KR100864677B1

KR100864677B1 - 항비만 효과를 나타내는 3,5-디히드록시벤조산 유도체화합물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100864677B1
Application number: KR1020070029255A
Authority: KR
Inventors: 노호식; 백흥수; 박우람; 신의석; 신동욱; 김덕희; 장이섭
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2007-03-26
Filing date: 2007-03-26
Publication date: 2008-10-23
Also published as: KR20080087273A

Abstract

본 발명은 항비만 효과를 나타내는 하기 화학식 1로 표시되는 3,5-디히드록시벤조산 유도체 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것이다:

[화학식 1]

상기 식 중, R은 아다만틸, 시클로헥실 또는 헥실이다.

3,5-디히드록시벤조산 유도체, 항비만, 루시퍼라아제, IDH3α, CPT1, 혈당

Description

항비만 효과를 나타내는 3,5-디히드록시벤조산 유도체 화합물 및 이의 제조방법{3,5-Dihydroxybenzoic acid derivative having anti-obesity activity and the preparation method thereof}

상기 식 중, R은 아다만틸, 시클로헥실 또는 헥실이다.

지질이 분해되어 에너지원으로 이용되는 과정은 3단계로 나눌 수 있는데, 1단계는 지질이 분해되어 지방산 등의 구성성분으로 되는 단계이고, 2단계는 β산 화(β-oxidation) 등을 거쳐 아세틸코에이(acetyl-CoA)가 되는 단계이며, 3단계는 이것이 TCA회로(tricarboxylic acid cycle)에서 완전히 산화 분해되는 것이다. 여러 가지 에너지원이 대사되어 아세틸-CoA가 되고 이것이 이산화탄소(CO₂)와 물(H₂O)로 산화되는 반응(TCA 회로)은 모두 미토콘드리아(mitochondria)의 기질(matrix)이나 내막에 존재하는 효소군에 의해 일어난다. TCA회로 내에서 구연산(citrate)은 아코니테이즈 효소(aconitase)에 의해 히드록시기(-OH)의 위치가 이동되어 아이소사이트레이트(isocitrate)로 되는데 아이소사이트레이트는 아이소사이트레이트 탈수소 효소(isocitrate dehydrogenase, 이하 IDH3α라 칭함)에 의해 산화되어 효소에 결합된 상태의 중간물질인 옥살로숙신산(oxalosuccinate)를 생성하고 보효소 NAD⁺를 환원하며 곧바로 탈탄산되어 알파케토글루타르산(α-ketoglutarate)과 이산화탄소(CO₂)를 생성한다. 이때 생성된 NADH는 바로 미토콘드리아 기질 내에 존재하는 전자전달계로 이동되어 생체내 활성 에너지인 ATP를 생성하게 된다(Journal of Biological Chemistry. 22199-22205 (1991), Journal of Theoretical Biology., 33-44 (2003)).

한편, 카르니틴 팔미토일 트랜스퍼라아제1(Carnitine palmitoyl transfrase 1:이하 CPT1이라 칭함) 효소는 세포내의 미토콘드리아 내부에 존재하는 단백질로서 긴 사슬의 지방산을 미토콘드리아 내부로 전달하는 역할을 한다. 이 효소는 세포내 미토콘드리아에서 일어나는 긴 사슬 지방산의 산화 과정에서 속도 결정 단계에 관여하는 것으로 알려져 있다. 세포수준의 실험 및 동물 수준의 실험에서 CPT1의 발 현을 증가시켰을 경우 지방산의 산화를 촉진시켜 에너지의 소비를 증가시킨다는 것이 알려졌다(Progress in Lipid Research, 231-268 (2001)). 렙틴은 음식물 섭취, 체중, 에너지 소비를 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데 이러한 렙틴이 녹아웃(knockout)된 생쥐가 비만이 유도된 생쥐(ob/ob mice)이며, 이러한 렙틴에 대한 수용체에 대한 유전자(leptin receptor)가 녹아웃된 것이 비만 생쥐(db/db mice, Nature, 632-635 (1996); Cell, 491-495 (1996))이다. 이 비만 생쥐들은 당뇨, 고지혈증, 비만 등의 대사성 질환을 연구하는데 실험모델로서 사용되고 있다.

이에 본 발명자들은 항비만 효과를 나타내는 화합물에 대한 연구를 진행하는 중 3,5-디히드록시벤조산 유도체 중에서 특정 구조의 화합물이 IDH3α와 CPT1의 각 프로모터의 활성을 유발하고, 비만생쥐(ob/ob)에서 LDL 콜레스테롤 및 혈당을 감소시키는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 3,5-디히드록시벤조산 유도체 화합물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

상기 식 중, R은 아다만틸, 시클로헥실 또는 헥실이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기한 3,5-디히드록시벤조산 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 비만 치료제를 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 3,5-디히드록시벤조산 유도체 화합물을 특징으로 한다:

[화학식 1]

상기 식 중, R은 아다만틸, 시클로헥실 또는 헥실이다.

상기 화학식 1로 표시되는 3,5-디히드록시벤조산 유도체 화합물은

(A) 3,5-디히드록시벤조산과 초산 무수물을 염기 존재하에서 반응하여 3,5-디아세틸옥시벤조산 화합물을 제조하는 단계;

(B) 상기 (A) 단계에서 생성된 3,5-디아세틸옥시벤조산 화합물로부터 에틸클로로포름메이트 및 친유성을 갖는 아민기를 이용하여 아미드 화합물을 제조하는 단계; 및

(C) 상기 (B) 단계에서 생성된 아미드 화합물의 아세틸기를 가수분해하여 3,5-디히드록시 벤조산 유도체 화합물을 제조하는 단계

를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 3,5-디히드록시벤조산 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 치료제를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 3,5-디히드록시 벤조산 유도체 화합물의 제조방법은 하기 (A), (B) 및 (C)단계를 포함하며 하기 반응식 1로 도식화할 수 있다.

(상기 식 중, R은 아다만틸, 시클로헥실 또는 헥실이다.)

(A) 3,5-디히드록시벤조산과 초산 무수물을 염기 존재하에서 반응하여 3,5-디아세틸옥시벤조산 화합물(Ⅱ)을 제조하는 단계:

본 발명의 제조방법 중 (A)단계에서 염기로는 피리딘, 트리에틸아민, 디메틸아미노피리딘 등을 사용할 수 있으나, 디메틸아미노피리딘 또는 디메틸아미노피리딘을 다른 염기와 함께 사용하는 것이 바람직하다. 디메틸아미노피리딘을 사용하지 않는 경우에는 반응 진행이 어려우며 수율이 낮아지기 때문에 염기를 과량 사용해야 하는 단점이 있다. 또한 (A)단계에서 용매로는 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라히드로퓨란 등을 사용할 수 있다. 반응온도는 10~80℃ 정도이며, 특히 40℃ 정도의 온도가 바람직하다.

(B) 상기 (A) 단계에서 생성된 3,5-디아세틸옥시벤조산 화합물로부터 에틸클로로포름메이트 및 친유성을 갖는 아민기를 이용하여 아미드 화합물(Ⅲ)을 제조 하는 단계:

본 발명의 제조방법 중 (B)단계에서 아미드 화합물(Ⅲ)을 제조하는 방법으로는 산할로겐화법, 활성에스테르법, 산무수물(acid anhydride)법이 모두 가능하나, 에틸클로로포름메이트를 이용하여 무수물 상태로 치환하는 방법이 가장 바람직하다. 여기에 친유성을 갖는 아민(R= 아다만틸, 시클로헥실, 헥실)으로 치환하여 아미드 화합물(Ⅲ)을 제조한다. 상기 (A) 단계에서 생성된 3,5-디아세틸옥시벤조산 화합물(Ⅱ)과 반응하는 친유기를 가진 아민의 당량비는 1:1.0 ~ 1:1.3 이 바람직하다. 이는 당량비가 1:1.0 미만이면 목적하는 생성물의 양이 적고, 1:1.3 초과이면 과량의 아민이 남아있기 때문이다.

본 발명의 제조방법 중 (B)단계에서 염기로는 피리딘, 트리에틸아민과 같은 염기가 사용될 수 있으나, 트리에틸아민을 사용하는 것이 바람직하다. (B)단계에서 반응용매로는 디클로로메탄, 아세톤, N,N-디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 테트라히드로퓨란 등이 사용될 수 있으나, N,N-디메틸포름아미드와 테트라히드로퓨란을 사용하는 것이 바람직하다. 한편 반응온도는 10~120℃ 정도이며, 특히 10~40℃ 정도의 온도가 바람직하다.

(C) 상기 (B) 단계에서 생성된 아미드 화합물의 아세틸기를 염기와 반응하여 가수분해하여 3,5-디히드록시 벤조산 유도체 화합물(Ⅰ, 화학식 1)을 제조하는 단계

본 발명의 제조방법 중 (C)단계에서 염기로는 수산화나트륨, 수산화칼륨과 같은 알칼리 금속 수산화물이 사용될 수 있다. (C)단계에서 반응용매로는 물, 메탄 올, 에탄올, 프로판올, 테트라히드로퓨란, 디클로로메탄 등이 사용될 수 있으나, 테트라히드로퓨란과 메탄올을 섞어 사용하는 것이 가장 빠른 시간에 반응을 완결시킬 수 있다. 메탄올과 테트라히드로퓨란의 비율은 1:1 ~ 1:5 까지 모두 가능하며, 특히 1:1 비율이 바람직하다.

상기의 제조방법에 의해 얻어지는 화학식 1의 3,5-디히드록시 벤조산 유도체 화합물의 구체적인 예로는,

N-아다만틸-3,5-디히드록시벤즈아미드,

N-시클로헥실-3,5-디히드록시벤즈아미드,

N-헥실-3,5-디히드록시벤즈아미드,

를 들 수 있다.

상기한 제조방법에 의해 제조한 화학식 1로 표시되는 3,5-디히드록시 벤조산 유도체 화합물은 에너지 대사에 관여하는 단백질 중에서 IDH3α 및 CPT1의 각 프로모터의 활성을 촉진하고, 비만생쥐(ob/ob mice)의 LDL 콜레스테롤 및 혈당의 감소를 유발함으로써 비만 치료제, 당뇨병 치료제, 고지혈증 치료제로서의 작용을 나타낸다.
본 발명의 조성물은 통상적인 방법에 따라 약학 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 활성 성분에 대한 담체, 부형제 또는 매질(medium)로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다. 따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭시르, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다.
적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥, 복강, 근육, 국소도포, 첩포 및 이온토포레시스(iontophoresis)를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있고, 이 중에서 국소 적용 및 경구투여가 바람직하다.
사람의 경우, 활성 화합물의 통상적인 1일 투여량은 1 내지 100mg/kg체중, 바람직하게는 5 내지 70mg/kg체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명에 따른 3,5-디히드록시 벤조산 유도체 화합물의 제조방법을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

[실시예 1] N-아다만틸-3,5-디히드록시벤즈아미드의 제조

3,5-디히드록시벤조산(100g, 0.65mol)을 1000㎖의 디클로로메탄에 녹인 다음 디메틸아미노피리딘에 촉매(4g, 0.03mol)를 넣고 5분간 환류시킨 후 트리에틸아민(199ml, 1.43mol)을 적가하였다. 여기에 초산 무수물(135ml, 1.43mol)을 천천히 적가시키고 반응온도 40℃에서 2시간 동안 환류시켰다. 반응이 완결된 후 반응용액을 디클로로메탄(1000ml)을 적가하여 희석시킨 후 물 1000㎖를 넣어 씻어준 후 1M HCl용액 500ml으로 씻어준 다음, 무수 망간(100g)으로 건조시킨 후 여과하고 농축하여 헥산으로 결정화 한 후 재여과하여 3,5-디아세틸옥시벤조산 화합물(Ⅱ) 132g(수율 = 85%)을 얻었다. 이 화합물(Ⅱ)(100g, 0.42mol)을 테트라히드로퓨란(1500㎖)에 녹이고 트리에틸아민(76.1ml, 0.55mol)을 적가한 후, 여기에 1.3당량의 에틸클로로포름메이트(52.2ml, 0.55mol)를 천천히 적가한 후 30분간 교반한 다음, 여기에 아다만틸-1-아민(75.6g, 0.50mol)과 트리에틸아민(84.3ml, 0.60ml)을 N,N-디메틸포름아미드 1500ml에 열을 가하여 녹인 후 천천히 적가한 뒤 3시간 동안 추가 교반하였다. 반응이 완결된 후 여과하고 반응액을 농축시킨 다음 디클로로메탄 1500ml에 다시 녹인 후 증류수(500ml)로 씻어주고 포화된 탄산수소나트륨 500ml로 씻어준 다음 무수 망간(100g)으로 건조시킨 후 여과하고 농축하여 헥산으로 결정화한 후 재여과하여 아미드 화합물(Ⅲ) 112g(수율 = 72%)을 얻었다. 이 화합물(Ⅲ) (100g, 0.27mol)을 테트라히드로퓨란:메탄올(1 : 1) 용매 1500㎖에 녹인 후 15%의 수산화칼륨을 넣고 100ml을 넣고 30분 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후 산을 가하여 중화하고 반응액을 농축시킨 후 초산에틸 1500ml을 넣고 녹인 후 물 1000ml로 씻어준 후 여과하고 농축하여 헥산으로 결정화한 후 재여과하여 목적물인 N-아다만틸-3,5-디히드록시벤즈아미드(Ⅰ) 67g(수율 = 86%)을 미황색 고체로 얻었다.

TLC(초산 에틸 : 헥산 = 1 : 1) Rf = 0.63

¹H NMR(DMSO-d6, δ) : 9.63(s, OH, 2H), 7.36(s, 1H,NH), 6.53(s, 2H), 6.24(s, 1H), 1.98(s, 9H), 1.58(s, 6H)

[실시예 2] N-시클로헥실-3,5-디히드록시벤즈아미드의 제조

아다만틸-1-아민 대신에 시클로헥실-1-아민을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 목적물(58.9g, 80%)을 미색의 고체로 얻었다.

TLC(초산 에틸 : 헥산 = 1 : 1) Rf = 0.58

¹H NMR(DMSO-d6, δ) : 9.63(s, OH, 2H), 7.36(s, 1H,NH), 6.53(s, 2H), 6.24(s, 1H), 2.8(m, 1H), 1.80(m, 4H), 1.40(m, 4H), 1.2(m, 2H).

[실시예 3] N-헥실-3,5-디히드록시벤즈아미드의 제조

아다만틸-1-아민 대신에 헥실-1-아민을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 목적물(55.3g, 75%)을 미색의 고체로 얻었다.

TLC(초산 에틸 : 헥산 = 1 : 1) Rf = 0.60

¹H NMR(DMSO-d6, δ) : 9.65(s, OH, 2H), 7.36(s, 1H,NH), 6.53(s, 2H), 6.24(s, 1H), 2.91(m, 2H), 1.68(m, 2H), 1.45(m, 2H), 0.92(m, 3H).

[시험예 1] IDH3α와 CPT1의 각 프로모터의 활성 측정

(1단계) 세포주와 세포 배양

IDH3α와 CPT1의 각 프로모터-루시퍼라아제 및 세포내에서 유전자의 지속적인 발현을 위한 네오마이신(neomycin - 선택적 표지) 융합 유전자를 함유하는 Huh7 세포주를 10% 우혈청(fetal calf sefum)을 함유한 DMEM 배지(Dulbecco's modifided Eagle's Medium, Invitrogen, 1210-0038) 및 페니실린/스트렙토마이신(peniciliin/streptomycin) 항생제(Invitrogen, 15140-122)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 수행하였다.

(2단계) IDH3α와 CPT1의 각 프로모터의 활성 증가

단계 1에서 배양된 세포주를 각각 트립신 처리하여 단일세포 현탁액을 만들고 96 well plate에서 24시간 배양하였다. 그 후 DMEM 배지에 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹인 실시예 1~3의 3,5-디히드록시 벤조산 유도체 화합물들을 10 ppm의 농도로 세포에 24시간 처리하였다. 처리 후 promega사의 루시퍼라아제 활성 측정 키트(Luciferase assay kit)를 이용하여 발현되는 루시퍼라아제의 활성을 측정함으로써 프로모터의 활성을 측정하였다. 양성대조군으로는 비만에 효과적인 것으로 알려진 제니스테인(Genistein)을 함께 사용하였다(한국특허 출원번호 제 2003- 0095226호).

IDH3α프로모터의 활성 분석을 해 본 결과, 대조군과 비교할 때 루시퍼라제 활성 증가 효과를 확인할 수 있었다(표 1). 또한 이와 마찬가지로 CPT1 프로모터의 활성 또한 대조군과 비교할 때 루시퍼라제 활성 증가 효과를 확인할 수 있었다(표 2).

IDH3α프로모터의 활성

물질	루시퍼라아제 활성
비처리군	2000
제니스테인	6000
실시예 1	14000
실시예 2	13500
실시예 3	13200

CPT1 프로모터의 활성

물질	루시퍼라아제 활성
비처리군	10000
제니스테인	19000
실시예 1	34000
실시예 2	34500
실시예 3	35000

[시험예 2] 혈당 억제 효과

유전적으로 비만이 유도된 8주령의 수컷 비만이 유도된 생쥐(ob/ob mice, 폴라스 인터내셔널, 한국)에 대하여, 실시예 1~3의 화합물을 0.02 % 함유한 AIN93G 사료(한삶R&D,한국)를 2주간 자유롭게 섭취하게 하였으며, 대조군으로는 화합물이 포함되지 않은 AIN93G 사료를 역시 2주간 자유롭게 섭취하게 하였다. 2주후 혈액을 채취하여 LDL 콜레스테롤의 감소를 확인하였으며(표3), 혈당의 감소량을 측정한 결과(표4), 본 발명에 따른 3,5-디히드록시벤조산 유도체 화합물 처리군에서 혈당이 감소함을 확인하였다.

LDL 콜레스테롤 감소량

물질	mg/dL
비처리군	78
실시예 1	68
실시예 2	65
실시예 3	67

혈당의 감소량

물질	mg/dL
비처리군	250
실시예 1	150
실시예 2	147
실시예 3	140

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 3,5-디히드록시벤조산 유도체 화합물들은 에너지 소비 대사에 관여하는 단백질 중에서 IDH3α와 CPT1의 각 프로모터의 활성 증가를 유발하며, LDL 콜레스테롤의 감소 및 혈당의 감소를 가져오므로, 향후 비만, 고지혈증, 당뇨병 등의 지방대사 이상질환에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 화학식으로 표시되는 3,5-디히드록시벤조산 유도체 화합물:

[화학식]

상기 식 중, R은 시클로헥실 또는 헥실이다.
제 1항에 있어서, 상기 3,5-디히드록시벤조산 유도체 화합물은 N-시클로헥실-3,5-디히드록시벤즈아미드 또는 N-헥실-3,5-디히드록시벤즈아미드 임을 특징으로 하는 화합물.
(A) 3,5-디히드록시벤조산과 초산 무수물을 염기 존재하에서 반응하여 3,5-디아세틸옥시벤조산 화합물(Ⅱ)을 제조하는 단계;

(B) 상기 (A) 단계에서 생성된 3,5-디아세틸옥시벤조산 화합물로부터 에틸클로로포름메이트 및 친유성을 갖는 아민기를 이용하여 아미드 화합물(Ⅲ)을 제조하는 단계; 및

(C) 상기 (B) 단계에서 생성된 아미드 화합물의 아세틸기를 가수분해하여 3,5-디히드록시 벤조산 유도체 화합물(Ⅰ)을 제조하는 단계

를 포함하는 하기 반응식 1로 도시되는 3,5-디히드록시벤조산 유도체 화합물의 제조방법:

[반응식 1]

상기 식 중, R은 시클로헥실 또는 헥실이다.
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