KR100856964B1 - 특이적 및 선택적 전기 및 전자기 신호를 사용한 기질금속단백질분해효소 유전자 발현의 조절 - Google Patents

특이적 및 선택적 전기 및 전자기 신호를 사용한 기질금속단백질분해효소 유전자 발현의 조절 Download PDF

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Abstract

본원 발명은 병에 걸리거나 다친 관절 연골의 치료에서 특이적 및 선택적 전기 및 전자기 신호에 의하여 발생된 필드장의 적용을 통하여 연골 세포에서 기질 금속단백질분해효소 유전자의 발현을 조절하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
유전자 발현이란 인간 게놈 (DNA)의 특이 부분 (유전자)가 mRNA로 전사되고 이어서 단백질로 번역되게 하는 과정을 상향조절 또는 하향조절하는 것을 의미한다. 기질 금속단백질분해효소 유전자 발현의 감소를 위하여 최적화된 필드장을 발생하는 특이적 및 선택적 전기 및 전자기 신호를 발생하고 특이적 및 선택적 신호에 의하여 발생된 필드장에 연골 조직을 노출시켜 상기 연골 조직에서 기질 금속단백질분해효소 유전자 발현을 조절하는 것을 포함하는 방법 및 그 장치가 제공된다. 얻어진 방법 및 장치는 골관절염, 류마티스 관절염, 연골 손상, 연골 결함, 및 종양 전이의 표적 치료에 유용하다.
연골 세포, 기질 금속단백질분해효소 유전자의 발현, 특이적 및 선택적 전기 및 전자기 신호

Description

특이적 및 선택적 전기 및 전자기 신호를 사용한 기질 금속단백질분해효소 유전자 발현의 조절 {Regulation of Matrix Metalloproteinase Gene Expression Using Specific and Selective Electrical and Electromagnetic Signals}
관련 출원의 상호 참조
본 특허출원은, 2000년 2월 23일자로 출원된 미국 가특허출원 제60/184,491호의 우선일을 주장하는 2001년 2월 23일자로 출원된 PCT 특허출원 제PCT/US01/05991호의 미국 국내단계 특허출원인 미국특허출원 제10/257,126호의 부분 계속 출원인 2003년 6월 13일자로 출원된 미국특허출원 제10/461,188호의 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 손상된 또는 질병에 걸린 관절 연골의 치료를 위한 특이적이고 선택적인 전기적 및 전자기적 신호에 의하여 발생된 필드장의 적용에 의해 연골 세포 에서의 기질 금속단백질분해효소(Matrix Metalloproteinase, MMP) 유전자 발현을 하향조절하는 방법 뿐 아니라 그러한 신호를 발생하는 장치에 관한 것이다.
다양한 생물학적 조직 및 세포에 존재하는 것으로 여겨지는 생물전기적 상호작용 및 활성은 가장 덜 이해된 생리학적 과정의 하나이다. 그러나, 특정 조직 및 세포의 성장 및 복구에 관한 이러한 상호작용 및 활성에 대하여 최근 많은 연구가 있었다. 특히, 전기장 및 전자기장에 의한 자극 및 뼈 및 연골의 성장 및 복구에 대한 이의 영향에 대해 많은 연구가 이루어지고 있다. 연구자들은 그러한 연구가 다양한 의학적 문제에 대한 새로운 치료의 발전에 유용할 수 있다고 믿는다.
퇴행성 관절 질병으로도 알려진 골관절염은 관절 연골의 퇴행 뿐아니라 연골밑 뼈의 증식 및 리모델링으로도 특징화된다. 통상적 증상은 경직, 운동의 제한, 및 통증이다. 골관절염은 관절염의 가장 흔한 형태이며, 연령에 따라서 유병률이 현저하게 증가한다. 자가-보고된 골관절염을 앓고 있는 고연령의 환자가 그렇지 않은 동료에 비해 2배 정도 자주 의사를 방문하는 것으로 나타났다. 그러한 환자들은 그들의 연령군의 다른 이들에 비해 활동이 제한되거나 침대에 누워있는 있는 날들이 더 많은 경험을 겪는다. 한 연구에서는, 징후를 나타내는 대다수의 환자가 이후 8년의 기간 동안에 현저하게 무능력하게 되었다(문헌[Massardo et al.,Ann. Rheum. Dis. 48 : 893-897, 1989] 참조).
비스테로이드성 항염증제 (NSAID)가 골관절염의 1차적 치료 양식으로 남아있다. NSAID의 효능이 그들의 진통 또는 항염증 성질에 의존하는지, 또는 연골에서 퇴행성 과정을 완화시키는지 여부는 알려져 있지 않다. 또한, NSAID가 환자에게 해로울 수도 있다는 우려도 있다. 예를 들면, NSAID는 위, 위장관, 간 및 신장에서 잘 알려진 독성효과를 갖는다. 그러나, 아스피린은 동물에서 프로테오글리칸(proteoglycan) 합성 및 정상적 연골 복구 과정을 저해한다. 인간에서의 한 연구는 인도메타신이 엉덩이 연골의 파괴를 촉진시킬 수도 있다는 것을 시사하였다. 모든 역효과는 바로 골관절염에 가장 감수성인 집단인 고연령층에서 보다 흔하다.
흔히 골다공증으로 알려진 질병에서는, 뼈에서 무기질이 빠져나가고 비정상적으로 희박하게 된다. 뼈는 무기 또는 무기질 성분 뿐 아니라 세포 및 기질의 유기 성분을 포함한다. 세포 및 기질은 뼈에 강성을 부여하는 인산칼슘 (85%) 및 탄산칼슘(10%)의 무기질 성분으로 포화된 아교질 섬유의 구조를 포함한다. 골다공증이 일반적으로 고연령층을 괴롭히는 것으로 생각되지만, 특정 유형의 골다공증은 그 뼈가 기능적 스트레스의 대상이 되지 않는 모든 연령층의 사람들에게 영향을 줄 수 있다. 그러한 경우에는, 환자는 고정화의 연장된 기간 동안에 피질 및 해면 뼈의 현저한 손실을 경험할 수 있다. 고연령층 환자는 뼈의 골절 후 고정화된 경우 불사용으로 인한 뼈 손실을 경험하는 것으로 알려져 있는데, 이는 궁극적으로 이미 골다공성인 골격에서 2차적인 골절을 일으킨다. 감소된 뼈 밀도는 척추골 와해, 엉덩이, 아래 팔, 손목, 발목의 골절 뿐아니라 통증의 무능력화를 초래할 수 있다. 그러한 질병에 대한 대안적인 비수술적 치료가 필요하다.
펄스화된 전자기장(pulsed elctromagnetic field, PEMF) 및 전기용량적 커플링(capacitively coupling, CC)은 1979년에 식품의약국에 의해 승인된 이후 뼈 치료에서 치유되지 않는 골절 및 관련된 문제를 치료하는데 광범위하게 사용되어 왔다. 이러한 형태의 치료의 시도에 대한 원래의 근거는 뼈에 대한 물리적 스트레스가 미소한 전기적 전류가 나타나게 한다는 것을 관찰한 것으로, 이는, 기계적인 변형과 함께, 물리적 스트레스를 뼈 형성을 촉진시키는 신호로 변환시키는데 기초가 되는 메카니즘인 것으로 생각된다. PEMF 및 전기용량적 커플링 (전극이 치료대역 에서 피부 상에 위치함)을 사용한 불유합, 비침습 기술의 치료에서 성공적인 직접적 전기장 자극과 함께 역시 효과적인 것으로 밝혀졌다. 펄스화된 전자기장은 고-전도성 세포외 유체에서 작은 유도 전류(페러데이 전류)를 발생시키는 반면, 전기용량적 커플링은 조직 내에서 직접적으로 전류를 생기게 하고; PEMF 및 CC 모두는 이에 의해 내인성 전기적 전류를 모방한다.
원래는 뼈 중의 결정 표면에서 생기는 현상에 기인하는 것으로 생각되는 내인성 전기적 전류는, 고정된 음전하를 갖는 유기 구성요소를 함유하는 뼈의 채널에서 전해질을 함유하는 유체의 이동에 의해 1차적으로 기인하고, 소위 "스트리밍 전위(streaming potentials)"라고 불리우는 현상을 발생시키는 것으로 나타났다. 연골에서의 전기적 현상의 연구는 연골이 기계적으로 압축되는 경우 나타나는 뼈에서 기술된 바와 유사한 기계적-전기적 변환 메카니즘이 연골 기질에서 프로테오글리칸 및 콜라겐에서의 고정된 음전하의 표면에 걸쳐 유체 및 전해질의 이동을 일으킨다는 것을 입증하였다. 이러한 스트리밍 전위는 뼈에서와 유사한 연골에서의 목적에 작용하는 것이 명백하며, 기계적 변형과 함께 기질 성분의 연골세포 합성을 자극할 수 있는 신호 변환에 이르게 한다.
직접적 전류, 전기용량적 커플링, 및 PEMF의 주된 적용은 정형외과에서 불유합 뼈 골절의 치료에 사용되는 것이었다(문헌[Brighton et al., J. Bone Joint Surg. 63: 2-13, 1981 ; Brighton and Pollack, J Bone Joint Surg. 67: 577-585, 1985; Bassett et al., Crit. Rev. Biomed. Eng. 17: 451-529, 1989 ; Bassett et al., JAMA 247: 623-628, 1982] 참조). 임상적 반응은 성인에서의 엉덩이의 무혈 관 괴사 및 어린이의 레그-퍼스(Legg-Perthes's) 질병에서 보고되었다(문헌[Bassett et al., Clin. Orthop. 246: 172-176, 1989; Aaron et al., Clin. Orthop. 249: 209-218, 1989; Harrison et al., J. Pediatr. Orthop. 4: 579-584, 1984] 참조). 또한, PEMF(Mooney, Spine 15: 708-712, 1990) 및 전기용량적 커플링 (Goodwin, Brighton et al., Spine 24: 1349-1356, 1999)이 허리 유합술(lumbar fusions)의 성공율을 현저하게 증가시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 말초 신경 재생의 확대 및 혈관신생의 작용 및 증진이 보고되었다(문헌[Bassett, Bioessays 6: 36-42, 1987] 참조). 스테로이드 주사 및 기타 통상적 조치에 불응성인 지속적인 근육둘레 띠 건염을 앓고 있는 환자는 플라시보 처리된 환자에 비해 현저한 이점을 나타내었다(문헌[Binder et al., Lancet 695-698, 1984] 참조). 마지막으로, 브라이튼(Brighton) 등은 래트에서 적절한 전기용량적 커플링 전기장이 요추에서 척추 골다공증을 예방하고 반전시키는 능력을 모두 나타낸다는 것을 밝혔다(문헌[Brighton et al., J. Orthop. Res. 6: 676-684, 1988; Brighton et al., J. Bone Joint Surg. 71: 228-236, 1989] 참조).
보다 최근에, 이 분야의 연구는 조직 및 세포에 대한 효과 자극에 초점을 맞추었다. 예를 들면, 직접적 전류는 세포막을 통과할 수 없고, 그 제어는 세포외 기질 분화에 의해 달성된다고 추측되었다(문헌[Grodzinsky, Crit. Rev. Biomed. Eng 9: 133-199, 1983] 참조). 직접적 전류와 반대로, PEMF는 세포막을 통과하고, 이들을 자극하거나 세포내 소기관에 직접적으로 영향을 미친다고 보고되었다. 세포외 기질 및 생체내 연골내 골화에 대한 PEMF의 효과에 대한 시험에 의해 증가된 연골 분자의 합성 및 뼈 골소주의 성숙이 밝혀졌다(문헌[Aaron et al., J: Bone Miner. Res. 4: 227-233, 1989] 참조). 보다 최근에, 로리치(Lorich), 브라이튼(Brighton) 등은 문헌[Clin. Orthop. Related Res. 350: 246- 256, 1998]에서 전기용량적으로 커플링된 전기적 신호의 신호 변환은 전압 게이트된 칼슘 채널을 통하며, 세포질 칼슘의 증가를 일으키고 이어서 활성화된 (세포골격(cytoskeletal)) 칼모듈린(calmodulin)의 증가를 일으킨다는 것을 보고하였다.
반응의 메카니즘을 이해하기 위하여 조직 배양을 연구하는 방향의 조사가 많이 이루어졌다. 한 연구에서, 전기장이 연골세포의 DNA로의 [3H]-티미딘의 혼입을 증가시켜 전기적 자극에 의해 발생한 Na+ 및 Ca2+ 플럭스가 DNA 합성을 유발시킨다는 개념을 지지한다는 것이 밝혀졌다(문헌[Rodan et al., Science 199; 690-692, 1978] 참조). 연구는 2차 메신저 cAMP 및 전기적 동요에 기인한 세포골격 재배열에서 변화를 발견하였다(문헌[Ryaby et al., Trans. BRAGS 6: 1986; Jones et al., Trans. BRAGS 6: 51, 1986; Brighton and Townsend J. Orthop. Res. 6: 552-558, 1998] 참조). 다른 연구들은 글리코스아미노-글리칸, 술페이션(sulfation), 히아루론산, 리소자임 활성 및 폴리펩티드 서열에 대한 효과를 밝혔다(문헌[Norton, et al., J. Orthop. Res. 6: 685-689, 1988; Goodman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3928-3932, 1988] 참조).
1996년에 본 발명자들에 의해 환형 2축성 0.17% 기계적 응력이 배양된 MC3T3-E1 골 세포에서 TGF-β1 mRNA의 현저한 증가를 일으킨다는 것이 보고되었다( 문헌[Brighton et al., Biochem, Biophys. Res. Commun. 229: 449-453, 1996] 참조). 1997년에 몇 가지 의미있는 연구가 이어졌다. 한 연구에서는 동일한 환형 2축성 0.17% 기계적 응력이 유사한 골 세포에서 PDGF-A mRNA에서의 현저한 증가를 나타냈다는 것이 보고되었다(문헌[Brighton et al., Biochem, Biophys. Res. Commun. 43: 339-346, 1997] 참조). 또한, 60kHz 전기용량적으로 커플링된 20mV/cm의 전기장이 유사한 골 세포에서 TGF-β1의 현저한 증가를 일으킨다는 것이 보고되었다(문헌[Brighton et al., Biochem, Biophys. Res. Commun. 237: 225-229, 1997] 참조). 그러나, 다른 유전자에 대한 그러한 장의 효과에 대해서는 문헌에 보고된 바 없다.
상기 인용된 특허출원 (발명의 명칭 "Regulation of Genes Via Application of Specific and Selective Electrical and electromagnetic Signals")에는 질병에 걸린 또는 손상된 조직의 목표 유전자를 조절하기 위한 필드장을 생성시키는데 사용하기 위한 특이적이고 선택적인 전기적 및 전자기적 신호를 결정하기 위한 방법이 개시되어 있다. 본 발명은 연골 질병 (관절염), 연골 손상, 연골 결함, 및 종양 전이의 치료를 위한 특이적이고 선택적인 전기적 및 전자기적 신호에 의하여 발생된 필드장의 적용을 통하여 하나의 목표된 유전자 발현, 즉, 기질 금속단백질분해효소 유전자 발현을 조절하는 방법을 기술함으로써 거기에 기술된 기법에 기초한다.
발명의 요약
본 발명은 특이적이고 선택적인 전기적 및(또는) 전자기적 신호에 의하여 발생된 필드장의 적용을 통하여 연골세포에서 기질 금속단백질분해효소 (MMP) 유전자 발현을 조절하는 것에 관한 것이다. 전기장 지속시간, 진폭, 주파수, 및 작업 사이클에 대한 용량-반응 곡선을 수행함으로써, 관절 연골 세포에서 기질 금속단백질분해효소 mRNA를 하향조절하기에 최적 신호가 발견되었다. 최적 신호는 20mV/cm의 진폭, 30분의 지속시간, 100%의 작업 사이클, 60 kHz의 주파수, 및 싸인파 구조를 갖는 전기용량적으로 커플링된 전기장을 발생시켰다. 특히, 본 발명은 그러한 신호에 의해 발생된 필드장의 적용을 통하여 연골 세포 중에서 기질 금속단백질분해효소(MMP) 유전자 발현을 하향조절하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 전기용량적으로 커플링된 전기장, 유도적으로 커플링된 전기장, 전자기장, 또는 조합된 필드장으로 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 및 기타 MMP의 유전자 발현(mRNA에 의해 측정됨)을 특이적이고 선택적으로 하향조절하는 방법이 제공된다. 골관절염, 류마티스 관절염, 연골 손상, 연골 결함 등은 약 30분의 지속시간, 약 10-20 mV/cm의 전기장 진폭, 약 60 kHz의 주파수, 약 100%의 작업 사이클 및 싸인파 구조를 갖는 약 20mV/cm의 전기용량적으로 또는 유도적으로 커플링된 전기장으로 치료된다. 본 발명의 방법에 따라, "특이적이고 선택적인" 신호는 MMP 유전자의 발현을 하향조절하는 진폭, 지속시간, 작업-사이클, 주파수, 및 파형의 소정의 특징을 갖는 신호이다(특이성). 이는 주어진 생물학적 또는 치료적 반응을 달성하기 위하여 MMP 유전자 발현을 하향조절하는 상이한 신호를 선택할 수 있도록 한다(선택성). 본 발명은 또한 MMP 유전자의 발현을 하향조절하는 필드장을 생성시키는 특이적이고 선택적인 신호를 발생시키는 본원에 기술된 방법을 사용하는 장치에 관한 것이다.
관련된 측면에서, 본 발명은 골관절염, 류마티스 관절염, 연골 손상, 및 연골 결함의 치료 방법 및 치료 장치에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 또한 금속단백질분해효소의 세포 생산을 감소시키는 것으로 알려지거나 감소시키는 것으로 의심되는 시작 신호의 지속시간을 방법론적으로 변화시킴으로써 MMP 유전자 발현에 대한 "특이적이고 선택적인" 신호를 결정하기 위한 방법론을 포함한다. 최적 지속시간을 선택한 후, 신호의 진폭은 MMP-1, MMP-3, MMP-13의 유전자 발현에 의해 결정되는 바와 같이 시간의 최적 지속시간에 대해 변화된다. 기타 신호 특성은 일정하게 유지하면서, 작업 사이클, 주파수, 및 파형은 방법론적으로 변화된다. 상기 방법은 금속단백질분해효소의 발현에서 최대 감소를 나타내는 최적 신호가 결정될 때까지 반복된다.
본 발명의 상기 및 기타 측면은 하기의 본 발명의 상세한 설명에서 상세히 설명될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 인터류킨(IL-1β)의 존재하에 관절 연골 연골세포가 다양한 지속시간에 대한 20 mV/cm 전기용량적으로 커플링된 전기장에 노출된 경우의 MMP-1 mRNA 발현의 도식적 표현이다. 나타낸 바와 같이, 최소 MMP-1 발현은 신호가 30 분 동안 적용되는 경우에 발생한다. MMP-1 mRNA의 최대 발현은 전기가 사용되지 않은 경우 인터류킨(IL-1β)의 존재하에 발생한다.
도 2는 인터류킨(IL-1β)의 존재하에 관절 연골 연골세포가 다양한 지속시간에 대한 20 mV/cm 전기용량적으로 커플링된 전기장에 노출된 경우의 MMP-3 mRNA 발현의 도식적 표현이다. 나타낸 바와 같이, 최소 MMP-3 발현은 신호가 30 분 및 6 시간 동안 적용되는 경우에 발생한다. MMP-3 mRNA의 최대 발현은 전기가 사용되지 않은 경우 인터류킨(IL-1β)의 존재하에 발생한다.
도 3은 인터류킨(IL-1β)의 존재하에 관절 연골 연골세포가 다양한 지속시간에 대한 20 mV/cm 전기용량적으로 커플링된 전기장에 노출된 경우의 MMP-13 mRNA 발현의 도식적 표현이다. 나타낸 바와 같이, 최소 MMP-13 발현은 신호가 30 분 및 24 시간 동안 적용되는 경우에 발생한다. MMP-13 mRNA의 최대 발현은 전기가 사용되지 않은 경우 인터류킨(IL-1β)의 존재하에 발생한다.
도 4는 관절 연골세포가 IL-1β의 존재 하에서 상이한 작업 사이클의 20 mV/cm 전기용량적으로 커플링된 전기장에 노출될 경우 MMP-1 mRNA 발현을 그래프로 나타낸 것이다. 지시된 바와 같이, 100% 작업 사이클 신호에서 MMP mRNA의 최소 발현이 일어났다. 전기가 사용되지 않았을 때 IL-1β의 존재 하에서 MMP-1 mRNA의 최대 발현이 일어났다.
도 5는 관절 연골세포가 IL-1β의 존재 하에서 상이한 작업 사이클의 20 mV/cm 전기용량적으로 커플링된 전기장에 노출될 경우 MMP-3 mRNA 발현을 그래프로 나타낸 것이다. 지시된 바와 같이, 100% 및 8.3% 작업 사이클에서 최소 발현이 일어났다. 전기가 사용되지 않았을 때 IL-1β의 존재 하에서 MMP-3 mRNA의 최대 발현이 일어났다.
도 6은 관절 연골세포가 IL-1β의 존재 하에서 상이한 작업 사이클의 20 mV/cm 전기용량적으로 커플링된 전기장에 노출될 경우 MMP-13 mRNA 발현을 그래프로 나타낸 것이다. 지시된 바와 같이, 100% 및 50% 작업 사이클에서 최소 발현이 일어났다. 전기가 사용되지 않았을 때 IL-1β의 존재 하에서 MMP-13 mRNA의 최대 발현이 일어났다.
도 7은 본 발명의 바람직한 실시태양에 따른, 무릎의 골관절염의 치료를 위한 2개의 상이한 장치를 예시하는 도표이다.
본 발명은 도 1-7을 참고하여 아래에 자세히 기술될 것이다. 당업자는 이 도면과 관련하여 여기에 제공된 기재가 예시 목적만을 위한 것이고, 본 발명의 범위를 어느 식으로도 제한하지 않는다는 것을 알 것이다. 본 발명의 범위와 관한 모든 의문은 첨부된 청구범위를 참고하여 해결될 것이다.
본 발명은 일정 유전자의 발현이 특이적 및 선택적 전기 및(또는) 전자기 신호에 의해 발생된 특이적 및 선택적 필드장의 적용에 의해 조절될 수 있다는 발견에 기초한다. 즉, 뼈, 연골 및 기타 조직 세포에서 각 유전자를 조절하는 필드장을 발생시키는 특이적 및 선택적 전기 및(또는) 전자기 신호가 존재하며, 이 특이적 신호가 상기 세포에서 유전자를 특이적으로 및 선택적으로 조절할 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 발견되었다. 특히, 조직 또는 세포의 성장, 유지, 복구, 및 변성 또는 악화를 지배하는 유전자 발현이 특이적 및 선택적 전기 및(또는) 전자기 신호에 의해 발생된 필드장의 적용에 의해 본 발명에 따라 조절되어 유익한 임상 효과를 제공할 수 있다. 이러한 발견은 뼈 골절 및 결함, 골관절염, 골다공증, 암 및 기타 질병을 비롯한 일정 의학 상태를 표적으로 하는 치료 방법의 개발 및 상기 방법을 이용하는 장치의 개발에 유용하다.
특히, 본 발명은 MMP 발현이 상당히 하향조절되어, 연골 질환 과정을 늦추거나 역전시키는데 요구되는 바와 같은 관절 연골에서 MMP의 생성을 감소시킬 수 있다는 것을 설명한다. 본 발명은 여기에 기재된 최적 전기장이 MMP를 상당히 하향조절할 수 있고, 따라서 IL-1β의 존재 하에서도 MMP 합성을 감소시킬 수 있다는 것을 명확하게 보여준다. 당업자는 또한, 여기에 전기용량적 커플링에 대해 기재되나 자기유도적 커플링에서도 동등하게 효과적인 적당한 전기장 및 기타 공지된 필드장 적용 기술이 관절염(골관절염 및 류마티스 관절염), 연골 손상, 연골 결함 및 조직 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 알 것이다.
본원에 사용될 경우, "신호"는 장치에 의해 배출된 기계적 신호, 초음파 신호, 전자기 신호 및 전기 신호를 비롯한 다양한 신호를 언급하는데 사용된다. 본원에 사용된 용어 "필드장"은 이것이 조합 필드장이건, 펄스 전자기장이건, 또는 직접 전류, 전기용량적 커플링 또는 자기유도적 커플링에 의해 발생되었건, 표적 조직 내의 전기장을 가리키는 것으로 이해되어야 한다.
문구 "원격"은 떨어져서 작동하거나, 작동되거나 또는 조절되는 것을 의미하는데 사용된다. "원격" 조절은 떨어져서 유전자의 발현을 조절하는 것을 말한다. "원격으로" 제공한다는 것은 떨어져서 제공하는 것을 말한다. 예를 들면, 원격 공급원으로부터 특이적 및 선택적 신호를 제공하는 것은 조직 또는 세포로부터 떨어져 있는 공급원으로부터, 또는 인체의 밖 또는 외측의 공급원으로부터 신호를 제공하는 것을 말한다.
문구 "특이적 및 선택적" 신호는 표적 유전자 또는 기능적으로 상보적인 표적 유전자를 상향조절하거나 하향조절하는 진폭, 지속 시간, 작업 사이클, 주파수 및 파형의 특징을 미리 결정한 전기장을 생성하는 신호를 의미한다(특이성). 이것은 주어진 생물학적 또는 치료학적 반응을 달성하기 위해, 상이한 "특이적 및 선택적" 신호를 선택하여 다양한 유전자의 발현을 상향조절하거나 하향조절할 수 있도록 한다(선택성).
용어 "조절하는"은 유전자 발현을 조절하는 것을 의미한다. "조절하는"이란 상향조절 및 하향조절을 포함하는 것으로 이해된다. 상향조절은 유전자의 발현을 증가시키는 것을 의미하고, 하향조절은 유전자의 발현을 억제하거나 방지하는 것을 의미한다.
"기능적으로 상보적인"이란 주어진 세포 또는 조직에서 그의 발현이 상보적이거나 상승적인 2개 이상의 유전자를 말한다.
"조직"은 환자의 구조적 물질 중 하나를 형성하는 세포외 물질과 함께 세포 집단을 말한다. 본원에서 사용될 경우, 용어 "조직"은 뼈 또는 연골 조직뿐만 아니라 근육 및 기관 조직, 종양 조직을 포함하는 것이다. 또한, 본원에서 사용된 용어 "조직"은 개별 세포를 가리킬 수 있다.
"환자"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간을 말한다.
본 발명은 일정 조직, 세포 또는 질병을 표적화하는 치료 방법 및 장치를 제공한다. 특히, 손상되거나 발병된 조직 또는 세포에서 복구 과정과 연관된 유전자 발현은 표적 조직 또는 세포에서 조절될 유전자에 대해 특이적 및 선택적인 전기 신호에 의해 생성된 필드장의 적용에 의해 조절될 수 있다. 유전자 발현은 각 유전자 또는 각 상보적 유전자 세트에 대한 특이적 및 선택적인 신호의 적용에 의해 상향조절 또는 하향조절되어 유익한 임상 효과를 제공할 수 있다. 예를 들면, 특정의 특이적 및 선택적인 신호는 바람직한 일정 유전자 발현을 상향조절하는 전기장을 생성할 수 있는 반면, 동일하거나 또 다른 특정의 특이적 및 선택적인 신호는 바람직하지 못한 일정 유전자 발현을 하향조절하는 전기장을 생성할 수 있다. 당업자는 발병되거나 손상된 일정 조직이, 조직의 성장, 유지, 복구, 및 변성 또는 악화를 지배하는 유전자를 조절하는 것에 의한 치료에 표적화될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 방법 및 장치는 발병되거나 손상된 일정 표적 조직과 연관된 유전자 발현에 특이적 및 선택적인 필드장을 생성하는 신호를 확인하는 것에 기초한다. 예를 들면, 다양한 형태의 전기(예, 전기용량적 커플링, 자기유도적 커플링, 조합 필드장)는 각 선택된 유전자에 있어서 적용된 필드장의 주파수, 진폭, 파형 또는 작업 사이클을 변화시킴으로써 환자 신체의 표적된 조직 또는 세포에서 유전자 발현을 특이적 및 선택적으로 조절할 수 있다. 전기에 노출된 시간의 지속은, 전기가 환자 신체의 표적된 조직 또는 세포에서 유전자 발현을 특이적 및 선택적으로 조절할 수 있는 능력에 영향을 미칠 수 있다. 특이적 및 선택적 신호는, 유전자 발현에 목적하는 효과를 제공하는 주파수, 진폭, 파형, 작업 사이클, 및 지속 시간의 적당한 조합이 발견될 때까지 각 유전자에 적용하기 위한 전기장을 조직적으로 생성할 수 있다.
일정 유전자 발현에 대한 전기장의 특이성 및 선택성이 여러 인자에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 발병되거나 손상된 다양한 조직 또는 질병 상태가 치료를 위해 표적화될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 특히, 적당한 주파수, 진폭, 파형 및(또는) 작업 사이클을 갖는 전기장이 일정 유전자의 발현에 특이적 및 선택적일 수 있고, 따라서 표적화된 치료를 제공할 수 있다. 일시적 인자(예, 전기장에 노출된 지속 시간)도 특정 유전자 발현에 대한 전기장의 특이성 및 선택성에 영향을 미칠 수 있다. 전기장을 특정 지속 기간 동안 적용함으로써 유전자 발현의 조절이 더 효과적일(또는 가능하게 될) 수 있다. 따라서, 당업자는 본 발명이 발병되거나 손상된 다양한 조직 또는 질병을 표적화하는 치료를 제공하기 위해, 일정 유전자 발현에 특이적 및 선택적인 전기장이 발견될 때까지 전기장의 주파수, 진폭, 파형, 작업 사이클 및(또는) 지속 시간을 변화시키는 것을 제공한다는 것을 이해할 것이다.
따라서, 본 발명은, 적당한 지속 기간 동안 적당한 주파수, 진폭, 파형 및(또는) 작업 사이클을 갖는 특이적 및 선택적 신호에 의해 생성된 필드장의 적용에 의해, 발병되거나 손상된 특정 조직과 연관된 일정 유전자의 발현을 조절하는 것이 가능하므로 표적화된 치료를 제공할 수 있다. 따라서, 발병되거나 손상된 조직 또는 질병 상태를 치료에 표적화하기 위해, 전기장을 생성하는 신호의 특이성 및 선택성이 일정 유전자의 발현을 조절하도록 영향을 받을 수 있다. 특히, 본 발명은 골관절염, 류마티스 관절염, 연골 손상, 및 연골 결함 및 변형의 표적화된 치료를 제공한다.
또한, 본 발명은 기질 금속단백질분해효소 유전자 발현의 하향조절에 특이적이고 선택적인 하나 이상의 신호의 공급원을 포함하는 장치를 제공한다. 본 발명의 장치는 전기용량적 커플링의 경우 특이적 및 선택적 신호에 의해 생성된 필드장을 적용하도록 된 하나 이상의 전극에 의해, 및 자기유도적 커플링의 사용시에는 특이적 및 선택적 신호에 의해 생성된 필드장을 적용하도록 된 연장된 코일(들)에 의해, 연골 세포에 적용하기 위한 상기 신호를 생성하는 것을 제공한다. 본원에 기재된 최적 필드장은 적당한 표면 전극에 의해 쌍으로 또는 스트립으로, 의류, 바지 멜빵, 무릎싸개 또는 깁스에 포함될 수 있고, 피부에 적용되는 임의의 관절에 적용될 수 있고, 전기용량적 커플링, 자기유도적 커플링 (전자기장) 또는 조합 필드장에 의해 전달될 수 있다.
본 발명의 장치는 특이적 및 선택적 신호에 의해 생성된 필드장을 환자의 발병되거나 손상된 조직 및(또는) 피부에 직접 적용할 수 있다. 또한, 전기용량적으로 커플링된 장치가 검체의 피부에 닿아야 한다는 것이 이해될 수 있기는 하지만, 본 발명의 장치는 특이적 및 선택적 필드장의 원격 적용(예, 발병되거나 손상된 조직에서 떨어져서 필드장을 적용)을 제공할 수 있다. 본 발명의 장치는, 전기용량적 커플링의 경우, 발병되거나 손상된 조직의 근처에서 환자의 신체에 전극을 부착시키는 수단을 포함할 수 있다. 예를 들면, 도 7에 나타낸 바와 같이, 자가-부착성 전도 전극이 골관절염에 시달리는 무릎 관절의 양 측에서 환자의 피부에 부착될 수 있다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 장치(10)는 장치(10)를 환자의 신체에 부착시키는 자가-부착성 전극(12)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 장치(10)는, 파워 유닛(14)이 환자의 종아리, 허벅다리 또는 허리 주위에 장착되는 VELCRO® 스트랩(도시되지 않음)에 부착될 수 있도록 반대 측에 VELCRO® 패치 16을 갖는 파워 유닛(14)에 부착된 전극(12)을 포함할 수 있다. 자기유도적 커플링의 경우, 본 발명의 장치(10)는 전극(12) 대신 파워 유닛(14)에 부착된 코일(도시되지 않음)을 포함할 수 있다.
본 발명의 장치(10)는 다양한 방법으로 이용될 수 있다. 장치(10)는 휴대할 수 있거나, 환자의 신체에 영구적 또는 일시적으로 부착될 수 있다. 본 발명의 장치(10)는 바람직하게는 비침투성이다. 예를 들면, 본 발명의 장치(10)는 환자의 피부와 접촉하도록 된 전극의 적용에 의해 환자의 피부에 적용되어, 예정된 특이적 및 선택된 신호에 의해 생성된 필드장을 적용할 수 있다. 상기 신호는 시간에 따라 변화하는 전류가 흐르는 코일에 의해 적용되어, 조직을 침투하는 특이적 및 선택된 전자기장을 생성할 수도 있다. 본 발명의 장치(10)는 환자의 피부 아래에 이식하는 것을 비롯하여, 환자에 이식될 수도 있다.
하기 실시예는 본 발명의 방법이 연골 성장 및 복구를 제공할 수 있다는 것을 예시할 것이다. 연골 성장 및 복구는 연골 세포에서 기질 금속단백질분해효소 발현을 하향조절하여 골관절염 환자에서 관절 연골 파괴 또는 악화를 예방하거나 억제하는 특이적 및 선택된 신호에 의해 자극될 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 연골을 파괴하는 기질 금속단백질분해효소의 유전자의 하향조절을 제공할 수 있다. 관절 연골, 유리 연골 및 성장판 연골을 비롯한 다양한 연골 세포가 본 발명의 방법에 의해 표적화될 수 있다.
당업자는 다양한 다른 연골 질병 및 손상이 본 발명의 방법에 의해 치료를 위해 표적화될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
나아가, 당업자는 본 발명의 장치가, 한 쌍 또는 복수 쌍의 전극에 적용하기 위한 프로그램되고 개폐가능한 복수의 특이적 및 선택적 신호를 갖는 전기용량적으로 커플링된 파워 유닛, 또는 개폐가능한 복수의 특이적 및 선택적 신호를 갖는 파워 유닛에 부착된 전자기 코일, 및 특이적 및 선택적 신호를 생성하는 전력 공급을 갖는 초음파 자극기를 비롯한 다양한 형태로 제공될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, 장치 선호는 환자 용인 및 환자 순응도에 기초한다. 현재 당업계에서 이용가능한 가장 작고 가장 휴대가능한 유닛은 전기용량적 커플링 유닛이나, 극히 민감한 피부를 가진 환자는 자기유도적 커플링을 선호할 수 있다. 반면, 초음파 유닛은 가장 많은 환자의 협조를 요구하나, 어떤 환자에서는 사용이 바람직할 수 있다.
본 발명은, 예시를 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 설명된다.
재료 및 방법
태아 또는 성인 소 관절 연골로부터 연골세포 배양물을 제조하였다. 연골세포(5 x 105 세포/cm2)를 특별히 변형된 쿠퍼(Cooper) 접시 상에 플레이팅하였다. 세포를 7일까지 성장시키고, 실험 조건을 시작하기 직전에 매질을 바꿨다. 본 시험 동안 실험 세포 배양물을 출력이 44.81V 피크 대 피크인 전기용량적으로 커플링된 60 kHz 싸인 파 신호 전기장을 받게 하였다. 이것은 300 μA/cm2의 전류 밀도로 접시의 배양 매질에서 20 mV/cm의 계산된 필드장 강도를 생성하였다. 대조 세포 배양 접시는 함수 발생기에 연결되지 않은 것을 제외하고 자극된 접시의 것과 동일하였다.
제조자의 교시에 따라서 트리졸(TRIzol)을 사용하여 토탈(total) RNA를 단리하고, 수퍼스크립트(SuperScript) II 역전사 효소를 사용하여 역전사(RT)를 수행하였다. RT-PCR 기술에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프리머는 발표된 cDNA 서열로부터 선택되거나, 프리머 발현 소프트웨어 프로그램을 사용하여 설계하였다. RT-PCR 생성물의 정량적 실시간 분석을 ABI 프리즘(Prism)® 7000 서열 검출 시스템(Sequence Detection System)을 사용하여 수행하였다.
기질 금속단백질분해효소(MMP) 유전자 조절(다른 것들 중에서 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13에 대한 유전자를 비롯함)을 원하는 바와 같이 하향조절하기 위한 최적의 신호는 다음과 같이 체계적으로 찾았다. MMP의 세포적 생성을 감소하는 것으로 알려진 (또는 심지어 단지 감소한다고 추측되는) 전기 신호를 MMP의 유전자 발현(mRNA)를 위한 필드장을 발생시키는 특이 신호를 결정하기 위한 출발 신호로 삼았 다. 처음에, 모든 다른 신호 특성(진폭, 작업 사이클, 주파수, 및 파형)을 일정하게 하면서 신호의 지속시간을 가변함으로써 용량-반응 곡선을 수행하였다 (도 1-3). 이는 MMP의 유전자 발현을 위한 출발 신호의 최적 지속시간을 결정한다. 다음에 제2 용량-반응 곡선을, 이번에는 진폭 및 다른 신호 특성을 일정하게 유지하면서 작업 사이클을 100%(일정)에서 8.3% 이하로 변화시킴으로써 수행하였다 (도 4-6). 세번째론 진폭을 변화하고, 네번째론 주파수를 변화하고, 다섯번째론 파형을 변화하면서 용량-반응을 반복하였고, 각 시도에서 다른 신호 특성을 일정하게 유지하였다. 이 방법에 의하여, 다양한 MMP의 유전자 발현에서의 가장 큰 감소를 산출하는 것에 대한 최적의 신호를 결정하였다.
단백질 발현을 당업계에 알려진 방법, 예를 들어 실시간 정량적 RT-PCR, 노던 분석, 면역검정법, 직접 생화학 분석 등에 의하여 결정할 수 있다.
관절 연골세포에 의한 금속단백질분해효소의 생성
관절 연골세포를 60 kHz에서 20 mV/cm의 전기용량적으로 커플링된 전기장에 노출시켰다. 그 결과는 도 1-6에 도시하였다.
도 1은 연골 세포를 인터루킨 (IL-10)의 존재 하에서 다양한 지속시간 동안 20 mV/cm의 전기용량적으로 커플링된 전기장에 노출하였을 때 MMP-1 mRNA 발현을 그래프적으로 나타낸 것이다. 도시된 바와 같이, MMP-1 발현은 신호 지속시간이 30분일 때 일어났다. MMP-1 mRNA의 최대 발현은 전기가 사용되지 않고 IL-1β의 존재 하에서 일어났다.
도 2는 관절 연골 세포를 IL-1β의 존재 하에서 다양한 지속시간 동안에 20 mV/cm 전기용량적으로 커플링된 전기장에 노출하였을 때 MMP-3 mRNA 발현을 그래프적으로 나타낸 것이다. 도시된 바와 같이, 신호 지속시간이 30분 및 6시간일 때 최소의 MMP-3 생성이 일어났다. MMP-3 mRNA 의 최대 발현은 전기를 사용하지 않을 때 일어났다.
도 3은 IL-1β의 존재 하에서 관절 연골세포를 다양한 지속시간 동안에 20 mV/cm 전기용량적으로 커플링된 전기장을 노출하였을 때 MP-13 mRNA 발현을 그래프적으로 도시한 것이다. 도시한 바와 같이, MMP-13 최소 발현은 신호 지속시간이 30분 및 24시간에서 일어났다. MMP mRNA의 최대 발현은 전기를 사용하지 않을 때 IL-1β의 존재 하에서 일어났다.
도 4는 1L-1β의 존재 하에서 관절 연골 세포를 상이한 작업 사이클, 20 mV/cm 전기용량적으로 커플링된 전기장에 노출하였을 때 MMP mRNA 발현을 그래프적으로 도시한 것이다. 도시한 바와 같이, 100% 작업 사이클 신호에서 MMP-1 mRNA의 최소 발현이 일어났다. MMP-1 mRNA의 최대 발현은 전기가 사용되지 않고 IL-1β의 존재 하에서 일어났다.
도 5는 1L-1β의 존재 하에서 관절 연골 세포를 상이한 작업 사이클의 20 mV/cm 전기용량적으로 커플링된 전기장에 노출하였을 때 MMP-3 mRNA 발현을 그래프적으로 도시한 것이다. 도시한 바와 같이, 100% 및 8.3%의 작업 사이클 신호에서 최소 발현이 일어났다. MMP-3 mRNA의 최대 발현은 전기가 사용되지 않을 때 IL-1β의 존재 하에서 일어났다.
도 6은 1L-1β의 존재 하에서 관절 연골 세포를 상이한 작업 사이클, 20 mV/cm 전기용량적으로 커플링된 전기장에 노출하였을 때 MMP-13 mRNA 발현을 그래프적으로 도시한 것이다. 도시한 바와 같이, 100% 및 50 %의 작업 사이클 신호에서 최소 발현이 일어났다. MMP-13 mRNA의 최대 발현은 전기가 사용되지 않을 때 IL-1β의 존재 하에서 일어났다.
앞서 언급한 바와 같이, 도 7은 무릎에 골관절염이 있는 환자를 치료하기 위하여 사용되는 본원 발명에 따른 장치 (10)을 도시한다. 도시된 바와 같이, 두개의 원형, 부드러운 전도성, 자가-부착 전극 (12)가 관절 라인의 수준에서 무릎의 양쪽의 피부 상에 위치해 있다. 전극 (12)는 뒷면에 벨크로(VELCRO)® 패치(16)이 있는 전력 유닛 (14)과 연결되며, 전력 유닛 (14)가 종아리, 넙적다리 또는 허리 둘레에 맞춰진 벨크로® 스트랩(도시되지 않음)에 부착될 수 있다. 전극 (12)은 환자가 매일 저녁에 자기 전에 또는 다른 편한 시간에 그 피부 지점에 위치할 수 있다. 물론, 다른 적합한 유형의 전극 (12) 또는 코일(자기유도 커플링에 사용)도 사용될 수 있다.
전력 유닛 (14)는 바람직하게 작고 (예를 들어 6-8 온스) 표준 9볼트 전지에 의하여 충전되어 피크 대 피크 전압 5볼트, 6-10mA, 20mV/cm, 60kHz 싸인파 신호를 상기 피부에 위치하고 있는 전극 (12)에 보낸다. 적당한 작업 사이클 (100%)로 매일 약 30분 이 신호를 제공하면, 기질 금속단백질분해효소를 코딩하는 유전자를 현저히 하향조절하는 것으로 보여진다. 이 처리는 추가의 관절 연골의 퇴화를 방지 또는 최소화할 뿐만 아니라 이미 손상되거나 나빠진 관절 연골을 치료할 것이다. 이 치료는 또한 종양의 전이를 방지 또는 최소화 하여야 한다.
상기 기술된 예들은 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13 유전자의 발현이 현저히 하향조절되어 관절 연골을 파괴하는 효소의 생성을 감소시켜 관절염 (골관절염 및 류마티스 관절염 모두), 연골 손상, 및 연골 결함을 치료할 수 있다.
타입 II 콜라겐과 함께 프로테오글리칸은 금속단백질분해효소에 의한 관절염의 진행에서 일찍 손상, 퇴화 및(또는) 파괴되는 관절 연골의 주요한 유기 구성원이다. 본원 발명은 상기 실시예에서 기술된 최적의 전기장이 MMP-1,MMP-3 및 MMP-13 mRNA을 매우 현저히 하향조절하고 따라서 심지어는 IL-1β의 존재 하에서 연골 기질의 파괴를 막아줌을 명백히 보여주고 있다. 당업자는 전기용량적 커플링으로 본원에 기술한 적합한 전기장에 대하여, 자기유도적 커플링 및 이와 대등한 또는 거의 대등한 전기장 특성을 생성하는 모든 전자기 시스템에도 동등하게 유효함을 이해할 것이다. 또한 당업자는 더 고유한 신호 특성이 더 많은 데이터 점들(예를 들어 30± 3분 동안에 100±3 % 작업 사이클)로 실험을 더 함으로써 발견될 수 있음도 잘 이해할 것이다. 그러나, 신호 특성 각각의 이러한 상대적으로 중요하지 않은 변화는 당업자에게는 본원의 교시를 받은 수준 이내의 범위임으로 여겨질 것이다.
또한, 당업자는 본원 발명의 수많은 다른 변화도 본원 발명의 가능한 범위 내임을 인식할 것이다. 예를 들어, 본원에서 기술된 최적 필드장은 두개 이상의 적합한 표면 전극을 통하여, 쌍으로 또는 스트립으로, 의류, 바지 멜빵, 무릎싸개, 또는 캐스트(깁스)와 통합하여 임의의 관절에 가해지고 자기유도적 커플링 수단에 의하여 전달될 수 있다. 따라서, 본원 발명의 범위는 상기 기술된 바람직한 양태에만 한정되고자 함이 아니며, 이하 특허청구의 범위에 의해서만 한정될 것이다.

Claims (28)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 약 60 kHz의 주파수를 갖는 하나 이상의 특이적이고 선택적인 신호를 발생시키고, 상기 하나 이상의 특이적이고 선택적인 신호의 적용 지속 시간 및(또는) 작업 사이클을 조절 및 변화시켜, 그로부터 발생되어 표적 조직에 가해지는 특이적이고 선택적인 필드장을 변화시키는 신호원, 및
    상기 신호원에 연결되어 상기 하나 이상의 특이적이고 선택적인 신호를 받고, 표적 조직에 대해 작동하도록 배치되며, 상기 하나 이상의 특이적이고 선택적인 신호를 받으면, mRNA로 측정했을 때 표적 조직 내에서 금속단백질분해효소의 유전자 발현을 하향조절하는데 특이적이고 선택적인, 약 10-20 mV/cm의 강도를 갖는 필드장을 표적 조직 내에서 발생시키는 필드장 발생 장치
    를 포함하는, 골관절염, 류마티스 관절염, 연골 손상 및(또는) 연골 결함의 치료용 장치.
  17. 제16항에 있어서, 상기 신호원을 구동하는 휴대용 전력 유닛을 추가로 포함하는 장치.
  18. 제16항에 있어서, 표적 조직 부근의 환자의 신체에 상기 필드장 발생 장치를 부착하는 수단을 추가로 포함하는 장치.
  19. 제16항에 있어서, 상기 신호원을 환자의 신체에 부착하는 수단을 추가로 포함하는 장치.
  20. 제16항에 있어서, 하나 이상의 특이적이고 선택적인 신호를 필드장 발생 장치에 가하여 발생된 필드장을, 전기용량적 커플링 또는 자기유도적 커플링으로 표적 조직에 가하는 수단을 추가로 포함하는 장치.
  21. 제20항에 있어서, 상기 신호원에 의해 발생된 특이적이고 선택적인 신호가 싸인파 구조이고 약 100%의 작업 사이클을 갖는 장치.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 제16항에 있어서, 상기 특이적이고 선택적인 신호가 그로부터 발생된 특이적이고 선택적인 필드장에 노출시, 표적 조직 내에서 mRNA로 측정했을 때 표적 조직 내에서의 금속단백질분해효소의 유전자 발현을 실질적으로 감소시키는 신호 특성을 가질 때까지, 상기 신호원이 상기 특이적이고 선택적인 신호의 진폭, 지속시간, 작업 사이클, 주파수 및 파형을 선택적으로 변화시키는 것인 장치.
  26. 제16항에 있어서, 매 24시간 마다 약 30분의 지속시간 동안 관절 연골 세포에 특이적이고 선택적인 전기장을 가하는 장치.
  27. 제16항에 있어서, 상기 신호원이 상기 필드장 발생 장치로부터 떨어져 있는 장치.
  28. 제16항에 있어서, 상기 필드장 발생 장치가 전극 또는 하나 이상의 코일을 포함하는 장치.
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