KR100863753B1 - Micropost array for quantitative measurement of c. elegans behaviors and the preparation method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 마이크로포스트 어레이(100)의 사시도이다. 1 is a perspective view of a
도 2는 도 1의 마이크로포스트 어레이(100)의 확대 단면도이다.2 is an enlarged cross-sectional view of the
도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 마이크로포스트 어레이(100)의 제조공정도이다.3 is a manufacturing process diagram of the
도 4는 마이크로포스트가 존재하지 않을 때 수중에서 유영하는 예쁜꼬마선충의 모습이다.Figure 4 shows the appearance of a pretty little nematode swimming underwater when no microposts are present.
도 5는 본 발명의 마이크로포스트 어레이(100) 위에서 예쁜꼬마선충이 사인곡선을 그리는 운동을 하는 모습을 나타낸 도이다. Figure 5 is a diagram showing a state that the pretty little nematode is a sinusoidal motion on the
도 6은 본 발명의 마이크로포스트 어레이(100)의 마이크로포스트 중심 간격을 변화시킴에 따라 예쁜꼬마선충의 수영속도 변화를 나타낸 도이다.6 is a view showing a change in swimming speed of the pretty little nematodes as the micropost center interval of the
도 7은 예쁜꼬마선충의 진동수에 따른 속도 변화를 나타낸 도이다.Figure 7 is a diagram showing the speed change according to the frequency of the pretty little nematodes.
도 8은 (a)한천 플레이트와 (b)본 발명의 마이크로포스트 어레이(100)에서 예쁜꼬마선충의 속도분포를 나타낸 도이다. 8 is a diagram showing the speed distribution of the pretty little nematodes in the (a) agar plate and (b) the
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명> <Explanation of symbols for main parts of the drawings>
100: 마이크로포스트 어레이100: micropost array
110: 기판 120: 마이크로포스트110: substrate 120: micropost
본 발명은 마이크로포스트 어레이 (micropost array) 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 기판 위에 마이크로포스트가 일정한 간격으로 배치되어 예쁜꼬마선충 (C.elegans)이 서식하는 습한 토양과 유사한 환경을 형성함으로써 기존에 사용되던 한천 플레이트로 관측하기 어려운, 자연계에서 볼 수 있는 예쁜꼬마선충의 행동을 관찰할 수 있는 마이크로포스트 어레이 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a micropost array and a method for manufacturing the same, and more particularly, microposts are disposed on a substrate at regular intervals to form an environment similar to a wet soil in which pretty little nematodes ( C.elegans ) inhabit. By doing so, the present invention relates to a micropost array and a method of manufacturing the same, which are difficult to observe with agar plates used in the past, and can observe the behavior of pretty nematodes seen in nature.
반도체 소자 제조에 사용되던 포토리소그래피(photolithography) 방법을 이용해 만든 마이크로 구조물이 최근 미생물 연구에 이용됨으로써 마이크로 크기의 미생물에의 접근이 용이하게 되었다. 일 예로, 박테리아를 표면에 고정시켜 세포와 세포 사이의 상호작용에 대해서 관찰할 수 있게 되었고, 하나의 세포에 대하여 세포가 자라는 환경, 구조에 따라 그 모습의 변화를 관찰할 수 있게 되었다 (Douglas B. Weibel, Willow R. DiLuzio and George M. Whitesides, Nature Reviews Mirobiology, 2007, 5, 209-218).Microstructures made using the photolithography method used in the manufacture of semiconductor devices have recently been used in microbial research to facilitate access to micro-sized microorganisms. For example, bacteria can be immobilized on the surface to observe the interaction between cells and cells, and changes in appearance can be observed depending on the environment and structure in which cells grow (Douglas B). Weibel, Willow R. DiLuzio and George M. Whitesides, Nature Reviews Mirobiology, 2007, 5, 209-218).
또한, C. elegans 의 경우 산소를 감지하는 돌연변이에 대한 실험을 하거나, 미로를 제작하여 먹이를 찾아가는 실험을 한 바 있다 (Gray JM, et al., Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 2004 Jul 15;430(6997):317-22; Jianhua Qin and Aaron R. Maze exploration and learning in C. elegans, Wheeler Lab Chip, 2007, 7, 186 - 192).In addition, in the case of C. elegans , experiments were conducted on oxygen-sensitive mutations, or a labyrinth was built to find food (Gray JM, et al., Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.Nature. 2004 Jul 15; 430 (6997): 317-22; Jianhua Qin and Aaron R. Maze exploration and learning in C. elegans, Wheeler Lab Chip, 2007, 7, 186-192).
이에 더하여, 미세유체역학(microfluidics)를 이용하여 미생물의 움직임(motility), 주화성, 정족수 인식(quorum sensing)의 접근이 가능하게 되었는데, 이러한 소프트 리소그래피 기술의 사용은 미세구조를 연속적으로 반복생산할 수 있는 장점이 있고, 관찰과 분석에 있어서 이전보다 짧은 시간과 적은 자원으로 실험이 가능하게 하였으며, 기존의 방법으로 관측하기 어려운 움직임을 관찰하는데 보다 응용될 수 있어 새로운 기술 개발의 기반으로서 기존의 문제점에 대한 해결책이 될 수 있을 것이라 여겨지고 있다.In addition, microfluidics allows access to microbial motility, chemotaxis, and quorum sensing, which use soft lithography to continuously produce microstructures. It is possible to experiment with shorter time and less resources than before in observation and analysis, and it can be applied to observing movements that are difficult to observe by the existing methods. It is believed to be a solution.
한편, 습한 토양 입자들 사이에서 박테리아를 먹고 사는 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 선충류(Nematode)에 속하는 동물로서, 고등동물이 가지는 많은 특성들을 가지고 있고, 투명하기 때문에 현미경을 이용한 관찰이 용이하고, 실험실에서 한천 플레이트를 이용해 쉽게 키울 수 있을 뿐만 아니라 짧은 생활사를 갖고 단기간에 많은 수의 자손을 만들 수 있으며, 전체 염기서열이 밝혀져 있어 생명과학 및 의학 분야에서 연구자들이 선호하는 동물 모델로서 사용되고 있다. C. elegans는 보통 20℃에서 알로부터 성충으로 성장하는데 약 3일이 소요되며 성장할 때에 네 유생시기 (L1 ~ L4)를 거쳐서 몸길이 약 1mm 의 성충이 되어 2-3주 정도 생존하는 것으로 알려져 있다. Meanwhile, the caenorhabditis elegans , which eats bacteria among wet soil particles, belongs to the nematode (Nematode), has many characteristics of higher animals, and is transparent, so it is easy to observe using a microscope. Not only can they be easily grown using agar plates in the laboratory, but they can produce a large number of offspring in a short period of time with a short life history, and the entire sequence is revealed, making it a preferred animal model for researchers in life sciences and medicine. C. elegans usually takes about three days to grow from an egg to an adult at 20 ° C. It is known to survive for two to three weeks as it grows to about 1 mm in length through four larval stages (L1 to L4).
이러한 C. elegans의 행동 연구가 주요하게 이루어지고 있는데, 주화성 (chemotaxis), 주온성 (thermotaxis), 주기성(aerotaxis), 물결모양 (undulatory movement) 이동 양상 및 장애물에 부딪쳤을 때 뒤로 만동 (recoil)하거나 유리막대로 C. elegans를 건드릴 때 도망가는 등의 기계적 감각 (mechanosensation)에 대한 연구는 현재까지 부드러운 표면을 가진 한천 플레이트 상에서 이루어져 왔다.These C. elegans behavioral studies are mainly conducted, such as chemoaxis, thermomotaxis, aerotaxis, undulatory movement patterns of movement and recoil when faced with obstacles. The study of mechanosensation, such as running away when touching C. elegans with glass rods, has been done on agar plates with smooth surfaces.
그러나 C. elegans의 자연 서식 환경은 매우 복잡한 구조의 토양입자 사이 공간으로서 기존의 한천 플레이트와는 매우 상이해 실제 C. elegans 행동 연구에는 다소 미흡한 점이 있었다.However, the natural habitat environment of C. elegans is a very complex structure between soil particles, which is very different from the existing agar plates, which is somewhat lacking in actual C. elegans behavioral studies.
따라서 C. elegans의 자연 서식 환경에서의 실제 행동과 가까운 행동관찰 및 연구를 위하여 토양입자 사이 공간과 유사한 구조를 갖는 미세구조물의 개발이 요구되어 왔다. Therefore, the development of microstructures with structures similar to the spaces between the soil particles has been required for the behavior observation and study close to the actual behavior in the natural habitat environment of C. elegans .
이에 본 발명자는 기존의 한천 플레이트를 대체하는 것으로 실제 자연에서의 예쁜꼬마선충의 행동을 관찰할 수 있는, 실제 서식환경과 유사한 미세구조물을 만들기 위해 예의 노력한 결과, 기판 및 기판상의 마이크로 크기의 포스트로 구성되 어 있는 마이크로포스트 어레이가 예쁜꼬마선충의 자연 서식환경과 유사한 조건을 제공하여 실제 예쁜꼬마선충의 행동을 관찰할 수 있고, 이에 더하여 비정상적 행동을 나타내는 예쁜꼬마선충을 구별하여 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have made diligent efforts to make microstructures similar to the actual habitat environment, which can observe the behavior of pretty little nematodes in nature by replacing existing agar plates. The constructed micropost array provides conditions similar to the natural habitat of the pretty little nematode, which allows us to observe the behavior of the pretty little nematode, and to identify and detect the pretty little nematode that exhibits abnormal behavior. It confirmed and completed this invention.
따라서 본 발명은 기판 위에 마이크로포스트가 일정한 간격으로 배치된 것을 특징으로 하는 마이크로포스트 어레이를 제공하는데 그 목적이 있다.Therefore, an object of the present invention is to provide a micropost array, characterized in that the micropost is arranged on a substrate at regular intervals.
또한, 본 발명은 위 마이크로포스트 어레이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, an object of the present invention is to provide a method for producing the micropost array.
본 발명은 기판(110) 위에 마이크로포스트(120)가 일정한 간격으로 배치된 것을 특징으로 하는 마이크로포스트 어레이(micropost array, 100)에 관한 것이다. The present invention relates to a micropost array (100), characterized in that the
또한, 본 발명은 포토리소그래피 방법을 이용하여 SU-8 마스터 몰드를 제조하는 제1 단계; 상기 SU-8 마스터 몰드로부터 폴리디메틸실록산 (PDMS) 레플리카를 제조하는 제2 단계; 및 상기 PDMS 레플리카를 주형으로 아가(agar)를 부어 고형화시킨 후 분리함으로써 아가 마이크로포스트 어레이를 제조하는 제3 단계를 포함하는, 마이크로포스트 어레이(100)의 제조방법에 관한 것이다. In addition, the present invention comprises a first step of producing a SU-8 master mold using a photolithography method; A second step of preparing a polydimethylsiloxane (PDMS) replica from the SU-8 master mold; And a third step of manufacturing the agar micropost array by pouring the agar into a mold and solidifying the PDMS replica, and then separating the PDMS replica.
또한, 본 발명은 포토리소그래피 방법을 이용하여 SU-8 마스터 몰드를 제조 하는 제1 단계; 및 상기 SU-8 마스터 몰드로부터 폴리디메틸실록산 (PDMS) 레플리카를 제조한 후 분리함으로써 PDMS 마이크로포스트 어레이를 제조하는 제2 단계를 포함하는, 마이크로포스트 어레이(100)의 제조방법에 관한 것이다. In addition, the present invention comprises a first step of producing a SU-8 master mold using a photolithography method; And a second step of manufacturing a PDMS micropost array by preparing a polydimethylsiloxane (PDMS) replica from the SU-8 master mold and then separating it.
이하, 본 발명을 도면을 참조하여 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 마이크로포스트 어레이(100)의 사시도이고, 도 2는 도 1의 마이크로포스트 어레이(100)의 확대 단면도이다.1 is a perspective view of a
도 1 및 도 2에 도시한 바와 같이, 본 발명의 마이크로포스트 어레이(100)는 아가를 이용하여 제조된 것으로, 기판(110) 위에 마이크로포스트(120)가 일정한 간격으로 배치된 것을 특징으로 한다.1 and 2, the
먼저, 본 발명의 마이크로포스트 어레이(100)의 구조에 대해서 설명한다.First, the structure of the
상기 기판(110)은 마이크로포스트를 배열하여 어레이를 제조하기 위한 기본 구조로, 소정 두께의 판상 형태로 이루어진다. The
상기 기판(110) 상면에 다수의 마이크로포스트(120)를 일정간격으로 배열하는데, 마이크로포스트(120)는 단면이 원형 또는 오각형, 육각형, 팔각형 등의 다각형으로, 기판(110) 상면에서 소정 높이로 돌출되어진 형태가 될 수 있다. 이 중 단면이 원형인 것이 바람직하다. A plurality of
이러한 마이크로포스트(120)는 기판(110)과 마이크로포스트(120)가 접하는 부분에서부터 기판에서 멀어질수록 단면적이 일정하거나 또는 단면적이 좁아지는 임의의 형태를 모두 포함한다. The
상기 마이크로포스트(120)의 직경은 50~300 마이크로미터 정도가 예쁜 꼬마 선충의 사인 곡선과 알맞게 매치되는 이유로 바람직하다. 50 마이크로미터 미만이면 구조물을 만들기에 어려운 점에서 좋지 않으며, 300 마이크로미터를 초과하면 예쁜꼬마선충의 운동성을 관찰하기 힘들다는 점에서 좋지 않다.The diameter of the
상기 마이크로포스트(120)의 높이는 70~200 마이크로미터 정도가 예쁜꼬마선충을 포함하여 표면에 적당한 물층을 함유할 수 있어 (예쁜꼬마선충의 직경이 약 80 마이크로미터 이하) 바람직하다. 70 마이크로미터 미만이면 예쁜꼬마선충을 포스트와 함께 물층에 놓게 할 수 없으므로 좋지 않고, 200 마이크로 미터를 초과하면 PDMS로부터 분리해 낼 때 잘 떨어져 나오지 않아 구조물을 만들기 힘들다는 점에서 좋지 않다.The
상기 간격은 한 마이크로포스트(120)와 다른 마이크로포스트(120) 사이의 갭(a)을 말하고(도 2 참고), 이 간격은 50~300 마이크로미터 정도가 예쁜꼬마선충이 기둥을 이용해 앞으로 나아가는 등 마이크로포스트 사이를 이동하기에 바람직하다. 50 마이크로미터 미만이면 선충이 이동하기에 너무 좁고, 300 마이크로미터를 초과하면 예쁜꼬마선충의 운동을 관찰하기에 적절하지 않다. The spacing refers to the gap (a) between one
또한, 한 마이크로포스트(120)의 중심과 다른 마이크로포스트(120)의 중심사이의 거리(b)(도 2)는 100~600 마이크로미터 정도가 예쁜꼬마선충이 기둥을 이용해 앞으로 나아가는 등의 예쁜꼬마선충의 움직임을 관찰하기에 적절하다. 100 마이크로미터 미만이면 마이크로포스트 직경을 50마이크로미터 미만으로 만들어야 해서 구조를 만들기가 어렵고, 600 마이크로미터를 초과하면 마이크로포스트의 직경이 300 마이크로미터를 넘어야 하므로 예쁜꼬마선충의 운동을 관찰하기에 적절하지 않다. In addition, the distance (b) (FIG. 2) between the center of one
또한, 본 발명의 어레이에는 다수 개의 마이크로포스트를 포함하는데, 이들은 각각 형태, 간격, 높이 및 직경이 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다.In addition, the array of the present invention includes a plurality of microposts, which may each be the same in shape, spacing, height and diameter, or may be different.
이러한 본 발명의 마이크로포스트 어레이(100)를 제조하기 위한 재료로는 아가 (agar) 또는 어레이 제조에 사용되는 통상의 고분자(SU-8, PDMS)를 사용할 수 있는데, 그 중 아가 또는 폴리디메틸실록산(PDMS)를 사용하는 것이 바람직하다. As a material for manufacturing the
아가는 홍조류의 세포벽에 들어있는 갈락토오스와 그 갈락토오스 유도체로 구성되는 점질성 다당류로서, 약 70%의 아가로오스 (C-3결합의 β-D-갈락토오스와 C-4결합의 3,6-안히드로-α-L-갈락토오스가 교대로 이어진 곧은 사슬구조)와 약 30%의 아가로펙틴 (아가로오스와 기본구조는 같지만 황산기, 글루쿠론산, 피루브산이 결합되어 있는 구조)의 혼합물로 알려져 있다. 아가는 우뭇가사리속의 우뭇 가사리와 홍조류의 여러 종에서 추출한 열수추출액(熱水抽出液)의 응고물인 우무를 얼려 건조시킴으로써 수득할 수 있는데, 물과 혼합하여 80℃ 이상으로 가열하면 완전히 용해되어 액체 상태로 변하고 온도가 점차 내려가면 젤리같이 고형화됨으로써 몰드에 부어 특정 형태로 성형하기 용이한 장점이 있다. 또한, 무독성의 천연물질이라는 장점도 있어 식품에 많이 이용되고, 세균 배양을 위한 고형 배지 및 공업용 등으로 상용되고 있다. Agar is a viscous polysaccharide composed of galactose and its galactose derivatives in the cell wall of red algae, and contains about 70% of agarose (3,6-eye of C-3 bond β-D-galactose and C-4 bond). It is known as a mixture of hydro-α-L-galactose with alternating straight chain structure and about 30% of agalopectin (same structure as agarose but with sulfate, glucuronic acid and pyruvic acid). . Agar can be obtained by freezing and drying the radish, which is a coagulum of hot water extract extracted from several species of Locust spp. And red algae in the Locust spruce. When mixed with water and heated to 80 ℃ or more, it is completely dissolved into liquid state. When the temperature changes and gradually decreases, it becomes solid like a jelly, so that it is easy to pour into a mold and mold to a specific shape. In addition, it has the advantage of being a non-toxic natural material, it is widely used in food, it is commercially available for solid media and industrial use for bacterial culture.
본 발명에서는 시판되는 아가 분말을 사용할 수 있으나 특별히 이에 제한되지는 않는다. In the present invention, commercially available agar powder may be used, but is not particularly limited thereto.
사용하는 아가의 농도는 2~6%(w/v), 바람직하게는 3~4%(w/v) 범위가 될 수 있다. 아가의 농도가 2% 미만인 경우 마이크로포스트 어레이가 너무 무르게 제작되어 부서지기 쉽고, 따라서 실험에 이용하기에 불편하게 되며, 6%를 초과하는 경우 아가의 수분함유량이 작아 그 탄력성이 떨어져 제조과정 중 분리해 낼 때 잘 떨어져 나오지 않는 이유로 좋지 않다.The concentration of agar to be used may be in the range of 2 to 6% (w / v), preferably 3 to 4% (w / v). If the concentration of agar is less than 2%, the micropost array is too soft and brittle, and thus uncomfortable to use in experiments. If it exceeds 6%, the water content of the agar is small and its elasticity is low, so it is separated during the manufacturing process. It's not good because it doesn't come off well.
상술한 바와 같이 아가를 이용하여 제조된 마이크로포스트 어레이는 부드럽고 젤리 같은 말랑말랑한 재질을 나타낸다. As described above, the micropost array manufactured using agar exhibits a soft and jellyy soft material.
특히, 본 발명의 아가를 이용하여 제조된 마이크로포스트 어레이는 자체가 물을 함유하고 있고, 표면에 얇은 물 층이 존재하는 것을 특징으로 하고, 시간이 경과하여 건조되더라도 물에 일정시간 담가두었다가 사용하는 경우 마이크로포스트 어레이 자체가 충분히 물을 흡수하여 함유할 수 있고, 표면에 얇은 물층을 보유할 수 있다.In particular, the micropost array manufactured by using the agar of the present invention is characterized in that it contains water and a thin layer of water is present on the surface, and it is used after being immersed in water for a certain time even if dried over time. In this case, the micropost array itself can sufficiently absorb and contain water and have a thin layer of water on its surface.
또한, 본 발명의 마이크로포스트 어레이의 재료로 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용하는 것도 바람직한데, PDMS로 제조된 본 발명의 마이크로포스트 어레이 표면을 물로 채워 물 층을 형성시킨 후 위에 커버를 덮으면 상기 아가로 제조된 마이크로포스트 어레이에서와 같이 물층을 보유할 수 있다. It is also preferable to use polydimethylsiloxane (PDMS) as the material of the micropost array of the present invention. The surface of the micropost array of the present invention made of PDMS is filled with water to form a water layer, and then the cover is covered with the agar. The water layer may be retained as in a micropost array made of microorganisms.
본 발명의 일 실시예에 따른 아가를 이용한 마이크로포스트 어레이 (100)의 제조공정은 도 3에 제시되어 있다.A manufacturing process of the
제1 단계는 포토리소그래피 방법을 이용하여 SU-8 마스터 몰드를 제조하는 단계로(도 3의 (a) 참고), The first step is to prepare a SU-8 master mold using a photolithography method (see (a) of FIG. 3),
예를 들어 설명하면, 네가티브 포토레지스트 (negative photoresist)인 SU-8 (화학식 1)을 스핀 코팅기를 이용하여 실리콘 기판 상부에 약 110 마이크로미터의 두께로 도포한 후, 65℃에서 30분, 90 ℃에서 60 분 동안 prebake 시킨다. 그 다음, SU-8이 코팅된 실리콘 기판 위에 마이크로포스트 어레이가 디자인된 포토마스크를 놓고, 33.4 mW/cm2의 세기의(또는 365nm의) 자외선(UV)으로 15 초 동안 노광시킨다. 그 후 65℃에서 30분, 90 ℃에서 30 분 동안 postbake시킨 다음 노광이 완료된 실리콘 기판을 SU-8 현상액에 15분 동안 담궈 현상하여 SU-8 마스터 몰드를 제조한다.For example, a negative photoresist SU-8 (Formula 1) is applied to the silicon substrate by using a spin coater at a thickness of about 110 micrometers, and then at 65 ° C. for 30 minutes and 90 ° C. Prebake for 60 minutes. Next, place a photomask with a micropost array on a SU-8 coated silicon substrate, It is exposed for 15 seconds with ultraviolet (UV) light of 33.4 mW / cm 2 (or 365 nm). Subsequently, postbake at 65 ° C. for 30 minutes and at 90 ° C. for 30 minutes was performed, and the exposed silicon substrate was dipped in SU-8 developer for 15 minutes to develop SU-8 master mold.
상기 SU-8의 코팅 두께에 따라 마이크로포스트 (120)의 높이가 결정되게 되고, 상기 포토 마스크의 디자인에 따라 마이크로포스트 (120)의 형태, 직경 및 마이크로포스트 사이의 간격이 결정되게 된다.The height of the
마이크로포스트 형태는 원형 또는 오각형, 육각형, 팔각형 등의 다각형이 될 수 있으나, 바람직하게는 원형이 되도록 포토 마스크를 디자인하고, 마이크로포스트의 직경은 50~300 마이크로미터 정도가 되도록, 마이크로포스트 간격은 50~300 마이크로미터 정도가 되도록 포토 마스크를 디자인하여 사용한다. The micropost shape may be a circle or a polygon such as a pentagon, a hexagon, or an octagon, but the photomask is preferably designed to be circular, and the micropost has a diameter of 50 to 300 micrometers, and the micropost spacing is 50. Design and use photo masks to be around 300 micrometers.
이렇게 제1 단계에서 제조된 SU-8 마스터 몰드는 본 발명에서 최종적으로 얻고자 하는 마이크로포스트 어레이의 형태를 나타내게 된다.The SU-8 master mold prepared in the first step thus shows the form of the micropost array to be finally obtained in the present invention.
제2 단계는 상기 SU-8 마스터 몰드로부터 폴리디메틸 실록산 (polydimethylsiloxane, PDMS) 레플리카를 제조하는 단계로(도 3의 (b) 참고),The second step is to prepare a polydimethylsiloxane (PDMS) replica from the SU-8 master mold (see (b) of Figure 3),
상기 SU-8 마스터 몰드 위에 액상의 PDMS를 붓고 70~80℃에서 1시간 이상 경화시킨 후 SU-8 마스터 몰드에서 떼어내어 고형화된 PDMS 레플리카를 제조한다.The liquid PDMS is poured onto the SU-8 master mold and cured at 70 to 80 ° C. for at least 1 hour to remove the SU-8 master mold to prepare a solidified PDMS replica.
제3 단계는 상기 PDMS 레플리카를 주형으로 아가를 부어 고형화시킨 후 분리함으로써 아가(agar) 마이크로포스트 어레이를 제조하는 단계로(도 3의 (c) 및 (d) 참고), The third step is to prepare agar micropost array by pouring and solidifying the agar with a template in the PDMS replica (see Fig. 3 (c) and (d)),
먼저, 액체상태의 아가를 준비하는데 물(증류수)에 시판하는 아가 분말을 2~6%(w/v) 농도로 첨가하고 이를 80℃ 이상으로 가열하여 아가 분말을 완전히 녹인 후 60℃ 이상 (약 60~65℃)의 온도로 식혀서 사용한다.First, prepare agar in liquid state, add commercially available agar powder to water (distilled water) at a concentration of 2 to 6% (w / v), and heat it to 80 ° C or more to completely dissolve the agar powder, and then to 60 ° C or more (about Cool to 60 ~ 65 ℃) and use.
상기 고형화된 PDMS 레플리카를 주형으로 하여 그 위에 60℃ 이상의 액체상태의 아가를 붓고, 공기방울을 제거한 후 식혀서 고형화시킨다.The solidified PDMS replica is used as a template, and the agar in a liquid state of 60 ° C. or more is poured thereon, and the air bubbles are removed and cooled and solidified.
아가 농도는 2% 미만이면 마이크로포스트 어레이 제작시 마이크로포스트 어레이가 너무 무르게 제작되어 부서지기 쉬운 단점이 있고, 6 % 초과하면 아가의 수분함유량이 작아 그 탄력성이 떨어져 PDMS로부터 분리해 낼 때 잘 떨어져 나오지 않기 때문에 좋지 않으며, 특히 3~4 % 정도가 바람직하다.If the agar concentration is less than 2%, the micropost array is too soft to be broken when fabricating the micropost array, and if it is more than 6%, the moisture content of the agar is small and its elasticity is low so that it is not easily separated from the PDMS. It is not good because it is not, especially about 3 to 4% is preferred.
상기에서 고형화된 아가를 분리하면 상기 SU-8 마스터 몰드와 같은 형태의 본 발명의 마이크로포스트 어레이가 완성되게 된다. When the solidified agar is separated, the micropost array of the present invention having the same shape as the SU-8 master mold is completed.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 PDMS로 된 마이크로포스트 어레이 (100)의 제조공정은 하기와 같다. In addition, the manufacturing process of the
제1 단계는 포토리소그래피 방법을 이용하여 SU-8 마스터 몰드를 제조하는 단계로, 상기와 동일한 방법으로 제조하되 최종적으로 얻고자 하는 마이크로포스트 어레이의 요철과 반대되는 형상이 제조될 수 있도록 포토마스크 디자인하여 SU-8 몰드를 제조한다.The first step is to manufacture a SU-8 master mold using a photolithography method, and the photomask is designed to produce a shape opposite to the unevenness of the micropost array to be manufactured in the same manner as described above. To produce a SU-8 mold.
이어서 제2 단계는 상기 SU-8 마스터 몰드로부터 폴리디메틸 실록산 (PDMS) 레플리카를 제조한 후 분리하는 단계로, 상기 SU-8 마스터 몰드 위에 액상의 PDMS를 붓고 70~80℃에서 1시간 이상 경화시킨 후 SU-8 마스터 몰드에서 고형화된 PDMS 레플리카를 분리함으로써 PDMS 마이크로포스트 어레이를 제조한다.Subsequently, the second step is to prepare a polydimethyl siloxane (PDMS) replica from the SU-8 master mold and then separate it. The liquid PDMS is poured onto the SU-8 master mold and cured at 70 to 80 ° C. for at least 1 hour. PDMS micropost arrays are then prepared by separating the solidified PDMS replica from the SU-8 master mold.
이렇게 제2 단계에서 제조된 PDMS 레플리카는 최종적으로 얻고자 하는 마이크로포스트 어레이의 형태를 가지게 된다. The PDMS replica manufactured in the second step is in the form of the micropost array to be finally obtained.
상기한 본 발명의 마이크로포스트 어레이의 제조방법에 따르면 다양한 미세구조를 간편하게 연속적으로 반복생산할 수 있게 된다.According to the manufacturing method of the micropost array of the present invention described above, it is possible to easily and repeatedly produce various microstructures.
상기와 같이 제조된 본 발명의 마이크로포스트 어레이 (100)는 예쁜꼬마선충의 행동연구, 비정상 예쁜꼬마선충의 검출, 예쁜꼬마선충을 이용한 대상물질의 독성테스트 및 약물 스크리닝 등의 용도로 사용될 수 있다.The
예쁜꼬마선충(C. elegans)은 다세포 생물 가운데 최초로 1998년에 10억개의 전체염기서열이 규명된 동물로서, 19,000여개 유전자를 가지고 있으며, 인간과 공 유하고 있는 유전자도 상당하여, 인체내 독성 메카니즘 등의 의약 및 생명공학 연구에 있어서 대표적인 동물 모델로 활용되고 있다. C. elegans is the first multicellular organism to identify 1 billion total nucleotide sequences in 1998. It has 19,000 genes and a lot of genes shared with humans. It is used as a representative animal model in medicine and biotechnology research.
본 발명의 마이크로포스트 어레이에서 마이크로포스트는 이러한 C. elegans가 서식하는 토양과 유사한 구조를 형성하고, 어레이상의 얇은 물층은 서식지의 습한 조건과 유사한 환경을 제공하므로, 본 발명의 마이크로포스트 어레이에 C. elegans를 적용시 기존의 방법으로 관측하기 어려운 C. elegans의 행동을 관찰 및 연구하는데 보다 응용될 수 있으며, 물리적인 자극을 느끼지 못하거나, 반응하는데 결함이 있거나, 움직임이 협동적이지 못한 돌연변이이거나 또는 병든 상태와 같은 비정상적인 C. elegans의 검출을 가능하게 한다. In the micropost array of the present invention, the micropost forms a structure similar to the soil inhabiting such C. elegans , and the thin water layer on the array provides an environment similar to the wet conditions of the habitat . elegans is more applicable to observing and studying the behavior of C. elegans, which is difficult to observe by conventional methods, and is a mutation that does not feel physical stimulus, is defective in response, or is not cooperative in movement, or Enables the detection of abnormal C. elegans such as diseased conditions.
또한, C. elegans의 경우 토양·수중의 중금속 독성이나, 내분비계 장애 물질을 포함한 환경오염물질의 독성연구 등에 적합한 동물 모델로 알려져 있으므로 특히, 본 발명의 마이크로포스트 어레이는 C. elegans를 이용한 대상물질의 독성테스트 및 약물 스크리닝에 활용될 수 있다.In addition, since C. elegans is known as an animal model suitable for the toxicity of heavy metals in soil and water or toxicity of environmental pollutants including endocrine disruptors, the micropost array of the present invention is a target material using C. elegans . It can be used for toxicity test and drug screening.
대상물질 또는 약물을 C. elegans에 처리한 후, C. elegans의 행동 방식을 본 발명의 마이크로포스트 어레이에서 관찰함으로써 보다 민감하고 빠르게 독성테스트 및 약물 스크리닝 결과를 얻을 수 있어 관련연구에 유용할 것이다. After treatment of C. elegans with a target substance or drug, the behavior of C. elegans can be observed in the micropost array of the present invention to obtain more sensitive and rapid toxicity test and drug screening results.
또한, 특정 유전자가 조작된 C. elegans를 본 발명의 마이크로포스트 어레이에서 관찰하는 경우에, 유전자가 C. elegans 행동에 미치는 영향을 보다 정확하게 연구하는데도 활용될 수 있을 것이다. In addition, when observing C. elegans engineered in a particular gene in the micropost array of the present invention, it may be used to more accurately study the effect of the gene on C. elegans behavior.
도 4는 포스트가 존재하지 않을 때 수중에서 유영하는 C. elegans의 모습으로, 회색비율은 이미지의 변화 정도를 나타내는데, 검은색 부분은 변화가 많은 부분이고 하얀색 부분은 변화가 없는 부분을 나타낸다. 물속에서도 C. elegans는 물결모양 (undulatory movement)으로 수영함을 알 수 있는데, 이러한 상황에서는 실제 자연 서식환경과 유사하지 않으므로 제자리에서의 움직임만 있고, 전혀 속도가 나지 않고 이동이 어려움이 있음을 알 수 있다. FIG. 4 shows C. elegans swimming underwater when no posts are present, where the gray ratio represents the degree of change in the image, with the black portion representing the change and the white portion representing the change. It can be seen that C. elegans swim in undulatory movements in the water. In this situation, it is not similar to the natural habitat, so there is only movement in place, no speed, and no movement. Can be.
반면, 본 발명의 마이크로포스트 어레이를 사용하는 경우 자연 서식환경에서 볼 수 있는 C. elegans의 입체적 행동을 관찰할 수 있다.On the other hand, when using the micropost array of the present invention can observe the three-dimensional behavior of C. elegans that can be seen in the natural habitat environment.
도 5는 본 발명에서 제조한 마이크로포스트 어레이(원형기둥 직경 : 300㎛, 기둥중심간격 475㎛, 기둥높이 110㎛)를 마이크로 포스트가 위쪽으로 오게 놓고 물에 1시간 이상 침지시켜 표면 위에 형성된 얇은 물층이 존재하게 한 후 C. elegans를 올려놓았을 때, C. elegans가 사인곡선을 그리는 운동을 하는 모습을 나타낸 것이다. 1초에 5장씩 찍은 사진을 합친 사진으로 C. elegans는 왼쪽에서 오른쪽으로 수영하고 있다. 5 is a thin water layer formed on the surface of the micropost array (circular column diameter: 300㎛, column center interval 475㎛,
C. elegans는 사인곡선 운동시 몸의 힘을 마이크로포스트에 밀어 반발력을 이용해 방향성을 보이며 수영을 하는 모습임을 알 수 있다. 이러한 방향성의 수영을 통해 이동속도를 한천 플레이트에서 보다 10배 이상 증가시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다. C. elegans shows the direction of swimming by using the repulsive force to push the force of the body to the micropost during the sinusoidal exercise. It was found that the directional swimming can increase the moving speed by more than 10 times than in the agar plate.
이러한 사실을 통해 C. elegans가 실제 자연환경에서 토양 입자들 사이를 이 동할 때 이와 유사한 운동을 통해 빠르게 이동한다는 것을 알 수 있다.This fact indicates that C. elegans moves rapidly through similar movements as they move between soil particles in the natural environment.
또한, 기둥 사이를 통해 막대기처럼 움직이며 이동하는 행동 등 한천 플레이트에서 볼 수 없었던 흥미로운 움직임들도 관찰할 수 있다. You can also observe interesting movements that were not seen in the agar plate, such as the movement of sticks through the columns.
도 6은 본 발명의 마이크로포스트 어레이의 포스트 중심 간격(post spacing)을 변화시킴에 따라 변하는 C. elegans의 수영속도를 관찰한 결과이다.FIG. 6 shows the results of observing the swimming speed of C. elegans that changes as the post spacing of the micropost array of the present invention is changed.
C. elegans가 앞으로 원활하게 나아갈 때 구부러지는 각도가 다른 포스트에 방해가 되지 않고, 적합한 포스트의 배열을 지지대로 삼아 반동과 방향성이 생길 때 속도가 가장 많이 증가하게 된다. When C. elegans moves forward smoothly, the angle of bending does not interfere with other posts, and the speed increases most when recoils and directionality are supported by the proper post arrangement.
L4 stage인 C. elegans(길이 600~900㎛)를 사용하여 그 크기에서 속도가 가장 많이 증가하는 포스트 중심간 거리를 확인한 결과, 420~480 마이크로미터에서 높은 수영속도를 나타냄을 알 수 있다.Using the L4 stage C. elegans (
도 7은 C. elegans의 진동수에 따른 속도 변화를 나타낸 것으로, 포스트 사이를 지나는 C. elegans로 인해 발생하는 물결모양의 진동수가 증가할수록, 그의 속도도 증가함을 알 수 있다. Figure 7 illustrates the speed changes according to the frequency of C. elegans, the more the frequency of a wave shape that is caused by C. elegans passes between the posts increases, it can be seen that his rate increases.
도 8은 한천 플레이트와 본 발명의 마이크로포스트 어레이에서 C. elegans의 속도분포를 나타낸 도로, 8 is a road showing the velocity distribution of C. elegans in the agar plate and the micropost array of the present invention,
정상 C. elegans(N2), 물리적 자극 감지에 결함이 있는 돌연변이 C. elegans(MEC-4, MEC-10) 및 움직임이 협동적이지 않은 돌연변이 C. elegans(UNC-29, UCN-105)(서울대, C.elegans Genetic center)를 사용하여 속도 관찰한 결과, 기존의 한천 플레이트에서는 각 C. elegans의 속도의 차이가 크게 나지 않는 것을 볼 수 있으나(도 6의 (a)) 본 발명의 마이크로포스트 어레이에서는 정상 C. elegans만이 그 속도가 매우 급증하였고, 나머지 돌연변이들은 한천 플레이트에서보다는 속도가 증가했지만 정상 C. elegans에 비해 증가율이 매우 낮음을 알 수 있어, C. elegans 별 속도의 차이가 현저함을 확인할 수 있었다(도 6의 (b)).Normal C. elegans (N2), mutant C. elegans (MEC-4, MEC-10) defective in detecting physical stimuli and mutant C. elegans (UNC-29, UCN-105) (Seoul University) , C. elegans Genetic Center) using the result of the speed observation, it can be seen that the difference in the speed of each C. elegans in the conventional agar plate (Fig. 6 (a)) micropost array of the present invention in the normal C. elegans was only the speed is very soaring, the remaining mutations are also remarkable difference, C. elegans rate I can see the growth rate is very low compared to the normal rate of increase than in C. elegans, but agar plates It could be confirmed (Fig. 6 (b)).
따라서, 본 발명의 마이크로포스트 어레이를 물리적인 자극을 느끼지 못하거나, 반응하는데 결함이 있거나, 움직임이 협동적이지 못한 돌연변이이거나 또는 병든 상태와 같은 비정상 C. elegans의 검출에 이용하는 경우 기존의 한천 플레이트를 사용하는 경우보다 더 용이하게 검출할 수 있으며, 상대적으로 짧은 시간내에 검출이 이루어질 수 있으므로 우수한 비정상 C. elegans 검출 효과를 나타낸다. Therefore, when using the micropost array of the present invention to detect abnormal C. elegans , such as a mutant that is not physically stimulating, is defective in responding, is not cooperative with movement, or is ailing, an existing agar plate is used. It can be detected more easily than in the case of use, and since the detection can be made within a relatively short time, it shows an excellent abnormal C. elegans detection effect.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위내에서 여러가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것이 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.The present invention described above is not limited to the above-described embodiments and the accompanying drawings, and it is common in the art that various substitutions, modifications, and changes can be made without departing from the technical spirit of the present invention. It will be apparent to those who have knowledge.
상기한 바와 같이 본 발명에 따른 마이크로포스트 어레이는 예쁜꼬마선충이 서식하는 습한 토양과 유사한 환경을 형성함으로써 기존의 예쁜꼬마선충 연구에 사용되던 한천 플레이트로는 관측하기 어려운, 자연계에서 볼 수 있는 예쁜꼬마선충의 행동을 관찰할 수 있다. As described above, the micropost array according to the present invention forms an environment similar to the wet soil in which the pretty nematodes inhabit, which is difficult to observe with the agar plate used in the research of the pretty nematodes. The behavior of nematodes can be observed.
따라서 본 발명의 어레이는 예쁜꼬마선충의 주화성, 주기성, 주열성, 기계적 감각 등의 행동 연구에 유용하며, 특히 예쁜꼬마선충의 행동 연구 및 물리적인 자극을 느끼지 못하거나, 반응하는데 결함이 있거나, 움직임이 협동적이지 못한 돌연변이이거나 또는 병든 상태인 비정상 예쁜꼬마선충의 검출, 예쁜꼬마선충을 이용한 대상물질의 독성테스트 및 약물 스크리닝하는데 있어 유용하게 활용될 수 있다.Therefore, the array of the present invention is useful for studying behaviors such as chemotaxis, periodicity, thermophilicity, and mechanical sensation of pretty nematodes, and in particular, studies on behavior and physical stimulation of pretty nematodes do not feel or are deficient in reaction or movement. This can be useful for the detection of abnormal pretty nematodes, disease tests, and toxicity screening of drugs using these uncooperative mutations or diseased diseases.
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