KR100896747B1 - Composite for Inducing Maturation of Dendritic Cell Containing Fucoidan or its Homologous - Google Patents

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Abstract

본 발명은 후코이단 또는 그 유사체를 이용한 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법 및 상기 방법에 의해 성숙화된 성숙 수지상 세포를 함유하는 세포치료제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 미성숙 수지상 세포를 후코이단 또는 그 유사체로 처리하는 것을 특징으로 하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법, 후코이단 또는 그 유사체를 유효성분으로 함유하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물 및 상기 방법으로 성숙화된 성숙 수지상 세포를 함유하는 세포치료제에 관한 것이다.The present invention relates to a method for inducing maturation of immature dendritic cells using fucoidan or an analog thereof, and to a cell therapeutic agent containing mature dendritic cells matured by the method, and more particularly, to treat immature dendritic cells with fucoidan or an analog thereof. The present invention relates to a method for inducing maturation of immature dendritic cells, a composition for inducing maturation of immature dendritic cells containing fucoidan or the like as an active ingredient, and a cell therapeutic agent containing mature dendritic cells matured by the above method.

본 발명에 따르면, 종래의 고가의 사이토카인 첨가 없이 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 분화시킬 수 있어, 성숙 수지상 세포를 함유하는 암치료용 세포치료제를 보다 경제적으로 제조할 수 있다.According to the present invention, immature dendritic cells can be differentiated into mature dendritic cells without the addition of conventional expensive cytokines, thereby making it possible to economically manufacture a cell therapy agent for treating cancer containing mature dendritic cells.

후코이단, 수지상 세포, 성숙 수지상 세포, 세포치료제, Fucoidans, dendritic cells, mature dendritic cells, cell therapies,

Description

후코이단 또는 그 유사체를 함유하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물{Composite for Inducing Maturation of Dendritic Cell Containing Fucoidan or its Homologous}Composition for Inducing Maturation of Dendritic Cells Containing Fucoidan or Its Analogues {Composite for Inducing Maturation of Dendritic Cell Containing Fucoidan or its Homologous}

도 1은 후코이단 및 그 유사체의 화학적 구조를 나타낸 것이다. 1 shows the chemical structure of fucoidan and its analogs.

도 2는 미성숙 수지상 세포로 분화 유도시킨 혈액 유래 단핵구의 미성숙 수지상 세포 특이적인 단백질 표면인자의 발현을 측정한 결과를 나타낸 것이다. Figure 2 shows the results of measuring the expression of immature dendritic cell-specific protein surface factors of blood-derived monocytes induced differentiation into immature dendritic cells.

도 3은 미성숙 수지상 세포를 후코이단 또는 그 유사체로 처리하여 성숙화 시킨 경우, 성숙 수지상 세포의 특이적인 단백질 표면인자의 발현을 측정한 결과를 나타낸 것이다. Figure 3 shows the results of measuring the expression of specific protein surface factors of mature dendritic cells when matured by treating immature dendritic cells with fucoidan or its analogs.

도 4는 미성숙 수지상 세포에 후코이단 또는 그 유사체를 농도별로 처리한 경우, 성숙 수지상 세포의 특이적인 단백질 표면인자 발현 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다. Figure 4 shows the results of measuring changes in the expression of specific protein surface factors of mature dendritic cells when the immature dendritic cells were treated fucoidan or its analogs by concentration.

도 5는 미성숙 수지상 세포에 후코이단, 후코이단 유사체 또는 LPS를 처리하였을 때 나타나는 형태학적 변화를 나타낸 것이다. Figure 5 shows the morphological changes appearing when immature dendritic cells treated with fucoidan, fucoidan analogue or LPS.

도 6은 미성숙 수지상 세포에 후코이단, 후코이단 유사체 또는 LPS를 각각 처리한 성숙 수지상 세포의 항원 포식 능력을 측정한 결과를 나타낸 것이다. Figure 6 shows the results of measuring the antigen predation capacity of mature dendritic cells treated with immature dendritic cells, fucoidan, fucoidan analogues or LPS, respectively.

도 7은 후코이단, 후코이단 유사체 또는 LPS로 유도되어진 성숙 수지상 세포의 사이토카인의 분비 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. Figure 7 shows the results of measuring the degree of cytokine secretion of mature dendritic cells induced by fucoidan, fucoidan analogue or LPS.

도 8은 후코이단, 후코이단 유사체 또는 LPS에 의해 성숙화된 수지상 세포의 T 림프구의 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다. Figure 8 shows the results of measuring the activity of T lymphocytes of dendritic cells matured by fucoidan, fucoidan analogue or LPS.

도 9는 후코이단, 후코이단 유사체 또는 LPS에 의해 성숙화된 수지상 세포로 활성화된 T 림프구의 인터페론-감마의 분비능력을 측정한 결과를 나타낸 것이다. Figure 9 shows the results of measuring the secretion capacity of interferon-gamma of activated T lymphocytes into dendritic cells matured by fucoidan, fucoidan analogue or LPS.

도 10은 혈액에서 분리된 미성숙 수지상 세포의 성숙 수지상 세포에 후코이단, 후코이단 유사체 또는 LPS을 처리한 세포의 성숙화 수지상 세포에 특이적인 단백질 표면 인자 발현을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 10 shows the results of measuring protein surface factor expression specific for mature dendritic cells of cells treated with fucoidan, fucoidan analogues or LPS in mature dendritic cells of immature dendritic cells isolated from blood.

도 11은 혈액에서 분리된 미성숙 수지상 세포에 후코이단, 후코이단 유사체 또는 LPS를 처리하여 성숙화시킨 수지상 세포의 사이토카인의 분비능을 측정한 결과를 나타낸 것이다. Figure 11 shows the results of measuring the cytokine secretion capacity of dendritic cells matured by treatment of immature dendritic cells isolated from blood to fucoidan, fucoidan analogue or LPS.

본 발명은 후코이단 또는 그 유사체를 이용한 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법 및 상기 방법에 의해 성숙화된 성숙 수지상 세포를 함유하는 세포치료제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 미성숙 수지상 세포를 후코이단 또는 그 유사체로 처리하는 것을 특징으로 하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법, 후코이 단 또는 그 유사체를 유효성분으로 함유하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물 및 상기 방법으로 성숙화된 성숙 수지상 세포를 함유하는 세포치료제에 관한 것이다.The present invention relates to a method for inducing maturation of immature dendritic cells using fucoidan or an analog thereof, and to a cell therapeutic agent containing mature dendritic cells matured by the method, and more particularly, to treat immature dendritic cells with fucoidan or an analog thereof. The present invention relates to a method for inducing maturation of immature dendritic cells, a composition for inducing maturation of immature dendritic cells containing fucoidan or an analog thereof as an active ingredient, and a cell therapeutic agent containing mature dendritic cells matured by the above method.

이제까지 암치료의 대부분은 수술, 항암제 그리고 방사선 치료가 주종을 이루었다. 그러나 이러한 치료는 부작용이 따르고 또한 완치가 어려워 암의 근본적인 치료법은 되지 못하는 실정이다. 특히 전이 암이나 재발 암의 경우 대부분 수술이 불가능하며 화학적 치료제에 저항성을 가지는 경우가 많아 이러한 암환자들을 위한 새로운 치료제의 개발이 절실히 요구되는 실정이다.Until now, most of the cancer treatments were mainly surgery, chemotherapy and radiation. However, these treatments have side effects and are difficult to cure, and thus cannot be a fundamental treatment for cancer. In particular, metastatic or recurrent cancers are mostly inoperable and resistant to chemotherapy. Therefore, the development of new treatments for these cancer patients is urgently needed.

최근에 연구 개발되고 있는 수지상세포를 이용한 암 치료제는 기존의 어떠한 치료제 보다 환자 지향적이며, 기억면역에 의해 장기적으로 효능을 볼 수 있어 동일 암에 대한 전이나 재발 방지에 매우 효과적일 뿐 아니라 안전하며 새로운 항암 면역치료법으로 기대되어 현재 선진국에서 다양한 종류의 암에 대해 치료용 백신으로 개발되고 있다. 특히 수지상세포 백신은 원발암을 수술로 제거한 후 전이 및 재발을 방지할 수 있는 치료제로 사용할 수 있어 암 치료시장에서 상당한 경쟁력을 갖게 될 것이다. 수지상세포 암 백신은 환자별로 맞춤치료의 형태로 생산되며 생산 공정 시 고가의 사이토카인이 대량으로 요구되어 다른 치료제에 비해 고가이기는 하나 암환자의 증가 추세나 국제적 시장성을 고려해 볼 때 충분한 상업적 가치가 있어 선진국을 중심으로 개발에 박차를 가하고 있다. Recently, the research and development of cancer cells using dendritic cells is more patient-oriented than any other treatments, and can be effective long-term by memory immunity, which is very effective in preventing the recurrence or recurrence of the same cancer. It is expected to be an anti-cancer immunotherapy and is currently being developed as a vaccine for treatment of various types of cancer in developed countries. In particular, dendritic cell vaccine may be used as a therapeutic agent to prevent metastasis and recurrence after surgical removal of primary cancer, which will give a significant competitive advantage in the cancer treatment market. Dendritic cell cancer vaccines are produced in the form of customized treatments for each patient, and the production process requires a large amount of expensive cytokines, which are more expensive than other treatments, but have sufficient commercial value in view of the increasing trend of cancer patients and international marketability. The developed countries are spurring development.

수지상세포 백신은 세포간의 정교한 인지작용에 의거한 암세포 특이적 면역 반응을 유도하여 암세포만을 공격하여 사멸시키는 방법으로 기존 항암치료와 달리 부작용이나 고통이 거의 없는 무독성의 치료방법이다 (Barratt-Boyes SM and Figdor CG, Cytotherapy, 6:105, 2004; Grunebach F et al. Cancer Immunol Immunother, 54:517, 2005). 특히 치료기간 동안 입원할 필요가 없고, 정기적으로 병원을 방문하여 백신을 투여 받는 형태이기 때문에 다른 암 치료와 달리 환자의 삶의 질을 저하시키지 않는 장점이 있어 인체 친화적인 차세대 암치료제로 기대를 모으고 있다. 기존의 임상연구사례를 보면 백신 치료 후 단기간의 평가시점까지 종양치료반응을 보이지 않은 환자라 하더라도 이후 다른 항암치료에 대한 반응율이 크게 향상되는 것으로 보고되고 있다. 그러므로 수지상세포 백신 단독치료뿐 아니라 다른 항암치료와 병행할 경우 난치성 암의 치료에 보다 큰 상승효과를 기대할 수 있을 것이다. Dendritic cell vaccines induce cancer cell-specific immune responses based on sophisticated intercellular cognitive responses and attack and kill only cancer cells. Unlike conventional chemotherapy, dendritic cell vaccines have no side effects or pain. Figdor CG, Cytotherapy, 6: 105, 2004; Grunebach F et al. Cancer Immunol Immunother, 54: 517, 2005). In particular, there is no need to be hospitalized during the treatment period, and since it is a form of regular visits to the hospital to receive vaccines, unlike other cancer treatments, it does not deteriorate the quality of life of patients. have. According to existing clinical studies, even patients who did not show tumor response until the short-term evaluation time after the vaccine treatment have been reported to significantly improve the response rate to other chemotherapy. Therefore, in combination with other chemotherapy as well as dendritic cell vaccine alone treatment, a greater synergistic effect can be expected in the treatment of refractory cancer.

수지상 세포는 분화 단계별로 크게 미성숙 및 성숙 수지상 세포로 나누어 볼 수 있다. 수지상 세포는 미성숙 상태로 존재하며 T 세포 활성을 유도하지 못한다. 이 경우 수지상 세포에는 보조자극 인자가 거의 발현되지 않고 있지만 미성숙 수지상 세포는 세포표면에 항원 포획에 필요한 다양한 수용체 분자들을 다량 발현하고 있어 매우 효과적으로 항원을 포획함으로 면역의 초기단계를 담당한다. 또한 다른 항원제시세포와는 달리 MHC(주요 조직 적합성 항원) 발현양이 높아 극소량의 항원도 효과적으로 제시하여 T 세포 활성을 유도할 수 있다. 그 외에도 미성숙 수지상 세포는 외부 항원에 감작되면 이를 Th1와 Th2 세포에 교차 항원제시를 할 수 있어 바이러스 감염 뿐 아니라 죽은 미생물이나 사멸된 세포에 대해서도 세포 독성 T 림 프구의 활성을 효과적으로 유도할 수 있다. Dendritic cells can be divided into immature and mature dendritic cells by stage of differentiation. Dendritic cells are immature and do not induce T cell activity. In this case, almost no co-stimulatory factor is expressed in dendritic cells, but immature dendritic cells express a large amount of various receptor molecules necessary for capturing antigens on the cell surface, thus capturing antigens very effectively, and thus is responsible for the initial stage of immunity. In addition, unlike other antigen-presenting cells, the expression of MHC (major histocompatibility antigen) is high, and thus a small amount of antigen can be effectively presented to induce T cell activity. In addition, when immature dendritic cells are sensitized to foreign antigens, they can cross-present antigens to Th1 and Th2 cells, effectively inducing cytotoxic T lymphocyte activity against dead microorganisms or killed cells.

미성숙 수지상 세포는 항원에 감작된 후에는 성숙화 단계를 거치면서 모양과 활성이 급격히 변하여 항원포획에 필요한 분자들은 사라지고 대신 T 세포 활성유도에 필요한 보조 자극인자나 T 세포와의 반응에 필요한 분자들의 발현이 현저히 증가된 성숙 수지상 세포가 된다. 또한 성숙화 단계의 수지상 세포는 CCR7과 같이 임파절로의 이동에 필요한 화학주개성 수용체를 발현하고 이를 통해 부근의 임파절이나 비장으로 이동하여 세포성 면역을 유도한다. 이들은 항원을 포획한 후 1-2일 사이에 보조자극인자들의 발현이 현저히 증가되면서 임파절에서 항원 특이 T 세포를 활성화시킨다.After immature dendritic cells are sensitized to the antigen, they undergo a maturation stage, which rapidly changes their shape and activity so that the molecules necessary for capturing the antigen disappear. Instead, the expression of co-stimulatory factors necessary for inducing T cell activity or molecules necessary for reaction with the T cells are lost. Becomes a markedly increased mature dendritic cell. In addition, dendritic cells in the maturation stage express a chemotactic receptor required for migration to lymph nodes, such as CCR7, through which they move to nearby lymph nodes or spleen to induce cellular immunity. They activate antigen-specific T cells in lymph nodes with a marked increase in the expression of costimulatory factors within 1-2 days after capturing the antigen.

수지상 세포의 세포 치료제는 현재 많이 연구되어지고 있는 분야이다. 수지상 세포의 세포 치료제는 부작용이 없고 안전한 치료용 암 백신으로 알려져 있으나 연구가 많이 진행된 만큼 많은 문제점들도 제기되어 왔다. 최근 연구 결과에 따르면 미성숙 수지상 세포를 세포 치료제로 사용하였을 경우 암을 더 활성화시키는 결과를 나타내기도 하여, 수지상 세포를 이용한 세포 치료제는 충분히 성숙된 성숙 수지상 세포를 이용하여야한다(대한민국 특허공개 10-2005-7016059). 또한 수지상 세포 치료제는 한 사람 한 사람에 맞추어진 맞춤형 치료제로서 많은 비용이 드는 것도 하나의 문제점이다. Cell therapy for dendritic cells is a field that is currently being studied. Cell therapy for dendritic cells is known to have no side effects and is a safe therapeutic cancer vaccine. However, many problems have been raised as much research has been conducted. Recent studies have shown that when immature dendritic cells are used as cell therapeutics, they may activate cancer more. Cell therapy using dendritic cells should use mature mature dendritic cells (Korean Patent Publication No. 10-2005). -7016059). In addition, dendritic cell therapies are one of the problems that are costly as a customized treatment for each person.

본 발명자들은 기존의 고가의 사이토카인을 사용하지 않으면서, 미성숙 수지 상 세포를 성숙 수지상 세포로 성숙화시키는 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, 해조류에서 추출된 후코이단 또는 그 유사체를 미성숙 수지상 세포에 처리한 경우, 기존의 사이토카인이나 LPS보다 효율적으로 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 성숙화시킬 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have diligently tried to find a method of maturing immature dendritic cells into mature dendritic cells without using existing expensive cytokines. As a result, when fucoidan or its analog extracted from algae is treated to immature dendritic cells, The present invention has been accomplished by confirming that immature dendritic cells can be matured into mature dendritic cells more efficiently than conventional cytokines or LPS.

본 발명의 목적은 미성숙 수지상 세포를 후코이단 또는 그 유사체로 처리하는 것을 특징으로 하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법을 제공하는데 있다.It is an object of the present invention to provide a method for inducing maturation of immature dendritic cells, characterized in that immature dendritic cells are treated with fucoidan or an analog thereof.

본 발명의 다른 목적은 후코이단 또는 그 유사체를 유효성분으로 함유하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a composition for inducing maturation of immature dendritic cells containing fucoidan or its analogs as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 성숙화된 성숙 수지상 세포를 함유하는 세포치료제를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a cell therapy containing mature dendritic cells matured by the above method.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 혈액으로부터 분리된 단핵구를 미성숙 수지상 세포로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 미성숙 수지상 세포를 후코이단 또는 그 유사체으로 처리하여 성숙 수지상 세포로 성숙화시키는 단계를 포함하는 후코이단 또는 그 유사체를 이용한 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of (a) differentiating monocytes isolated from blood into immature dendritic cells; And (b) treating the immature dendritic cells with fucoidan or an analog thereof to mature into mature dendritic cells, thereby providing a method for inducing maturation of immature dendritic cells using fucoidan or an analog thereof.

본 발명은 또한, (a) 혈액으로부터 미성숙 수지상 세포를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 미성숙 수지상 세포를 후코이단 또는 그 유사체로 처리하여 성숙 수지 상 세포로 성숙화시키는 단계를 포함하는 후코이단 또는 그 유사체를 이용한 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법을 제공한다.The invention also comprises the steps of (a) isolating immature dendritic cells from the blood; And (b) treating the immature dendritic cells with fucoidan or an analog thereof to mature into mature dendritic cells, thereby providing a method for inducing maturation of immature dendritic cells using fucoidan or an analog thereof.

본 발명에 있어서, 상기 후코이단 유사체는 F36 또는 F37인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the fucoidan analog may be characterized as being F36 or F37.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 GM-CSF 및 인터루킨-4를 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, step (a) may be performed by adding GM-CSF and interleukin-4.

본 발명에 있어서, 상기 후코이단 또는 그 유사체의 처리농도는 10~100 μg/ml 인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the treatment concentration of the fucoidan or its analogue may be characterized in that 10 ~ 100 μg / ml.

본 발명은 또한, 후코이단 또는 그 유사체를 유효성분으로 포함하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for inducing maturation of immature dendritic cells comprising fucoidan or an analog thereof as an active ingredient.

본 발명은 또한 상기 방법에 의해 유도된 성숙 수지상 세포를 함유하는 암치료용 세포치료제를 제공한다.The present invention also provides a cell therapy agent for treating cancer containing mature dendritic cells induced by the above method.

본 발명에 있어서, 상기 성숙 수지상 세포는 CD40, CD80, CD83 및 MHC-클래스II에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the mature dendritic cells may be characterized by showing positive immunological properties to CD40, CD80, CD83 and MHC-class II.

본 발명에서는, 해조류 추출물인 후코이단 및 그 유사체를 이용하여 단핵구로부터 유도되어진 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 성숙화를 유도하였으며, 혈액으로부터 분리되어진 수지상 세포에서도 후코이단 또는 그 유사체가 성숙화를 유도하는 것을 밝혔다. 여기에 사용되어진 단핵구와 수지상 세포는 건강한 공여자로부터 제공 받은 혈액으로부터 추출한 세포이다. In the present invention, the maturation of immature dendritic cells derived from monocytes was induced to mature dendritic cells using fucoidan, an algae extract, and its analogs, and it was found that fucoidan or its analogs also induced maturation in dendritic cells isolated from blood. Monocytes and dendritic cells used herein are cells extracted from blood provided from healthy donors.

본 발명의 수지상 세포의 성숙화 유도를 확인하는 방법은 상기 단핵구와 수 지상 세포에 성숙화가 유도되는 과정에서 단백질 표면인자의 발현과 형태학적 변화, 사이토카인의 분비 및 T 림프구의 활성을 측정하는 것을 포함한다. The method of confirming the induction of maturation of dendritic cells of the present invention includes measuring the expression and morphological changes of protein surface factors, cytokine secretion and T lymphocyte activity during the induction of maturation in the monocytes and aquatic cells. do.

본 발명에서는, 첫 번째 단계에서 후코이단 또는 그 유사체가 단핵구로부터 유도되어진 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 성숙화를 유도하는 것을 실험적으로 증명하였으며, 두 번째 단계에서 후코이단 또는 그 유사체에 의해 유도되어진 성숙 수지상 세포가 T 림프구의 활성을 증가시키는 것에 대하여 실험적으로 증명하였고, 세 번째 단계에서는 혈액으로부터 분리한 수지상 세포를 후코이단 또는 그 유사체로 처리하였을 경우 더욱 성숙화 되는 것을 실험적으로 증명하였다. In the present invention, it was experimentally demonstrated that the first step induces maturation of immature dendritic cells derived from monocytes into mature dendritic cells, and the second step in mature dendritic cells induced by fucoidan or its analogs. Was experimentally demonstrated to increase the activity of T lymphocytes, and in the third step experimentally demonstrated that dendritic cells isolated from blood were more mature when treated with fucoidan or its analogs.

본 발명의 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도용 방법에 있어서, 상기 후코이단 또는 그 유사체는 10~100 μg/ml 농도로 처리하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30~70 μg/ml로 처리할 수 있으며, 가장 바람직하게는 50 μg/ml로 처리할 수 있다. 상기 농도 범위 내에서 성숙 수지상 세포 특이적인 단백질 표면인자인 CD80 및 CD83의 발현양이 높게 나타났다. 또한 후코이단 또는 그 유사체에 의한 성숙화는 12~48 시간동안 유도시키는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 18~36 시간동안 유도시킬 수 있으며, 가장 바람직하게는 24시간 동안 유도시킬 수 있다. In the method for inducing maturation of immature dendritic cells of the present invention, the fucoidan or its analogue is preferably treated at a concentration of 10-100 μg / ml, more preferably 30-70 μg / ml, Most preferably, 50 μg / ml. Within these concentration ranges, the expression levels of CD80 and CD83, which are mature dendritic cell specific protein surface factors, were high. In addition, maturation by fucoidan or an analog thereof is preferably induced for 12 to 48 hours, more preferably for 18 to 36 hours, and most preferably for 24 hours.

본 발명에 사용된 단핵구 세포는 건강한 공여자로부터 제공받은 것으로 15 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml 인터루킨-4를 처리하고, 6일간 배양하여 미성숙 수지상 세포로 분화를 유도하였다. 본 발명에서는 미성숙 수지상 세포에 후코스가 여섯체인 결합된 후코이단과 다섯체인 결합된 (F36), 다섯체인의 후코이단과 폴리만누로닉산을 혼합한 F37 및 대조군인 LPS를 처리하여 성숙 수지상 세포 특이적 단백질 표면 인자의 발현을 확인하였으며, 그 결과, 대조군인 LPS에 비해 후코이단 또는 그 유사체를 처리한 수지상 세포에서도 성숙 수지상 세포 특이적 단백질 표면 인자의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 또한 이러한 단백질 표면 인자의 발현 증가는 후코이단 또는 그 유사체의 농도를 변화시켜 처리하였을 경우 농도 의존적으로 발현양이 증가하는 것으로 확인되었다. Monocyte cells used in the present invention were provided from healthy donors, treated with 15 ng / ml GM-CSF and 10 ng / ml interleukin-4, and cultured for 6 days to induce differentiation into immature dendritic cells. In the present invention, the mature dendritic cell-specific protein is treated with immature dendritic cells by treating Fucos with six chains of fucoidan and five chains (F36), F37 with five chains of fucoidan and polymannuronic acid and LPS as a control. Expression of surface factors was confirmed, and as a result, it was confirmed that the expression of mature dendritic cell-specific protein surface factors was increased in dendritic cells treated with fucoidan or its analogues as compared to the control LPS. In addition, the increased expression of these protein surface factors was confirmed to increase the amount of expression depending on the concentration of the fucoidan or its analogues treated.

미성숙 수지상 세포와 후코이단 또는 그 유사체 그리고 대조군인 LPS를 처리하여 유도되어진 성숙 수지상 세포의 형태학적 변화와 단백질 표면 인자의 발현을 공초점 현미경을 이용하여 측정한 결과, 미성숙 수지상 세포의 덴드라이트는 매우 약한 반면 후코이단 또는 그 유사체 및 LPS에 의해 성숙화 된 수지상 세포의 덴드라이트는 뚜렷한 것을 확인하였다. Morphological changes and expression of protein surface factors in mature dendritic cells induced by the treatment of immature dendritic cells, fucoidan or its analogues and LPS as a control group were measured using confocal microscopy. On the other hand, the dendrite of dendritic cells matured by fucoidan or its analogues and LPS was confirmed to be clear.

미성숙 수지상 세포는 포식능력이 뛰어난 특징이 있으며, 뛰어난 포식능력을 이용하여 항원을 포식하여 MHC를 이용하여 항원 표시를 하고 이와 함께 성숙화가 유도된다. 성숙화가 유도된 수지상 세포는 이러한 포식능력을 상실하고 T 림프구와의 상호 작용을 일으켜 T림프구의 활성을 증가시킨다. Immature dendritic cells are characterized by excellent phagocytic ability, and predominantly phagocytosis is used to feed antigens and to express antigens using MHC. Dendritic cells induced with maturation lose this phagocytic ability and interact with T lymphocytes, increasing T lymphocyte activity.

본 발명에서는 후코이단 또는 그 유사체와 대조군인 LPS에 의해 유도되어진 성숙 수지상 세포가 미성숙 수지상 세포에 비해 포식 능력이 감소한 것을 확인하였으며, 나아가, 대조군인 LPS에 비해 후코이단 또는 그 유사체가 유도한 성숙 수지상 세포의 포식능력이 더 감소된 것을 확인하였다. In the present invention, it was confirmed that mature dendritic cells induced by fucoidan or its analogs and LPS as a control group had reduced predation ability compared to immature dendritic cells, and furthermore, compared to the control LPS, fucoidan or its analogs induced mature dendritic cells. It was confirmed that the predation ability was further reduced.

후코이단 또는 그 유사체에 의해 유도되어진 성숙 수지상 세포의 사이토카인 분비능을 확인해 본 결과, 대조군인 LPS에 비교하여 인터루킨-4, 인터루킨-10, 인 터루킨-12p40 및 TNF-α의 분비양은 비슷한 것으로 측정되었으나, 인터루킨-12p70의 분비는 LPS에서 유도한 성숙 수지상 세포는 높은 반면 후코이단 또는 그 유사체에 의해 유도되어진 성숙 수지상 세포는 분비하지 않는 것으로 확인되었다.As a result of confirming the cytokine secretion ability of mature dendritic cells induced by fucoidan or its analogues, the amount of interleukin-4, interleukin-10, interleukin-12p40 and TNF-α was similar compared to the control LPS. The secretion of interleukin-12p70 was high in mature dendritic cells derived from LPS, but not in mature dendritic cells induced by fucoidan or its analogs.

성숙 수지상 세포의 가장 중요한 특징으로는 T림프구의 활성을 유도하는 것이다. 활성화 되어진 T림프구는 증식 속도가 증가하며 인터페론-감마의 분비가 증가 되어 주변의 다른 T림프구의 활성을 돕고 면역작용을 활발하게 일으켜 항원을 제거한다. The most important feature of mature dendritic cells is the induction of T lymphocyte activity. Activated T lymphocytes increase the rate of proliferation and increase the secretion of interferon-gamma, which helps the activation of other nearby T lymphocytes and actively stimulates immune function to remove antigens.

본 발명에서 후코이단 또는 그 유사체에 의해 유도되어진 성숙 수지상 세포는 대조군인 LPS에 비해 약하기는 하지만 면역작용에 충분한 수의 T림프구 증식을 유도하였고 증식된 T림프구는 충분한 양의 인터페론-감마를 분비하는 것이 확인되었다. In the present invention, mature dendritic cells induced by fucoidan or its analogs induce a proliferation of T lymphocytes, which are weaker than the control LPS but sufficient for immunization, and the proliferated T lymphocytes secrete a sufficient amount of interferon-gamma. Confirmed.

본 발명에서 후코이단 또는 그 유사체에 의해 유도된 성숙 수지상 세포는 단핵구로부터 유도 되어진 미성숙 수지상 세포뿐만 아니라 건강한 공여자로부터 얻은 미성숙 수지상 세포에서도 그 효과가 확인되었다. 건강한 공여자로부터 제공 받은 미성숙 수지상 세포에 후코이단 또는 그 유사체와 LPS를 처리하였을 때 수지상 세포 특이적 단백질 표면 인자의 발현양이 증가되었고 사이토카인의 분비 또한 증가되었다. 하지만 이 경우에도 후코이단 또는 그 유사체에 의해 성숙화된 수지상 세포에서는 인터루킨-12p70의 분비 양이 증가하지 않은 것으로 확인되었다. In the present invention, mature dendritic cells induced by fucoidan or its analogs have been found to be effective not only in immature dendritic cells derived from monocytes but also in immature dendritic cells obtained from healthy donors. When immature dendritic cells from healthy donors were treated with fucoidan or its analogues and LPS, the expression levels of dendritic cell-specific protein surface factors increased and cytokine secretion increased. However, even in this case, it was confirmed that the secretion amount of interleukin-12p70 did not increase in dendritic cells matured by fucoidan or an analog thereof.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only intended to illustrate the invention, so the scope of the invention is not to be construed as limited by these examples.

실시예 1: 후코이단 유도체의 추출Example 1 Extraction of Fucoidan Derivatives

1-1 F37의 추출1-1 Extraction of F37

F36과 F37은 러시아 PIBOC와 연계하여 추출하였다. F36은 추출되어진 F37에서 polymannuronic acid를 제거한 상태로 F37의 추출을 선행하였다. 해조의 Fucus evanescens를 건조시키고 지방질을 제거하여 추출원료로 하였다. 상기 원료에 80~90% 에탄올 또는 아세톤을 건조된 원료와 동량 첨가하여 추출하였으며, 추출된 해조 다당류는 pH 6이하 60~80℃인 염산을 이용하여, 분리된 다당류와 염산의 비율을 1:20으로 하여, 두 번 추출하였다. 얻어진 추출물을 플라스크서에 여과하여, 정제하기 위하여 원심분리 또는 분리기에 보관하였다. 남은 해조는 압축 여과기에 의해 압축하였다. 추출물은 막들과 함께 살균된 초여과장치를 이용하여 여과하였다. 그리고 분리된 막들과 함께 초정밀 여과장치를 이용하여 처음의 용액양의 1/3~1/4까지 농축시켰다. 농축물은 pH 5.5~6.5에서 탄산수소나트륨으로 중화시켰다. 농축물은 증류수를 첨가하여 저분자 불순물을 제거 하고 다시 처음의 양으로 농축하였으며, 상기 불순물 제거과정을 2~3회 반복하였다. 정제된 농축물은 증발 장치를 이용하여 처음의 양의 1/4~1/5로 증발시킨다. 목적하는 물질은 친액성 건조를 이용하여 건조시키거나, 염화칼슘, 염화마그네슘 또는 염화나트륨의 존재 하에서 80~96% 에탄올로 침전시켰다. 침전물은 압력 여과기로 앞착시키고, 탈수시키고, 압착된 침 전물을 드럼 타입의 방폭구조 압력 건조기에 의해 건조시켰다. F36 and F37 were extracted in conjunction with the Russian PIBOC. F36 preceded the extraction of F37 with polymannuronic acid removed from the extracted F37. Fucus evanescens of seaweed was dried and fat was removed to prepare the extract. 80-90% ethanol or acetone was extracted by adding the same amount to the dried raw material, and the extracted seaweed polysaccharides were hydrochloric acid having a pH of 60 to 80 ° C. or less, and the ratio of the separated polysaccharide and hydrochloric acid was 1:20. Extracted twice. The resulting extract was filtered through a flask and stored in a centrifuge or separator for purification. The remaining seaweed was compressed by a compression filter. The extract was filtered using a sterilized ultrafiltration with membranes. The membranes were separated and concentrated to 1/3 to 1/4 of the original solution volume using an ultra-precision filter. The concentrate was neutralized with sodium bicarbonate at pH 5.5-6.5. The concentrate was removed by adding distilled water to remove the low molecular impurities, and then concentrated to the first amount, and the process of removing the impurities was repeated 2-3 times. The purified concentrate is evaporated to 1/4 to 1/5 of the original amount using an evaporator. The desired material was dried using lyophilic drying or precipitated with 80-96% ethanol in the presence of calcium chloride, magnesium chloride or sodium chloride. The precipitate was preceded by a pressure filter, dehydrated, and the compressed precipitate was dried by a drum type explosion-proof pressure dryer.

F37은 망치를 이용하여 체에 갈음으로써 분말화시켰으며, 상기 분말은 1 mm의 구멍사이즈의 체에 거른 후, 필름 재질의 꾸러미에 0.5~5.0 Kg으로 밀봉된 상태로 보관하였다. 상기 제조된 F37은 Dishet (Z. Dische, Shettles L.B. et al., J. Biol. Chem., 175:595, 1948)의 방법과 carbazolic (Blumenkranz N and Asboe-Hansen G., Anal. Biochem., 54:484, 1973)방법에 의하여 분석하였다. 상기 제조된 F37은 러시아 의과학 음식물 연구소에서 분석하였으며, 러시아 연방 서비스 명부에 음식물 처리 산업과 화장품 관련 생물학적 원료로서 등록되었다.F37 was pulverized by sieving with a hammer, and the powder was sieved through a 1 mm hole size sieve, and then stored in a film-like package at 0.5 to 5.0 Kg. The prepared F37 was prepared by Dishet (Z. Dische, Shettles LB et al ., J. Biol. Chem., 175: 595, 1948) and carbazolic (Blumenkranz N and Asboe-Hansen G., Anal.Biochem., 54). : 484, 1973). The prepared F37 was analyzed by the Russian Institute of Medical Food and Food Science and registered as a biological raw material for the food processing industry and cosmetics in the Russian Federation's Service Directory.

1-2 F36의 추출 Extraction of 1-2 F36

F36은 다음 방법에 의해 획득되었다. 1-1에서 제조된 F37에 HCl (pH 1.5~2)을 첨가하여, 산성화시켜 polymannuronic acid를 제거하였다. polymannuronic acid의 침전물은 압력 여과기로 압착시키고, 탈수시키고, 압착된 침전물을 드럼 타입의 방폭구조 압력 건조기에 의해 건조시켰다. 추출물은 막들과 함께 초정밀 여과장치를 이용하여 처음의 용액양의 1/3~1/4로 농축한다. 농축물은 증류수를 첨가하여 저분자 불순물을 제거 하고 다시 처음의 양으로 농축하였으며, 상기 불순물 제거 과정을 2~3회 반복하였다. 정제된 농축물은 증발장치를 이용하여 처음의 양의 1/4~1/5로 증발시켰다. 목적하는 물질은 친액성 건조를 이용하여 말리거나 염화칼슘, 염화마그네슘 또는 염화나트륨의 존재 하에서 80~96% 에탄올로 침전시켰다. 침전물은 압력 여과기를 이용하여 압착시키고, 탈수시켰으며, 압착된 침전물은 드럼 타입의 방폭구조 압력 건조기에 의해 건조시켰다.F36 was obtained by the following method. HCl (pH 1.5-2) was added to F37 prepared in 1-1 and acidified to remove polymannuronic acid. The precipitate of polymannuronic acid was compressed with a pressure filter, dehydrated, and the compressed precipitate was dried by a drum type explosion-proof pressure dryer. The extract is concentrated with 1/3 to 1/4 of the volume of the original solution using an ultra-precision filter with membranes. The concentrate was distilled water was added to remove the low molecular impurities, and then concentrated to the first amount, the impurities removal process was repeated 2-3 times. The purified concentrate was evaporated to 1/4 to 1/5 of the original amount using an evaporator. The desired material was dried using lyophilic drying or precipitated with 80-96% ethanol in the presence of calcium chloride, magnesium chloride or sodium chloride. The precipitate was compressed using a pressure filter, dehydrated, and the compressed precipitate was dried by a drum type explosion-proof pressure dryer.

본 발명에서 제조된 F36 및 F37은 지질 성분을 함유하고 있지 않아 장기간 보관이 가능하며, F37의 경우는 3년간 보관이 가능하다 (지질 물질을 포함한 해조 농축물의 보관기간은 1년임). F36 and F37 prepared in the present invention do not contain a lipid component and can be stored for a long time, and in the case of F37, it can be stored for 3 years (the storage period of the seaweed concentrate including lipids is 1 year).

실시예 2: 단핵구로부터 미성숙 수지상 세포의 분화 유도Example 2: Induction of Differentiation of Immature Dendritic Cells from Monocytes

건강한 공여자로부터 제공받은 혈액으로부터 microbead(MACS; Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany)를 이용하여 CD14+ 단핵구를 분리하였다. 분리된 단핵구는 10% FCS (fetal calf serum), 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, USA)를 사용하여 5%의 CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였으며, 수지상 세포로의 분화를 유도하기 위하여 15ng/ml GM-CSF(R&D Systems, Minneapolis, USA)와 10 ng/ml의 인터루킨-4(R&D Systems, Minneapolis, USA)를 6일 동안 함께 배양하였다. CD14 + monocytes were isolated from microbead (MACS; Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany) from blood from healthy donors. Isolated monocytes were fed with 5% CO 2 using RPMI-1640 medium (Gibco BRL, USA) supplemented with 10% fecal calf serum (FCS), 100 U / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin. Incubated in an incubator, 15 ng / ml GM-CSF (R & D Systems, Minneapolis, USA) and 10 ng / ml of Interleukin-4 (R & D Systems, Minneapolis, USA) for 6 days to induce differentiation into dendritic cells. Incubated together.

분화된 수지상 세포는 수지상 세포 특이적 단백질 표면 인자인 CD1a 및 MHC-클래스II와 단핵구 특이적 단백질 표면 인자인 CD14 항체를 이용하여 분화정도를 확인하였다. 분리된 단핵구에서는 CD14가 높게 발현되었고 CD1a가 발현되지 않았으나, 분화 유도된 수지상 세포의 경우 CD14가 감소하고 CD1a가 현저하게 증가되는 것으로 확인되었으며, MHC-클래스 II 또한, 수지상 세포로 분화 되면서 증가되는 것으로 나타났다 (도 2). Differentiated dendritic cells were identified using the dendritic cell-specific protein surface factors CD1a and MHC-class II and monocyte-specific protein surface factor CD14 antibody. In isolated monocytes, CD14 was highly expressed and CD1a was not expressed. However, in the case of differentiation-induced dendritic cells, CD14 was decreased and CD1a was markedly increased. MHC-class II was also increased as they were differentiated into dendritic cells. Appeared (FIG. 2).

실시예 3: 후코이단 또는 그 유사체에 의한 수지상 세포의 단백질 표면 인자의 변화Example 3: Change of Protein Surface Factors of Dendritic Cells by Fucoidan or Analogs thereof

단핵구로부터 분화 유도된 미성숙 수지상 세포로부터 후코이단 또는 그 유사체를 처리 하여 성숙 수지상 세포 특이적 단백질 표면 인자를 유세포 분석기를 이용하여 측정하였다. 미성숙 수지상 세포에 후코이단(Sigma Chemicals, St. Louis, MO), F36, F37을 50 μg/ml 으로 처리하고 대조군으로 LPS (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) 1 μg/ml 를 처리하여 단백질 표면 인자의 발현을 측정하였다. 후코이단과 F37을 처리한 수지상 세포는 CD40, CD80 및 CD83의 발현이 LPS를 처리한 수지상 세포와 비슷하게 측정된 반면, F36을 처리한 수지상 세포의 경우는 후코이단 처리군과 F37 처리한 군에 비해 CD40, CD80 및 CD83의 발현이 낮게 나타나, 수지상 세포의 성숙화를 유도하는 정도가 약한 것으로 나타났다. 또한 MHC 클래스 II의 발현도 LPS를 처리한 군에 의해 가장 강력하게 발현되고 F37 및 후코이단을 처리한 군에서도 각각 증가되었으나, F36을 처리한 군에서는 미미한 발현을 보였다(도 3). 미성숙 수지상 세포에 후코이단을 농도 별로 처리하였을 때 10~100μg/ml에서 수지상 세포의 단백질 표면 인자가 농도 의존적으로 증가되는 것을 이 보이고 50 μg/ml에서 가장 효과가 큰 것으로 나타났다(도 4). Mature dendritic cell specific protein surface factors were measured using flow cytometry by treating fucoidans or their analogs from immature dendritic cells induced differentiation from monocytes. Immature dendritic cells were treated with 50 μg / ml of fucoidan (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), F36, and F37 and 1 μg / ml of LPS (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) as a control, and the protein surface factors. Expression was measured. Dendritic cells treated with fucoidan and F37 were measured similarly to dendritic cells treated with LPS, whereas CD40, CD80, and CD83 were treated with dendritic cells treated with F36 compared with those treated with F36 and F37. The expression of CD80 and CD83 was low, indicating a weak degree of inducing maturation of dendritic cells. In addition, the expression of MHC class II was also most strongly expressed by the group treated with LPS and increased in the group treated with F37 and fucoidan, respectively, but showed little expression in the group treated with F36 (FIG. 3). When the concentration of fucoidan in immature dendritic cells showed that the protein surface factor of dendritic cells was increased in a concentration-dependent manner at 10 ~ 100μg / ml and was shown to be the most effective at 50 μg / ml (Fig. 4).

실시예 4: 수지상 세포의 형태학적 변화Example 4: Morphological Changes of Dendritic Cells

미성숙 수지상 세포에 후코이단 또는 그 유사체와 LPS를 처리하여 성숙화를 유도한 성숙 수지상 세포를 Giemsa 염색법과 주사 현미경 및 공초점 현미경을 이용하여 형태학적 변화를 관찰하였다. 성숙 수지상 세포로 성숙화가 유도된 세포는 뚜렷한 덴드라이트가 형성된 것이 보이고 표면 단백질 인자인 CD86과 MHC 클래스 II 의 발현 또한 크게 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 5).Immature dendritic cells were treated with fucoidan or its analogs and LPS to induce maturation. The morphological changes were observed using Giemsa staining, scanning microscopy and confocal microscopy. The cells induced to mature into mature dendritic cells showed distinct dendrite formation and expression of surface protein factors CD86 and MHC class II were also significantly increased (FIG. 5).

실시예 5: 후코이단 또는 그 유사체에 의해 성숙된 수지상 세포의 포식능력Example 5: The phagocytosis of dendritic cells matured by fucoidan or its analogs

미성숙 수지상 세포는 항원을 포식하여 표면에 제시하기 위하여 포식능력이 뛰어난 것이 특징이다. 하지만 성숙화가 진행되면 그 능력은 상실되고 T 림프구의 활성에 관여하게 된다. 세포의 포식능력은 Dextran-FITC(Sigma Chemicals, St. Louis, MO)를 이용하여 증감을 확인할 수 있다. 미성숙 수지상 세포는 높은 포식능력을 보이고 후코이단 또는 그 유사체와 LPS에 의해 성숙화 된 수지상 세포는 그 능력이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한 후코이단 또는 그 유사체에 의해 유도된 성숙 수지상 세포는 대조군인 LPS에 비해 더욱 포식능력이 감소되어진 것으로 확인되었다(도 6).Immature dendritic cells are characterized by excellent phagocytosis in order to phage antigens and present them on the surface. As maturation progresses, however, its capacity is lost and it is involved in the activity of T lymphocytes. The phagocytosis of the cells can be confirmed by increasing and decreasing using Dextran-FITC (Sigma Chemicals, St. Louis, Mo.). Immature dendritic cells showed high phagocytosis, and dendritic cells matured by fucoidan or its analogues and LPS were found to have decreased capacity. In addition, mature dendritic cells induced by fucoidan or its analogs were found to have a reduced predation ability compared to the control LPS (Fig. 6).

실시예 6: 후코이단 또는 그 유사체에 의해 성숙화 되어진 수지상 세포의 사이토카인 분비능Example 6 Cytokine Secretion of Dendritic Cells Matured by Fucoidan or Analogs thereof

후코이단 또는 그 유사체와 대조군인 LPS에 의해 성숙된 수지상 세포에서 세포가 배양 되고 있던 배양액을 분리하고 ELISA법을 이용하여 사이토카인 분비를 확인하였다. 미성숙 수지상 세포에서는 성숙 수지상 세포가 분비하는 사이토카인이 거의 분비 되지 않았으며 후코이단 또는 그 유사체에 의해 성숙된 수지상 세포는 인터루킨-4, 10, 12p40과 TNF-α의 분비가 활발하였으나 LPS를 처리한 대조군에 비해 인터루킨-12p70의 분비가 현저하게 낮은 것으로 확인되었다 (도 7).Culture medium in which cells were cultured from dendritic cells matured by fucoidan or its analog and control group LPS was isolated, and cytokine secretion was confirmed by ELISA. In immature dendritic cells, the cytokine secreted by mature dendritic cells was hardly secreted, and dendritic cells matured by fucoidan or its analogs showed high secretion of interleukin-4, 10, 12p40 and TNF-α, but were treated with LPS. Compared with the interleukin-12p70 secretion was found to be significantly lower (Fig. 7).

실시예 7: 성숙 수지상 세포의 T 림프구 활성Example 7: T Lymphocyte Activity of Mature Dendritic Cells

성숙된 수지상 세포의 가장 중요한 능력 중의 하나는 T 림프구의 활성을 유도하는 것이다. 활성화 되어진 T 림프구는 증식 속도가 빨라지며 인터페론-감마의 분비가 증가한다. 후코이단 또는 그 유사체에 의해 성숙된 수지상 세포는 T 림프구를 증식시켰고(도 8), 뿐만 아니라 증식된 T 림프구는 많은 양의 인터페론-감마를 분비하는 것으로 확인되었다 (도 9). One of the most important abilities of mature dendritic cells is to induce the activity of T lymphocytes. Activated T lymphocytes increase the rate of proliferation and increase the secretion of interferon-gamma. Dendritic cells matured by fucoidan or its analogs proliferated T lymphocytes (FIG. 8), as well as the proliferated T lymphocytes were found to secrete large amounts of interferon-gamma (FIG. 9).

실시예 8: 혈액 중의 수지상세포의 성숙화 유도Example 8 Induction of Maturation of Dendritic Cells in Blood

건강한 공여자로부터 혈액을 제공 받아 수지상 세포 분리 kit을 이용하여 수지상 세포를 분리하였다. 분리된 수지상 세포는 성숙 및 미성숙 수지상 세포가 혼합되어있는 상태로 미성숙 수지상세포만 따로 분리하지는 않았다. 실시예 2와 동일한 방법으로, 분리된 수지상 세포에 후코이단과 대조군 LPS를 처리하여 수지상 세포의 단백질 표면인자를 측정하였다. CD80, CD83 및 CD86이 분리한 수지상 세포에 비해 높게 발현되는 것을 확인하였으며, 케모카인 수용체인 CCR7의 발현 또한 증가하는 것을 확인하였다(도10). 또한 사이토카인의 분비에 있어서도 분리된 수지상 세포의 경우 면역 작용에 관여하는 사이토카인의 분비가 현저하게 낮았으나, 후코 이단 및 LPS에 의해 성숙된 수지상 세포의 경우 인터루킨-10, 인터루킨-12p40, TNF-α의 분비가 증가되는 것을 확인하였다. 그러나 분화시킨 수지상 세포에서와 같이 분리 되어진 수지상 세포에서도 후코이단에 의해 성숙화된 수지상 세포의 경우 인터루킨-12p70의 분비가 낮은 것을 확인하였다 (도 11). Dendritic cells were isolated from a healthy donor using dendritic cell separation kit. The isolated dendritic cells were not separated from the immature dendritic cells in a state in which mature and immature dendritic cells were mixed. In the same manner as in Example 2, the isolated dendritic cells were treated with fucoidan and control LPS to measure protein surface factors of the dendritic cells. CD80, CD83 and CD86 were confirmed to be expressed higher than the isolated dendritic cells, it was confirmed that the expression of the chemokine receptor CCR7 also increased (Fig. 10). In addition, the secretion of cytokines involved in immune function was significantly lower in cytokine secretion, but interleukin-10, interleukin-12p40, and TNF- in dendritic cells matured by fucoidan and LPS. It was confirmed that the secretion of α is increased. However, it was confirmed that the secretion of interleukin-12p70 was low in dendritic cells matured by fucoidan even in the dendritic cells separated as in the differentiated dendritic cells (FIG. 11).

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 해조류의 추출물인 후코이단 또는 그 유사체를 이용하여 미성숙 수지상 세포로부터 성숙 수지상 세포로 성숙화가 유도되는 것을 증명하였으며, 혈액으로부터 분리한 수지상 세포에서도 같은 효과를 보임으로써 새로운 수지상 세포의 성숙화 유도체로 사용이 가능하고 암을 치료하기 위한 새로운 조건의 세포 치료제로 이용이 가능할 것이다.As described above, according to the present invention, it was demonstrated that the maturation of immature dendritic cells from mature dendritic cells to mature dendritic cells was induced using fucoidan, an extract of algae, and new dendritic cells by showing the same effect in dendritic cells isolated from blood. It may be used as a maturation derivative of cells and may be used as a cell therapeutic agent in a new condition for treating cancer.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.Having described the specific parts of the present invention in detail, it will be apparent to those skilled in the art that these specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. will be.

Claims (10)

5체인 후코오스와 폴리만뉴로닉 산이 결합된 구조를 가지는 후코이단 유사체 F37을 유효성분으로 함유하는 수지상 세포 성숙화 유도 조성물.A dendritic cell maturation inducing composition comprising a fucoidan analog F37 having a structure of 5-chain fucose and polymanneuronic acid as an active ingredient. 다음 단계를 포함하는, 5체인 후코오스와 폴리만뉴로닉 산이 결합된 구조를 가지는 후코이단 유사체 F37을 이용한 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법:A method of inducing maturation of immature dendritic cells using fucoidan analog F37 having a structure of 5-chain fucose and polymanneuronic acid, comprising the following steps: (a) 혈액으로부터 분리된 단핵구를 미성숙 수지상 세포로 분화시키는 단계; 및(a) differentiating monocytes isolated from blood into immature dendritic cells; And (b) 상기 미성숙 수지상 세포를 후코이단 또는 그 유사체로 처리하여 성숙 수지상 세포로 성숙화시키는 단계.(b) treating the immature dendritic cells with fucoidan or an analog thereof to mature into mature dendritic cells. 다음 단계를 포함하는, 5체인 후코오스와 폴리만뉴로닉 산이 결합된 구조를 가지는 후코이단 유사체 F37을 이용한 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법:A method of inducing maturation of immature dendritic cells using fucoidan analog F37 having a structure of 5-chain fucose and polymanneuronic acid, comprising the following steps: (a) 혈액으로부터 미성숙 수지상 세포를 분리하는 단계; 및(a) separating immature dendritic cells from blood; And (b) 상기 미성숙 수지상 세포를 후코이단 또는 그 유사체로 처리하여 성숙 수지상 세포로 성숙화시키는 단계.(b) treating the immature dendritic cells with fucoidan or an analog thereof to mature into mature dendritic cells. 삭제delete 제2항에 있어서, 상기 (a) 단계는 GM-CSF 및 인터루킨-4를 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 2, wherein step (a) is performed by adding GM-CSF and interleukin-4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 성숙 수지상 세포는 CD40, CD80, CD83 및 MHC-클래스 II에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 2 or 3, wherein the mature dendritic cells exhibit positive immunological properties for CD40, CD80, CD83, and MHC-class II. 제2항 또는 제3항에 있어서, 후코이단 유사체 F37의 처리 농도는 10~100 μg/ml인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 2 or 3, wherein the treatment concentration of fucoidan analog F37 is 10-100 μg / ml. 5체인 후코오스와 폴리만뉴로닉 산이 결합된 구조를 가지는 후코이단 유사체 F37을 유효성분으로 함유하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.A composition for inducing maturation of immature dendritic cells containing a fucoidan analog F37 having a structure of 5-chain fucose and polymanneuronic acid as an active ingredient. 제2항 또는 제3항의 방법에 의해 유도된 성숙 수지상 세포를 함유하는 암치료용 세포치료제.Cell therapeutic agent for cancer treatment containing mature dendritic cells induced by the method of claim 2 or 3. 제9항에 있어서, 상기 성숙 수지상 세포는 CD40, CD80, CD83 및 MHC-클래스 II에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포치료제.10. The cell therapeutic agent of claim 9, wherein the mature dendritic cells exhibit positive immunological properties for CD40, CD80, CD83, and MHC-class II.
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