KR100889169B1

KR100889169B1 - 뉴로키닌-1 수용체 길항 효과를 나타내는 시호 수 추출물의제조 방법 및 시호 수 추출물을 함유하는 뉴로키닌-1수용체 길항성 약학 조성물

Info

Publication number: KR100889169B1
Application number: KR1020060094166A
Authority: KR
Inventors: 구경아; 이범종; 윤현주; 김영훈
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2006-09-27
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2009-03-17
Also published as: KR20080028630A

Abstract

본 발명은 NK-1 수용체에 대한 길항 효능이 있어 SP(substance P) 결합 저해 활성(%)이 뛰어난, 예컨대 공지된 합성 길항제의 효능 이상인 시호(Bupleurum falcatum L.)의 수(水) 분획물의 제조 방법 및 수득된 시호 수 분획물을 함유하는 NK-1 수용체 길항성 약학 조성물에 관한 것이다. 용매 극성별로 순차적으로 n-헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트 3종의 용매를 이용하여 수득한 분획물 중 최종 수 분획물은 공지된 뛰어난 NK-1 수용체 길항제인 L-733,160과 비교했을 때 비슷하거나 더 우수한 SP 결합 저해 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 시호 수 분획물을 함유하는 NK-1 수용체 길항제 조성물은 NK-1 수용체 길항제를 필요로 하는 각종 질병, 특히 염증성 간질환, 천식, 관절염, 당뇨병, 우울증, 구토, 통증, 불안 등의 치료 또는 예방을 위한 합성물 대용의 천연 약물로서 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

시호, 수 분획물, 뉴로키닌-1 수용체 길항제

Description

뉴로키닌-1 수용체 길항 효과를 나타내는 시호 수 추출물의 제조 방법 및 시호 수 추출물을 함유하는 뉴로키닌-1 수용체 길항성 약학 조성물{ANTAGONISTIC PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR NEUROKININ-1 RECEPTOR}

도 1은 NK-1 수용체 길항제(공지물: L-733,060)의 농도별 SP 결합 저해 활성(%)을 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명의 방법에 따른 시호의 총추출물과 각 용매 분획물의 NK-1 수용체 길항 효과를 비교한 그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 시호의 최종 수 분획물의 5개 소분획물이 나타내는 NK-1 수용체 길항 효과를 도시한 그래프이다.

본 발명은 NK-1 수용체에 대한 길항 효능이 공지된 비펩타이드성 합성 길항제의 효능과 비슷하거나 뛰어난 NK-1 수용체 길항 효능이 있는 시호(Bupleurum falcatum L.)의 수(水) 분획물을 함유하는 NK-1 수용체 길항제 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

뉴로키닌 수용체(Neurokinin receptor ; NK)는 중추신경계와 말초신경계에 작용하는 신경펩티드(neuropeptide) 중에 타키키닌(tachykinins)계에 속하는 세포내 리간드(ligand) 물질 P(substance P; SP)가 결합하는 주요 수용체이다[Substance P. Int J Biochem Cell Biol 33 : 555-576 (2001)].

SP는 1931년에 말의 뇌와 창자에서 처음 발견되었고 이하 화학식 1과 같이 11개의 아미노산(HOOC-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂)으로 이루어진 신경전달물질로서 NK-1, NK-2, NK-3, 3가지 수용체에 대해 결합력을 나타내지만 주로 NK-1 수용체(친화도 0.05-0.5 nM)에 결합하여 생리학적 기능을 수행한다[Substance P. Int J Biochem Cell Biol 33 : 555-576 (2001)].

화학식 1

현재, NK-1 수용체는 뇌의 편도, 해마, 시상하부, 선조체, 척수와 같은 중추신경계나 피부, 염증세포, 소화계, 호흡계, 심혈계 등의 말초 신경계에 골고루 분포해 있는 것으로 알려져 있다. NK-1 수용체는 리간드 SP가 결합함으로써 활성화 되는 G-커플링된(G-coupled) 수용체로서 신경조절자(neuromodulator) 또는 신경전달자(neurotransmitter)의 역할을 수행하기 위한 중요한 생리학적 기능을 한다[Substance P. Int J Biochem Cell Biol 33 : 555-576 (2001) 및 Expression of functional NK-1 receptors in murine microglia. Glia 37 : 258-267 (2002)].

중추신경계에서 SP에 의한 NK-1 수용체 활성화는 우울증, 통증, 구토, 불안과 같은 증세를 유발한다[Distinct mechanism for antidepressant activity by blockade of central substance P receptors. Science 281 : 1640-1645 (1998)]. 말초신경계에서는 상피세포의 침투력 변화, 혈관 수축, 가래 분비 증가, 기도 수축, 염증전 매개인자(proinflmmatory mediator)로서 편두통, 관절염, 천식, 염증장병(inflammatory bowel syndrome;IBS), 통각 과민증을 유발하는 것으로 알려져 있다[Targeting tachykinins for the treatment of obstructive airways disease. Treat Respir Med 3 : 201-216 (2004); Role of substance P in inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis 51 : 1014-1018 (1992); The role of substance P in inflammatory disease. J Cell Physiol 201 : 167-180 (2004)].

NK-1 수용체를 매개로 유발되는 위와 같은 체내의 현상들은 우울증, 편두통과 같은 신경성 장애증이나 천식, 고혈압, 당뇨병, 관절염, 동맥경화, 간염 등과 같은 주요 성인병의 원인이 되고 있다. 이처럼 NK-1 수용체는 사망률이 높다고 알려진 다양한 질환, 특히 성인병에 대한 치료제 개발 위한 하나의 핵심 작용점이 될 수 있다. 따라서 이를 조절하는 물질의 발굴이 절실히 요구된다.

최근 연구 보고들에 의하면 NK-1 수용체 길항제(antagonist)가 염증성 간질환, 천식, 관절염, 당뇨병, 우울증, 구토억제에 효능이 있는 것으로 보고되고 있다. 이는 NK-1 수용체 길항제 개발을 표적(target)으로 하면 다양한 질환들의 예방 및 치료제 개발의 가능성을 높이 시사한다[Potential therapeutic targets for neurokinin-1 receptor antagonists. Expert Opinion on Emerging Drugs 9 : 9-21 (2004)].

1960년대부터 현재에 이르기까지 NK-1 수용체에 대해 길항작용을 가진 화학물질을 발굴하기 위하여 세계 유명 제약회사(예, Roche, GlaxoSmithKline, Merck, Pfizer, Novartis, Boehringer Ingelheim, Eli Lilly등)에서는 리간드인 SP의 펩티드성 구조의 유사체를 합성하거나 저분자량의 비펩티드성 약물을 유기 합성법으로 만들어 다수의 선도 물질을 제시하였고 현재, 20여 종의 유기합성물들이 임상 I, II, III상 진행 중에 있다[Potential therapeutic targets for neurokinin-1 receptor antagonists. Expert Opinion on Emerging Drugs 9 : 9-21 (2004)].

국내에서는 유일하게 동아제약에서 마취제, 관절염, 당뇨병 치료를 목적으로 이하 화학식 2a에서 보여주는 구조처럼 저분자량(MW 370.50)의 NK-1 수용체 길항제를 개발하였고 현재, 임상 II상 연구 중에 있다. 또한, 최근에 미국 식약청에서 승인한 비펩티드성(non-peptide) NK-1 길항제인 아프레피탄트(aprepitant)(MK 869)(화학식 2b)는 머크사가 개발한 항우울제이다. 항암요법의 가장 큰 부작용의 하나인 오심과 구토를 억제하는데도 탁월한 효과를 보여 항암약물과 함께 병행 투여되고 있다[Aprepitant: a neurokinin-1 receptor antagonist for the treatment of chemotherapy-induced nausea and vomiting. Expert Rev Anticancer Ther 4 : 715-724 (2004)]. 이와 같이 NK-1 수용체 길항제는 다양한 효능을 발휘한다는 것이 널리 알려져 있다.

화학식 2

개발되었던 몇몇 길항제들의 특징은 그 효능이 종에 따라 다르고 수용체의 구조적 특성상 세로토닌(serotonin), 노르아드레날린(noradrenalin), 도파민 전달체(dopamine transforters) 또는 모노아민 산화효소(monoamine oxidase)등의 다른 수용체에 친화성을 전혀 나타내지 않으면서 NK-1 수용체에 대해서만 강하게 특이성을 나타내는 장점이 있다 [Different binding epitopes on the NK1 receptor for substance P and a non-peptide antagonist. Nature 362, 345-348 (1993)].

펩티드 구조보다 비펩티드성 길항제는 화학 구조의 다양성을 큰 장점으로 하고 효능이 더 뛰어나다. 그리고 신경성 질환 약물로 사용할 경우 BBB (Blood-Brain-Barrier)를 통과하기가 용이하므로 최근에는 비펩티드성 합성물질들을 대상으로 NK-1 수용체 길항제 개발의 연구가 활발히 진행되고 있는 추세이다[Pharmacology of CP-99,994; A nonpeptide antagonist of the tachykinin neurokinin-1 receptor. J Pharmacol Exp Ther 267 : 472-479 (1993); A potent non-peptide antagonist of the substance P (NK1) receptor. Science 251: 435 (1991) 및 Successful virtual screening for a submicromolar antagonist of the neurokinin-1 receptor based on a ligand-supported homology model. J Med Chem 47 : 5381-5392 (2004)].

하지만, 이와 같이 유기합성법에 의해 만들어진 합성 물질은 인체에 부작용을 일으킬 가능성이 많다는 것은 당업계에 공지된 사실이다. 이에 본 발명자들은 예로부터 동양의학의 근간으로서 수천년간의 오랜 임상경험이 축적되어 있는 결과들을 바탕으로 질병의 치료나 예방의 차원에서 사용되어 왔고 부작용이 적다는 장점을 가지고 있는 천연물로부터 NK-1 수용체 길항제를 규명하기 위한 연구를 시도하고자 한다.

천연물을 소재로 물질 P와 NK-1 수용체의 결합을 방해하는 물질의 개발은 주식회사 엘지생활건강에서 개시한 바 있다(대한민국특허공개번호 2005-0067951). 이 문헌에 따르면, 가려움의 주된 중재자인 물질 P와 NK1 수용체의 결합을 방해하거나(방해하고) 염증성 싸이토카인의 억제를 통한 항염증작용으로 민감성 피부질환에 따른 가려움증이나, 두피 가려움증, 알러지에 의한 가려움증을 완화시키고자 안드로그라폴라이드(Andrographolide) 또는 안드로그라폴라이드를 유효성분으로 함유하는 천심련(Andrographis paniculata) 추출물을 함유하는 가려움억제 또는 완화 조성물을 개시하고 있다.

또한, 대한민국 특허 공개번호 2006-0000127(2006.01.06)은 민감성 피부질환 에 따른 가려움증이나, 두피 가려움증, 알러지에 의한 가려움증을 완화시킬 수 있는 가려움증 억제 또는 완화 조성물로서, 베르바민(BERBAMINE) 또는 베르바민(BERBAMINE)을 함유하는 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 가려움증 억제 또는 완화 조성물을 개시한다. 상기 베르바민(BERBAMINE) 또는 베르바민(BERBAMINE)을 함유하는 추출물은 황련(COPTIS CHINESIS FRENCH.) 이나 소백(BERBERIS AMURENSIS RUPR.), 분방기(STEPHANIA TETRANDRIA S. MOORE), 함바기(STEPHANIA JAPONICA MIERS) 등의 뿌리 및/또는 줄기로부터 얻을 수 있다. 이러한 가려움증 억제 또는 완화 조성물은 두피 세정제, 저자극성 화장료, UV 등에 대한 피부보호제, 전신세정제, 세안제, 비누, 크림, 일회용 기저귀, 아토피성 유아 제품 등을 구성한다고 개시하고 있다.

또한, 대한민국 특허 공개번호 2006-0093626 (2006.08.25)은 가려움증을 억제하거나 아토피 완화에 효능이 있는 천연 추출물로서 상황버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 가려움 억제 및 아토피 완화용 조성물을 제공한다. 이러한 조성물에 함유된 상황버섯 추출물은 가려움증을 매개하는 히스타민(HISTAMINE)의 유리를 억제시키고 가려움의 주된 중재자인 물질 P (SUBSTANCE P)-NK1수용체의 결합을 방해하므로, 가려움증 억제뿐만 아니라 아토피 피부염의 완화에 매우 효과적이라고 개시하고 있다.

또한, 대한민국 특허 등록번호 0544945 (2006.01.13)는 밀리타리스동충하초(CORDYCEPS MILITARIS) 열수추출물을 포함하는 면역증진을 위한 조성물로서, 상세하게는 이러한 밀리타리스동충하초 열수 추출물은 고형암을 이식받은 마우스 비 장내의 T-세포, B-세포 및 NK-세포수를 유의적으로 증가시킴으로써 세포 및 체액 매개성 면역반응의 증진을 통해 수명연장효과 및 항종양 효과를 나타내며, 비장에 의한 IL-2 분비능을 증가시켜 숙주의 면역기능을 활성화시키므로, 면역증진을 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다고 개시하고 있다.

이상, 천연물의 추출물을 소재로 한 NK-1 수용체 길항제 또는 항종양 효과가 있는 면역 증진 조성물은 다수가 개시되어 있지만, 사람 NK-1 수용체에 선택적인 길항성 및 SP 결합 저해 활성이 공지의 합성 길항제(예컨대, Aprepitant)와 유사하거나 더 우수하여 대체 의약물로서 사용하기에 충분한 천연물 소재 추출물에 대해서는 어떠한 암시나 개시가 전무한 상황이다.

이에 본 발명자들은 다수의 천연물 추출물(예컨대, 10종, 지황, 향부자, 작약, 황금, 감초, 용안육, 황련, 원지, 박하, 시호)을 대상으로 NK-1 수용체 길항 효과를 검사한 결과, 놀랍게도 1종의 천연물, 즉 시호(Bupleurum falcatum L.)로부터 본 발명의 방법에 따른 특정 추출물이 목표로 한 뛰어난 NK-1 수용체 길항 효과를 나타낸다는 것을 발견했다. 특히 이러한 길항 효능은 공지된 합성 길항제의 효능 이상이어서 대체 의약물로서 사용하기에 충분한 것이라 판단되어 시호 추출물을 예의 연구한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

일 관점으로서, 본 발명은 NK-1 수용체 길항 효능이 있어 SP 결합 저해 활성이 뛰어난 시호(Bupleurum falcatum L.)의 수(水) 분획물을 함유하는 NK-1 수용체 길항성 약학 조성물을 제공한다.

바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 NK-1 수용체에 대한 길항 효능이 공지된 합성 길항제의 효능 이상이면서 합성 물질로 인한 임의의 잠재적 부작용의 발생 가능성이 없는 천연물인 시호(Bupleurum falcatum L.)의 말린 가지 절편의 에탄올 엑스를 n-헥산, 클로로포름 및 에틸 아세테이트 용매를 극성별로 순차 처리한 후 최종 수득되는 수(水) 분획물을 함유하는 NK-1 수용체 길항성 약학 조성물을 제공한다.

이러한 NK-1 수용체 길항제 조성물에 함유되는 시호 수 분획물의 양은 1㎍ 내지 50㎍/ml 범위이다.

본 발명의 NK-1 수용체 길항성 약학 조성물은 전술한 시호 수 분획물 이외에 공지된 다른 NK-1 수용체 길항제와의 혼합물로 사용되고(되거나) 약학적 허용성 담체를 함유할 수 있다. 이러한 다른 NK-1 수용체 길항제 및/또는 약학적 허용성 담체는 물론 시호 수 분획물의 NK-1 수용체의 길항 효과에 악영향을 미치지 않는 것이라는 것은 당연한 것이다.

시호는 산형과(傘形科 Apiaceae)에 속하는 다년생초로서, 한방에서는 뿌리를 시호라고 하여 말라리아, 황달의 치료 및 두통, 감기·고열·통증·흥분을 가라앉히고, 간을 튼튼하게 하는 데 사용되어 요즈음에는 대량으로 재배하기도 한다. 뿌리에는 약 3％ 정도의 사포닌(saponin)과 지방유가 함유되어 있다(브리태니커 백과사전; http://www.britannica.co.kr 참조)고 한다. 본 발명에서는 시호의 말린 가지, 뿌리 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 시호의 말린 가지를 절편화한 것을 사용한다.

상세히 설명하면, 본 발명의 방법에 따른 시호의 특정 추출물은 시호의 말린 가지 절편에 50% 에탄올을 가해 초음파 추출 후 여과하고, 이 여액을 감압 농축하여 에탄올 엑스를 얻은 다음, 이러한 에탄올 엑스를 증류수에 현탁한 다음 n-헥산, 클로로포름 및 에틸 아세테이트 용매를 극성별로 순차 처리한 후 최종 수득되는 수 분획물을 포함한다. 이와 같은 최종 수 분획물은 사용된 용매의 어떠한 중간 추출물보다 뛰어난 SP 결합 저해 활성을 나타낸다. 이러한 SP 결합 저해 활성은 본 발명자들이 설계한 분석 조건에 따라, 공지의 비펩타이드성 길항제(L-733,060)를 농도별 비교군으로 사용하여 효능 분석한 결과, 비교군과 효능이 비슷하거나 보다 뛰어난, 95% 이상의 저해 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 염증성 간 질환, 통증감소, 우울증, 암세포 증식 억제작용에 효과가 뛰어난 시호의 수 분획물을 함유한 NK-1 수용체 길항성 약학 조성물을 제공한다.

또한, 최종 시호 수 분획물 중에서 효능 및 순도면에서 더욱 바람직하게 사용할 수 있는 활성 소분획물을 얻기 위하여 재정제한 결과, 역상 컬럼 크로마토그래피 분석 산물인 5개의 소분획물(BF-W1 내지 BF-W5) 중에서 BF-W4와 BF-W5 소분획물의 SP 결합 저해 활성이 우수한 것으로 확인된다. 가장 바람직한 것은 BF-W4 소분획물이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 전술한 시호 수 분획물 중 역상 컬럼 크로마토그래피 분석의 제4번 및 제5번 소분획물을 함유하는 NK-1 수용체 길항성 약학 조성물을 제공한다.

다른 관점으로서, 본 발명은 시호의 말린 가지 절편을 사용하여 에탄올 엑스 를 수득하고, 이 엑스를 헥산, 클로로포름 및 에틸 아세테이트 3종의 용매를 극성별로 순차 처리하여 생성되는 최종 시호 수 분획물을 수득하는 단계를 포함하는, NK-1 수용체 길항제 효능이 뛰어난 시호 수 분획물의 제조방법에 관한 것이다.

이러한 관점의 구체예에 따르면, 시호의 말린 가지 절편을 준비하는 단계, 이러한 시호에 50% 에탄올을 가하고 초음파 추출한 후 여과한 후, 이 여액을 감압 농축하여 에탄올 엑스를 얻는 단계, 이러한 에탄올 엑스를 증류수에 현탁한 다음 n-헥산으로 분획하여 n-헥산 분획 및 수 분획으로 분리하는 단계, 분리한 수 분획을 다시 클로로포름으로 분획하여 클로로포름(CHCl₃)분획 및 수 분획으로 분리하는 단계, 및 분리한 수 분획을 다시 에틸 아세테이트로 분획하여 에틸 아세테이트 분획과 수 분획으로 분리하여, 이 수 분획을 최종 시호 수 분획물로서 수득하는 단계를 포함한다.

이러한 관점의 바람직한 구체예에 따르면, 초음파 추출은 3회 이상 반복 실시하며, 특히 5회 이상 3시간 동안에 걸쳐 실시하는 것이 바람직하다. 이와 같이 추출한 시호의 총 추출물을 용매 극성별로 순차적으로 n-헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 3종의 용매를 이용한 추출을 실시하며, 이러한 각 용매를 이용한 추출 방법은 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 실시할 수 있다. 예를 들면, 추출물 제조는 시호 600g에 2L의 50% 에탄올로 온도 50℃, 3시간동안 1회 초음파 처리를 3번 반복 실시하여 농축하고 이를 증류수에 현탁한 후 n-헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트의 각 분획물을 제조하였다. 각 분획물은 n-헥산 2L, 클로로포름 2L, 에틸 아세테이트 4L를 가지고 극성별로 순차적으로 분획화한 것일 수 있다.

수득되는 각 용매 분획물의 NK-1 수용체 길항 효과를 측정하기 위하여 다량의 NK-1 수용체가 존재하는 것으로 알려진 사람 세포 배양물, 구체적으로 뇌의 편도, 해마, 시상하부, 선조체, 척수와 같은 중추신경계 조직이나 세포, 또는 피부, 염증세포, 소화계, 호흡계, 심혈계 등의 말초신경계 조직이나 세포 등을 이용할 수 있다. 바람직한 구체예에 따르면, 사람 아교모세포종-별아교세포종, 상피 유사 세포주(Human glioblastoma-astrocytoma, epithelial-like cell line)인 U-373 MG 세포주를 사용할 수 있다. 이러한 세포주는 한국세포주 은행 등에서 분양받을 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 한국세포주 은행에서 분양받은 수탁번호 KCLB 30017을 사용했다.

전술한 시호의 각 용매 추출물의 NK-1 수용체 길항 효과 분석은 각 용매 추출물을 공지의 뛰어난 NK-1 수용체 길항제인 비교군과 유사 농도로 사용하여 상기 세포주 배양물에 각각 투여하고, 그 다음 형광 프로브가 결합된 SP를 동일한 농도로 투여한 후 형광광도계로 측정하여 수행할 수 있다. 형광 프로브가 결합된 SP의 형광도는 485nm에서 여기시킨 후 528nm에서 방출 광을 측정하여 수득할 수 있다.

NK-1 수용체 길항 효과 검사 시, 비교군으로는 사람 NK-1 수용체에 선택적인 비펩타이드성 길항제로서 염증성 간질환, 통증 감소, 우울증, 암세포 증식 억제작용에 효과가 뛰어난 것으로 알려진 L-733,060을 사용했다[Neurokinin-1 receptor antagonists CP-96,345 and L-733,060 protect mice from cytokine-mediated liver injury. J Pharmacol Exp Ther 305 : 31-39 (2003)]. 비교 검사 결과, 총 추출물 (SP의 NK-1 수용체 결합력 45% 저해) < 에틸 아세테이트 분획 (61% 저해) < 수 분획 (95% 저해) 순으로 NK-1 수용체에 대한 SP의 결합을 저해하는 효과가 나타난다. 즉, 최종 시호의 수 분획물이 SP 결합 저해 활성이 가장 높았고, 이는 잘 알려진 특이적 NK-1 수용체 길항제인 L-733,060의 10nM 농도에서 88%의 수용체에 대한 SP의 결합 저해 활성보다 뛰어난 것으로서, 대체 의약물로서 사용가능성이 충분한 것이라 생각한다.

이러한 대체 의약물로서의 사용가능성을 높이기 위하여, 시호 수 분획물을 재정제함으로써 전술한 비교군과 비슷하거나 높은 활성을 나타내는 활성 소분획을 제공한다. 따라서, 본 발명은 바람직한 양태로서, 전술한 제조방법에 따라서 수득한 시호 수 분획물을 추가로 메탄올과 물의 혼합 용매 구배를 이용한 역상 컬럼 크로마토그래피로 분석하여 5개의 소분획을 수득하는 단계, 및 각 소분획의 SP 결합 저해 활성을 측정하여 저해활성이 뛰어난 제4번(BF-W4) 및 제5번(BF-W5) 소분획물을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다. 이러한 제조방법에서 메탄올과 물의 혼합 용매는 물 100%, 물 75%와 메탄올 25%, 물 50%와 메탄올 50%, 물 25%와 메탄올 75% 및 메탄올 100%의 구배로 사용할 수 있다.

이와 같이 수득된 시호 수 분획물의 구체적인 성분에 대해서는 본 발명에서 확인하지 못하였으나, 시호 수분획물의 주 성분은 트리테르펜 계열의 사이코사포닌류(saikosaponins)인 것으로 알려져 있고[The chemical studies on oriental plant drugs XV. on the constituents of Bupleurum Spp. Chem Pharm Bull 14 : 1023-1033 (1966) ; Saponins isolated from Bupleurum falcatum L. J Chem Soc 20 : 2043-2048 (1975); Phenethyl alcohol glycosides and iospentenol glycosides from fruit of Bupleurum falcatum. Phytochemistry 51 : 819-823 (1999)], 이러한 사이코사포닌류는 항염증, 급만성 간질환, 면역조절, 고지혈증 등과 관련된 질환에 효능이 있는 것으로 알려져 있다[Effect of saikosaponin, a triterpene saponin, on apoptosis in lymphocytes: association with c-myc, p53, and bcl mRNA. Br J Pharm 131 : 1285-1293 (2000)].

이러한 활성 소분획의 SP 결합 저해 활성이 공지의 뛰어난 NK-1 수용체 길항제 합성물보다 뛰어난 활성이라는 점과 천연물 추출물이라는 점에 비추어 볼 때 NK-1 수용체 길항제 약물의 대체 약물로 사용하여도 무방할 것으로 판단된다. 전술한 바와 같이, 이러한 시호 수 분획물 또는 활성 소분획물은 각각 NK-1 수용체 길항제 조성물에 1 ㎍/㎖ - 50 ㎍/㎖ 농도 범위로 사용할 수 있다.

또한, 이러한 시호 수분획물 또는 활성 소분획물을 함유하는 NK-1 수용체 길항제 조성물은 통상적인 NK-1 수용체 길항제의 투여 방식에 적합하게 제형화되고 제형에 따라 검체에게 투여될 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이와 같은 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 설명한 것으로서 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 간주되어서는 안 된다.

실시예

실시예 1: 시호 수분획물 제조

시호에 50% 에탄올 3L 씩을 가해 3시간 동안 5회 초음파 추출 후 여과했다. 이를 감압 농축하여 에탄올 엑스 (시호 T)를 얻었다. 에탄올 엑스를 증류수에 현탁한 다음 n-헥산으로 분획하여 n-헥산 분획(시호 H) 및 수 분획을 얻었다. 수 분획을 다시 클로로포름으로 분획하여 CHCl₃(시호 C) 분획 및 수 분획을 얻었다. 이 수 분획을 다시 에틸 아세테이트로 분획하여 에틸 아세테이트 분획 (시호 E)과 수 분획 (시호 W)을 얻었다.

실시예 2: NK-1 수용체 급원으로서 U-373 MG 세포주의 배양

NK-1 수용체가 다량 존재하는 NK-1 수용체 급원으로서 사람 아교모세포종-별아교세포종, 상피 유사 세포주(Human glioblastoma-astrocytoma, epithelial-like cell line)인 U-373 MG 세포주를 한국세포주 은행에서 분양받은 것을 사용했다(수탁번호: KCLB 30017)

이 세포주를 RPMI 1640 90%, 소태혈청(fetal bovine serum) 10%, 페니실린 100 IU/㎖과 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖을 포함하는 배양액을 사용하여 37℃ 배양기에서 공기 (95%)와 CO₂ (5%)의 혼합기체와 수분을 계속 공급하면서 배양하였다. 세포가 일정하게 자라면 트립신 (trypsin)을 이용하여 세포를 배양용기에서 분리한 후 2 x 10⁵ cells/㎖로 희석하여 배양용기에 이식하였다. 세포주는 7일에 한번씩 계대배양하여 사용하였다.

실시예 3: 시료처리

시호의 총 추출물과 각 용매 분획물 및 L-733,060(Tocris, USA)들은 DMSO (최종농도 0.1% 이내)에 용해시킨 후 증류수로 희석하여 100 ㎎/㎖의 농도로 제조 한 다음 밀리포어 막 필터(0.22 ㎛, Millex-GV, U.S.A.)를 통과시켜 무균상태로 만들어 두었다.

실시예 4: 시험관내 NK-1 수용체 길항효과 시험

실시예 2에 기재한 바와 같이 배양한 U373 MG 세포 (2x10⁵ 세포/㎖)를 배양용기에 이식한 후, 다음 날 NK-1 수용체 길항 효과를 측정하고자 하는 SP 저해 활성 비교군으로 잘 알려진 NK-1 수용체 길항제 L-733,060를 농도 0 내지 100nM로 배양세포에 처리했다.

1시간 후에 형광 프로브(probe)가 결합된 물질 P (SP-ⓕ) 10nM를 처리하고 3시간 후에 형광광도계를 이용하여 NK-1 수용체에 결합된 SP-ⓕ의 형광도는 485 nm에서 여기(exciting)시킨 후 528 nm에서 방출 광(emission light)을 측정하였다.

비교군의 농도별 SP 결합 저해 효과는 도 1에 도시했으며, 시료 농도가 증가할수록 SP 형광 강도는 감소하고 SP 결합 저해 활성(%)은 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 이로써 본 실시예의 NK-1 수용체 길항 효과 분석법으로서 유효하다는 것이 입증되었다.

이러한 유효 분석법을 이용하여 본 발명에 따른 시호 추출물 각 시료와 비교군의 SP 결합 저해 활성(%)을 매개제(vehicle)만 처리한 세포(①), 매개제 처리 후 SP-ⓕ 처리한 세포 (②), 시료 처리 후 SP-ⓕ 처리한 세포 (③)의 형광도를 측정하여 SP 결합 저해 활성(%)으로서 수득했다. 이 때 각 시료의 농도는 50㎍/㎖를 사용했고, 비교군인 L733,060은 10nM(4.39 ng/㎖)의 농도로 투여했다.

SP 결합 저해활성(%)은 다음과 같은 식에 따라 계산하여 결정하였고 독립적인 3번의 실험을 반복 수행한 후 평균값으로 나타냈다:

[수학식 1]

SP 결합 저해활성(%) = 100-[(②-①)/(③- ①) ×100]

(여기서, ①은 매개제(vehicle)만 처리한 세포의 형광도를 나타내고, ②는 매개제 처리 후 SP-ⓕ 처리한 세포의 형광도를 나타내며, ③은 시료 처리 후 SP-ⓕ 처리한 세포의 형광도를 나타낸다).

실험 결과, 총 추출물을 용매 극성별로 순차적으로 n-헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트로 처리한 후 수득한 3종의 분획물로 나누어 NK-1 수용체 길항 효과를 검색한 결과 총추출물 (SP의 NK-1 수용체 결합력 45% 저해) < 에틸 아세테이트 (61% 저해) < 수 분획 (95% 저해) 순으로 NK-1 수용체에 대한 SP의 결합을 저해하는 효과를 나타내었다. 잘 알려진 특이적 NK-1 수용체 길항제 L-733,060은 10nM의 농도에서 88%의 수용체에 대한 SP의 결합 저해 활성을 나타내었다(도 2 참조). 이와 같은 비교를 통해 본 발명에 따른 시호 수 분획물의 SP 결합 저해활성은 매우 뛰어난 것이라고 간주할 수 있다.

실시예 5: NK-1 수용체 길항 효과를 나타내는 수분획물 중의 소분획 분석

실시예 4에서 확인된 바와 같이 NK-1 수용체 길항효과를 나타낸 수 분획을 C₁₈ 수지 역상 컬럼 크로마토그래피 (RP cc)를 시행하여 수분획물의 활성 소분획을 조사했다. 먼저 수분획물 분획을 전개 용매로서 MeOH과 물의 혼합 용매를 여러 혼 합 비율(물 100% → 물 75% + 메탄올 25% → 물 50% + 메탄올 50% → 물 25% + 메탄올 75% → 메탄올 100%)로 사용하여 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 5개의 소분획 (BF-W1에서 BF-W5)을 수득했다.

이와 같이 수득한 각 소분획의 길항 효과는 실시예 4와 동일하게 분석했다. 5개 소분획의 활성을 분석한 결과 저해활성 성분이 시호 수 분획물 중 제4 소분획 BF-W4 및 제5 소분획 BF-W5에 포함되어 있음을 확인했다(도 3 참조).

용매 극성별로 순차적으로 n-헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 물 4종의 용매를 이용하여 수득한 시호 추출물 중 최종 수 분획물은 공지된 뛰어난 NK-1 수용체 길항제인 L-733,160과 비교했을 때 비슷하거나 더 우수한 SP 결합 저해 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 시호 수 분획물을 함유하는 NK-1 수용체 길항제 조성물은 NK-1 수용체 길항제를 필요로 하는 각종 질병, 특히 염증성 간질환, 천식, 관절염, 당뇨병, 우울증, 구토, 통증, 불안 등의 치료 또는 예방을 위한 합성물 대용의 천연 약물로서 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

Claims

용매 추출법으로 처리된 시호(Bupleurum falcatum L.)의 최종 수(水) 분획물을 함유하고, 이 수분획물이 50㎍/ml의 농도일 때, 뉴로키닌 수용체(neurokinin receptor; NK)-1에 대한 신경전달물질 SP(substance P)의 결합 저해 활성이 공지의 합성 NK-1 길항제인 L-733,060(상품명, 미국 토크리스(Tocris)사 제품; 10nM)과 비슷하거나 이보다 우수한 활성을 보유하는, 우울, 불안, 천식, 구토의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,

용매 추출법으로 처리된 시호의 최종 수 분획물이 시호의 말린 가지 절편의 에탄올 엑스(extract)를 n-헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트 용매를 극성별로 순차 처리한 후 최종 수득되는 수 분획물인 것인 약학 조성물.
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