KR101981147B1 - Method for Evaluating Immunostimulation Effect of Immuno Materials Using Dendritic Cell and Screening Immuno Materials - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 식약품 소재의 면역효과의 특성과 강도에 대한 합리적인 평가방법 및 면역기능 소재의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 수지상세포를 이용하여 면역소재의 면역증진 또는 면역개선 효과 평가방법 및 면역기능 소재의 스크리닝 방법에 관한 것이다.More particularly, the present invention relates to a method for evaluating the immunity enhancement or immune enhancement effect of an immunological material using dendritic cells, and a method for evaluating the immunity enhancement effect using the dendritic cells. The present invention relates to a method for screening an immune function material.
최근 건강에 대한 관심이 고조되면서 면역과 관련한 각종 질환으로 고생하는 환자뿐만 아니라 건강에 큰 이상이 없는 사람들도 면역에 관련된 여러 가지 대체요법에 따른 식품이나 건강보조식품을 섭취하는 사례가 늘고 있다.As the interest in health has increased recently, not only those suffering from various diseases related to immunity but also those who have not suffered from health problems are increasingly consuming foods or health supplements according to various alternative therapies related to immunity.
정부에서는 이러한 면역관련 식약류에 대한 최소한의 관리를 위해 또한 사용지침을 주기 위해 '면역기능인정제품'을 지정하여 관리하고 있다. 2017년 기준 면역기능인정제품으로 인삼, 홍삼, 알콕시글리세롤함유 상어간유, 알로에 겔, 클로렐라와 같은 '고시형원료' 함유제품과, 게르마늄효모, 금사 상황버섯, 당귀혼합추출물, 클로렐라, 표고버섯균사체, Enterococcus faecalis 가열처리건조분말, L-글루타민, 다래추출물, 소엽추출물, 피카오프레토분말 등 복합물, 구아바잎추출물등복합물, 스피루리나, 청국장균배양정제물(폴리감마글루탐산칼륨) 등 '개별인정원료'를 함유하는 제품이 있다. 물론 이외에도 수많은 식품 또는 건강보조식품, 기능성 소재 등이 소비되고 있다.The government has designated and managed 'immune function recognition products' to provide guidance for use of these immunity-related drugs in order to minimize administration. It is a product recognized as an immune function in 2017. It is a product that contains ginseng, red ginseng, alkoxyglycerol containing shark liver oil, aloe gel and chlorella, and germanium yeast, germanium mushroom, Angelica japonica extract, chlorella, Enterococcus faecalis Heat-treated dry powder, compound such as L-glutamine, extracts of lobules, extracts of lobules, and picaprotein, complexes such as guava leaf extract, spirulina, and chungkukjanggangbanggang (potassium polygamarate) There is a product. Of course, many other foods, health supplements, and functional materials are consumed.
한편, 사람을 대상으로 하는 한국 건강기능식품의 면역기능평가 가이드라인에 비추어보면 식품 섭취에 의해 기대되는 면역기능은 크게 ① 저하된 면역의 증강을 목적으로 하는 것과 ② 민감해진 면역반응(알레르기)을 조절해주는 것 등 두 가지로 분류된다. 즉, 면역관련 각종 식약품들은 면역증진(Immunity; 면역능, 면역항원, 항감염, 면역증강)용과 면역관용(Tolerance; 알레르기개선, 항염증, 과대면역개선, 과민면역개선)용으로 구분된다. 면역증진과 면역관용은 상호 상반된 기능이다. 정상적인 면역기능 수행을 통해 건강함을 유지하기 위해서는 면역증진과 면역관용이 잘 조정된 균형이 필요하다. 위험한 병원체들과 암화된 세포(transformed cell)들을 특이적으로 공격하여 잘 제거하지만, 해 없는 자가조직, commensal microorganisms, food antigens, 그리고 environmental antigens에는 관용성을 나타내야 한다. 그러한 면에서 이러한 두 가지 면역기능에 대해 식약품 소재가 미치는 효과를 효과적으로 조사할 수 있는 평가방법이 필요하다.Meanwhile, In light of Korea Immune Function Assessment Guidelines of supplements that people targeted sensitive became immune reactions (allergy) ② as for the purpose of immunity is largely ① enhancement of degraded immune expected by food intake And the like. That is, various immune-related drugs are immune enhancing expression is divided for the;; (allergic improvement, anti-inflammatory, excessive immune improvement, hypersensitive immune improvement Tolerance) (Immunity immunity, the immune antigen, anti-infectives, immuno-enhancement) and one for tolerance. Immune enhancement and immune tolerance are mutually incompatible functions. To maintain good health through normal immune functioning, a well-balanced balance of immune enhancement and immune tolerance is needed. It specifically attacks and removes dangerous pathogens and transformed cells, but it has to be tolerant to non-autologous tissues, commensal microorganisms, food antigens, and environmental antigens. There is a need for an evaluation method that can effectively investigate the effects of pharmaceutical ingredients on these two immune functions.
그러나 현재까지 다양한 면역관련 식약품 소재가 개발되어 시판되고 있음에도 이러한 식약품 소재의 면역효과의 특성과 강도에 대한 합리적인 평가 시스템이나, 면역증진 소재의 개발을 위한 표준화된 시험법이 없는 것이 현실이다. 그렇기 때문에 A 소재가 B 소재에 비해 면역증강 효과가 몇 % 더 강하다는 식의 상대적이고 비합리적인 비교만 있거나, C 소재가 면역관련 생체물질 D의 발현을 몇 % 촉진한다는 등의 단편적 데이터만 있을 뿐 각종 면역관련 소재의 면역기능의 특성 및 강도에 따라 분류하고 수치화하는 것도 이루어지지 않고 있다.However, even though various immune-related pharmaceutical materials have been developed and marketed to date, there is no rational evaluation system for the characteristics and the strength of the immune effect of such pharmaceutical materials or a standardized test method for the development of immunity enhancing materials. Therefore, there are only relative and unreasonable comparisons such that the A material is a few percent stronger than the B material, or the C material promotes the expression of the immune-related biomaterial D by a few percent. The classification and quantification of the immune function related to the characteristics and the intensity of the immune function have not been carried out.
공개특허 2011-0084118는, 피험자로부터 분리된 면역세포를 후보식품의 존재하에 배양하는 단계 및 배양결과 상기 후보식품이 면역세포를 활성화하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 개인별 맞춤형 면역증진 식품의 선별을 위한 면역분석방법을 제시하고 있다. 그러나 이 종래기술은 이미 알려진 면역소재가 특정인에게 효과가 있는지 여부를 확인하는 방법에 한정될 뿐이다. Open Patent Application No. 2011-0084118 discloses a method for screening a personalized immunosuppressive food comprising the steps of culturing an immune cell isolated from a subject in the presence of a candidate food and determining whether the candidate food activates the immune cell as a result of the culture Immunoassay method is suggested. However, this prior art is limited to a method of determining whether an already known immunological material is effective for a particular person.
하기 논문은, 쥐 피부세포로부터의 특수한 수지상세포 바이오 센서 클론 및, 이를 활용하여 약물을 분류하는 방법에 관한 것으로서 특수 개발된 수지상세포에서 IL-1beta의 발현 유도를 통해 항암제를 분류하는 것이다. 그런데 이에 의하면 유사한 방법으로 면역관련 식약품 소재를 분류할 수 있을 것이라는 힌트를 주긴 하지만, 특수한 수지상세포를 개발하고 이를 활용한 것이어서 '범용성'이 없다. 또한 면역에 많은 생체물질이 관여함에도 불구하고 IL-1beta의 발현만을 확인하기 때문에 그 결과를 신뢰하기 어렵다.The following article relates to a specific dendritic cell biosensor clone from rat skin cells and a method for classifying drugs using the same, and classifies anticancer agents by inducing IL-1beta expression in specially developed dendritic cells. However, this suggests that a similar method could be used to classify immune-related pharmaceutical materials, but there is no 'universality' because it is the development and use of specific dendritic cells. In addition, despite the involvement of many biomaterials in the immune system, only the expression of IL-1beta is confirmed, so the results are not reliable.
식약품 소재의 면역효과의 특성과 강도에 대한 합리적인 평가 시스템이나 실험방법론이 없는 이러한 현실은 면역관련 식약품의 활용과 개발 양 측면에서 문제를 야기하고 있다.Rational evaluation of the nature and strength of the immune effect of pharmaceutical materials This reality, without system or experimental methodology, poses problems both in terms of utilization and development of immune-related drugs.
사람마다 개인적인 기질이나 환경적인 차이에 의해 면역증강이 필요한 (즉, 면역관용이 있으면 안되는) 사람이나 상황일 수도, 그 반대일 수도 있다. 또한 면역증강 또는 면역관용이 요구되더라도 그 정도가 과하게 되면 오히려 부작용이 발생할 여지가 있다. 무분별한 면역관련 식약품의 남용은 오히려 건강을 악화시킬 우려가 있어 이는 개인적인 문제뿐만 아니라 사회적으로도 큰 문제를 야기할 수 있다.Every person may be a person or situation that requires immune enhancement (ie, should not be immune tolerant) due to personal temperament or environmental differences, or vice versa. Also, even if immunity enhancement or immunity tolerance is required, the degree of overexposure may cause side effects. The abuse of unreasonable immune-related drugs may cause health problems, which can cause social problems as well as personal problems.
또한 면역관련 식약품으로 가능성이 있는 소재의 발굴과 개발 역시 개별적, 단편적으로 이루어지고 있다. 예컨대, 어떤 소재의 면역관련 특성이 발견되면 이를 확인하기 위해 동물실험으로 직행할 수밖에 없어 시간과 비용이 많이 소요되는 단점이 있다.In addition, the discovery and development of materials that are likely to be immune-related drugs are also conducted individually and on a piecemeal basis. For example, when an immune-related characteristic of a material is found, it is inevitable that it takes time and expense because it is inevitable to go directly to an animal experiment to confirm it.
그럼에도 아직까지 면역관련 식약품 소재의 세포독성 여부 및 정도, 면역특성(indexing), 면역증진 강도 등을 체계적으로 평가하는 방법에 대해 알려진 바 없다. Nevertheless, there is no known method for systematically assessing the cytotoxicity and degree of immune-related drug substances, indexing, and immunity enhancement intensity.
본 발명은 이상과 같은 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 식약품 소재의 면역능의 특성과 강도를 객관화, 수치화할 수 있는 평가방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been proposed in order to solve the above problems, and it is an object of the present invention to provide an evaluation method that can objectify and quantify the characteristics and intensity of immunity of a pharmaceutical material.
또한 본 발명은 상기 평가방법을 활용하여 면역증진 소재를 스크리닝하는 방법 및 개인 맞춤형 면역증진 소재 선별방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is another object of the present invention to provide a method of screening an immunity enhancing material using the above evaluation method and a method of selecting a personally customized immunity enhancing material.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 According to an aspect of the present invention,
(A) 수지상세포에 대상 소재 추출물을 처리한 처리구와, 블랭크를 처리한 대조구를 배양하는 단계; (B) 상기 처리구와 대조구에서, MHC II가 발현되지만 CD40은 발현되지 않는 그룹(A0)과, MHC II가 강하게 발현되면서 CD40도 발현되는 그룹(A1)의 세포비율을 측정하는 단계; 및 (C) 하기 식에 따라 상기 대상 소재의 면역증진 효과를 수치화하는 단계;를 포함하는 면역 소재의 면역증진 효과 평가방법에 관한 것이다.(A) culturing a dendritic cell treated with a subject material extract and a control treated with a blank; (B) measuring the cell ratio of the group (A0) in which MHC II is expressed but CD40 is not expressed and the group (A1) in which MHC II is strongly expressed and CD40 is also expressed in the treated and control groups; And (C) quantifying the immunity-enhancing effect of the subject material according to the following formula: < EMI ID = 2.0 >
이상과 같이 본 발명은 면역관련 식약품 소재의 면역능의 특성(면역증강 또는 면역관용)과 강도를 시험관 수준에서 신속하고 객관적으로 평가할 수 있도록 한다.As described above, the present invention makes it possible to quickly and objectively evaluate the immunological properties (immunity enhancement or immune tolerance) and the strength of the immune-related pharmaceutical material at the test tube level.
이러한 본 발명에 의해 종래 알려진 면역관련 식약품 소재의 면역학적 특성을 객관적이고 정확하게 파악할 수 있어 면역관련 식약품의 품질 표준화가 가능하게 되며, 소비자는 자신에게 적절한 면역관련 식약품을 선택할 수 있게 된다.With the present invention, it is possible to objectively and precisely grasp the immunological characteristics of the known immuno-related pharmaceutical materials, thereby making it possible to standardize the quality of the immuno-related pharmaceuticals and allow the consumer to select appropriate immuno-related pharmaceuticals.
또한 이러한 본 발명에 의하면, 새로운 면역 소재의 발굴과 탐색이 용이하게 되고, 후속 동물실험의 방향을 가이드할 수 있어 종래에 비해 시간과 비용을 절감하면서도 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있게 된다. In addition, according to the present invention, new immune materials can be easily searched and searched, and the direction of a subsequent animal experiment can be guided, thereby achieving reliable results while saving time and cost compared with the conventional method.
도 1은 본 발명에서 수지상세포의 준비 및 시료 처리 과정의 개념도.
도 2는 본 발명에서 유세포분석시 적용된 안티바디 패널.
도 3, 4는 본 발명에서 게이팅 전략을 보여주는 개념도 및 그 결과 인자들의 발현양상을 보여주는 도표.
도 5는 면역기능이 검증된 소재들의 면역능지수II 값을 보여주는 도표.
도 6은 면역기능이 검증된 소재들의 인자 발현량과 면역특성이 상관관계 없음을 보여주는 도표.
도 7은 면역기능이 확인된 다양한 신규 소재들의 면역능지수II 값을 보여주는 도표.
Fig. 1 is a conceptual diagram of preparation of dendritic cells and sample processing in the present invention. Fig.
2 is an anti-body panel applied in flow cytometry analysis in the present invention.
FIGS. 3 and 4 are a conceptual diagram showing a gating strategy in the present invention, and a chart showing an expression pattern of the resultant factors. FIG.
FIG. 5 is a chart showing immunostimulation II values of immune function-tested materials. FIG.
FIG. 6 is a graph showing that there is no correlation between the amount of immunogenicity and the immunogenicity of the substances whose immune function has been verified.
FIG. 7 is a chart showing the immunological index II values of various new materials with confirmed immune function.
본 발명자는, 면역증강 또는 면역관용 기능이 확인된 식약품 소재로 처리된 수지상세포의 표면에 발현되는 MHC, 공동활성인자 CD40, CD80, PD-L1, PD-L2 및 접착분자 CD11b, CD11c들의 발현양상에 일정한 패턴이 있음을 발견하였다. 또한 이러한 패턴들은 처리된 식약품 소재의 면역증강 기능 혹은 면역관용 기능 특성에 대응하며, 그 면역기능의 강도와도 관련이 있음을 확인하였다. 이에 본 발명자는 이러한 패턴을 지수화하고 면역증강 또는 면역관용 기능이 확인된 식약품 소재를 대상으로 그 유효성을 검증하여 본 발명을 도출하게 되었다.Expression of MHC, co-activating factors CD40, CD80, PD-L1, PD-L2 and adhesion molecules CD11b, CD11c expressed on the surface of dendritic cells treated with a food material whose immune enhancing or immunostimulatory function has been confirmed by the present inventors We found that there are certain patterns in the pattern. These patterns also correspond to the immune enhancement function or immune tolerance characteristic of the treated food material and also to the intensity of the immune function. Thus, the present inventors have derived the present invention by exposing such a pattern and verifying the effectiveness of a pharmaceutical material having an immunostimulatory or immunostimulatory function.
보다 구체적으로, 다양한 면역관련 소재로 수지상세포를 처리하고, MHC II가 발현되지만 CD40은 발현되지 않는 그룹(A0)의 세포비율과, MHC II가 강하게 발현되면서 CD40도 발현되는 그룹(A1)의 세포비율을 조사 분석하였다. 그 결과, 면역증진 효과가 있는 것으로 알려진 소재의 경우 A1/A0의 비율이 높았고, 반대로 면역관용 효과가 있는 것으로 알려진 소재에서는 A1/A0의 비율이 낮다는 상관관계를 확인하고 본 발명을 완성한 것이다. 이러한 본 발명은 실제 면역관련 동물모델 실험과 대비하여 그 타당성이 확인되었다. More specifically, dendritic cells were treated with various immune-related substances, and the ratio of the cells of the group (A0) in which MHC II was expressed but CD40 was not expressed and the cells of the group (A1) in which MHC II was strongly expressed and CD40 was also expressed Ratio. As a result, it was confirmed that the ratio of A1 / A0 was high in the case of materials known to have immunity enhancing effect, and that the ratio of A1 / A0 was low in materials known to have immune tolerance effect. This validity of the present invention has been confirmed in comparison with the actual immune-related animal model test.
전술하였듯이 본 발명은 As described above,
(A) 수지상세포에 대상 소재 추출물을 처리한 처리구와, 블랭크를 처리한 대조구를 배양하는 단계; (B) 상기 처리구와 대조구에서, MHC II가 발현되지만 CD40은 발현되지 않는 그룹(A0)과, MHC II가 강하게 발현되면서 CD40도 발현되는 그룹(A1)의 세포비율을 측정하는 단계; 및 (C) 하기 식에 따라 상기 대상 소재의 면역증진 효과를 수치화하는 단계;를 포함하는 면역 소재의 면역증진 효과 평가방법에 관한 것이다.(A) culturing a dendritic cell treated with a subject material extract and a control treated with a blank; (B) measuring the cell ratio of the group (A0) in which MHC II is expressed but CD40 is not expressed and the group (A1) in which MHC II is strongly expressed and CD40 is also expressed in the treated and control groups; And (C) quantifying the immunity-enhancing effect of the subject material according to the following formula: < EMI ID = 2.0 >
바람직하게는 상기 A0, A1 그룹의 세포비율은 CD11c가 발현되는 세포들에서 측정하는 것이 좋다. Preferably, the cell ratio of the A0, A1 group is measured in cells expressing CD11c.
본 발명은 생물학적 실험을 반영한 것이므로 '평균 이상' '평균 이하'의 경계가 명확하게 구분되지 않는 경우도 있을 것인데, 이러한 경우 실험자가 본 발명이 속하는 기술분야에서 용인되는 범위 내에서 그 경계를 구분할 수 있을 것이다.Since the present invention reflects biological experiments, there are cases where the boundary of 'above average' and below 'below average' is not clearly distinguished. In such a case, the experimenter may classify the boundaries within the scope of the present invention. There will be.
본 발명의 발명자가 검토분석한 바에 의하면, 면역관련 소재들의 면역능지수II의 역수가 소재의 면역관용 정도와 비교적 정확하게 대응됨이 확인되었다. 따라서 본 발명에서의 면역능지수II는 실질적으로 면역관용지수로도 활용될 수 있을 것이다.The inventors of the present invention reviewed and analyzed that the reciprocal of the immune function index II of the immune-related materials corresponds to the immune tolerance degree of the material relatively accurately. Therefore, the immune function index II in the present invention may be substantially utilized as an immune tolerance index.
하기 실시예에서는 상기 수지상세포로 마우스 골수세포로부터 분화된 것을 이용하였으나, 이에 제한되지 않고 인체에서 분리된 것을 이용할 수도 있다. In the following examples, the dendritic cells differentiated from mouse bone marrow cells were used, but the present invention is not limited thereto and those separated from human can be used.
본 발명에서 상기 대상 소재의 추출물은, 물, C1~C4 의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에틸, 에테르, 클로로포름 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출용매로 추출된 것일 수 있다. 하기 실시예에서는 대상 소재에 따라, 분말, 물 추출물 및 알콜 추출물을 사용하였다.In the present invention, the extract of the subject material is extracted with water, C1-C4 alcohol, hexane, ethyl acetate, butylene glycol, propylene glycol, glycerin, ethyl acetate, ether, chloroform, It may be one extracted with a solvent. In the following examples, powders, water extracts and alcohol extracts were used, depending on the materials used.
본 발명에서 상기 대조구는 대상 소재 추출물이 포함되지 않은 vehicle, 즉 블랭크로 처리된 것이다. In the present invention, the control is treated with a vehicle, i.e., a blank, which does not contain the subject material extract.
본 발명에서 상기 단계(B)에서 CD11b, MHCII 및 CD11c 등 면역인자들의 발현여부 및 발현 정도는, 유세포분석법(flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학법(immnohistochemistry), 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the expression level and expression level of CD11b, MHCII and CD11c immunity factors in the step (B) are determined by flow cytometry, fluorescence activated cell sorting (FACS), enzyme immunoassay (ELISA) or by any one method selected from the group consisting of radioimmunoassay (RIA), sandwich assay, Western blotting, immunoprecipitation, immnohistochemistry, enzyme substrate staining and antigen-antibody aggregation But is not limited thereto.
본 발명에서 상기 단계(B)는, 하기 실시예에서처럼, 유세포분석법에 의해 수행되는 것이 바람직하다. The step (B) in the present invention is preferably carried out by flow cytometry, as in the following examples.
이 경우, 처리구와 대조구 세포로부터, In this case, from the treatment and control cells,
① FSC-H vs. FSC-A 플롯에서 단리되지 않은 세포(doublets와 clumps)를 제외하는 소단계, ① FSC-H vs. In the FSC-A plot, small steps excluding the unfractionated cells (doublets and clumps)
② FSC-A vs. SSC-A 플롯에서 세포 잔해(debris)를 제외하는 소단계, ② FSC-A vs. Small steps to exclude cell debris from the SSC-A plot,
③ SSC-A vs. Live/Dead 플롯에서 살아있는 세포만 게이팅하는 소단계, ③ SSC-A vs. In live / dead plots, small steps to gating only live cells,
④ 살아있는 세포에서 CD11c+ 세포들을 게이팅하는 소단계 및 ④ a small step of gating CD11c + cells in living cells and
⑤ 게이팅된 CD11c+ 세포들을 CD40 vs. MHCII 발현 평면상에 펼쳐서 A0 그룹과 A1 그룹을 구획하는 소단계를 거쳐 수행될 수 있다.⑤ Gated CD11c + cells were transfected with CD40. RTI ID = 0.0 > A0 < / RTI > group and the A1 group by spreading on the MHCII expression plane.
이 경우 A0 그룹과 A1 그룹의 세포수 또는 세포비율은 유세포분석 결과 정보로부터 통상의 방법에 따라 용이하게 확인할 수 있다.In this case, the cell numbers or cell ratios of the A0 group and the A1 group can be easily confirmed from the flow cytometric analysis information according to a conventional method.
이상과 같은 본 발명에 의한 면역 소재의 면역증진 효과 평가방법은, 면역능이 알려지지 않는 식약품 소재의 면역증진 소재 스크리닝 방법으로 활용될 수 있다. 유세포분석을 적용하는 경우에는 Live/Dead 세포 비율 정보도 도출되기 때문에 소재의 독성도 동시에 평가가 가능하게 된다. The method of evaluating the immunity enhancing effect of the immunological material according to the present invention as described above can be utilized as a method of screening the immunological enhancing material of the pharmaceutical material whose immunological ability is unknown. When flow cytometry is applied, information on live / dead cell ratio is also derived, so that toxicity of the material can be evaluated at the same time.
또한 피측정자로부터 유래된 단구세포를 통해 얻은 수지상세포를 적용하는 경우에는 개인 맞춤형 면역증진 소재 선별방법으로도 활용될 수 있을 것으로 예견된다.In addition, when dendritic cells obtained from monocytes derived from a subject are applied, it can be used as a method of selecting a personalized immunity enhancing material.
이하 도면과 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the drawings and examples. However, the drawings and the embodiments are only illustrative of the contents and scope of the technical idea of the present invention, and the technical scope of the present invention is not limited or changed. It will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made within the scope of the technical idea of the present invention based on these examples.
[실시예] [Example]
1. 대상 소재 추출물의 준비1. Preparation of target material extract
대상 소재 추출물은 농축액 또는 분말형태로 한국한의학연구원(대전, 한국)과 (주)비케이바이오(제주, 한국)에서 공급받았다. 소재 추출용액(에탄올 또는 물)에 대한 정보를 표시하였다. The material extracts were supplied either in concentrated form or in powder form from the Korean Institute of Oriental Medicine (Daejeon, Korea) and the non-fermented broth (Jeju, Korea). Information on the material extraction solution (ethanol or water) is displayed.
추출물을 10% DMSO in PBS 용액으로 40 또는 200 ㎎/㎖의 보관액을 제조하여 -20℃에 보관하였다.The extracts were stored at -20 ° C in a 10% DMSO in PBS solution at 40 or 200 mg / ml.
2. 수지상세포의 준비 및 시료 처리2. Preparation and sample treatment of dendritic cells
다물사이언스(한국)에서 구매하여 일반적 조건의 충남대학교 의과대학 실험동물 관리 사육실에서 멸균된 사료와 물을 자유롭게 섭취시키며 사육한 6~10주령의 암컷 C57BL/6 마우스의 대퇴골로부터 통상의 방법에 따라 골수세포를 획득하였다.The femur of female C57BL / 6 mice (6-10 weeks old) was fed with sterilized feed and water ad libitum in the experimental animal care room of Chungnam National University Medical School under general conditions. Cells were obtained.
획득된 골수세포를 하기 표와 같은 조성의 배지에 혼합하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 6일 배양하여 수지상세포로 분화를 유도하였다.The obtained bone marrow cells were mixed in a medium having the following composition, and cultured for 6 days at 37 ° C and 5% CO 2 to induce differentiation into dendritic cells.
배양 3일째 배지를 보충해 주고, 6일째 부착되지 않은 분화된 수지상세포를 회수하고 원심분리하였다(1500rpm, 5분). 분리된 세포를 동일 배지에 현탁하고 48-well plate에 5×105개가 되도록 분주하였다(도 1).The medium was supplemented on the third day of culture, and the differentiated dendritic cells not attached on the sixth day were collected and centrifuged (1500 rpm, 5 minutes). The isolated cells were suspended in the same medium and dispensed into a 48-well plate at 5 × 10 5 cells (FIG. 1).
이때 상기 대상 소재 추출물의 보관액을 상기 배지로 최종농도가 100~1000 ㎍/㎖가 되도록 희석하여 농도별로 처리하고 동일한 조건에서 24시간 배양한 후 부착되지 않은 세포를 수거하여 유세포분석을 수행하였다. 세포독성이 심한 소재의 경우에는 최종농도를 낮추어가며 실험을 진행하였다. At this time, the stock solution of the subject material extract was diluted with the medium to a final concentration of 100 to 1000 占 퐂 / ml, treated for each concentration, cultured for 24 hours under the same conditions, and unattached cells were collected and analyzed for flow cytometry. In the case of highly cytotoxic material, the final concentration was lowered.
3. 유세포분석3. Flow cytometry
수지상세포의 생존율과 세포표면 활성인자 및 억제인자의 발현 정도를 측정하기 위하여 유세포분석을 실시하였다.Flow cytometry analysis was performed to determine the survival rate of dendritic cells and the degree of expression of cell surface activators and inhibitors.
세포염색법은 확립된 방법에 따라 수행하였고, Live/Dead staining을 통해 수지상세포의 생존율을 확인하였다. 수지상세포의 positive marker인 MHCII와 CD11c, 수지상세포 표면에 발현하는 공동활성인자 CD40, CD80 및 억제인자 PD-L1, PD-L2 안티바디를 사용하여 세포를 염색한 후 유세포분석장치 (FACS Canto Ⅱ, BD bioscience, 미국)를 이용하여 분석하였다.Cell staining was performed according to the established method, and the survival rate of dendritic cells was confirmed by Live / Dead staining. Cells were stained with MHCII and CD11c, positive markers of dendritic cells, coactivators CD40, CD80 and inhibitors PD-L1 and PD-L2 anti-bodies expressed on the dendritic cell surface, and analyzed by flow cytometry (FACS Canto II, BD bioscience, USA).
(1) 실험재료 (1) Experimental material
① 안티바디(도 2)① Anti-body (Figure 2)
FITC-conjugated anti-CD273(PD-L2) (11-9972-85, eBiosciences),FITC-conjugated anti-CD273 (PD-L2) (11-9972-85, eBiosciences),
PE-anti-CD274(PD-L1) (558091, BD Pharmingen),PE-anti-CD274 (PD-L1) (558091, BD Pharmingen),
PerCP-Cy5.5-MHCⅡ (562363, BD Pharmingen),PerCP-Cy5.5-MHCII (562363, BD Pharmingen),
PE-Cy7-anti-CD80 (25-0801-82, eBioscience),PE-Cy7-anti-CD80 (25-0801-82, eBioscience),
APC-anti-CD11c (20-0114-U100, Tonbo bioscience),APC-anti-CD11c (20-0114-U100, Tonbo bioscience),
APC-Cy7-CD11b (BD Pharmingen, USA),APC-Cy7-CD11b (BD Pharmingen, USA),
② FACS buffer② FACS buffer
1X PBS (phosphate buffered saline), 1% BSA (Bovine serum albumin), 0.05% NaN3 (Sodium azide)1X PBS (phosphate buffered saline), 1% BSA (Bovine serum albumin), 0.05% NaN 3 (sodium azide)
③ LIVE/DEAD™ Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit (L34966, Invitrogen) ③ LIVE / DEAD ™ Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit (L34966, Invitrogen)
동봉된 DMSO 50 μl로 stock을 만들어 -20℃에 보관. 세포 염색 시 PBS에 1:1000으로 희석하여 사용. Light protection, Desiccate.Store stock at -20 ° C in stock with 50 μl of enclosed DMSO. For cell staining, dilute 1: 1000 in PBS. Light protection, Desiccate.
(2) 수지상세포의 염색 및 유세포분석(2) Dyeing and flow cytometry analysis of dendritic cells
종래 확립된 방법에 따라 수지상세포를 염색하고 유세포분석을 수행하였다. 통상의 방법에 따라 유세포분석 과정에서 소재의 독성 즉, 세포의 생존율 평가도 이루어졌다. 각 실험은 2~3회 반복하여 시행하였다. 유세포분석 실험에서 얻어진 결과는 Prism Graph-Pad를 이용하여 평균 ± 표준오차로 분석하였고, 데이터는 FlowJo software (FlowJo, USA)를 이용하여 분석하였다.Dendritic cells were stained according to a conventionally established method and flow cytometry was performed. The toxicity of the material, that is, the cell survival rate, was also evaluated in flow cytometry according to the usual method. Each experiment was repeated 2 ~ 3 times. The results obtained from flow cytometry analysis were analyzed by means of Prism Graph-Pad using mean ± standard error. Data were analyzed using FlowJo software (FlowJo, USA).
(3) 게이팅 및 테이터 분석(3) Gating and analyzing data
다음과 같은 전략에 따라 게이팅이 이루어졌다. 하기 설명에서 게이팅과정을 통해 "X를 제외, 분리 또는 선택"한다는 것은 '유세포분석 데이터에서 X에 대한 전자정보를 제외, 분리 또는 선택하여 정보처리'한다는 의미이다. Gating was done according to the following strategy. In the following explanation, "excluding X, excluding or selecting" through the gating process means that "electronic information for X is excluded from flow cell analysis data, separated or selected, and processed."
먼저, FSC-H vs. FSC-A 플롯에서 단리되지 않은 세포(doublets와 clumps)를 제외하고, 이어서 FSC-A vs. SSC-A 플롯에서 세포 잔해(debris)를 제외하여 단일세포(singlet cell)를 분리하였다. 이어서 SSC-A vs. Live/Dead 플롯에서 사멸 세포를 제거하고 생존 세포만 게이팅하였다. First, FSC-H vs. Unfractionated cells (doublets and clumps) in the FSC-A plot were excluded, followed by FSC-A vs. FSC-A plots. Single cells were isolated from the SSC-A plot except for cell debris. SSC-A vs. SSC-A On the Live / Dead plot, apoptotic cells were removed and only viable cells were gated.
이어서 상기 생존 세포를 대상으로 아래와 같이 다양한 전략에 따라 게이팅 하여 대상 소재가 수지상세포에 대한 보조자극인자 및 억제인자 발현에 미치는 영향을 분석하였다.The surviving cells were then gated according to various strategies as follows to analyze the effect of the material on the expression of ancillary stimulators and inhibitors on dendritic cells.
4. 평가방법의 확정 및 검증4. Determination and Verification of Evaluation Methods
(1) 사전 실험(1) Preliminary experiments
면역증진 효과가 있는 것으로 알려진 다양한 소재와, 항염증(면역관용) 효과가 있는 것으로 알려진 다양한 소재의 알콜추출과 물추출을 전술한 방법에 따라 수지상세포에 처리하고, 보조자극인자 및 억제인자의 발현특성을 확인하였다(도 3, 4 참조).Alcohol and water extraction of various materials known to have immunoenhancing effects and various materials known to have anti-inflammatory (immune tolerance) effects were treated to dendritic cells according to the method described above, and expression of co-stimulatory factors and inhibitory factors (See Figs. 3 and 4).
이어서 CD11c, MHICII 그리고 CD40의 발현정도에 기초하여 수지상세포를 CD40 vs. MHCII 발현 평면상에 펼치고, 각각 미발현, 발현, 고발현으로 구분하여 9구획으로 구분하였다(도 4 참조). 그 결과 대부분의 소재들에서 ① CD40이 발현되지 않으면서 MHC II가 보통으로(도면에서 2번구획) 또는 강하게(3번구획) 발현되는 그룹과, ② MHC II가 강하게 발현되면서 CD40도 보통으로(도면에서 6번구획) 또는 강하게(9번구획) 발현되는 그룹이 비교적 명확하게 구분되었다. 즉, MHC II가 발현되지만 CD40은 발현되지 않는 그룹(A0; 2번구획+3번구획)과, MHC II가 강하게 발현되면서 CD40도 발현되는 그룹(A1; 6번구획+9번구획)이 비교적 명확하게 구분되었다. Based on the degree of expression of CD11c, MHICII and CD40, dendritic cells were then transfected with CD40. MHCII expression plane, and classified into nine compartments by dividing them into undifferentiated, expressed, and highly expressed, respectively (see FIG. 4). As a result, in most of the materials, (1) a group in which MHC II is expressed normally (2 compartments in the figure) or strongly (3 compartments) while no CD40 is expressed, and 2 a group in which MHC II is strongly expressed, (The 6th compartment in the figure) or strongly (the 9th compartment) were relatively clearly distinguished. That is, the group in which MHC II is expressed but the CD40 is not expressed (A0;
그 결과, 면역증진 효과가 높은 것으로 알려진 소재들에서 A1/A0의 비율이 높았고, 면역관용 효과가 있는 소재들에서는 그 비율이 낮았다. 즉, 소재 처리에 따른 A1/A0의 비율과 상기 소재의 기존에 알려진 면역특성(면역증진 또는 면역관용)에 상관관계가 나타남을 확인하였다.As a result, the ratio of A1 / A0 was high in materials known to have high immunity enhancing effect and low in materials having immunostimulatory effect. In other words, it was confirmed that the ratio of A1 / A0 according to the material treatment correlates with the previously known immune characteristics (immune enhancement or immune tolerance) of the material.
(2) 본 발명에 의한 평가방법의 확정(2) Determination of the evaluation method according to the present invention
이상과 같이, 면역관련 기능적 특성이 알려진 소재로부터 면역기능과 A0, A1 그룹의 비율 사이에 일정한 패턴이 있음을 발견하였다. 이에 소재들의 면역기능 강도를 평가하고 하고 타 소재들과의 객관적 비교가 가능하도록 면역항원성의 척도로 하기 식과 같은 면역능지수II를 정의하였다.As described above, it was found that there is a certain pattern between the immune function and the ratio of the A0 and A1 groups from the material in which the immuno-related functional properties are known. In order to evaluate the immune function intensity of the materials and to be able to make an objective comparison with other materials, Immunoassay II as the following formula was defined as a measure of immune antigenicity.
이때 대조구는 대상 소재 추출물이 포함되지 않은 vehicle, 즉 블랭크로 처리된 것이다. 본 발명에서는 위 1, 2에 기술한 바와 같이, 처리구와 동일한 양의 10% DMSO in PBS 용액에 동일한 양의 (수지상세포 배양) 배지가 혼합된 것을 vehicle로 하였지만, 추출물이 포함되지 않는 점 이외에 처리구에 첨가되는 처리액과 동일한 것이라면 vehicle로 특별한 제한은 없다. At this time, the control was treated with vehicle, ie blank, which does not contain the subject material extract. In the present invention, as described in the above 1 and 2, the same amount of (dendritic cell culture) medium was mixed with 10% DMSO in PBS solution in the same amount as the treatment, but in addition to the fact that the extract was not included, There is no particular limitation on the vehicle.
(3) 검증 테스트(3) Verification test
후코이단, PSK, 청귤다당, 유산균다당, Cold-fX, 홍삼농축액, 표고버섯균사체, 다래추출물, 스피루리나, 구아바잎추출물과 같이 종래 면역기능이 동물실험 검증과정을 통해 확인된 십종의 소재를 대상으로 상기 4의 사전 실험과 같은 방식으로 면역능지수II를 측정하여 면역기능에 대한 수치화를 시도하였다(아래 표 및 도 5 참조). A total of ten kinds of materials, which have been confirmed through an animal test procedure, such as fucoidan, PSK, citrus polysaccharide, lactic acid bacterial polysaccharide, Cold-fX, red ginseng concentrate, mushroom mycelium, extracts of spirulina, 4 < tb > < tb > < tb > < tb > < / TABLE >
도표에서 볼 수 있듯이, 이미 면역증진소재로 인증받은 소재들은 면역능지수II이 높은 값을 나타내고 과민면역개선으로 인증받은 소재들은 낮은 값을 가짐을 알 수 있다. As can be seen in the chart, the materials that have already been certified as immunopotentiating material have a higher value of immune function index II, and those certified by improved immunosuppression have a lower value.
시험관내 처리조건에서 세포 생존율 70% 이상에서 면역관련측정치에 효과를 보이는 가장 높은 시료처리농도에서의 면역능지수II 값을 등급화하여 종래 알려진 소재들의 면역관련 기능과 비교하여 통합적으로 살펴보면, 면역능지수II 값이 3 이상이면 면역증진 기능이 있는 것으로, 2 이하이면 면역관용 기능이 있는 것으로 확인되었다. In the case of in vitro treatment conditions, the level of immunity index II at the highest sample treatment concentration, which has an effect on the immune related measurement at a cell survival rate of 70% or more, was graded and compared with the immune related functions of known materials, A value of 3 or more indicates that the immune enhancing function exists, while a value of 2 or less indicates that the immune tolerance function is present.
(4) 인자들의 발현량과 면역특성의 관계(4) Relation between the immunogenicity and the onset of factor
종래에는 수지상세포에 대한 소재의 효과를 시험관 수준에서 평가할 때 소재처리에 의한 각 자극인자와 억제인자들의 발현량을 비교하는 방법을 사용하였다. 도 6에 위 검증테스트에 사용된 소재들에 의한 각 인자들의 발현량과 면역능지수II 관계를 도시하였다.Conventionally, when evaluating the effect of a material on dendritic cells at the level of a test tube, a method of comparing the expression amounts of each stimulating factor and inhibitory factors by the material treatment was used. FIG. 6 shows the relationship between the amount of each factor and the index of immunity index II by the materials used in the above verification test.
도시된 바와 같이, 예를 들면 자극인자 CD40의 발현량이 상대적으로 적은 청귤다당, 차가버섯 등이 발현량이 많은 후코이단, 홍삼농축액보다 더 면역증진 작용을 하며, 억제인자 PD-L1의 발현량이 상대적으로 아주 많은 후코이단, 홍삼농축액 등이 실제 가장 큰 면역증진 작용을 하며, 오히려 상대적으로 발현량이 적은 스피루리나나 다래추출물 등이 면역관용 작용을 함을 알 수 있다. 즉, 기존의 각 자극인자와 억제인자들의 발현량 측정값과 소재의 면역특성(면역능지수 II)은 상관관계를 보이지 않는다.As shown in the figure, for example, the expression level of the inhibitory factor PD-L1 is relatively higher than that of the fucoidan and red ginseng concentrate, in which the expression level of the stimulating factor CD40 is relatively low, such as citrus polysaccharide and chaga mushroom, Many of the fucoidan and red ginseng concentrates actually have the greatest immunity enhancing effect, while the relatively low expression levels of the spirulina and Darya extracts have immuno tolerance. In other words, there is no correlation between the expression level of each stimulating factor and inhibitory factor and the immune characteristic (immune function index II) of the material.
따라서 종래와 같이 소재처리에 의한 각 자극인자와 억제인자들의 발현량을 단순 비교하는 방법으로는 소재들의 상대적인 면역능을 예측하고 동물실험모델을 설계하는데 적합하지 않음을 확인할 수 있다. Therefore, it can be confirmed that the method of simply comparing the expression amounts of the stimulating factors and inhibitory factors by the material treatment as in the prior art is not suitable for predicting the relative immunity of the materials and designing the animal experimental model.
5. 상품으로 개발중인 면역소재에 대한 평가 및 새로운 면역소재의 발굴5. Evaluating the immune materials being developed as products and finding new immune materials
면역기능이 있는 것으로 평가되어 특허등록되었거나 특허출원중인 주)비케이바이오의 식품소재들과 특허출원하였거나 개발중인 한국한의학연구원의 소재들을 대상으로 상기 4의 사전 실험과 같은 방식으로 면역능지수I를 측정하여 면역증진 또는 면역관용 기능이 있는지, 있다면 강도가 어느 정도인지를 예측하였다.Immunity is assessed and registered as a patent or patent pending. Note) The immune function index I is measured in the same manner as the preliminary experiment of the above 4 for the food materials of the non-biotechnology and the materials of the Korean Institute of Oriental Medicine, Immunity enhancement, or immune tolerance, and if so, how much.
면역기능이 동물실험을 통해 검증된 10개 소재들과 면역능 평가대상 시료에 대한 면역능지수II 값을 표와 도면(도 7)에 표시하였다.Table 10 and Table (Fig. 7) show the values of Immunity Index II for 10 samples tested for immunological function in animals and immunoassay samples.
그 결과, 양유, 톳추출분말, 양배추추출분말, 미역추출분말, 후코이단, CP-다당, 홍삼농축액, 은시호(효소2), KP-다당 등이 가장 좋은 면역증진 소재로, 차가버섯, 유산균다당, 브로콜리다당, 청귤다당, PSK, 감귤다당, 알로에다당, 방울양배추추출분말, 백개자, 한라봉다당, Cold-fX, 차가버섯, 황개자 등도 상대적으로 좋은 면역증진소재로, 은시호(에탄올), 자몽과피다당, 한라봉폴리페놀, 아삼, 표고버섯균사체, 식방풍, 스피루리나, 양배추다당, Resveratrol, 웰뮨 등도 면역증진소재가 될 수 있으나, 다래추출물, 구아바잎추출물, Vitamin D3, 북강활 등은 면역관용 소재임이 예측되었다. As a result, the best immune enhancing materials such as soybean oil, top extract powder, cabbage extract powder, seaweed extract powder, fucoidan, CP-polysaccharide, red ginseng concentrate, (Ethanol), Grapefruit (Grapefruit), Citric Acid (Citric Acid), Citric Acid (Citric Acid), Citric Acid Guava leaf extract, Vitamin D3, and norangbang can be used as immunopotentiating agents, although they may be immunopotentiating materials such as hyperpigmented polysaccharide, haparabong polyphenol, assam, shiitake mushroom, food windbreak, spirulina, cabbage polysaccharide, resveratrol, It was predicted to be a material.
이상과 같은 본 발명에 의하면 시험관내에서 수지상세포에 소재를 처리하고 면역 자극인자와 억제인자 각각의 발현여부, 발현정도를 확인함으로써 소재의 세포독성 여부 및 정도, 면역특성(indexing), 면역증진 강도 등에 대한 기초정보를 용이하게 획득할 수 있게 된다. 또한 처리된 수지상세포가 생성하는 면역관련 물질들의 발현 비율을 인덱싱하여 소재의 면역성의 특성 및 강도에 따라 소재를 분류하고 서열하는 것이 가능해지므로, 대상소재의 면역특성(면역증강 or 면역관용)과 그 강도를 체계적으로 정립할 수 있게 된다.According to the present invention as described above, the dendritic cells are treated in a test tube and the expression and degree of expression of each of the immunostimulatory and inhibitory factors are confirmed, thereby determining the cytotoxicity and degree of the material, the index of immunity, And the like can be easily obtained. Furthermore, since the expression ratio of immune-related substances produced by the treated dendritic cells can be indexed, it is possible to classify and sequence the materials according to the characteristics and the strength of the immune property of the material. Therefore, the immune characteristics (immune enhancement or immune tolerance) The strength can be systematically established.
또한 본 발명은 면역식품(소재)의 면역증진을 시험관 수준에서 평가할 수 있도록 면역기능 검사치의 수량화 및 등급화를 가능하게 하는 것이다. 이에 의해 종래 알려진 면역식품(소재)의 면역학적 특성을 정확하게 파악할 수 있어 면역식품의 품질 표준화가 가능하게 된다. 또한 본 발명에 의하면 새로운 소재가 면역기능을 가지는지, 그렇다면 면역증진인지 면역관용인지 그 효과의 정도가 어떤지를 빠르고 정확하게 평가할 수 있으므로 신소재 탐색이 용이해지고, 동물모델에 대한 가이드라인을 제시할 수 있어 새로운 면역기능 소재의 탐색과 검증을 효율적으로 할 수 있게 된다. The present invention also enables the quantification and grading of immune function test values so that the immune enhancement of the immune food (material) can be evaluated at the in vitro level. This makes it possible to accurately grasp the immunological characteristics of a known immunological food (material) and to standardize the quality of the immunological food. In addition, according to the present invention, it is possible to quickly and accurately evaluate whether the new material has an immune function, and whether immune enhancement or immune tolerance is the degree of the effect, thus facilitating the search for new materials and providing guidelines for animal models The new immune function material can be efficiently searched and verified.
Claims (8)
(B) 유세포분석법으로, 상기 처리구와 대조구에서 MHC II가 발현되지만 CD40은 발현되지 않는 그룹(A0)과, MHC II가 강하게 발현되면서 CD40도 발현되는 그룹(A1)의 세포비율을 측정하는 단계;
(C) 하기 식에 따라 상기 대상 소재의 면역증진 효과를 수치화하는 단계;를 포함하는 면역 소재의 면역증진 효과 평가방법.
(A) culturing a dendritic cell treated with a subject material extract and a control treated with a blank;
(B) measuring the cell ratio of the group (A0) expressing MHC II but not CD40 in the above treatment and control and the group (A1) expressing CD40 even when MHC II is strongly expressed;
(C) quantifying the immunity enhancing effect of the subject material according to the following equation: < EMI ID = 1.0 >
상기 단계(B)에서,
CD11c가 발현되는 세포들에서 A0, A1 그룹의 세포비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 면역 소재의 면역증진 효과 평가방법.
The method according to claim 1,
In the step (B)
Wherein the ratio of cells of A0, A1 group is measured in cells expressing CD11c.
배양된 처리구 및 대조구의 살아있는 세포에서 CD11c+ 세포들을 게이팅하는 소단계와,
이어서 CD11c+ 세포들을 CD40 vs. MHCII 발현 평면상에 펼쳐서 A0 그룹과 A1 그룹을 구획하는 소단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 소재의 면역증진 효과 평가방법.
The method according to claim 1,
A small step of gating CD11c + cells in living cells of cultured treatment and control,
CD11c < + >Lt; RTI ID = 0.0 > A0 < / RTI > group and A1 group by spreading on MHCII expression plane.
상기 살아있는 세포는,
FSC-H vs. FSC-A 플롯에서 단리되지 않은 세포(doublets와 clumps)를 제외하는 소단계, FSC-A vs. SSC-A 플롯에서 세포 잔해(debris)를 제외하는 소단계 및 SSC-A vs. Live/Dead 플롯에서 살아있는 세포만 게이팅하는 소단계를 포함하는 과정을 거쳐 획득되는 것을 특징으로 하는 면역 소재의 면역증진 효과 평가방법.
The method of claim 5,
The living cell may be,
FSC-H vs.. Small steps, excluding FSC-A plots, except for unfractionated cells (doublets and clumps). A small step excluding cell debris and SSC-A vs. SSC-A plots. And a step of gating only live cells in a live / dead plot. ≪ RTI ID = 0.0 > 21. < / RTI >
A method for screening an immune enhancement material using the method for assessing immune enhancement according to any one of claims 1, 2, 5, and 6.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| KR1020180114899A KR101981147B1 (en) | 2018-09-27 | 2018-09-27 | Method for Evaluating Immunostimulation Effect of Immuno Materials Using Dendritic Cell and Screening Immuno Materials |
| PCT/KR2019/010689 WO2020067648A2 (en) | 2018-09-27 | 2019-08-22 | Method for evaluating immunity enhancement effect of immunogenic material by using dendritic cells, and method for screening for immunogenic material |
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|---|---|---|---|
| KR1020180114899A KR101981147B1 (en) | 2018-09-27 | 2018-09-27 | Method for Evaluating Immunostimulation Effect of Immuno Materials Using Dendritic Cell and Screening Immuno Materials |
Publications (1)
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