酸γ-烷基酯在无水THF中悬浮，其中加入光气，氮气下回流至混合物成为均一。溶液倒入庚烷中以沉淀NCA产物，过滤，干燥并用适宜的溶剂重结晶。

聚谷氨酸γ-烷基酯的制备

将谷氨酸γ-烷基酯-NCA溶于无水DMF中，溶液中加入催化量的伯胺直至呈粘稠(通常过夜)。溶液倒入水中，并过滤，从而分离出产物。产物用GPC或透析纯化。

实施例1

制备封端的碘甲状腺原氨酸组合物，它含有T3和T4共价连接在聚谷氨酸N端的共聚物

通过各种已报道的方法可知聚谷氨酸的合成方法。本实施例中聚谷氨酸的合成通过活化苄基谷氨酸NCA(BnGlu-NCA)的单体。BnGlu-NCA然后聚合，用溴

应制备谷氨酸/T4/T3共聚物，T4和T3的掺入随pKb的增加而减少。乙酸钠是较好的，因为其pKb值在溴化钠，聚谷氨酸和钠盐之间。反应中用碱式氧化铝使T4-NCA和T3-NCA保持完整而没有明显的端封和自身聚合。T4-NCA和T3-NCA的稳定性会影响谷氨酸/T4/T3共聚物的商业化生产。乙酸钠可被碳酸钠，碳酸氢钠，丙酸钠，丁酸钠，戊酸钠，碱式氧化铝或其它任何能中和与氨基复合的溴化氢的弱碱所替代。

谷氨酸/T4/T3共聚物的合成起始于苄基谷氨酸，甲状腺素，和三碘甲状腺原氨酸。所有这些合成原料在合适的有机溶剂中单独与光气反应。BuGlu-NCA的聚合是在四氢呋喃(THF)中进行，以甲醇钠为引发剂。聚苄基谷氨酸在乙酸中用15％的溴化氢脱保护。产物中应不含有未复合的溴化氢，它曾溶解在DMF中，用乙酸钠处理过。把先前已制备好的T4-NCA和T3-NCA混合，再加到溶液中。在搅拌下反应直至用薄层层析(TLC)检测不到T4-NCA和T3-NCA。把最后的产物加到水中，用水洗涤沉淀，真空干燥，得到无定形的粉末。

用不同的弱碱所进行的试验揭示了不同的羧酸钠盐在聚谷氨酸封端中的作用。反应中用丙酸钠、丁酸钠和戊酸钠代替乙酸钠都得到基本相同的结果。

苄基谷氨酸-NCA的制备

苄基谷氨酸(25克)在氮气下悬浮于400ml无水乙酸乙酯中。混合物加热回流，并分六等份加入30克的三光气。反应回流3小时至均一。溶液冷却至室温，过滤并真空浓缩。将白色粉末在50ml热的无水乙酸乙酯中重结晶，得到17.4克(63％)白色粉末

T4-NCA的制备

在一个带氮气进口的圆底烧瓶中，5克甲状腺素和25ml四氢呋喃(THF)及1.3克三光气，混合物回流4小时至均一。溶液冷却至室温，在搅拌下滴加200ml庚烷，晶体过滤并真空干燥。得到4.72g(91％)一种米色的粉末。

T3-NCA的制备

在一个带氮气进口的圆底烧瓶中，4.29克三碘甲状腺原氨酸和20ml四氢呋喃(THF)及1.45克三光气，混合物回流4小时至均一。溶液冷却至室温，在搅拌下滴加200ml庚烷，从黄色胶状物中倾去液体，在无水乙酸乙酯和己烷中重结晶。得到2.5g(56％)一种白色的粉末。其在高度真空下干燥

聚苄基谷氨酸的制备

苄基谷氨酸(17.4克)在氮气下溶于无水四氢呋喃(THF)中，往其中分批加入238mg甲醇钠。溶液搅拌2天至粘度明显增加。在搅拌下，溶液倒入1.5L石油醚中，倾去石油醚，再加回1L石油醚。手工搅拌混合物。倾去石油醚，再加入500ml石油醚重复该过程。白色固体在空气干燥然后真空干燥，得到14.7g(95％)白色绒纸样固体。

聚谷氨酸的制备

乙酸(10ml)与10ml 30％(重量)溴化氢乙酸溶液搅拌，并在乙酸中手工加入1.96g聚苄基谷氨酸。混合物在室温下搅拌一天，然后再加入到50ml醚中。白色沉淀过滤，用30ml醚洗涤4次，并在高度真空下干燥。得到1.11g(97％)一种白色粉末。

谷氨酸/T4/T3共聚物的制备

聚谷氨酸(375mg)溶解在3ml无水DMF中，加入乙酸钠(24mg)，接着加入105mgT4-NCA和8mgT3-NCA的混合物。溶液搅拌2天至TLC显示甲状腺素原料消失。溶液倒入30ml水中并冷却至10℃过夜。沉淀过滤，用水洗涤高真空干燥。得到413mg(85％)浅棕色粉末。经链霉蛋白酶系统完全消化2小时，质子NMR表明T3和T4共价连接到聚谷氨酸的N端。

实施例2

肽聚合物的制备

聚天冬氨酸：Asp(OtBu)(13mg，0.07mmol)和Asp(OtBu)-NCA(200mg，0.93mmol)溶解在无水DMF(5ml)中，溶液在氩气下室温搅拌过夜。第二天早上，将2.5ml反应混合物转移到另一个烧瓶中(烧瓶B)。T4-NCA(27mg，0.03mmol)加入到原先的烧瓶中(烧瓶A)。两份溶液在氩气下再搅拌24小时。在每个烧瓶中加入水(50ml)沉淀聚合物。过滤收集所得的固体并在真空中干燥过夜。

已干燥的Asp(OtBu)n(烧瓶B)和T4-NCA(OtBu)n(烧瓶A)溶解在95％三氟醋酸水溶液中(3ml)，在室温下搅拌2小时。加入乙醚(10ml)沉淀脱保护的聚合物并将混悬液保存在4℃2小时。聚合物分别经过滤收集并在真空中干燥过夜。这样得到48mgAsp_n(烧瓶B)和12mgT4-Asp_n(烧瓶A)。MALDI表明T4-Asp_n(烧瓶A)含有不同长度聚合物的混合物：T4-Asp_3-12。

聚丝氨酸和聚苏氨酸也按此法制备。丝氨酸反应混合物含N-甲基吗啉。(1.1当量)

产率是基于在拆分反应之前原反应中总氨基酸含量进行估算的。质量范围由MALDI测定。产率超过100％是由于存在盐或在反应混合物拆分时分布不均一。

HPLC和链霉蛋白酶试验表明T4-Asp_3-12，T4-Ser_4-9，T4-Thr_1-8样品中很少有游离的T4，T4在消化后释放。

实施例3

(Glu)n-头孢氨苄的制备

Glu(OtBu)NCA(1.000g，4.4mmol)和盐酸头孢氨苄(0.106g，0.3mmol)溶解在无水DMF(5ml)中。反应在氩气下室温搅拌进行。三天后，用真空旋转蒸发器去除溶剂。所得的固体放置在氩气下，再用4N盐酸二噁烷溶液(2ml)溶解，然后再氩气下室温搅拌。1小时后，用真空旋转蒸发器去除二噁烷和盐酸。将固体悬浮在甲醇(2ml)中，并再次用真空旋转蒸发器去除残留的盐酸和二噁烷。产物再悬浮在甲醇(2ml)中，加水(20ml)沉淀之。水悬浮液再于4℃保存4小时，离心分离固体。离心沉淀再真空干燥过夜。通过MADLI测定此过程得到(Glu)n-头孢氨苄464mg。MALDI显示有聚合物(Glu)_7-13和(Glu)_5-14-头孢氨苄的混合物。其他链长也许存在但MADLI色谱中不是清晰可见。反相HPLC(265nm，C18柱，16％甲醇/4％THF/80％水为流动相)显示在所分离出的物质中没有游离的头孢氨苄。“水”在HPLC中是指含0.1％庚烷硫酸和1.5％三甲胺的水缓冲液。

实施例4

纳曲酮衍生物

3-甲基-纳曲酮：纳曲酮(6.0g，16.5mmol)溶解在100ml蒸馏水中。溶液用1N NaOH滴定至最终pH为11.8。在滴定过程中，中性的纳曲酮沉淀出来并又溶解到溶液中。直到pH为11.8时，用旋转蒸发器在高真空下去除溶剂，所得的固体在真空下室温保存过夜。固体然后悬浮/溶解在无水四氢呋喃(200ml)并在氩气下室温搅拌过夜，于超过30分钟内滴加入在50ml四氢呋喃中的碘代甲烷(2.1mg，33mmol)。反应在氩气下室温搅拌再进行3小时。在减压下旋转蒸发去除溶剂。残留固体然后溶解在40ml氯仿中，此有机溶液用30ml饱和NaCl溶液，3×30ml 1N的NaOH洗涤并最后用30ml饱和NaCl溶液洗涤两次。收集有机溶液并用硫酸钠干燥。在真空下用旋转蒸发器除去有机溶剂并干燥过夜，得到纯3-甲基纳曲酮(5.6g，15.8mmol，产率96％)，是棕色的残留物并用TLC和¹H-NMR鉴定。与纳曲酮光谱比较，用于鉴定化合物的特征是¹H-NMR(360MHz，CDCl₃)δ6.677(d，1H，纳曲酮芳香环)，6.591(d，1H，纳曲酮芳香环)，3.874(s，3H，甲氧基)，0.6-0.5ppm(m，2H，纳曲酮环丙基)和0.2-0.1ppm(m，2H，纳曲酮环丙基)。

Boc-Glu(Nal)-OtBu：Boc-Glu-OtBu固体(0.96g，3.18mmol)，纳曲酮(1.00g，2.65mmol)和PyBrop(1.73g，3.71mmol)溶解在5ml无水DMF中并在氩气下室温搅拌。加入无水N-甲基吗啉(1.08ml，9.81mmol)且反应继续在氩气和室温下搅拌进行。两天后，加入另外的Boc-Glu-OtBu固体(0.096g，0.318mmol)，PyBrop(0.173g，0.371mmol)和N-甲基吗啉(0.10ml，0.981mmol)。再过两天后，在高真空下旋转蒸发去除溶剂，所得固体然后溶解在氯仿中，此有机溶液用2×20ml饱和NaCl溶液，3×20ml 10％的碳酸钠萃取并最后用20ml饱和NaCl溶液洗涤。收集有机溶液并用硫酸钠干燥，硅胶吸附。然后用闪色谱和梯度为0-1.5％的甲醇氯仿溶液得到纯的偶联有氨基酸的纳曲酮(0.486g，0.78mmol，29％)。所分离物质的纯度由TLC鉴定(6∶1甲醇/氯仿)，氨基酸分子和纳曲酮的存在都由¹H-NMR确定。指示质子：¹H-NMR(360MHz，CDCl₃)δ6.81(d，1H，纳曲酮芳香环)，6.63(d，1H，纳曲酮芳香环)，4.3-4.2(m，1H，谷氨酸αH)，1.7-1.3(bs对，18H，Boc和OtBu基团，0.6-0.4ppm(m，2H，纳曲酮环丙基)和0.2-0.0ppm(m，2H，纳曲酮环丙基)。

Boc-Glu(Nal)-OtBu：Boc-Glu(Nal)-OtBu固体可用相似方法获得，收率41％。指示质子：¹H-NMR(360MHz，CDCl₃)δ6.84(d，1H，纳曲酮芳香环)，6.66(d，1H，纳曲酮芳香环)，4.6-4.5(m，1H，天冬氨酸αH)，1.6-1.3(bs对，18H，Boc和OtBu基团，0.7-0.5ppm(m，2H，纳曲酮环丙基)和0.4-0.1ppm(m，2H，纳曲酮环丙基)。

NMR定性：

虽然纳曲酮NMR谱复杂，但有几个关键质子的化学位移特殊且是纳曲酮特有的。

实施例5：

           阿昔洛韦

2-氨基-9-(2-羟-乙氧基甲基)-1，9-2氢-嘌呤-6-酮

往15聚谷氨酸(0.600g，0.310mmol)的DMF(25ml)溶液中加入EDCI(2.07g，10.8mmol)。所得混合物室温搅拌1小时。然后，加入N-甲基吗啉(0.51ml，4.7mmol)，再加入阿昔洛韦(1.74g，7.75mmol)和DMF(25ml)和N-甲基-吗啉(0.85ml)的混合物。反应在室温下搅拌进行4天。然后，加入50ml水，除去全部溶剂，往干燥的产物中加入水(100ml)，并未反应的阿昔洛韦形成沉淀。离心去除固体，上清液用超滤纯化(YM1膜)。大约300ml水穿过膜。NMR显示一个未预见的烷基-脲侧链连接的杂质。得到的聚Glu(阿昔洛韦)(0.970g)是浅黄色固体：¹H-NMR(360MHz，D₂O)δ1.11(br m，4H脲)，2.01(br m，2H，谷氨酸βH)，2.39(br m，2H，谷氨酸γH)，2.72-(br m，2H，脲)，3.32(br m，6H，阿昔洛韦CH₂和脲)，3.83(br m，3H脲)，4.38(br，d，3H，谷氨酸αH)，5.47(br s，2H，阿昔洛韦1’CH₂)，7.94(br s，1H阿昔洛韦8CH)。

实施例6

非索非那定

2-(4-{1-羟基-4-[4-羟-二苯基-甲基)-哌啶-1-基]-丁基}-苯基)-2-甲基-丙酸

聚-Glu(非索非那定)

往15聚谷氨酸(0.078g，0.040mmol)的DMF(5ml)溶液中加入EDCI(0.035g，0.18mmol)。搅拌30分钟后，加入N-甲基吗啉(0.03ml，0.24mmol)，搅拌10分钟后，再用注射器加入非索非那定(0.100g，0.20mmol)和N-甲基-吗啉(0.07ml，0.60mmol)和DMF(5ml)的溶液。反应在室温下搅拌进行3天后，样品用水(25ml)溶解。形成固体沉淀，该沉淀是药物偶联物和游离的非索非那定，将水酸化并使所有的固体溶解。超滤纯化(YM1膜，再用YM3膜)和在pH7时用G25空间排阻色谱，得到聚-谷氨酸(非索非那定)(0.010g)，白色固体：¹H-NMR(360MHz，D₂O)δ1.37(s，8H，非索非那定，CH₂和CH₃)，1.58(br m，5H，非索非那定，CH和CH₂)，1.99(br m，24H，谷氨酸βH)，2.31(br m，24H，谷氨酸γH)，2.70(br m，5H，非索非那定，CH和CH₂)，4.14(br m，26H，谷氨酸βH)，7.25(brs，14H，非索非那定芳香氢)。

实施例7

4-氨基-1-(5-羟甲基-4氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮

往15聚谷氨酸(0.123g，0.060mmol)的DMF(8ml)溶液中加入EDCI(0.403g，2.10mmol)。30分钟后，加入N-甲基吗啉(0.13ml，1.2mmol)，35分钟后，再用注射器加入扎西他滨(0.200g，0.95mmol)和N-甲基-吗啉(0.10ml，0.9mmol)和DMF(2ml)的溶液。反应在室温下搅拌进行48小时后，去除溶剂，残留样品用水(15ml)溶解。超滤纯化(YM1膜，再用YM3膜)和在pH7时用G25空间排阻色谱。得到聚-谷氨酸(扎西他滨)(0.083g)，浅黄色固体：¹H-NMR(DMSO-d6w/D₂O)δ1.14(br m 20H，脲)，1.90(br m，30H，谷氨酸βH，谷氨酸γH和扎西他宾的CH₂)，2.66(br m，4H，脲)，3.24(br m，36H，脲，扎西他宾的CH和CH₂)，4.29(br m，8H，谷氨酸αH)，5.87(br s，1H，扎西他宾1’位CH)，7.18(br s，1.19H，扎西他宾NH₂)，8.52(br s 1H，扎西他宾6位CH)。

实施例8

斯塔夫定

1-(5-羟甲基-2，5-二氢-呋喃-2-基)-5-甲基-1H-嘧啶-2，4-二酮

其制备与聚-Glu(扎西他滨)相似，用超滤纯化(YM1)得到聚-Glu(斯塔夫定)0.089g，白色粉末：¹H-NMR(D₂O)δ1.87(s，3H，斯塔夫定5位CH₃)，2.06(brm，38H，谷氨酸βH，谷氨酸γH)，2.49(br m，12H，谷氨酸γH)，3.55(br m，12H，脲，斯塔夫定5’位CH₂)，4.45(br d，13H，谷氨酸αH)，5.98(d，1H，斯塔夫定1’位CH)，6.48(d，1H，斯塔夫定3位CH)，6.96(d，1H，斯塔夫定2’位CH)，7.63(s，1H，斯塔夫定6位CH)。

实施例9

甲硝唑

2-(2-甲基-5-硝基-咪唑-1-基)-乙醇

其制备与聚-Glu(扎西他滨)相似，用超滤纯化(YM1)得到聚-Glu(甲硝唑)0.326g，黄色粉末：¹H-NMR(DMSO-d6)δ1.18(br d，13H，脲)，1.93(br s，17H，谷氨酸βH，谷氨酸γH)，2.71(br s，16H，脲)，4.01(br m，18H，谷氨酸αH和甲硝唑CH₂)，4.58(br s，2H，甲硝唑CH₂)，8.05(br s，1H，甲硝唑2位CH)。

实施例10

甲基纳曲酮

甲基纳曲酮-葡萄糖缩酮偶联物

往甲基纳曲酮(0.200g，0.56mmol)的二噁烷(20ml)溶液中加入D-α-葡萄糖(2.02g，11.2mmol)、triflic酸(0.05ml，0.62mmol)和CuSO₄(1.00g)。反应混合物在室温下搅拌4天。反应物过滤，用饱和碳酸氢钠中和并再次过滤。除去二噁烷和水，残留物加入到氯仿中用水抽提(3×100ml)有机层用MgSO4干燥并用减压去除溶剂，粗品用硅胶纯化(0-10％的甲醇的氯仿溶液)得到缩酮偶联物(0.010g)，与游离的甲基纳曲酮比例为1∶1。¹H-NMR(CDCl₃)δ0.14(br s，4H，纳曲酮环丙基)，0.53(br m，4H，纳曲酮环丙基)，0.90(m，2H，纳曲酮环丙基)，1.48(m，6H，纳曲酮)，2.19-2.78(m，12H，纳曲酮)，3.03(m，12H，纳曲酮)，3.03(m，12H，纳曲酮)，3.75(q，2H，葡萄糖)，3.87(m，8H，纳曲酮CH₃和葡萄糖)，3.97(q，2H，葡萄糖)，4.14(t，1H，葡萄糖)，4.66(s，1H，纳曲酮)，6.65(m，4H，纳曲酮)。

实施例11

醋氨酚

N-(4-羟基-苯基)-乙酰胺

2-氨基-戊二酸5-(4-乙氨基-苯)酯或Glu(醋氨酚)

在BocGlu(OSuc)-OtBu(0.500g，1.25mmol)和醋氨酚(0.944g，6.25mmol)的THF(15ml)溶液中加入N-甲基-吗啉(1.40ml，12.5mmol)。反应加热至回流，并在回流搅拌下过夜。除去溶剂，粗品用硅胶纯化(50-75％乙酸乙酯的己烷)得到Boc-Glu(醋氨酚)-OtBu

(0.432g，0.900mmol，72％)：¹H-NMR(360MHz，CDCl₃)δ1.43(d，18H，t-Bu)，1.97(m，1H，Glu-βH)，2.12(s，3H，醋氨酚CH₃)，2.25(m，1H，Glu-βH)，2.60(m，2H，Glu-γH)，4.25(m，1H，Glu-αH)，7.04(d，2H，醋氨酚芳香环)，7.48(d，2H，醋氨酚芳香环)。

Boc-Glu(醋氨酚)-OtBu(0.097g，0.20mmol)的4N盐酸二噁烷(10ml)溶液中室温搅拌2小时。除去溶剂得到Glu(醋氨酚)(0.90g)盐酸盐：¹H-NMR(D₂O)δ2.19(s，3H，醋氨酚CH₃)，2.41(m，1H，Glu-βH)，2.97(m，2H，Glu-γH)，4.18(t，1H，Glu-αH)，7.19(d，2H，醋氨酚芳香环)，7.51(d，2H，醋氨酚芳香环)；¹³CNMR。(DMSO)δ23.80，29.25，51.00，66.24，119.68，121.69，137.00，145.35，168.23，170.42，170.79。

3-(2，5-二氧代-噁唑烷-4-基)丙酸4-乙酰氨基苯酯或Glu(醋氨酚)NCA

往2-氨基-戊二酸5-(4-乙酰氨基-苯)酯(1.54g，4.29mmol)的THF(40ml)混合物中加入三光气(1.02g，3.43mmol)。所得的溶液回流搅拌3小时。在反应中，沉淀产物并滤除，得到Glu(醋氨酚)NCA(1.02g，2.64mmol，62％)，一种米色粉末：¹H-NMR(DMSO-d6)δ2.01(s，3H，醋氨酚CH₃)，2.15(m，2H，Glu-βH)，2.81(m，2H，Glu-γH)，3.76(t，1H，Glu-αH)，7.06(d，2H，醋氨酚芳香环)，7.63(d，2H，醋氨酚芳香环)，8.57(br，s，1H，酰胺)，10。19(s，1H，酰胺)；¹³C NMR。(DMSO)δ23.81，29.25，52.13，54.62，119.66，121.71，136.98，145.35，168.19，170.46，170.77。

实施例12

双嘧达莫

2-[{6-[双(2-羟基-乙基)-氨基]-4，8-二-哌啶-1-基-嘧啶[5，4-d]嘧啶-2-基}-(2-羟基-乙基)-氨基]-乙醇

Glu(双嘧达莫)

双嘧达莫(0.500g，0.990mmol)和Boc-Glu(Osuc)-OtBu(3.96g，9.91mmol)的THF(35ml)溶液中加入DMAP(0.072g，0.60mmol)和N-甲基吗啉(0.22ml，1.98mmol)。溶液然后回流48小时。去除溶剂，粗品用硅胶(25-50％乙酸乙酯的己烷溶液)纯化。分离得到两种主要产物，一种是R＝2-3(0.57g)，另一个是R＝3-4(2.80g)，为亮黄色油状物。[对于R＝2-3 ¹H-NMR(CDCl₃)δ1.41(s，42H，t-Bu)，1.64(br s，5H，双嘧达莫)，1.85(m，2H，Glu-βH)，2.07(m，2H，Glu-βH)，2.37(m，4H，Glu-γH)，3.60-4.24(m，12H，Glu-αH和双嘧达莫)]；[对于R＝3-4而言与上面类似，除1.44(s，56H，t-Bu)之外]。

Boc-Glu(双嘧达莫)-OtBu(R＝2-3，0.57g)和4NHCl二噁烷(10ml)溶液室温搅拌2.5小时。去除溶剂，产物是一种亮黄色的固体：¹H-NMR(DMSO-d6)δ1.65(br m，4H，Glu-βH和双嘧达莫)，2.04(br m，2H，Glu-βH)，2.40(br m，4H，Glu-γH)，3.75(br m，8H，双嘧达莫)3.91(br m，2H，Glu-αH)，8.55(br m，2H，酰胺H)。

实施例13

齐多夫定(AZT)

1-(4-叠氮-5-羟甲基-四氢-呋喃-2-基)-5-甲基-1H-嘧啶-2，4-二酮

的二噁烷(75ml)溶液中加入DMAP(0.137g，1.13mmol)和N-甲基吗啉(0.82ml，7.49mmol)。溶液然后加热回流6小时并在70℃加热12小时。除去溶剂粗品用硅胶纯化(100％氯仿)，得到Boc-Glu(AZT)-OtBu(1.09g，1.91mmol，51％)，一种黄色泡沫。

¹H-NMR(CDCl₃)δ1.40(d，32H，t-Bu)，1.86(s，3H，AZTCH₃)，2.11(m，2H，Glu-βH)，2.38(m，4H，Glu-γH和AZT 2’位CH₂)，4.00-4.31(m，4H，AZT 4’位CH和5位’CH₂和Glu-αH)，5.21(d，1H，AZT 3’位CH)，6.01(t，1H，AZT 1’位CH)，7.16(s，1H，AZT 6位CH)。

Boc-Glu(AZT)-OtBu(1.09g，1.91mmol)的4NHCl二噁烷溶液(20ml)搅拌4小时，除去溶剂。得到产物Glu(AZT)(0.89g，1.99mmol，定量)黄色玻璃状物质。¹H-NMR(D₂O)δ1.89(s，3H，AZT CH₃)，2.21(m，2H，Glu-βH和AZT 2’位CH₂)，2.58(m，2H，Glu-γH)，3.70(t，1H，Glu-αH)，4.05-4.41(m，4H，AZT4’位CH，3’位CH和5’位CH₂)，6.18(t，1H，AZT1位CH)，7.51(s，1H，AZT 6位CH)。

实施例14

苏氨酸NCA

在Thr-OtBu(0.500g，2.85mmol)的THF(25ml)混合物中加入三光气(0.677g，2.28mmol)。所得的溶液回流搅拌3小时。溶液蒸发至干燥，得到Thr-NCA(0.500g，2.48mmol，87％)，为白色固体。Thr-NCA不再进行进一步表征鉴定。

实施例15

制备作为聚合反应的起始合成子的药物-谷氨酸偶联物

对于非一级胺的药物被选物，形成有可能会困难，为克服这个困难，使用下列路线，其中药物先与谷氨酸偶联，这个合成子被用来引发偶联。此方法成功用于舍曲林和甲氧氯普胺。

Boc-Glu(OtBu)-OH与舍曲林的偶联

1.Boc-Glu(OtBu)-OH(0.44g，1.46mmol)和PyBOP(0.84g，1.60mmol)搅拌溶解在无水DMF(15ml)中。

2.加入DIEA(0.31ml，1.75mmol)，氨基酸衍生物活化15分钟。

3.边搅拌将盐酸舍曲林(0.50g，1.46mmol)加入到混合物中，再加另外的0.31ml DIEA。

4.混合物搅拌16小时

5.溶液经汽提得到棕色的油

6.将此油溶解在乙酸乙酯(100ml)中，所得的溶液分别用10％HCl(3×30ml)，饱和碳酸氢钠，4M硫酸氢钠和盐水洗涤。

7.溶液用硫酸镁干燥，过滤并在减压下用旋转蒸发器除去溶剂，产生浅棕色油。

8.该油用真空干燥，用硅胶进行柱层析纯化，使用乙酸乙酯/己烷1∶5至1∶4的溶剂系统。

9.收集产品组分，再用回转蒸发器除去溶剂，得到0.85g(99％)的最终产物，舍曲林-NH-C(O)-谷氨酸-NH3+。

10.制备产物经真空干燥

实施例16

聚-赖氨酸-布洛芬的合成

I.布洛芬-O-琥珀酰亚胺的制备(RI-172)(Grafe&Hoffman，制剂学(Pharmazie)55：286-292，2000)

室温下搅拌布洛芬(2.06g，10mmol)在5ml二噁烷的溶液中加入二环己基碳二亚胺(DCC，2.27g，11mmol)的25ml二噁烷溶液。10分钟后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，1.16g，10mmol)的15ml二噁烷溶液。反应混合物室温搅拌5小时，然后用烧结玻璃漏斗过滤以去除二环己基脲(DCU)。经旋转蒸发后，产物经从二氯甲烷/己烷中结晶得到2.36g(78％)的无色固体。¹H-NMR(DMSO-d6)δ0.86(d，6，CH₃)，1.49(d，3，α-CH₃)，1.81(m，1，CH)，2.43(d，2，CH₂)，3.33(m，4，CH₂CH₂)，4.22(q，1，CH)，7.16(d，2，芳基H)，7.28(d，s，芳基氢)

II.聚赖氨酸与布洛芬-O-琥珀酰亚胺的偶联(RI-197)

聚赖氨酸-HBr(SIGMA，100mg，34.5mmol)溶解在1ml水中，用碳酸氢钠调pH至8，室温搅拌。将布洛芬-O-琥珀酰亚胺(116mg，380mmol)的二噁烷溶液2毫升加入到此溶液中，搅拌过夜，二噁烷用旋转蒸发去除并用10mlpH8的碳酸氢钠水溶液稀释。沉淀经烧结玻璃漏斗过滤，并用3×10ml水和4×10ml二乙基醚洗涤，高真空干燥过夜得到固体105mg(62％)。¹H-NMR(DMSO-d6)δ0.85(br s，6，CH₃)，1.27(br s，3，α-CH₃)，1.40-1.79(m，5，布洛芬CH和赖氨酸γ和δCH₂CH₂)，2.31(d，2，βCH₂)，2.41-2.52在DMSO下(m，2，βCH₂)，2.73-3.01(m，2，εCH₂)，3.51-3.85(m，1，布洛芬CH)，4.01-4.43(m，1，αCH)，7.14(d，2，芳基H)，7.6(d，2，芳基氢)，7.90-8.06(m，2，NH)。

实施例17

[赖氨酸]_xx-[吉非诺齐或萘普生]或[谷氨酸]_xx-L-多巴合成的总结

[Glu]₁₅-L-二羟基苯丙氨酸或[Glu]₁₅-L-多巴的合成

L-多巴(0.050g，254mmol)和GluNCA(0.666g，3.85mmol)溶解在6mlDMF中。氮气下搅拌过夜。反应用薄层层析

(9∶1水∶乙酸)来检测，显示有游离药物(Rf＝0.70)和被认为是聚合物的更极性的斑点(Rf＝0.27).加12ml水终止反应。用1NHCl调pH为1-2。用旋转蒸发除去溶剂，粘稠的残留物在真空中干燥。将所得的粘液转移到一个新的装水的容器中并冻干。得到米色至浅棕色晶体。产量：0470g，62％。

¹HNMR显示有焦谷氨酸的污染；这样，产物在水中悬浮，超滤(Millipore，再生纤维素，YM1分子量截留：1000)，滤余液在真空中干燥。产量：0.298g。¹HNMR(500MHz，DMSO)显示谷氨酸和L-多巴的相对比例为30∶1，6.6(L-多巴芳香环)，6.4(L-多巴芳香环)，4.1(Glu，α)，1.85(Glu，γ，L-多巴)，2.3(L-多巴，苄基)，12.4-11.5(Glu，COOH)，8.0(Glu酰氨)。

[谷氨酸]₁₀-L-多巴的合成

除了只用0.439gGluNCA以外，其它同[Glu]₁₅-L-多巴合成相同。最后纯品的产量为0.007g。

¹HNMR(500MHz，DMSO)显示谷氨酸和L-多巴的相对比例为8∶1。

萘普生-琥珀酰亚胺的合成

萘普生(2.303g，10mmol)的5ml二噁烷中加入溶于15ml二噁烷的N-羟基琥珀酰亚胺(1.16g，10mmol)和溶于25ml二噁烷的二环己基碳二亚胺(2.2g11mmol)。反应搅拌过夜，不溶性的二环己基脲用过滤除去。旋转蒸发除去溶剂，残留物溶解在30-40ml二氯甲烷中。加入约10ml己烷，混合物冷却至4℃2小时。再滴加己烷至小片状白色晶体开始形成，溶液冷藏过夜。收集活性酯，用己烷洗涤和用真空干燥(2.30g，70.0％)：¹HNMR(500MHz，DMSO)1.70(d，3H，CH₃)，2.9(s，4H，琥珀酰亚胺)，3.91(s，3H，OCH₃)，4.18(q，1H，CH)，7.75-7.12(m，6H，芳香环)。

聚赖氨酸-萘普生的合成

往1ml[Lys]₁₄·14·HBr(0.100g，35mmol)水溶液(含10mg/ml碳酸钠)加入萘普生-琥珀酰亚胺(0.124g，379mmol)的2ml二噁烷溶液。搅拌过夜形成沉淀。加入30-40ml水(含10mg/ml碳酸钠)后形成更多沉淀，过滤分离，用50ml乙醚洗涤。细小的白色粉末经干燥(0.095g，53％)：¹HNMR(500MHz，DMSO)8.1(m，1H，赖氨酸；酰胺)，7.8-7.0(m，6H，芳香环)，4.4-4.1(m，2H，αCH)，3.3(s，3H，0CH₃)，2.8(m，2H，ε)，1.7-1.0(m，9H，β，γ，δCH₃)。

吉非诺齐-琥珀酰亚胺的合成

吉非诺齐(GEM)(5.0g，20.0mmol)的30ml二噁烷中加入溶于20ml二噁烷的N-羟基琥珀酰亚胺(2.3g，20.0mmol)和溶于50ml二噁烷的二环己基碳二亚胺(4.5g 22.0mmol)。反应搅拌过夜，不溶性的二环己基脲用过滤除去。旋转蒸发除去溶剂，残留物溶解在15-20ml二氯甲烷中。滴加己烷至晶体开始出现，混合物冷却至4℃过夜。再加入3ml正己烷，混合物-20℃冷藏过夜。活性酯形成小片装结晶并收集，用己烷洗涤和用真空干燥(5.8g，80.0％)：¹HNMR(500MHz，DMSO)1.2，1.3(s，6H，CH₃)，1.8-1.5(m，6H，GEM CH₂)，2.3-2.1(s，6H，芳香环CH₃)，2.85-2.7(d，4H，琥珀酰亚胺CH₂)，7.0-6.6(m，3H，芳香环)。

聚赖氨酸-吉非诺齐的合成

往1ml[Lys]₁₁·11·HBr(0.100g，43.5mmol)水溶液(含10mg/ml碳酸钠)加入吉非诺齐-琥珀酰亚胺(0.094g，261.1mmol)的2ml二噁烷溶液。搅拌过夜形成沉淀。加入30ml水(含10mg/ml碳酸钠)后形成更多沉淀，过滤分离，用50ml乙醚洗涤。细小的白色粉末经干燥(0.019g，1％)：¹HNMR(500MHz，DMSO)1.5-1.0(m，12H，β，γ，δ，CH₃)，1.85-1.5(m，4H，CH₂)，22.3，2.1(s，6H，芳香环CH₃)，3.35(s，2H，ε)，3.85(s，2H，OCH₂)，4.05(s，1H，α)，5.6(d，1H，氨基甲酸酯)，7.0-6.7(m，3H，芳香环)，8.0(d，1H，酰胺)。

实施例18

所有试剂均不进行进一步处理。1HNMR由Bruker300MHz(300)和JEOL500MHz(500)NMR光谱仪进行，使用四甲基硅烷为内部标准。薄层层析用硅胶60F₂₅₄预铺板。色谱使用硅胶60(230-400目)。

聚精氨酸的制备

方法1

在溶有H-Arg(Z)₂-OH(0.300g，0.68mmol)的3ml无水DMSO中加入叠氮磷酸二苯酯(219μl，1.02mmol)和三乙胺(236μl，1.69mmol)。反应在氩气下进行48小时，届时溶液倒入100ml水中。所得的不均一的溶液经离心分离出白色沉淀，其用3×100ml水，3×100ml甲醇和100ml乙醚洗涤然后，真空干燥，得到172mg米色粉末：¹HNMR(500MHz，DMSO)7.31(m，10H)，5.21(m，1H，苄基)，5.02(m，1H，苄基)，3.83(m，1H，α)，3.34(m，2H，δ)1.54(m，4H，β，γ)。

此产物溶解在1.5ml无水苯甲醚中，并与0.3ml无水甲磺酸搅拌3小时，届时再加入0.3ml无水甲磺酸且溶液搅拌1小时。反应混合物倒入6ml乙醚中并冷冻15分钟。此异质的两相混合物用旋转蒸发器浓缩至0.5ml。再分三次加8ml乙醚，两相混合物经离心，弃上相，留下一种黄色的胶状物。残留物用6ml丙酮洗涤两次，离心弃上相，留下黄白色的残留物。此残留物溶解在0.3ml水中，和AmberliteIRA-400振摇。过滤除树脂并用3ml水洗涤，洗脱液和洗涤物合并经真空干燥得到黄色的膜0.063g，(90％)：¹HNMR(500MHz，D₂O)4.37(m，1H，α)，3.22(m，2H，δ)，1.94-1.66(m，4H，β，γ)。MALDI-MS显示聚合程度从6至14不等的残留物。

方法2

在溶有Boc-Arg(Z)₂-OH(0.025g，0.05mmol)和H-Arg(Z)₂-OH(0.280g，0.63mmol)的3ml无水DMSO中加入叠氮磷酸二苯酯(219μl，1.02mmol)和三乙胺(236μl，1.69mmol)。反应在氩气下进行48小时，届时溶液倒入100ml水中。所得的不均一的溶液经离心分离沉淀，其用3×100ml水、3×100ml甲醇和100ml乙醚洗涤然后真空干燥得到132mg固体：¹HNMR(500MHz，DMSO)7.31(m，10H)，5.21(m，1H，苄基)，5.01(m，1H，苄基)，3.83(m，1H，α)，3.34(m，2H，δ)1.54(m，4H，β，γ)。

此产物溶解在1.5ml无水苯甲醚中，并与1.3ml无水甲磺酸搅拌4小时。此溶液用旋转蒸发器浓缩至0.5ml。加8ml乙醚，两相混合物经离心，弃上相，分三次加入10ml丙酮留下一种黄色的胶状物。离心弃上相，沉淀经真空干燥过夜。此残留物溶解在0.3ml水中，和AmberliteIRA-400振摇。过滤除树脂并用3ml水洗涤，洗脱液和洗涤物合并经真空干燥得到黄色的膜0.019g，(24％)：¹HNMR(500MHz，D₂O)4.37(m，1H，α)，3.22(m，2H，δ)，1.94-1.66(m，4H，β，γ)。MALDI-MS显示聚合程度从5至11不等的残留物。

T4偶联物的制备

偶联于氨基酸聚合物的T4，既可由将带保护的T4与市售的氨基酸均聚物偶联得到，也可通过T4部分与相应N-酸酐氨基酸聚合而得到。

T4与现成的均聚物的偶联

往溶有N-TeocT4(0.017g，17μmol)的1ml无水DMF中入二环己基碳二亚胺(0.004g，18μmol)，搅拌30分钟后加入N-二甲基-4-氨基吡啶(0.004g，36μmol)和18聚谷氨酸(0.017g，17μmol)，反应搅拌过夜。此浑浊的溶液倒入20ml水中并且用10ml二氯甲烷萃取二次。水相用1N盐酸酸化至pH3，并冷却至4℃，产物经离心分离，沉淀用8ml水洗涤三次。沉淀经真空干燥得到二环己基脲和N-TeocT4-Gly₁₈：¹HNMR(500DMSO)7.8(T4，芳香环)，7.1(T4，芳香环)，4.1(α)。

在不纯的带有保护的聚合物中加入2ml三氟乙酸。反应搅拌2小时，用旋转蒸发除去溶剂。残留物溶解在1mlDMF中，过滤除去不溶物。用旋转蒸发除去DMF并经真空干燥得到白色的物质(.012g，40％)：¹HNMR(500DMSO)7.8(T4，芳香环)，7.1(T4，芳香环)，4.1(bs，α)。

氨基酸NCA的制备

往溶有L-氨基酸(1.5g)的100ml无水THF中加入三光气(0.8当量)反应在装有回流冷凝器和NaOH阱的容器中进行，加热回流3小时。用旋转蒸发除去溶剂，残留物经己烷洗涤得到氨基酸NCA的白色残留物。

LeuNCA：¹HNMR(500 CDCl₃)6.65(s，1H，NH)，4.33(dd，1H，α)，1.82(m，2H，β)，1.68(m，1H，γ)，0.98(dd，6H，δ)。

PheNCA：¹HNMR(500 CDCl₃)7.36-7.18(m，5H)，5.84(s，5H)，4.53(dd，1H)，3.28(dd，1H，α)，2.98(dd，1H，β)。

Trp(Boc)NCA：¹HNMR(500 CDCl₃)8.14(d，1H)，7.49(d，2H)，7.36(t，1H)，7.27(m，1H)，5.90(s，1H，NH)，4.59(dd，1H，α)，3.41(dd，1H，β)，3.07(dd，1H，β)，1.67(s，9H，t-Bu)。

IleNCA：¹HNMR(300 CDCl₃)6.65(s，1H，NH)，4.25(d，1H，α)，1.94(m，1H，)，1.3(dm，2H，γ-CH₂)，1.03(d，3H，γ-CH₃)，0.94(t，3H，δ)。

Lys(Boc)NCA：¹HNMR(500 CDCl₃)6.65(bs，1H，NtH)，4.64(s，1H，氨基甲酸酯NH)，4.31(t，1H，α)，3.13(s，2H，ε)，2.04(m，2H，β)，1.84(m，2H，δ)，1.48(m，11H，γ，t-Bu)。

MetNCA：¹HNMR(500 CDCl₃)6.89(s，1H，NH)，4.50(dd，1H，α)，2.69(t，2H，γ)，2.10(m，1H，β)，2.08(m，4H，β，δ)。

典型的T4-N-封端的均聚物制备：

T4-Leu₁₅

往溶有IleNCA(0.200g，1.3μmol)的2.5mlDMF加入异亮氨酸(0.012g，0.1μmol)，在氩气下搅拌过夜后，T4-NCA(0.037g，0.050μmol)加入到反应中，再搅拌72小时。此白色的液体加入到8ml水中。此不均一的溶液冷却至4℃，离心弃去上清，沉淀物用8ml水洗涤。干燥的残留物用50ml加热至50℃的乙醇洗涤，干燥后得到白色的粉末(0.124g，55％)：¹HNMR(500DMSO)7.75(s，T4芳香环)，7.08(s，T4芳香环)，4.11(dd，α)，1.77(m，β)，1.38(m，β，γ-CH)，0.91(m，γ-CH，γ-CH₃，δ)。

T4-Phe15

白色粉末(58％)：¹HNMR(360MHz，DMSO)7.0-8.1(NH，芳香环)，4.5(α)，3.0(β)；MALDI-MS显示：T4-Phe_1-5。

T4-Met15

白色粉末(10％)：¹HNMR(500MHz，DMSO)8.0-8.5(酰胺NH)，4.4(α)，2.5(γ)，2.05(ε)，2.0-1.7(β)。

T4-Val15

白色粉末(14％)：¹HNMR(500MHz，DMSO)7.75(T4芳香环)，7.08(T4芳香环)，4.35(α)，3.45(β)，1.05(γ)。

对于那些使用带保护的NCA的偶联物，需要一个附加的，独立的脱保护步骤。

在溶解有T4-[Lys(Boc)]₁₅(0.256g，61μmol)的10ml二氯甲烷和三氟乙酸(10ml)一起搅拌2小时。用旋转蒸发器去除溶剂，残留物溶解在3ml水中并超滤(Amicon再生纤维素，YM1 NMWL1000，用30mlpH5的水洗涤)。滤余液真空干燥得到浅黄色的残留物：¹HNMR(500D₂O)7.82(s，T4，芳香环)，7.41(s，T4，芳香环)，4.29(bs，α)，3.00(bs，α)，2.13-1.70(m，β，δ，γ)；MALDI-MS显示产生的范围是T4-Lys_4-11。

T4-Trp15：1HNMR(500DMSO)8.25-6.80(m，芳香环)，4.50(bs，α)，3.40(bs，β)，3.00(bs，β)。

典型的T4-C-端封均聚物的制备

往溶有T4(0.078g，100μmol)的10ml无水DMF加入Trp(Boc)NCA(0.500g，1.514mmol)，在氩气下搅拌64小时，加入10ml水终止反应。此不均一溶液冷却至4℃，离心，沉淀用25ml水洗涤3次。残留物经真空干燥，得到棕色固体Trp(Boc)₁₅-T4。该物质进一步超滤纯化(Amicon再生纤维素，YM1，NMWL1000，用30ml pH5的水洗涤)，从而得到棕金黄色的固体(0.400g，79％)：¹H NMR(500DMSO)8.25-6.80(m，芳香环)，4.50(bs，α)，3.40(bs，β)，3.00(bs，β)，1.50(bs，t-Bu)。

[Trp(Boc)]₁₅-T4(0.509克)在8ml的1∶1二氯甲烷∶三氟乙酸中搅拌1.5小时。溶剂用旋转蒸发器去除，残留物真空干燥，得到一棕色固体(0.347g，97％)：¹H NMR(500DMSO)8.25-6.80(m，芳香环)，4.50(bs，α)，3.40(bs，β)，3.00(bs，β)。

[Lys(Boc)]₁₅-T4：¹H NMR(500D₂O)7.82(s，T4芳香环)，7.41(s，T4芳香环)，4.29(bs，α)，3.00(bs，ε)，2.13-1.70(m，β，δ，γ)。

Lys₁₅-T4：¹H NMR(500D₂O)7.82(s，T4芳香环)，7.41(s，T4芳香环)，4.29(bs，α)，3.00(bs，ε)，2.13-1.70(m，β，δ，γ)。

典型的随机T4/均聚物的制备

把T4NCA(0.065g，0.1mmol)和Trp(Boc)NCA(0.400g，1.2mmol)在4毫升无水DMF中混合。加入三乙胺(11微升，0.1mmol)，在氩气下搅拌反应44小时。加入10毫升水终止反应之后，该不均一混合物被冷却至4℃，离心。分离出沉淀物，用10毫升水洗涤3次，真空干燥。

把10毫升1∶1的二氯甲烷∶三氟乙酸加到该随机T4/[Trp(Boc)]₁₅均聚物中，一起搅拌反应1小时。用旋转蒸发器去除溶剂，真空干燥得到棕色的残留物(0.262g，91％)，继续用超滤纯化(Amicon再生纤维素，YM1 NMWL1000，用30mlpH5的水洗涤)：¹HNMR(500DMSO)8.25-6.80(m，芳香环)，4.50(bs，α)，3.40(bs，β)，3.00(bs，β)。

随机T4/Lys15：¹HNMR(500D₂O)；7.82(s，T4芳香环)，7.41(s，T4，芳香环)，4.29(bs，α)，3.00(bs，ε)，2.13-1.70(m，α，β，γ)。

聚赖氨酸丙戊酸钠(Depakote)的制备

在溶有羟戊酸(1.0g，6.9mmol)的14ml6∶1二氯甲烷∶DMF中加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.8g，6.9mmol)，双环己基碳二亚胺(1.6g，7.6mmol)和三乙胺(0.9g，8.9mmol)。反应搅拌60小时，届时溶液经过滤除去白色的沉淀并用旋转蒸发除去溶剂。残留物用闪色谱纯化(10∶1-2∶1己烷∶乙酸乙酯)以得到琥珀酰亚胺酯是一种清澈的油(1.0g，59％)：Rf(3∶1己烷∶乙酸乙酯)0.43；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)2.76(s，4H，琥珀酰亚胺)，2.61(m，1H，CH)，1.65-1.19(m，8H，CH₂)，0.88(t，6H，CH₃)。

在溶有Lys₁₄HBr(0.106g，37μmol)的0.8mlpH8的水中加入溶于0.4mlTHF的丙戊酸琥珀酰亚胺酯(0.104g，431μmol)。反应搅拌过夜，届时加入8ml水。溶液用6M盐酸酸化至pH3并用2ml二氯甲烷萃取2次。水层经干燥，残留物溶于1ml水中。溶液经SEC纯化(G-15，10ml干体积)并用水洗脱。合并那些含偶联物的组分并干燥得到白色的固体。经NMR显示每个药物分子带有28个赖氨酸。¹HNMR(D₂O)4.29(m，1H，α)，3.00(m，2H，ε)，1.87-1.68(m，4H，β，δ)，1.43(m，γ，CH₂)，0.85(t，CH₃)。

聚谷氨酸美伐他丁的制备

AcNGlu₁₅(3-美伐他丁)₂

在溶有15聚谷氨酸(0.116g，69μmol)的3ml无水DMF中加入1ml吡啶和乙酸酐(20μl，207μmol)。搅拌21小时后混合物用6NHCl酸化至pH1然后冷却至4℃。离心收集白色沉淀并用水洗涤3次，然后真空干燥得到11mgN-乙酰化的15聚谷氨酸(polyGlu₁₅)。

在溶有N-乙酰化15聚谷氨酸(0.011g，7αmol)的4.8ml无水DMF中加入二环己基碳二亚胺(0.022g，108μmol)。搅拌20分钟后，此不均一的溶液经过滤除去不溶性的二环己基脲并合并美伐他丁(0.042g，108μmol)和N-二甲基-4-氨基吡啶(0.013g，108μmol)。混合物搅拌23小时，届时加入20ml水终止反应。溶液用10ml氯仿萃取2次。水相用1NHCl调pH为3并冷却至4℃。离心收集所得的白色沉淀并用8ml水洗涤3次。固体溶于1ml水中并用1ml二氯甲烷洗涤和2ml乙酸乙酯洗涤2次。水相用1NHCl调pH为3，离心收集沉淀并用2ml水洗涤2次。经干燥的偶联物(2mg)由¹HNMR显示每两个美伐他丁分子有15个谷氨酸。¹HNMR(500MHz，DMSO)，5.92(5’美伐他丁)，5.72(3’美伐他丁)，5.19(4’美伐他丁)，5.17(8’美伐他丁)，3.12(3美伐他丁)，4.41(5美伐他丁)，4.03(α，Glu)，2.25(γ，Glu)，1.88(β，Glu)，0.82(4”，2’烯丙基甲基美伐他丁)，1.17(2”美伐他丁)。

Glu₁₅(3-美伐他丁)(160)

在溶有15聚谷氨酸(0.151g，77μmol)的3ml无水DMF中加入二环己基碳二亚胺(0.239g，1.159mmol)。氮气下搅拌4小时。除去白色沉淀并加入溶于10ml氯仿的和N-二甲基-4-氨基吡啶(0.141g，1.159mol)和美伐他丁(0.222g，0.569mmol)。混合物在氩气下搅拌21小时，除去沉淀。溶液用旋转蒸发浓缩并加入40ml饱和NaCl(液体)调至pH8。均一的溶液用20ml氯仿萃取3次并超滤(Amicon再生纤维素，YM1，NMWL 1,000)。滤余液经真空干燥得到8mg白色的残留物。由¹HNMR显示每个美伐他丁分子有15个谷氨酸。¹HNMR(500MHz，D₂O)，5.92，5.72(3’美伐他丁)，5.19(4’美伐他丁)，5.17(8’美伐他丁)，3.12(3美伐他丁)，4.41(5美伐他丁)，4.03(α，Glu)，2.25(γ，Glu)，1.88(β，Glu)，0.82(4”，2’烯丙甲基，美伐他丁)，1.17(2”美伐他丁)。

BocGlu(3-美伐他丁)O-t-Bu

在BocGlu(OSu)O-t-Bu(O.181g，453αmol)和美伐他丁(0.177g，453μmol)的40ml氯仿中加入N-二甲基-氨基吡啶(0.055g，452μmol)。反应在氩气下加热回流7小时再在20℃下搅拌8小时。用旋转蒸发除去溶剂，残留物用闪色谱纯化(8∶1-1∶1的己烷∶乙酸乙酯)得到偶联物，一种透明的膜(0.038g，11％)：Rf(3∶1己烷∶乙酸乙酯)0.22；1HNMR(CDCl3500MHz)5.97(d，1H，5’)，5.73(dd，1H，3”)，5.55(s，1H，4’)，5.32(s，1H，8”)，5.24(dd 1H，3)，5.09(d，1H，NH)，4.48(m，1H，5)，4.20(m，1H，α)，2.78(m，2H，2)，2.37(m，4H，2’，2”，γ)，1.45(s，18H，t-Bu)，1.12(d，3H，2”-CH₃)，0.88(m，6H，4”，2’-CH₃)。

聚谷氨酸泼尼松的制备

BocGlu(21-泼尼松)O-t-Bu

在BocGluO-t-Bu(0.400g，1.32mmol)的20ml氯仿中加入二环己基碳二亚胺(0.544g，2.64mmol)。反应搅拌1小时，过滤除去不溶性的二环己基脲。加入N-二甲基-氨基吡啶(0.320g，2.64mmol)和泼尼松(0.472g，1.32mmol)。反应加热回流60小时并过滤。用旋转蒸发除去溶剂，残留物用闪色谱纯化(10∶1-0∶1的己烷∶乙酸乙酯)得到偶联物，一种透明的膜(0.256g，31％)：Rf(6∶1氯仿∶甲醇)0.54；1HNMR(CDCl3 500MHz)7.68(d，1H，1)，6.16(d，1H，2)，6.04(s，1H，4)，5.15(d，1H，NH)，5.03(d，1H，21)，4.71(d，1H，21)，4.08(t，1H，α)，1.40(s，18H，t-Bu)。

谷氨酸(21-泼尼松)

在溶有BocGlu(21-泼尼松)O-t-Bu(0.060g，93μmol)的15ml二氯甲烷与三氟乙酸(1.5ml)搅拌1小时。用旋转蒸发除去溶剂，残留物用闪色谱(8∶1氯仿∶甲醇)纯化得到透明的膜：Rf(6∶1氯仿∶甲醇)0.13，¹HNMR(CDCl₃ 500MHz)7.72(d，1H，1)，6.25(d，1H，2)，6.14(s，1H，4)，5.14(d，1H，21)，4.75(d，1H，21)，4.10(t，1H，α)。

实施例19

氨基引发的L-谷氨酸NCA聚合

分子量(g/mol)  266.3    173    1538(n＝10)

质量(mg)       77500    466    ＝100％

毫摩尔         0.29     2.89   0.29

当量           1        10     1

DMF是四氢呋喃，无水，购自Aldrich。

玻璃器皿用前烘干。

1.GluNCA(500mg，2.89mmol)溶解在4mlDMF中，置于带气体入口管的15ml圆底烧瓶中，在氩气下搅拌。

2.阿替洛尔，溶解在1mlDMF中，加入到此Glu-NCA溶液中，室温搅拌72小时。大致上，反应可进行至经TLC监测无氨基引发物存在。对于这个反应，TLC用硅胶板，用20％的甲醇的乙酸乙酯溶液进行洗脱。

3.将反应溶液倒入20ml 10％碳酸氢钠溶液(pH＝8)来终止反应

4.水溶液用20ml二氯甲烷洗涤两次，20ml乙酸乙酯洗涤3次。

5.合并水层，用6NHCL调pH至6并用旋转蒸发减少体积至20ml。此溶液在冰箱中冷却3小时以上。

6.为沉淀聚合物产物，水溶液用6N盐酸酸化至pH 2，再放回冰箱中1-2小时。

7.混悬液分份倒入10ml试管中，离心15分钟至沉淀在试管底部形成结实的团块，这样水可被倾去。(在这点上，通常的步骤，最好用过滤漏斗过滤固体，再用酸性的水洗涤。阿替洛尔上使用离心是因为固体对过滤器而言太细了。

8.此固体在酸性水(pH约为2)再悬浮并振荡，再次离心倾去水。此步骤重复三次洗涤。

9.产物在高度真空下干燥过夜得到262克(59％)聚合物。NMR分析显示Glu/阿替洛尔的比例为30/1。

实施例20

Caco2人肠上皮细胞的单细胞层越来越多地用于预测口服药物的吸收。我们使用Caco-2透孔(transwell)系统和其他体外分析来评价宝力士德(polythroid)的性能。结果显示，宝力士德可以增强甲状腺素激素的口服输送以治疗甲状腺机能减退症。

体外性能

Caco-2人肠上皮细胞测定

Caco-2细胞在24孔板的胶原包被的孔表面上生长，形成连续的单细胞层以模拟肠道的一个小片断。这些孔是可以移动的，带有一个顶腔以代表顶侧(面向肠道的腔道)和一个底腔以代表基侧(浆膜的药物吸收位点)。上皮屏障的完整性可通过测量单细胞层两侧的电阻来监控。通过在上腔中加入样品，经培育后测量在基侧腔中药物的浓度来研究药物的吸收。

小肠上皮细胞蛋白酶消化宝力士德

宝力士德是由与T4和T3经肽键共价连接的谷氨酸的合成聚合物。该聚合物是甲状腺素激素的输送载体且被设计自身不穿过肠道屏障。相反，它被设计成以依赖于时间的方式释放T4和T3。甲状腺素激素的释放有赖于谷氨酸聚合物的酶解。在理论上，这是由于当宝力士德经过小肠道时遇到蛋白水解酶，蛋白质被胃蛋白酶和分泌到小肠中的胰酶消化成短肽。肠上皮细胞然后进一步发挥功能，切割这些短肽。这是通过蛋白水解酶(即结合在细胞表面的纹缘蛋白酶)来达此目的的。

监测纹缘蛋白酶对宝力士德的作用需要开发一种测定方法以将宝力士德与聚谷氨酸和甲状腺素激素区分开来。这样，我们开发了一种酶联免疫吸附测定法(ELISA)来特异性地识别宝力士德。此测定方法采用针对谷氨酸聚合物的抗体来俘获宝力士德，用针对T4和T3的抗体来检测宝力士德的存在。此方法与聚谷氨酸或甲状腺素激素本身无交叉反应。这样，宝力士德的蛋白酶降解导致T4和T3从聚合物中释放出来，从而ELISA的反应性相应的减少。这样，宝力士德特异性的ELISA可以用来检测宝力士德的降解。

宝力士德特异性的测定方法用于测定宝力士德在Caco-2细胞培养中的原位降解。将不同浓度的宝力士德加到Caco-2细胞的顶侧，并在37℃下于PBS中培育4小时(n＝4)。4小时培育前后的顶侧宝力士德的浓度用宝力士德特异性的ELISA进行测定(图6)。当浓度为相对较高的100微克时，26％宝力士德被降解，而当浓度低十倍时，84％的宝力士德被降解。如加入的浓度为0.5微克(接近于一剂正常人用剂量时肠道中的浓度)经4小时培育后残留的宝力士德的量低于ELISA的检测限(10ng)，提示基本上完全水解了。顶侧腔体中宝力士德量的减少宝力士德吸收穿过了单细胞层，因为在任何试验中均不含有可检测的宝力士德(见下)。我们不能排除宝力士德的细胞吸收，但对于顶侧宝力士德浓度的减少而言，酶解很可能最主要的因素(如果不是全部因素的话)。在较高浓度下，对于细胞吸收也难以解释如此大的残留宝力士德差异。

宝力士德增强了T4穿过Caco-2单细胞层的吸收

用Caco-2细胞穿透孔技术(n＝4)来监测T4的吸收。

将宝力士德(10微克)加入到穿透孔的顶侧。T4的顶侧加入量等于宝力士德中T4的含量。一种市售的T4ELISA法用于测定在37℃培育4小时后基侧腔中T4的水平。从宝力士德中吸收的T4水平明显比用与聚合物中含量相当的T4一起培育的Caco-2细胞高。

宝力士德没有穿过Caco-2单细胞层

为了测定宝力士德自身有无穿过Caco-2单细胞层，我们在与高浓度(100微克)宝力士德一起培育4小时后的基侧腔中用宝力士德特异性的ELISA测定了聚合物的浓度。样品(n＝4)显示在基侧无ELISA反应。宝力士德的检测限是10ng，这样也就是少于1/10,000的宝力士德被吸收。总之，就ELISA检测而言，宝力士德没有穿过Caco-2单细胞层。

宝力士德在胃肠模拟器中的消化

胃蛋白酶是由胃粘膜分泌，唯一在胃的酸性条件下有活力的蛋白酶。胰脏把一些蛋白水解酶分泌到肠中来降解蛋白质和多肽。在理论上，当聚合物下行通过肠道时，这些内源性的蛋白酶会将T4和T3从宝力士德中释放出来。

我们检测了宝力士德在美国药典的人工胃液和人工肠液中的情况并比较了用不同方法合成的宝力士德的消化情况。宝力士德的样品因甲状腺素激素的结合位点而不同。样品溶解在含有胃蛋白酶的人工胃液缓冲液中或溶解在含有胰脏酶提取物(胰酶)的人工肠液缓冲液中并在37℃下培育24小时。消化后，样品用HPLC测定以确定所释放的T4和T3单体。图9和图10显示了在胃液和肠液消化后T4和T3的水平。释放也因甲状腺素激素结合位点而不同。T4和T3结合在C端(C-封端)的宝力士德消化水平最高，另一方面，T4和T3结合在N端(N-封端)的宝力士德在人工胃液中未被消化，在人工肠液中的消化水平也相对较低。随机结合的宝力士德在人工胃液中显示只有少量的消化，在人工肠液中有中等程度的消化。总之，甲状腺素激素从宝力士德中释放的程度取决于合成的方法。这为口服释放的时间控制提供了一种潜在的方法(精细调控)。

结论和总结

●从体外性能试验中可得以下结论：

●胰脏和肠细胞的蛋白酶将T4和T3从宝力士德中释放出来。

●从宝力士德中释放出来的T4和T3穿过肠细胞单细胞层被吸收。

●在体外，宝力士德能促进T4穿过肠上皮细胞吸收。

●宝力士德本身在体外未穿过肠上皮屏障。

●时间释放的动力学可由宝力士德的合成方法来调控。

出来。这样，当他们在肠道中下行时，T4和T3就可以时间依赖性的方式释放。在Caco-2细胞模型中，一旦释放，激素就穿过小肠上皮被吸收。另外，体外肠上皮模型的数据提示将T4和谷氨酸聚合物结合可增强甲状腺激素的吸收，也许士德自身未穿过肠上皮屏障。这样，因为它不被血液吸收，因此对于聚合物给全身带来的影响的担心就减小了。

虽然上述的阐述和描述均以具体的实施例为参照。本发明并不是被限于所示的细节。还有，在与权利要求相当的范围和程度内对细节的各种修饰均不被认为是超出了本发明的内涵。

Claims (7)

1.一种口服给药的组合物，其特征在于，它含有：

多肽，所述多肽是选自下组的氨基酸的均聚物：谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸；

非氨基酸的活性物质，其中所述活性物质是共价连接于所述多肽的醇，所述活性物质通过所述醇与所述多肽的N端或C端共价连接，从而使所述活性物质在口服后通过酶催化释放到血液中，其中所述组合物是口服片剂或口服混悬剂形式，

其中，所述活性物质选自下组：纳曲酮、甲基纳曲酮、硫酸吗啡、芬太尼、氢可酮、氢吗啡酮、羟考酮、羟吗啡酮、双氢可待因、二乙酰吗啡、双氢吗啡、甲氢吗啡酮、可待因、盐酸曲马多、乙基吗啡和二乙酰吗啡。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多肽由谷氨酸组成。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多肽由丝氨酸组成。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多肽由赖氨酸组成。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的组合物，其中所述活性物质通过C端相连。

6.根据权利要求1、2、3或4所述的组合物，其中所述活性物质通过N端相连。

7.一种口服给药的组合物，其特征在于，它含有：

多肽，所述多肽是选自下组的氨基酸的均聚物：谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸；

非氨基酸的活性物质，其中所述活性物质是共价连接于所述多肽的胺，所述活性物质通过所述胺与所述多肽的C端共价连接，从而使所述活性物质在口服后通过酶催化释放到血液中，其中所述组合物是口服片剂或口服混悬剂形式，且其中所述活性物质为硫酸右旋苯丙胺。

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