KR100854207B1

KR100854207B1 - 아그마틴의 망막 신경절 세포 보호 용도

Info

Publication number: KR100854207B1
Application number: KR1020070033367A
Authority: KR
Inventors: 성공제; 김찬윤; 이종은; 홍사민
Original assignee: 성공제; 김찬윤; 이종은; 홍사민
Priority date: 2007-04-04
Filing date: 2007-04-04
Publication date: 2008-08-26
Also published as: WO2008123684A1; US20100130783A1; US8084502B2

Abstract

본 발명은 아그마틴(agmatine) 또는 이의 약제학적 허용 염의 사용 방법 및 이를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법 및 약제 조성물은 망막 신경절 세포(Retinal Ganglion Cell, RGC)의 아폽토시스, 특히 저산소증 또는 종양괴사인자-알파(TNF-α)에 의해 유도된 아폽토시스와 관련된 안질환, 바람직하게는 녹내장, 망막병증, 또는 시신경병증을 치료 또는 예방한다.

아그마틴, 망막 신경절 세포, 아폽토시스, 녹내장, 망막병증, 시신경병증

Description

아그마틴의 망막 신경절 세포 보호 용도{USE OF AGMATINE FOR PROTECTION OF RETINAL GANGLION CELLS}

도 1은 12시간(A), 24시간(B) 및 48시간(C) 동안의 저산소압에 의해 손상되는 형질전환 망막 신경절 세포(RGC-5)에 대한 아그마틴 및 뇌-유도 향 신경인자(BDNF)의 신경보호 효과를 유산염탈수소효소(LDH) 분비를 통하여 설명한 것이다. 결과는 32회 측정의 평균 ± 표준편차로 나타내었다(*P<0.001).

도 2는 아그마틴 및 BDNF의 존재 하에 배양될 때 저산소압에 의해 유도되는 망막 신경절 세포의 사멸이 감소된다는 사실을 RGC-5 배양물을 이용하여 관찰한 것이다. RGC-5를 단독(B) 또는 아그마틴의 존재(100 μM)(C) 또는 BDNF의 존재(10 ng/mL)(D) 하에서 48시간 동안 저산소압에 노출시켰다. 대조군인 정상 산소압 배양은 (A)에 나타내었다. 배양물을 훽스트(Hoechst) 33342 및 프로피디움 아이오다이드로 염색하였다. 배율은 400배이다.

도 3은 RGC-5의 저산소압에 의해 유도되는 아폽토시스에 대한 아그마틴 및 BDNF의 보호 효과를 나타내는 유세포 분석 결과를 도시한다. RGC-5를 단독(B) 또는 아그마틴의 존재(100 μM)(C) 또는 BDNF의 존재(10 ng/mL)(D) 하에서 12시간 동안 저산소압에 노출시켰다. 대조군인 정상 산소압 배양은 (A)에 나타내었다. 배양물을 아넥신 V-FITC 및 프로피디움 아이오다이드로 염색하였다. 아넥신에 높은 반응성을 나타내고 프로피디움 아이오다이드에 낮은 반응성을 나타내는 세포(우측 하부 영역)가 초기 아폽토시스성 세포이다.

도 4는 RGC-5의 저산소압-유도 아폽토시스에 대한 아그마틴 및 BDNF 보호 효과의 유세포 분석 결과를 도시한다. RGC-5를 단독(B) 또는 아그마틴의 존재(100 μM)(C) 또는 BDNF의 존재(10 ng/mL)(D) 하에서 24시간 동안 저산소압에 노출시켰다. 대조군인 정상 산소압 배양은 (A)에 나타내었다. 배양액을 아넥신 V-FITC 및 프로피디움 아이오다이드로 염색하였다. 아넥신에 높은 반응성을 나타내고 프로피디움 아이오다이드에 낮은 반응성을 나타내는 세포(우측 하부 영역)가 초기 아폽토시스성 세포이다.

도 5는 저산소압에 의해 유도된 RGC-5 내의 캐스페이즈-3 활성에 대한 아그마틴 보호효과의 비색 분석 결과를 도시한다. RGC-5를 아그마틴(100 μM) 또는 캐스페이즈-3의 억제제인 Z-VAD-FMK(50 μM)의 존재 또는 부재 하에서 24시간 동안 저산소압에 노출시켰다. 캐스페이즈-3의 특이적 활성은 캐스페이즈-3 기질(Ac-DEVD-pNA)의 절단에 의해 측정되었다.

도 6은 RGC-5 내의 미토겐-활성 단백질 키나제(MAPK)의 활성에 대한 아그마틴 및 BDNF의 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 분석 결과를 도시한다. 웨스턴 면역 블럿은 전체 MAPK 및 활성화된 형태인 인산-MAPK(JNK 및 인산-JNK(A), ERK 및 인산-ERK(B), p38 및 인산-p38(C)) 및 β-액틴(D)에 대한 항체들로 표지 되었다.

도 7은 RGC-5 내의 핵 인자-카파 B(NF-κB)에 대한 아그마틴 및 BDNF의 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 분석 결과를 도시한다. 웨스턴 면역 블럿은 핵(A) 및 세 포질(B) 단백질로부터 전체 NF-κB 및 활성화된 형태인 인산-NF-κB에 대한 항체들로 표지 되었다. 히스톤 3(A) 및 β-액틴(B)이 내부 대조군으로 사용되었다.

도 8은 24시간(A) 및 48시간(B) 동안 TNF-α에 노출되어 유도되는 RGC-5의 세포사멸에 대한 아그마틴 및 BDNF의 신경보호 효과를 LDH 분비를 통하여 설명한 것이다. 결과는 32회 측정의 평균 ± 표준편차로 나타내었다(*P<0.001).

도 9는 아그마틴의 존재 하에 배양될 때 RGC-5에서 TNF-α에 의해 유도되는 망막 신경절 세포의 사멸이 감소된다는 사실을 RGC-5 배양물을 이용하여 관찰한 것이다. RGC-5를 단독(C) 또는 아그마틴의 존재(100 μM)(D) 하에서 48시간 동안 50 ng/mL TNF-α에 노출시켰다. 대조군 배양은 (A)에 나타내었고 100 μM의 아그마틴이 첨가된 배양은 (B)에 나타내었다. 배양액을 훽스트 33342 및 프로피디움 아이오다이드로 염색하였다. 배율은 400배이다.

도 10은 TNF-α에 의해 유도된 RGC-5의 아폽토시스에 대한 아그마틴의 보호 효과를 나타내는 유세포 분석 결과를 도시한다. RGC-5를 아그마틴의 부재(C) 또는 아그마틴의 존재(100 μM)(D) 하에서 50 ng/mL TNF-α에 12시간 동안 노출시켰다. 대조군 배양은 (A)에 나타내었고 100 μM 아그마틴이 첨가된 배양은 (B)에 나타내었다. 배양액을 아넥신 V-FITC 및 프로피디움 아이오다이드로 염색하였다. 아넥신에 높은 반응성을 나타내고 프로피디움 아이오다이드에 낮은 반응성을 나타내는 세포(우측 하부 영역)가 초기 아폽토시스성 세포이다.

도 11은 TNF-α에 의해 유도된 RGC-5의 아폽토시스에 대한 아그마틴의 보호 효과를 나타내는 유세포 분석 결과를 도시한다. RGC-5를 단독(C) 또는 아그마틴의 존재(100 μM)(D) 하에서 50 ng/mL TNF-α에 24시간 동안 노출시켰다. 대조군 배양은 (A)에 나타내었고 100μM 아그마틴이 첨가된 배양은 (B)에 나타내었다. 배양액을 아넥신 V-FITC 및 프로피디움 아이오다이드로 염색하였다. 아넥신에 높은 반응성을 나타내고 프로피디움 아이오다이드에 낮은 반응성을 나타내는 세포(우측 하부 영역)가 초기 아폽토시스성 세포이다.

본 발명은 아그마틴(agmatine) 또는 이의 약제학적 허용 염의 사용 방법 및 이를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법 및 약제 조성물은 망막 신경절 세포(Retinal Ganglion Cell, RGC)의 아폽토시스, 특히 저산소증 또는 종양 괴사인자-알파(TNF-α)에 의해 유도된 아폽토시스를 차단한다. 본 발명에 따른 방법 및 약제 조성물은 안질환, 바람직하게는 녹내장, 망막병증, 또는 시신경병증을 치료 또는 예방한다.

녹내장(glaucoma)은 회복될 수 없는 실명을 초래하는 두 번째 주요한 원인으로, 전세계적으로 보았을 때 녹내장으로 인해 실명한 환자의 수는 5백만 명이며 이는 전체 실명 원인의 12.3%에 달한다(Foster and Resnikoff, 2005; Resnikoff et al., 2002). 녹내장은 단일 질환이라기 보다는 다양한 임상소견과 병리조직학적 소견을 보이는 여러 가지 양상으로 이루어진 질환 군으로, 특징적인 시신경유두(optic disc)의 변화와 망막 신경절 세포의 손상, 그리고 이에 따른 시야결손을 보이는 양상들의 총칭이라고 할 수 있다. 녹내장 이외에도 망막 신경절 세포의 손상을 일으키는 다양한 질병들이 존재하지만, 망막 신경절 세포의 선택적이고 진행적인 사멸은 녹내장의 고유한 특성이다(Osborne et al., 1999; Kaushik et al., 2003; Kuehn et al., 2005). 따라서, 녹내장 치료의 주요 목적은 망막 신경절 세포의 사멸을 방지하는 것이다.

안압의 상승은 녹내장의 발병과 관련이 있는 위험요인들 중에서 가장 확실하게 밝혀진 위험요인으로, 적절한 안압의 하강이 녹내장성 시야결손의 진행을 늦출 수 있다는 것은 잘 알려진 사실이다(Chauhan and Drance, 1992; Dielemans et al., 1994; Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group, 1998a, 1998b; Heijl et al., 2002; Maier et al., 2005). 이러한 사실을 바탕으로 지난 수십 년간, 녹내장 연구는 증가된 안압을 낮추기 위한 방법을 찾는 것에 집중되었다. 그러나 안압이 적절한 수준으로 떨어진 후에도 시야손상이 계속 진행하는 환자들이 있고, 정상 범위의 안압을 유지하면서도 시야손상이 진행되는 녹내장 환자들이 있다(Werner and Drance, 1977). 이러한 사실들은 녹내장의 발생 및 진행에 안압 상승 이외의 기전이 작용한다는 것을 의미한다. 이리하여 녹내장의 가장 주요한 병태생리학적 특징인 망막신경절세포층의 선택적인 아폽토시스를 일으키는 다른 기전을 찾고자 하는 연구들이 이루어졌고, 안관류압(ocular perfusion pressure)의 자기 조절 능력(autoregulation) 소실과 이로 인한 저산소증, 허혈(ischemia), 허혈-재관류(ischemic-reperfusion) 등의 혈액학적 요소들이 녹내장성 손상과 관련이 있음을 알게 되었다(Chung et al., 1999; Cioffi and Wang, 1999; Flammer, 1994; Flammer et al., 2002; Luo et al., 2001). 최근에는 망막신경절세포의 아폽토시스를 방지하기 위한 신경보호 효과에 연구의 초점이 모아지고 있다(Garcia-Valenzuela et al., 1995; Gross et al., 1999; Quigley et al., 1995;　Kerrigan et al., 1997; Okisaka et al., 1997; Kuehn et al., 2005).

TNF-α는 중추신경계의 별아교세포 및 미세아교세포로부터 합성되어 분비되는 염증성 사이토카인의 일종으로 다발성경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병을 비롯한 여러 퇴행성 신경질환에서의 세포독성과 연관되어 있음이 잘 알려져 있다(Moreau et al., 1996; Tarkowski et al., 2003; Sawada et al., 2006). 이러한 TNF-α의 세포독성은 TNF 수용체-1(TNF-R1)을 통한 세포의 아폽토시스 유발에 의한 것이다(Hsu et al., 1995). 망막 조직에서도 허혈에 의한 망막 또는 시신경의 손상에 TNF-α가 관여되어 있음이 보고되었다(Fontaine et al., 2002; Gardiner et al., 2005; Koizumi et al., 2003; Yoshida et al., 2004). 이는 허혈성 망막병증 및 허혈성 시신경병증의 기전에 의한 병적 손상에 TNF-α에 의한 망막세포 및 신경세포의 사멸이 관여되어 있음을 의미한다. 또한 시신경 절단(axotomy) 또는 짓누름(crushing) 손상에 의한 시신경 손상에 의해 유도되는 TNF-α가 망막 신경절 세포의 사멸을 일으킨다는 사실은 외상성 시신경병증에 의한 시신경 및 망막의 손상에도 TNF-α가 관여되어 있다는 것을 의미한다(Diem et al., 2001; Tezel et al., 2004). 이외에도 AIDS 관련 시신경병증에도 TNF-α가 연관되어 있음이 알려져 있다(Lin et al., 1997).

특히 안과의 퇴행성 신경질환이라 불리는 녹내장 환자에서는 TNF-α와 그 수 용체인 TNF-R1의 발현이 증가되어 있음이 보고되었다. 녹내장 환자에서 TNF-α는 신경아교세포에서 발현이 증가되어 있고 TNF-R1은 망막 신경절 세포에서 발현이 증가되어 있다(Tezel et al., 2001). 녹내장성 시신경유두에서도 미세아교세포 및 별아교세포는 풍부한 TNF-α를 포함하고 있다(Yan et al., 2000; Yuan and Neufeld, 2000, 2001). 또한 허혈 또는 증가된 정수압을 이용하는 in vitro 녹내장 실험모델에서, TNF-α의 합성이 신경아교세포에서 증가되며 이는 망막 신경절 세포에서 아폽토시스를 유도한다(Agar et al., 2006; Tezel et al., 2000). 녹내장 동물실험에서도 비슷한 결과를 얻을 수 있는데, TNF-α의 유리체강 내 주사(intravitreal injection)는 망막 신경절 세포의 축삭 변성 및 세포체의 지연 소실을 유도한다(Kitaoka et al., 2006). 또한 토끼 안구에 TNF-α를 유리체강 내 주사하면 시신경에서 축삭 변성이 일어난다(Madigan et al., 1996). TNF-α가 망막 신경절 세포의 사멸에 직접적으로 기여한다는 증거는 아직 제시된 바 없지만, 이전의 보고들을 통하여 녹내장성 안구에서도 망막 신경절 세포의 사멸에 TNF-α가 중요한 역할을 할 것이라고 생각되고 있다.

1990년대 후반부터 녹내장으로 인한 망막 신경절 세포의 사멸에 대한 신경보호 효과를 지니는 약물에 대한 연구가 매우 활발히 이루어지고 있다. 칼슘 채널 억제제들(Kitazawa et al., 1989; Netland et al., 1993; Bose et al., 1995; Sawada et al., 1996), 향 신경물질들(Johnson et al., 1986; Mansour-Robaey et al., 1994; Weibel et al., 1995; Di Polo et al., 1998; Pease et al., 2000; Quigley et al., 2000; Ko et al., 2001; Martin et al., 2003; Ji et al., 2004), α2-아드레날린성 촉진제들(Donello et al., 2001; Lafuente et al., 2001, 2002; WoldeMussie et al., 2001; Aviles-Trigueros et al., 2003; Wheeler et al., 2003), N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA) 수용체 길항제들(Vorwerk et al., 1996; Hare et al., 2004a, b), 산화질소 합성효소(NOS) 억제제들(Neufeld et al., 2002), 및 기타 물질들(Chaudhary et al, 1999; Kipnis et al., 2000; Schori et al., 2001; Quaranta et al., 2003; Hirooka et al., 2004; Qin et al., 2004; Lingor et al., 2005)이 망막 신경절 세포에 대한 신경보호 효과가 있음이 보고되었다. 하지만 녹내장으로 인한 망막 신경절 세포의 정확한 사멸의 기전은 아직 밝혀져 있지 않으며, 이를 효과적으로 억제하는 신경보호 약물도 아직은 없는 상태이다.

아그마틴은 최근 다양한 in vitro 및 in vivo 대뇌 손상 실험 모델에서 신경보호 효과가 보고되고 있는 물질이다. 아그마틴은 대뇌의 허혈 및 허혈-재관류 손상 모델에서 경색 부위의 면적 및 신경 손상을 감소시키는 것으로 알려져 있으며(Gilad et al., 1996; Kim et al., 2004; Kim et al., 2006). NMDA 및 글루타메이트의 노출로 인한 신경세포의 사멸로부터 신경세포를 보호하는 것으로 알려져 있다(Olmos et al., 1999; Zhu et al., 2003; Wang et al., 2006). 또한 스테로이드나 MPTP에의 노출에 의한 신경 손상에도 아그마틴은 보호효과를 보인다(Gilad et al., 2005; Zhu et al., 2006). 이러한 아그마틴의 신경보호 효과는 대뇌 손상 모델뿐만 아니라 척수 손상 모델에서도 확인되었다(Gilad and Gilad, 2000; Yu et al., 2000, 2003; Kotil et al., 2006). 그러나, 아그마틴이 망막 신경절 세포의 아폽토시스를 감소시킴으로써 망막 신경절 세포를 보호하는 역할을 할 수 있다는 것은 이전에 논의 또는 보고된 바가 없다. 또한 아그마틴은 알파2-아드레날린성 약물로서의 기능을 가지고 있기 때문에 신경보호 기전에 의한 망막신경절 세포의 사멸 억제 이외에도 안압의 하강에 의한 망막신경절 세포의 보호 작용도 가질 가능성이 있지만(Gabelt et al., 1994; Greenfield et al., 1997; Li et al., 1994; Toris et al., 1995), 이러한 사실은 이전에 논의 또는 보고된 바가 없다.

본 발명의 목적은 아그마틴 또는 이의 약제학적 허용 염을 이용하여 망막 신경절 세포를 아폽토시스로부터 보호함으로써 관련된 안 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법 및 약제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 아그마틴 또는 이의 약제학적 허용 염을 이용하여 포유류의 망막 신경절 세포의 아폽토시스를 차단하는 신규한 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 또한 아그마틴 또는 이의 약제학적 허용 염을 포함하는 포유류의 망막 신경절 세포의 아폽토시스를 차단하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 치료학적 유효량의 아그마틴 또는 이의 약제학적 허용 염을 이용하여 포유류의 망막 신경절 세포의 아폽토시스와 관련된 안 질환을 치료 또는 예방하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 치료학적 유효량의 아그마틴 또는 이의 약제학적 허용 염을 활성 성분으로 포함하는 포유류의 망막 신경절 세포의 아폽토시스와 관련된 안 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 아그마틴은 미토콘드리아의 아르기닌 탈탄산효소에 의한 L-아르기닌의 탈탄산 반응으로부터 합성되는 내인성 폴리아민이다(Tabor and Tabor, 1984; Reis and Regunathan, 2000; Grillo and Colombatto, 2004; Moinard et al., 2005). 아그마틴은 포유동물의 뇌 및 다른 기관에서 광범위하고 고르지 않게 발현되고(Li et al., 1994; Lortie et al., 1996), in situ로 형성되거나 외인성 요인들로부터 형성된다(Grillo and Colombatto, 2004; Moinard et al., 2005). 아그마틴은 다양한 생물학적 활성을 갖는 것으로 보고되었다; 아그마틴은 부신 친크롬세포로부터 카테콜아민(Li et al., 1994), 이자섬으로부터 인슐린(Sener et al., 1989), 및 시상하부로부터 황체형성 호르몬 분비호르몬(Kalra et al., 1995)의 분비를 촉진한다. 또한, 아그마틴은 모르핀의 진통효과를 증강시키고(Kolesnikov et al., 1996; Su et al., 2003), 유도성 일산화질소 합성효소의 활성을 억제하고(Galea et al., 1996), 폴리아민 항상성에 기여한다(Dudkowska et al., 2003; Grillo and Colombatto, 2004). 아그마틴은 α2-아드레날린성 및 이미다졸린 수용체들에 대한 촉진제이고(Li et al., 1994), NMDA 수용체에 대한 길항제인(Yang and Reis, 1999) 것으로 알려져 있다. 아그마틴은 본 발명의 속하는 분야에 널리 공지된 효소적 또는 화학적 제조 방법에 의해 제조되거나 특정 공급원으로부터 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에서 아그마틴은 아그마틴 그 자체 또는 이의 약제학적 허용 염을 모두 언급하는 것으로 해석된다.

본 발명에서 망막 신경절 세포의 아폽토시스는 바람직하게는 저산소증에 의해 유도된 아폽토시스 또는 TNF-α에 의해 유도된 아폽토시스이다.

본 발명에서 망막 신경절 세포의 아폽토시스와 관련된 안질환은 비제한적으로 녹내장, 망막병증 및 시신경병증을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 안질환은 녹내장, 허혈성 망막병증, 허혈성 시신경병증, 외상성 시신경병증 및 AIDS 관련 시신경병증을 포함한다.

본 발명에서 포유류는 바람직하게는 인간이다.

본 발명에서 사용된 조성물은 다양한 형태의 약제 조성물일 수 있다. 조성물은 바람직하게는 눈에 전달하기 위한 국소 안약 제제이다. 조성물은 안과학적으로 허용되는 보존제, 점도 증강제, 침투 증강제, 완충제, 염화나트륨 및 물을 포함하여 수성, 무균 안과용 현탁액 또는 용액을 형성할 수 있다. 안과용 용액 제제는 활성 성분을 생리적으로 허용되는 등장 수성 완충액에 용해시켜 제조될 수 있다. 또한, 안과용 용액은 안과학적으로 허용되는 계면활성제를 포함하여 활성 성분을 용해시키는데 도움을 줄 수 있다. 또한, 안과용 용액은 증점제 또는 겔화제를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 조성물의 각 개체에 대한 특이적 투여량은 임상의의 재량에 속한다. 또한 투여량은 환자 증상의 중증도, 환자의 연령, 체중에 따라 다를 것이다. 활성 성분인 아그마틴은 통상 이들 제제에서 조성물 또는 제제의 약 0.1- 1.0 중량%, 바람직하게는 약 0.1-0.5 중량%, 가장 바람직하게는 약 0.2 중량%의 양으로 함유될 것이다.

본 발명의 조성물은 이 분야의 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 안구에, 예를 들어, 국소 안구 점적제 또는 연고, 안구에 장치된 서방성 장치, 유리체강내, 결막하 또는 테논낭하 주사에 의해, 또는 전신적으로, 예를 들어 구강, 정맥내, 피하 또는 근육내 주사, 비경구적, 피부 또는 비강내 전달에 의해 전달될 수 있다.

이하에서, 본 발명을 보다 상세하게 설명할 것이다.

본 발명자들은 α₂-아드레날린성 촉진제(Li et al., 1994), NMDA 수용체 길항제(Yang and Reis, 1999), 및 유도성 일산화질소 합성효소의 억제제(Galea et al., 1996)로서의 역할로 인해 아그마틴이 망막 신경절 세포를 보호할 수 있을 것이라고 가정하였다. 본 발명에서, 본 발명자들은 형질전환 랫트 망막 신경절 세포(RGC-5)에서 TNF-α에 의해 유도된 아폽토시스에 대한 아그마틴의 신경보호 효과를 조사하였다(Krishnamoorthy et al., 2001; Maher and Hanneken, 2005). 또한, 망막 신경절 세포의 저산소압에 의해 유도되는 아폽토시스에 대한 아그마틴의 신경보호 효과를 조사하였다. 이와 함께, 아그마틴의 신경보호 효과를 망막 신경절 세포에 대한 공지된 보호성 향 신경물질인 BDNF와 비교하였다. 본 발명자들은 아그마틴이 망막 신경절 세포에서 TNF-α에 의해 유도되는 아폽토시스에 대한 신경보호 효과를 갖는다는 사실을 증명하였고, 또한 아그마틴이 저산소압에 의해 유도되는 세포 손상으로부터 망막 신경절 세포를 보호하고, 그의 신경보호 효과가 망막 신경절 세포에 대한 공지된 보호성 향 신경물질인 BDNF보다 훨씬 강력함을 확인하였다. 아그마틴의 신경보호 효과는 미토겐-활성 단백질 키나제인 c-Jun N-말단 키나제(JNK) 및 핵 인자-카파 B(NF-κB) 신호전달 경로와 관련되어 있는데, 이는 아그마틴이 BDNF와는 다른 기작을 사용함을 암시하는 것이다. 본 연구 결과는 아그마틴이 망막 신경절 세포 손상과 관련된 안 질환에 대한 새로운 치료 전략의 기초가 될 수 있음을 제시한다.

하기 실시예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것이며, 본 발명이 이에 국한되는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

실시예 1. 아그마틴의 저산소압 -유도 아폽토시스로부터 망막 신경절 세포 보호 효과

1.1. 화학물질 및 항체

황산 아그마틴(agmatine sulfate, Cat no. A7127) 및 재조합 인간 BDNF(Cat no. 248-BD-025)를 각각 시그마사(Sigma) 및 R&D 시스템사(R&D System)로부터 구입하였다. 토끼 다클론 항-JNK p54/46(Cat no. 9252), 항-ERK p44/42(Cat no. 9102), 항-p38(Cat no. 9212), 항-NF-κB p65(Cat no. 3034), 항-인산-JNK p54/46(Cat no. 9251), 항-인산-ERK p44/42(Cat no. 9101), 항-인산-p38(Cat no. 9211), 항-인산-NF-κB p65(Cat no. 3031), 및 항-히스톤 3(Cat no. 9715) 항체들은 셀 시그날링 테크놀러지사(Cell Signaling Technology)로부터 구입하였다. 마 우스 단클론 항-β 액틴 항체(Cat no. sc-47778)는 산타 크루즈 바이오테크놀러지사(Santa Cruz Biotechnology, Inc)로부터 구입하였다.

1.2. 세포 배양

출생 직후의 스프라그-다우리 랫트로부터 발생된 망막 신경절 세포인 RGC-5 세포주를 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(Gibco), 100 U/mL의 페니실린 및 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 변형된 둘베코의 변형 이글스 배지(DMEM; Gibco)에서 배양하였다. 상기 세포들을 2-3일마다 계대 배양하였고, 상기 배양은 5% CO₂ 조건 하, 37℃에서 수행되었다. 배양 동안, 세포들은 동일한 형태학적 표현형을 나타내었다. 모든 실험을 위하여, 세포들은 80% 컨플루언스(confluence)에서 사용되었다.

1.3. 망막 신경절 세포에 대한 저산소압 손상

배양액을 산소 수준(5% O₂, 5% CO₂, 90% N₂) 및 온도(37℃)가 조절된 폐쇄 저산소압 챔버(Forma Scientific Co.)로 옮겼다. 탈산소 무혈청 DMEM으로 두 번 세척한 후, 세포들을 저산소압 챔버 내에서 유지하였다. 대조군 세포는 저산소압에 노출시키지 않았다. 아그마틴 또는 BDNF를 지시된 바와 같이 손상 개시 시점에 배양 배지에 첨가하였다.

1.4. 유산염탈수소효소 ( LDH ) 분석

세포 생존능력은 12, 24 및 48시간 동안 저산소압 또는 정상 산소압 배양 후 손상된 세포들로부터 분비된 LDH의 측정에 의해 정량하였다. LDH 분비는, 각 배양 액을 거의 완전한 세포 손상을 유발하는 조건인 -70℃에서 밤새 냉동시키고 급속 해동시킨 후 야기되는 최대 LDH 분비를 나타내는 100에 대한 상대적인 값으로 표시된다. 모든 실험은 적어도 4번 반복하여 수행되었고, 서로 다른 플레이팅으로부터 유래된 세포 배양액을 사용하여 적어도 8번 반복되었다. LDH 분석을 이용한 예비 연구는 10μM 내지 1 mM의 아그마틴 농도 및 5 ng/mL 내지 100 ng/mL의 BDNF 농도를 시험하였다. 세포 사멸은 100μM 이상 농도의 아그마틴 및 10 ng/mL 이상 농도의 BDNF에서 현저히 감소되어, 본 발명자들은 100μM 아그마틴 및 10 ng/mL BDNF를 이후의 실험에 사용하였다.

1.5. 훽스트 ( Hoechst ) 33342 및 프로피디움 아이오다이드 염색

아폽토시스성 또는 괴사성 세포 사멸은 훽스트 33342 및 프로피디움 아이오다이드 이중 염색을 이용하여 특정되었다. 세포를 10 ㎍/mL 훽스트 33342 및 10 ㎍/mL 프로피디움 아이오다이드로 30분간 37℃에서 염색하였다. 인산염 완충 식염수(PBS)로 두 번 세척한 후, 세포를 형광 현미경에 부착된 디지털 카메라로 찍어 형상화하였다.

1.6. 아넥신 V 분석

아폽토시스가 활발하게 진행 중인 세포의 비율을 아넥신 V-FITC 아폽토시스 검출 킷트(BD Biosciences, Cat no. 556547)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 유세포 분석기로 결정하였다. 간략히 설명하면, 세포를 수확하고 결합 완충용액에 10⁶ cells/mL의 농도로 재분산시켰다. 10⁵ 세포를 5㎕의 아넥신 V-FITC 및 5㎕의 프로피디움 아이오다이드와 혼합하였다. 상온의 암실에서 15분간 보관한 후, 유량 분석기로 분석을 수행하였다.

1.7. 캐스페이즈 -3 활성 측정

캐스페이즈-3 활성은 CaspACE^TM 비색 분석 시스템(Promega, Cat no. G7220)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다. 간략히 설명하면, 세포를 수확하고 세포 용해 완충용액에 10⁸ cells/mL의 농도로 재분산시켰다. 세포 용해 후, 10⁶ 세포를 32㎕의 분석 완충용액 및 2㎕의 10 mM DEVD-pNA 기질과 혼합하였다. 37℃에서 4시간 동안 보관한 후, 흡광도를 405 nm에서 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다. 각 시료의 흡광도는 각 시료의 흡광도로부터 블랭크의 평균 흡광도를 차감하여 결정하였다.

1.8. 웨스턴 블럿 분석

전 세포 단백질을 추출하기 위하여, 세포를 얼음-냉각 PBS로 두 번 세척한 후 세포 용해 완충용액(50　mM Tris-HCl pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% Na-데옥시콜레이트, 150　mM NaCl, 1　mM EDTA, 10 mM Na₃VO₄,50 mM NaF, 1　mM PMSF, 1㎍/mL 아프로티닌, 1㎍/mL 류펩틴, 1㎍/mL 펩스타틴)을 이용하여 얼음에서 30분간 용해시켰다. 용해물을 초음파 처리한 후, 세포 균질액을 4℃, 15,000 g에서 10분간 원심분리하였다.

세포질 및 핵 단백질 추출을 위하여, 세포를 용해 완충용액 A(10 mM HEPES pH 7.4, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT, 10 mM Na₃VO₄,50 mM NaF, 1　mM PMSF, 1㎍/mL 아프로티닌, 1㎍/mL 류펩틴, 1㎍/mL 펩스타틴)을 이용하여 얼음에서 15분간 용해시키고, 10% NP-40을 첨가하였다. 10초간 볼텍싱(vortexing) 후, 용해물을 4℃, 15,000 g에서 1분간 원심분리하였다. 상등액을 세포질 분획으로부터 수집하였다. 펠렛을 용해 완충용액 C(20 mM HEPES pH 7.4, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% 글리세롤, 1 mM DTT, 10 mM Na₃VO₄,50 mM NaF, 1　mM PMSF, 1　㎍/mL 아프로티닌, 1　㎍/mL 류펩틴, 1　㎍/mL 펩스타틴)에 얼음에서 30분간 재분산시켰다. 용해물을 4℃, 15,000 g에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 핵 분획으로부터 수집하였다.

최종 상등액 내 단백질 농도를 브래드포드 시약(Bradford reagent)을 이용하여 측정하였고, 동량의 단백질(40 ㎍)을 램리(Laemmli) 시료 완충용액 내에서 끓인 후 10 또는 15% SDS-PAGE로 분석하였다. 단백질을 폴리비닐리덴 플로라이드 막(Immobilon; Millipore, Billerica,MA)으로 옮긴 후 JNK, ERK p44/42, p38, NF-κB p65, 인산-JNK, 인산-ERK p44/42, 인산-p38, 인산-NF-κB, β-액틴 및 히스티딘 3에 대한 항체들로 지시된 바와 같이 밤새 표지 하였다(1:1000로 희석). 면역활성 밴드를 홍당무 과산화효소(horseradish peroxidase) 컨쥬게이션된 이차 항체로 검출하고 증강된 화학발광에 의해 가시화하였다.

1.9. 통계학적 분석

실험 결과를 사회과학용 통계학적 패키지 12.0(Statistical Package for Social Sciences 12.0, SPSS)를 이용한 2-단 스튜던트 t-시험(2-tailed Student t-test) 또는 일방(one-way) ANOVA로 분석하였다. 차이는 p<0.05에서 통계학적으로 유의미하다고 간주되었다.

1.10. 결과

아그마틴은 RGC -5의 저산소압 -유도 세포 사멸을 억제한다.

본 발명자들은 먼저 배양된 형질전환 랫트 망막 신경절 세포(RGC-5)에 대한 저산소압의 영향을 조사하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 망막 신경절 세포에 대한 저산소압 조건의 영향은 유의미하였다(모두 P<0.001). 12, 24 및 48시간 동안 저산소압에의 노출은 LDH 분비를 각각 10.17%, 20.04%, 및 52.25%까지 현저하게 증가시켰다. 상기 결과는 망막 신경절 세포에 대한 저산소압-유도 시간-의존성 신경독성을 나타낸다.

이어서, 본 발명자들은 저산소압-유도 망막 신경절 세포 손상에 대한 아그마틴의 신경보호 효과를 조사하고, 이들의 효과를 BDNF와 비교하였다. 상기 결과는 저산소압 신경 손상에 대한 아그마틴의 중요한 영향을 나타내고, 이러한 효과가 BDNF에서 관찰되는 것보다 훨씬 강력함을 나타낸다. 12 및 24시간의 저산소압 노출 후(도 1A 및 B), 어떠한 처리군도 저산소압에 의해 유도되는 증가된 LDH 분비에 현저한 효과를 보이지 않았다(각각 P=0.864 및 P=0.266). 그러나, 도 1C에 나타낸 바와 같이, LDH 분비에 대한 아그마틴 및 BNDF의 현저한 효과가 관찰되었다(모두 P<0.001). 100μM 및 500μM 아그마틴은 LDH 분비의 저산소압-유도 증가를 25.60% 및 27.09%까지 예방하였다. 이와 유사하게, 10, 50, 및 100 ng/mL BDNF는 LDH 분 비를 각각 30.10%, 33.67%, 및 36.06%까지 억제하였다. 또한, 100μM 아그마틴은 10 ng/mL BDNF보다 LDH 분비를 억제하는데 더욱 효과적이었다(P<0.001).

아그마틴의 신경보호 효과를 훽스트 33342 및 프로피디움 아이오다이드 이중 염색을 이용하여 추가로 연구하였다. 48시간 후, 대조군 정상 산소압 배양액은 균일하고 조밀한 핵 형태를 갖는 컨플루언스 훽스트-양성 세포, 및 소수의 프로피디움 아이오다이드-표지 세포를 나타내었다(도 2A). 48시간 동안 저산소압에 배양액의 노출은 훽스트-양성 세포들의 상당한 손실 및 기형의 응축된 핵을 갖는 다수의 프로피디움 아이오다이드-양성 세포들의 출현을 초래하였다(도 2B). 망막 신경절 세포 손실은 배양액에 100μM 아그마틴(도 2C) 또는 10 ng/mL BDNF(도 2D)의 첨가에 의해 예방되었다.

아그마틴은 저산소압 -유도 아폽토시스로부터 RGC -5를 보호한다.

아그마틴이 망막 신경절 세포의 저산소압-유도 아폽토시스성 사멸에 대해 보호효과를 갖는지 여부를 규명하기 위하여, 본 발명자들은 아넥신 V 분석을 이용하여 이들 세포들을 시험하였다. 12시간 동안의 저산소압 노출 후에 아폽토시스성 세포의 비율에는 어떠한 유의미한 차이도 나타나지 않은 반면(도 3), 24시간 동안의 저산소압 노출 후에 아그마틴 또는 BDNF의 존재 시에는 아폽토시스성 세포들의 현저한 감소가 관찰되었다(도 4).

캐스페이즈-3 분석을 이용하여 본 발명자들은 아그마틴이 캐스페이즈-3의 저산소압-유도 특이적 활성에 대해 효과를 갖는지 여부를 조사하였다. 캐스페이즈-3의 특이적 활성은 캐스페이즈-3 기질(Ac-DEVD-pNA)의 절단에 의해 측정되었다. 24 시간 동안의 저산소압 후, 캐스페이즈-3 활성이 현저하게 유도되었는데, 이는 100μM 아그마틴 또는 50μM 캐스페이즈-3 억제제 Z-VAD-FMK의 처리에 의해 동일하게 억제되었다(도 5).

아그마틴에 의한 JNK 활성의 선택적 저해

저산소압 손상 후 전체 및 인산화 미토겐-활성 단백질 키나제(MAPKs), 및 망막 신경절 세포의 β-액틴의 대표적인 웨스턴 블럿을 도 6에 나타내었다.

인산-JNK에 대한 항체가 54 및 46 kDa에서 두 개의 밴드를 검출하였고, 상기 두 개의 밴드는 모두 본 연구에서 유사한 변화를 나타내었다. 저산소압 망막 신경절 세포에서 인산-JNKs의 증가는 저산소압 손상 9시간 경과 후에 명백해졌고 증가된 상태로 유지되었다(도 6A). BDNF가 아닌, 아그마틴 처리가 인산-JNKs의 저산소압-유도 발현을 현저하게 억제하였다.

인산-세포 외 신호-조절 키나제(ERK)에 대한 항체 역시 44 및 42 kDa에서 두 개의 밴드를 검출하였고, 두 개 밴드 모두 본 연구에서 유사한 경향을 보였다. 인산-ERKs는 망막 신경절 세포의 정상 산소압 배양에서는 검출되지 않았지만, 3시간의 저산소압 노출 후에 망막 신경절 세포에서 높게 발현되었고, 증가된 상태로 유지되었다(도 6B). BDNF 처리는 3 및 6시간의 저산소압 노출 후 인산-ERKs의 발현을 완벽히 억제하였지만, 그 이후에는 아무런 영향을 미치지 않았다. 이에 비하여, 아그마틴은 인산-ERKs의 발현에 유의미한 영향을 나타내지 않았다.

인산-p38 키나제(p38)에 대한 항체는 38 kDa에서 한 개의 밴드를 검출하였다. 인산-p38은 12시간 경과 후까지 정상 산소압 망막 신경절 세포에서는 검출되 지 않았지만, 3시간 동안의 저산소압 노출 후에 저산소압 망막 신경절 세포에서 명백해졌으며 증가된 상태로 유지되었다(도 6C). BDNF만이 6시간째에 인산-p38의 발현을 억제하였고 아그마틴은 인산-p38의 수준에 어떠한 영향도 미치지 않았다.

전체 미토겐-활성 단백질 키나제(MAPK; JNK, ERK, 및 p38) 및 β-액틴은 저산소압 손상에 의해 영향을 받지 않았다(도 6). BDNF 또는 아그마틴 처리 후에 어떠한 유의미한 변화도 관찰되지 않았다.

따라서, 인산-MAPK는 저산소압 노출 후에 서로 다른 활성화 프로파일을 나타내었다; ERK 및 p38은 초기에 활성화되었고, JNK는 나중에 활성화되었다. BDNF는 ERK(저산소압 노출 3 및 6시간 경과 후) 및 p38(저산소압 노출 6시간 경과 후)의 활성을 억제하는 반면, 아그마틴은 JNK(저산소압 노출 9시간 경과 후에 현저한 증가와 함께)의 활성을 억제하였다.

아그마틴에 의한 NF -κB 신호전달의 억제

NF-κB의 발현 및 활성을 저산소압 손상 후의 망막 신경절 세포의 핵 및 세포질 분획으로부터 평가하였다. 웨스턴 블럿 분석에서 대표적인 밴드들을 도 7에 나타내었다. 전체 및 인산-NF-κB에 대한 항체들이 65 kDa에서 이러한 대표적인 밴드들을 검출하였다.

핵 분획에서, 전체 NF-κB 및 히스톤 3은 저산소압 손상에 의해 영향을 받지 않았고, BDNF 및 아그마틴의 첨가에 의해 어떠한 유의미한 변화도 나타내지 않았다. 그러나, 인산-NF-κB는 1시간의 저산소압에 의해 망막 신경절 세포에서 현저하게 증가하였고 3시간 경과 후에 정상 수준으로 회복되었다. 인산-NF-κB의 증가 는 BDNF가 아닌, 아그마틴 처리에 의해 억제되었다.

이에 비하여, 세포질 분획에서는, 저산소압 망막 신경절 세포에서 인산-NF-κB 및 β-액틴의 수준에 있어 어떠한 유의미한 변화도 관찰되지 않았다. 그러나, 전체 NF-κB 발현은 1시간의 저산소압 노출 후에 증가하였고 3시간 경과 후에 정상 수준으로 회복되었다. 이러한 증가는 BDNF가 아닌, 아그마틴 처리에 의해 억제되었다.

실시예 2. 아그마틴의 TNF -알파 아폽토시스로부터의 망막 신경절 세포 보호 효과

2.1. RGC -5 배양 및 TNF -α 노출

출생 직후의 스프라그-다우리 랫트로부터 발생된 망막 신경절 세포인 RGC-5 세포주를 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(Gibco), 100 U/mL의 페니실린 및 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 변형된 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM; Gibco)에서 배양하였다. 상기 세포들을 2-3일마다 계대 배양하였고, 상기 배양은 5% CO₂ 조건 하, 37℃에서 수행되었다. 배양 시, 세포들은 동일한 형태학적 표현형을 나타내었다. 모든 실험을 위해서, 세포들은 80% 컨플루언스에서 사용되었다.

PBS로 두 번 세척한 후, 세포를 무혈청 DMEM에서 배양하고 10 또는 50 ng/mL 재조합 랫트 TNF-α Chemicon)로 48시간까지 처리하였다. 대조군 세포는 TNF-α에 노출시키지 않았다. 100μM 아그마틴을 지시된 바와 같이 손상 개시 시점에 배양 배지에 첨가하였다.

2.2. 유산염탈수소효소 ( LDH ) 분석

세포 생존능력은 TNF-α 투여 후 손상된 세포로부터 분비된 LDH의 양을 측정함으로써 정량 되었다. LDH 분비는, 각 배양액을 거의 완전한 세포 손상을 유발하는 조건인 -70℃에서 밤새 냉동시키고 급속 해동시킨 후 야기되는 최대 LDH 분비를 나타내는 100에 대한 상대적인 값으로 표시된다. 모든 실험은 적어도 4번 반복하여 수행되었고, 서로 다른 플레이팅으로부터 유래된 세포 배양액을 사용하여 적어도 8번 반복되었다.

2.3. 훽스트 ( Hoechst ) 33342 및 프로피디움 아이오다이드 염색

2.4. 아넥신 -V 분석

2.5. 통계학적 분석

2.6. 결과

아그마틴은 RGC -5 세포에서 TNF -α유도 아폽토시스를 억제한다.

본 발명자들은 먼저 RGC-5 세포에 대한 TNF-α의 영향을 조사하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, TNF-α에 대한 노출은 RGC-5 세포에서 시간-의존성 및 농도-의존성 세포 독성을 유발하였다. 24 및 48시간 동안의 10 ng/mL TNF-α 첨가는 LDH 분비를 각각 7.04 ± 3.26% 및 10.16 ± 1.77%까지 현저히 증가시켰고, 동일한 시간 동안의 50 ng/mL TNF-α 첨가는 LDH 분비를 각각 13.41 ± 6.20% 및 17.00 ± 1.92%까지 현저히 증가시켰다. 대조군에서는, LDH가 24 및 48시간째에 각각 5.04 ± 1.45% 및 6.11 ± 1.28%까지 증가하였다. RGC에 대한 TNF-α의 세포독성 효과는 유의미하였다(모두 P<0.001).

100μM 아그마틴 존재 시에, TNF-α 유도 LDH 분비는 현저히 억제되었다(모두 P<0.001). 50 ng/mL TNF-α로 자극된 그룹에서, 아그마틴은 24시간 및 48시간째에 LDH의 분비를 각각 5.91 ± 0.86% 및 8.14 ± 2.43%까지 현저히 감소시켰다(도 8). 따라서, 아그마틴은 TNF-α에 의해 손상된 망막 신경절 세포에 신경보호 효과를 나타낸다.

아그마틴의 신경보호 효과를 훽스트 33342 및 프로피디움 아이오다이드 이중 염색을 이용하여 추가로 연구하였다. 48시간 경과 후, 대조군 배양은 균일하고 조밀한 핵 형태를 갖는 컨플루언스 훽스트-양성 세포, 및 드물게 프로피디움 아이오다이드-표지 세포를 나타내었다(도 9A). 100μM 아그마틴의 첨가만으로는 어떠한 유의미한 효과도 나타내지 않았다(도 9B). 그러나, 48시간 동안 50 ng/mL TNF-α에 대한 배양액의 노출은 훽스트-양성 세포들의 상당한 손실 및 기형의 응축된 핵을 갖는 다수의 프로피디움 아이오다이드-양성 세포들의 출현을 초래하였다(도 9C). 망막 신경절 세포 손실은 배양액에 100μM 아그마틴의 첨가에 의해 예방되었다(도 9D).

아그마틴은 TNF -α유도 아폽토시스로부터 RGC -5를 보호한다.

TNF-α 유도 아폽토시스성 사멸에 대하여 망막 신경절 세포를 보호하기 위한 아그마틴의 능력을 규명하기 위하여, 본 발명자들은 아넥신 V 분석을 이용하였다. 50 ng/mL TNF-α에 대한 12시간 노출 후에는 아폽토시스성 세포의 비율에 있어 어떠한 차이도 관찰되지 않은 반면(도 10), 24시간 노출 후에는 100 μM 아그마틴의 존재 시에 아폽토시스성 세포가 현저히 감소하였다(도 11).

당업자라면 본 발명의 개시내용에 비추어, 본 발명의 정신과 범위로부터 벗어나지 않고 본 명세서에 개시된 실시 형태의 변화가 가능하다는 것을 알 수 있다. 보다 구체적으로, 화학적 및 구조적으로 관련되어 있는 일정한 약제는 유사한 결과를 얻도록 본 발명에서 기재한 약제에 대해 대체될 수 있다는 것은 당업자에게 명 백할 것이다. 본 명세서에서 개시된 모든 실시 형태는 본 발명에 개시된 내용에 비추어 과도한 실험 없이 실시될 수 있다. 본 발명의 전체 범위는 본 명세서의 기재 내용 및 그의 등가 실시 형태에 있어서 설명되어 있다. 본 명세서는 권리가 부여된 본 발명에 대한 보호의 전체 범위를 지나치게 좁히는 것으로 간주되어서는 안될 것이다.

본 발명자들은 구아니디노기를 갖는 내인성 폴리아민인 아그마틴이 LDH 분비에 있어서 저산소압-유도 증가 및 망막 신경절 세포의 아폽토시스성 사멸을 방지할 수 있으며, TNF-α가 LDH 분비 및 망막 신경절 세포에서의 아폽토시스를 유발함을 확인하고 나아가 아그마틴이 망막 신경절 세포에 대한 TNF-α의 신경 독성 효과를 억제할 수 있음을 확인하였다. 이로써, 본 발명은 아그마틴을 망막 신경절 세포의 아폽토시스와 관련된 안질환의 치료 또는 예방을 위한 약제로서 제공한다.

참고문헌

하기는 본 명세서에서 인용된 참조 문헌이다. 본 명세서에 기재된 참조 문헌은 그 전체가 본 명세서에 기재된 실시예 또는 기타 세부사항의 보충 요소를 제공하는 정도로 구체적으로 참조로 통합되며 본 발명의 일부를 구성한다.

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Claims

망막 신경절 세포의 아폽토시스를 차단하여 녹내장, 허혈성 망막병증, 허혈성 시신경병증, 외상성 시신경병증 및 AIDS 관련 시신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제 조성물로서,

아그마틴 또는 이의 약제학적 허용 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포의 아폽토시스는 저산소증에 의해 유도된 아폽토시스인 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포의 아폽토시스는 TNF-α에 의해 유도된 아폽토시스인 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
제2항에 있어서, 상기 아폽토시스의 차단이 아그마틴이 c-Jun N-말단 키나제(JNK) 및 핵 인자-카파 B(NF-κB)의 저산소압 유도 활성을 억제함으로써 일어나는 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
삭제
망막 신경절 세포의 아폽토시스 관련 질환인, 녹내장, 망막병증 및 시신경병증의 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물로서,

치료적 유효량의 아그마틴 또는 이의 약제학적 허용 염을 활성 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
삭제
제6항에 있어서, 상기 망막병증이 허혈성 망막병증인 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
제6항에 있어서, 상기 시신경병증이 허혈성 시신경병증, 외상성 시신경병증, 또는 AIDS 관련 시신경병증인 것을 특징으로 하는 약제 조성물.