KR100851764B1 - Oligonucleotide marker which contains phase transfer catalyst and the material differentiating or discerning method which employs the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유기 용매에 용해되는 올리고뉴클레오티드 유도체 및 이를 표지체로 사용하는 물체의 식별 또는 감식 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상전환 촉매(PTC, Phase Transfer Catalyst)와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체와 이를 표지체로 사용하는 물체의 식별 또는 감식 방법에 대한 것이다.The present invention relates to an oligonucleotide derivative dissolved in an organic solvent and a method for identifying or identifying an object using the same, and more particularly, to an oligonucleotide derivative combined with a phase transfer catalyst (PTC) and a label thereof. A method of identifying or identifying objects used as sieves.

올리고뉴클레오티드 유도체Oligonucleotide derivatives

Description

상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체 및 이를 사용하는 물체의 식별 또는 감식 방법{Oligonucleotide marker which contains phase transfer catalyst and the material differentiating or discerning method which employs the same}Oligonucleotide marker which contains phase transfer catalyst and the material differentiating or discerning method which employs the same}

도 1은 올리고뉴클레오티드를 유기 용매에 녹이고, 페인트에 적용한 후 다시 회수하는 경로를 나타낸 개략도이다. 1 is a schematic diagram showing a route for dissolving an oligonucleotide in an organic solvent and applying it to a paint and then recovering it again.

도2는 올리고뉴클레오티드의 염기부분이나 5'와 3'위치의 알코올 등이 아마이드 및 에스테르 결합을 한 올리고뉴클레오티드 유도체와 상전환 촉매의 결합체를 나타낸 도면이다.(R은 페인트의 성분과 용도에 따라 포화탄화수소, 방향족탄화수소, 불포화탄화수소, 헤테로원자가 포함된 포화 또는 불포화 탄화수소이다).2 is a diagram showing a combination of an oligonucleotide derivative having an amide and ester bond with a base portion of an oligonucleotide or an alcohol at 5 'and 3' positions, and a phase inversion catalyst (R is saturated according to the components and uses of the paint). Hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, unsaturated hydrocarbons, saturated or unsaturated hydrocarbons containing heteroatoms).

도 3은 올리고뉴클레오티드를 농도별로 희석하여 중합효소연쇄반응(PCR) 수행 후 아가로즈겔에 전기영동한 사진이다.Figure 3 is a photograph of the electrophoresis on agarose gel after the oligonucleotide was diluted by concentration to perform a polymerase chain reaction (PCR).

도 4a는 아클릴로일클로라이드로 보호반응시킨 올리고뉴클레오티드 유도체와 상전환 촉매를 페인트와 혼합하여 피복시키고 회수하여 중합효소연쇄반응 (PCR)수행 후 아가로스겔에서 전기영동한 사진이다. Figure 4a is a photo of electrophoresis on agarose gel after the polymerase chain reaction (PCR) was carried out by coating and recovering the oligonucleotide derivative protected by acryloyl chloride and the phase inversion catalyst mixed with paint.

도 4b는 도 4a의 올리고뉴클레오티드를 염기서열을 분석한 사진이다. Figure 4b is a photograph analyzing the nucleotide sequence of the oligonucleotide of Figure 4a.

도 5a는 아세틸클로라이드로 보호반응시킨 올리고뉴클레오티드 유도체와 상 전환 촉매를 페인트와 혼합하여 피복시키고 회수하여 중합효소연쇄반응(PCR)수행 후 아가로스겔에서 전기영동한 사진이다. FIG. 5A is a photograph of electrophoresis on agarose gel after polymerase chain reaction (PCR) was performed by coating and recovering an oligonucleotide derivative protected by acetyl chloride and a phase conversion catalyst by mixing with paint.

도 5b는 도 5a의 올리고뉴클레오티드를 염기서열을 분석한 사진이다.Figure 5b is a photograph analyzing the nucleotide sequence of the oligonucleotide of Figure 5a.

도 6a는 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드(A)와 보호반응시킨, 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체(B)를 페인트와 혼합하여 피복시키고 회수하여 각각 중합효소연쇄반응(PCR)수행 후 아가로스겔에서 전기영동한 사진이다.FIG. 6a shows that the oligonucleotide derivative (B) coupled with the phase inversion catalyst was coated and recovered by coating and recovering the oligonucleotide (A) coupled with the phase inversion catalyst, followed by polymerase chain reaction (PCR). Photographed on agarose gel electrophoresis.

도 6b는 상기 도 6a의 결합체 A와 결합체 B를 염기서열을 분석한 결과를 나타낸다. Figure 6b shows the result of analyzing the base sequence of the conjugate A and conjugate B of Figure 6a.

도 7a는 서로 다른 염기서열로 이루어진 3종의 올리고뉴클레오티드 유도체-PTC 결합체를 동시에 페인트와 혼합하여 물체에 코팅시키고 회수하여 PCR 수행 후 아가로스겔에서 전기영동한 사진이다.Figure 7a is a photograph of three kinds of oligonucleotide derivative-PTC conjugate consisting of different nucleotide sequences at the same time mixed with paint to coat and recover the object to perform a PCR electrophoresis on agarose gel.

도 7b는 도 7a의 3종의 올리고뉴클레오티드 유도체-PTC 결합체를 염기서열을 분석한 결과를 나타낸다.Figure 7b shows the result of analyzing the base sequence of the three oligonucleotide derivative-PTC conjugate of Figure 7a.

본 발명은 유기 용매에 용해되는 올리고뉴클레오티드 유도체 및 이를 표지체로 사용하는 물체 식별 또는 감식 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상전환 촉매(PTC, Phase Transfer Catalyst)와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체와 이를 표 지체로 사용하는 물품의 식별 또는 감식 방법에 대한 것이다.The present invention relates to oligonucleotide derivatives dissolved in organic solvents and methods for identifying or identifying objects using the same, and more particularly, oligonucleotide derivatives combined with a phase transfer catalyst (PTC) and a label thereof. It is about the identification or identification of the goods used.

올리고뉴클레오티드는 그 양이 극히 적을지라도 중합효소연쇄반응(PCR)을 통하여 동일한 염기 서열의 올리고뉴클레오티드로 대량 증폭이 가능하고, 증폭된 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 분석을 함으로써 극미량으로 존재하는 원래의 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 규명할 수 있다는 독특한 장점이 있다. 따라서, 이러한 올리고뉴클레오티드를 오일이나 페인트, 음식물, 화약 그리고 고가의 예술작품등 다양한 재료 또는 상품에 극미량 첨가함으로써, 상기 재료나 상품의 원래 출처 또는 운반경로 또는 예술 작품의 진품 여부를 정확하게 확인할 수 있다. Oligonucleotides can be amplified in large quantities into oligonucleotides of the same nucleotide sequence through polymerase chain reaction (PCR) even if the amount is extremely small, and the original oligonucleotides present in extremely small amounts by analyzing the nucleotide sequences of the amplified oligonucleotides. There is a unique advantage that can identify the base sequence of. Thus, by adding a very small amount of such oligonucleotides to various materials or products, such as oils, paints, food, gunpowder, and expensive works of art, it is possible to accurately determine the original source of the materials or goods, the transport route or the authenticity of the works of art.

올리고뉴클레오티드는 중성 조건에서 탈양자화(deprotonation)에 의해 음전하를 갖는다는 특성을 가지므로, 다수개의 포스포디에스테르(Phosphodiester)결합으로 이루어진 올리고뉴클레오티드 자체는 강한 친수성 (hydrophilic property)을 나타낸다. Since the oligonucleotides have the property of being negatively charged by deprotonation in neutral conditions, the oligonucleotides themselves composed of a plurality of phosphodiester bonds exhibit strong hydrophilic properties.

따라서, 올리고뉴클레오티드 자체는 수용액에는 잘 녹지만 일반적인 유기 용매에서는 거의 녹지 않게 된다. 이러한 성질은 올리고뉴클레오티드의 수용액을 제조하는 경우에는 문제가 되지 않으나, 올리고뉴클레오티드를 유기 용매 속에 용해시킬 경우에는 난용성 문제를 발생시킨다.Thus, the oligonucleotides themselves are well soluble in aqueous solutions but hardly soluble in common organic solvents. This property is not a problem when preparing an aqueous solution of oligonucleotides, but when the oligonucleotides are dissolved in an organic solvent, poor solubility problems occur.

그런데, 이러한 올리고뉴클레오티드를 물체의 표지(labelling)체로 사용하는 방법들이 이미 개시되어 있다. 예를들면, 국제특허공개 제 WO87/06383, WO90/14441, WO91/17265, WO94/04918 등이다. WO87/06383에서는 뉴클레오티드를 표지체로 사용할 수 있음을 제시하였지만, DNA 증폭이나, 염기서열 분석(Sequencing)을 통한 물체의 식별 방법은 전혀 기술되어 있지 않았으며, 친수성인 DNA를 유기 용매에 용해시키는 방법은 기재되어 있지 아니하다. WO90/14441에서는 친수성 올리고뉴클레오티드를 오일에 녹이기 위해 계면활성제(detergent)를 이용하여 유기 층에 올리고뉴클레오티드를 도입하는 기술을 개시하였다. However, methods for using such oligonucleotides as labeling bodies have already been disclosed. For example, International Patent Publication Nos. WO87 / 06383, WO90 / 14441, WO91 / 17265, WO94 / 04918 and the like. WO87 / 06383 suggested that nucleotides can be used as markers, but no method of identifying objects through DNA amplification or sequencing has been described, and the method of dissolving hydrophilic DNA in an organic solvent is not described. Not listed. WO90 / 14441 discloses a technique for introducing oligonucleotides into an organic layer using a detergent to dissolve hydrophilic oligonucleotides in oil.

그러나, 상기 특허에서는 특정 프라이머를 사용하여 증폭되는지 여부를 확인함으로써 DNA의 존재를 확인함에 그치며, DNA의 염기 서열의 식별표지 기능에 대해서는 언급하지 아니하고 있다. WO91/17265에서는 WO90/14441에서 제시된 특정한 프라이머에 의해 유전자가 증폭되는 것으로 염기서열을 확인하는 내용을 개시하면서 올리고뉴클레오티드가 고체 상태의 지지체나 물질과 공유 결합을 할 수 있음을 언급하였다. However, the patent only confirms the presence of DNA by confirming whether or not it is amplified using a specific primer, and does not mention the identification function of the DNA base sequence. WO91 / 17265 discloses the identification of a nucleotide sequence by amplification of a gene by a specific primer set forth in WO90 / 14441, mentioning that oligonucleotides can covalently bind to a solid support or material.

그러나, 상기의 특허에 기재된 내용은, 뉴클레오티드를 페인트나 오일에 직접 결합시킨 경우에는, 올리고뉴클레오티드의 추출 회수단계에서 공유결합을 끊어야 함으로서, 결국 염기의 변형을 가져오게 되어 유전자 증폭단계에서 정확한 서열로 증폭이 되지 않는 문제가 발생되어 상업화될 수 없었다. WO94/04918에서는 좀더 개선된 방법으로 유전자를 증폭하고 염기서열을 분석하며, 올리고뉴클레오티드이외에 두가지 이상의 발광체 또는 색깔을 나타내는 화합물을 표지체로 사용하는 기술을 개시하였다. 그러나, 이 방법 또한 올리고뉴클레오티드의 수산기 또는 염기의 아민기의 반응성을 고려하지 아니하며, 수산기나 아민기부분의 반응으로 인하여 중합효소연쇄반응(PCR)이나 염기서열 분석이 진행될 때 원래의 염기서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 얻어내지 못하는 문제점이 발생한다. However, the information described in the above patent is that when nucleotides are directly bound to paint or oil, the covalent bonds must be broken at the extraction and recovery stage of the oligonucleotide, resulting in a modification of the base and thus the correct sequence at the gene amplification stage. The problem of not being amplified occurred and could not be commercialized. WO94 / 04918 discloses a technique for amplifying genes, analyzing sequences, and using two or more luminescent or color compounds other than oligonucleotides as markers in a more improved manner. However, this method also does not consider the reactivity of the hydroxyl or base amine groups of the oligonucleotide, and has the original sequence when PCR or sequencing is performed due to the reaction of hydroxyl or amine groups. Problems arise in that oligonucleotides cannot be obtained.                         

또한, 상기 특허에 개시된 방법들은 올리고뉴클레오티드를 페인트나 오일, 보다 구체적으로는 차량용 도색 페인트등에 이용할 수 있다고 언급만하고, 이를 이용하여 원래의 차량을 추적 및 확인할 수 있는 방법에 대해서는 구체적으로 제시되지 않았다. In addition, the methods disclosed in the above patents only mention that oligonucleotides can be used in paints or oils, more specifically, vehicle paints, and the like, and methods for tracking and verifying the original vehicle using them have not been specifically described. .

따라서, 본 발명의 목적은 물체의 식별 표지로 사용될 수 있도록 친유성 물질에 대한 용해도가 향상된 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체를 제공하는 것이다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide an oligonucleotide derivative combined with a phase inversion catalyst having improved solubility in lipophilic substances so that it can be used as an identification label of an object.

본 발명은 또 다른 목적은 상기의 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for preparing an oligonucleotide derivative combined with the phase inversion catalyst.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체를 사용하여 식별하고자 하는 물체에 표지하는 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for labeling an object to be identified by using an oligonucleotide derivative combined with the phase inversion catalyst.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 상전환 촉매가 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체로 표지된 물체로부터 상기 올리고뉴클레오티드를 추출 및 분리한 후 증폭반응을 거쳐 염기서열을 분석함으로써 물체를 식별 또는 감식하는 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method of identifying or identifying an object by extracting and isolating the oligonucleotide from an object labeled with an oligonucleotide derivative to which the phase inversion catalyst is bound and analyzing the nucleotide sequence through an amplification reaction. It is.

상기와 같은 본 발명의 목적은, 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체 및 이를 표지체로 사용하는 물체의 식별 또는 감식 방법을 제공함으로써 달성된다. The object of the present invention as described above is achieved by providing a method for identifying or identifying an oligonucleotide derivative coupled with a phase inversion catalyst and an object using the same as a label.                     

본 발명의 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티트 유도체는 Oligonucleotide derivatives combined with the phase inversion catalyst of the present invention

1)유기용매중에서 상전환 촉매와 올리고뉴클레오티드간에 이온 결합을 형성시켜 상전환 촉매가 결합된 올리고뉴클레오티드를 제조하는 단계, 2)상전환 촉매가 결합된 올리고뉴클레오티드 결합체에 할로겐화 아실(acyl halide)과 같은 반응성 차단 보호기를 결합시켜 반응성을 제거하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 20 내지 1000 염기쌍으로 이루어지는 것이 바람직하다.
1) forming an ionic bond between a phase inversion catalyst and an oligonucleotide in an organic solvent to prepare an oligonucleotide to which a phase inversion catalyst is bound, 2) an acyl halide such as an oligonucleotide conjugate to a phase inversion catalyst Prepared by a method comprising the step of binding a reactive blocking protecting group to remove reactivity.
In addition, the oligonucleotide is preferably composed of 20 to 1000 base pairs.

본 발명에 있어서, 상전환 촉매로는 4차 암모늄염을 갖는 화합물 또는 양이온계 계면활성제(cationic surfactant)가 사용된다. In the present invention, a compound having a quaternary ammonium salt or a cationic surfactant is used as the phase inversion catalyst.

상기 상전환 촉매는 4차 암모늄염을 갖는 화합물 또는 양이온계 계면활성제 (cationic surfactant)구조를 가지므로, 음이온계의 올리고뉴클레오티드와 이온 결합을 형성하여 올리고뉴클레오티드의 음이온 하전 상태를 상쇄시킨다. 상기 촉매와 결합을 통하여 하전이 상쇄된 올리고뉴클레오티드는 수용성에서 지용성으로 전환되어 유기 용매에 용해될 수 있다.Since the phase inversion catalyst has a compound having a quaternary ammonium salt or a cationic surfactant structure, the phase inversion catalyst forms an ionic bond with an oligonucleotide of an anion to cancel the anion charged state of the oligonucleotide. Oligonucleotides whose charge is canceled through the coupling with the catalyst may be converted from water soluble to fat soluble to be dissolved in an organic solvent.

이와 같이, 유기 용매에 녹는 성질을 갖는 올리고뉴클레오티드를 유기 용매에 넣어 유성 페인트등의 친유성 제품에 섞으면 균일한 상태로 분산이 되어 극히 저농도의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 친유성 물체를 제조할 수 있다.In this way, when an oligonucleotide having a property of dissolving in an organic solvent is added to an organic solvent and mixed with an lipophilic product such as an oil paint, it is dispersed in a uniform state to produce an lipophilic object containing an extremely low concentration of oligonucleotide.

그러나, 단계 1)에서 얻어진 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드는 유기 용매하에서 올리고뉴클레오티드의 당의 5' 또는 3'의 수산기 또는 염기의 아민기를 할로겐화 아실(acyl halide)과 같은 반응성 차단 보호기와 반응시켜, 수산기 부분은 에스테르화하고, 염기의 아민기는 아마이드화한다.However, the oligonucleotide combined with the phase inversion catalyst obtained in step 1) is reacted with a reactive blocking protecting group such as an acyl halide, in which the 5 'or 3' hydroxyl group or base amine group of the sugar of the oligonucleotide is reacted in an organic solvent, The hydroxyl group moieties are esterified and the amine groups of the base are amidated.

상기 할로겐화 아실은 유기 용매의 종류 또는 올리고뉴클레오티드의 사용 용 도에 따라서 적절하게 선택할 수 있다. 예를들면, 올리고뉴클레오티드를 페인트에 단순히 용해시키고자 하는 경우에는 반응성이 없는 치환체를 갖는 할로겐화 아실(예:아세틸클로라이드)을 사용하여 반응성을 차단하고, 오랜 시간동안 유실 방지를 위해서 페인트의 구성수지와의 화학적 결합이 요구될 때는 화학 결합을 유도할 수 있는 반응성을 갖는 할로겐화 아실(예:아크릴로일클로라이드)를 이용하는 것이 바람직하다.The acyl halide may be appropriately selected depending on the type of the organic solvent or the use of the oligonucleotide. For example, if the oligonucleotide is simply to be dissolved in the paint, halogenated acyl (e.g. acetyl chloride) with an unreactive substituent is used to block the reactivity and to prevent loss of the coating for a long time. When a chemical bond of is desired, it is preferable to use a halogenated acyl (eg acryloyl chloride) having a reactivity capable of inducing a chemical bond.

또한, 상기의 반응성 차단 보호기는 질소와 아마이드 결합을 하고 산소와 에스테르결합을 하는 카보닐 화합물, N-Si와 O-Si 결합을 하는 실란닐화합물, N-S와 O-S 결합을 하는 술포닐화합물, N-C와 O-C 결합을 하면서 암모니아 처리시 N-C와 O-C 결합이 끊어질 수 있는 포화탄화수소, 방향족탄화수소, 불포화탄화수소, 헤테로원자가 포함된 포화 탄화수소 또는 헤테로원자가 포함된 불포화탄화수소로 이루어진 군에서 선택된다.In addition, the reactive blocking protecting group is a carbonyl compound having an amide bond with nitrogen and an ester bond with oxygen, a silanyl compound having an N-Si and O-Si bond, a sulfonyl compound having an NS and OS bond, and a NC; It is selected from the group consisting of saturated hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, unsaturated hydrocarbons, saturated hydrocarbons containing heteroatoms, or unsaturated hydrocarbons containing heteroatoms, which can break NC and OC bonds during ammonia treatment with OC bonds.

이러한 이유는 단계1)에서 얻어진 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드를 친유성 물질과 그대로 혼합하면 유성 제품의 종류에 따라 상기 친유성 물질과 화학 반응을 일으켜, 추후 올리고뉴클레오타이드 추후 회수 단계에서 상기 올리고뉴클레오티드가 그대로 회수되지 않는 문제가 발생하기 때문이다.For this reason, when the oligonucleotide combined with the phase inversion catalyst obtained in step 1) is mixed with the lipophilic substance as it is, a chemical reaction occurs with the lipophilic substance according to the type of the oily product, and the oligonucleotide is later recovered in the oligonucleotide later recovery step. This is because a problem occurs that is not recovered as it is.

따라서, 본 발명에서는 상기 상전환 촉매가 결합된 올리고뉴클레오티드를 유성 물질에 첨가하기 이전에 할로겐화 아실과 같은 반응성 차단 보호기를 도입시켜 반응을 차단시켜, 친유성 물질 내에서의 화학적 안정성을 확보하므로써, 친유성 물질과의 화학결합을 통한 올리고뉴클레오티드의 망실을 줄일 수 있다. Therefore, in the present invention, the reaction is blocked by introducing a reactive blocking protecting group such as acyl halide before adding the oligonucleotide to which the phase inversion catalyst is bound to the oily material, thereby securing chemical stability in the lipophilic material. The loss of oligonucleotides through chemical bonds with oily materials can be reduced.                     

본 발명의 또 다른 목적은 상기 상전환 촉매가 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체를 친유성 물질에 첨가하여 친유성 물질의 확인 표지를 가하는 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for adding an identification label of a lipophilic substance by adding an oligonucleotide derivative to which the phase inversion catalyst is bound to a lipophilic substance.

상기 친유성 물질에는 자동차 피복용 페인트, 락카, 도로 차선 표시용 페인트, 석유, 페인트 희석제, 화약, 천연오일, 건축용 페인트, 유기 용매, 접착제, 유성 물감, 육류 및 해산물과 같은 유성 제품을 포함한다.The lipophilic materials include oily products such as automotive coating paints, lacquers, road lane marking paints, petroleum, paint thinners, gunpowder, natural oils, construction paints, organic solvents, adhesives, oil paints, meat and seafood.

본 발명의 또 다른 목적은 1)상전환 촉매와 올리고뉴클레오티드가 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체를 반응성 차단기로 보호시킨 물체 감식 표지에 의해 표지된 물체로부터 상기 감식 표지를 추출하는 단계; 2)추출된 감식 표지를 암모니아로 처리하여 올리고뉴클레오티드 유도체에 결합된 반응성 차단 보호기를 제거하는 단계; 3)올리고뉴클레오티드 유도체의 식별 표지 부분의 염기서열을 인식하는 단계; 4) 3)에서 인식된 염기 서열을 갖는 감식 표지로 표지된 물체를 인지하는 단계를 포함하는 물체 감식 방법을 제공하여 달성된다. Still another object of the present invention is to 1) extract the identification label from the object labeled by the object identification label protecting the oligonucleotide derivative to which the phase inversion catalyst and the oligonucleotide are bound by a reactive blocker; 2) treating the extracted identification label with ammonia to remove the reactive blocking protecting group bound to the oligonucleotide derivative; 3) recognizing the nucleotide sequence of the identification label portion of the oligonucleotide derivative; 4) an object identification method comprising the step of recognizing an object labeled with a identification label having a base sequence recognized in 3).

본 발명의 방법은, 상기 식별 표지 부분을 염기 서열을 인식하기 전에 식별 표지 부분 올리고뉴클레오티드를 중합효소연쇄반응을 통하여 증폭시키는 단계를 추가로 더 포함한다.The method further comprises amplifying the identification label portion oligonucleotide through a polymerase chain reaction prior to recognizing the nucleotide sequence.

또한, 본 발명의 방법은 상기 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 단계 이후 증폭된 올리고뉴클레오티드를 벡터(vector)에 클로닝하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다. In addition, the method of the present invention may further comprise the step of cloning the amplified oligonucleotide into a vector (vector) after the amplification step by the polymerase chain reaction.

본 발명에 의한 유기 용매에 용해되는 상전환촉매와 결합된 올리고뉴클레오 티드 및 이들을 반응성 차단기로 보호시킨 올리고뉴클레오티드 유도체와 상전환촉매(PTC)결합체는 다양한 분야에 응용될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 유도체와 상전환촉매(PTC)결합체는 각종 오일, 페인트, 음식물, 보안시스템 및 차량에 표지체(Marker)로서 사용될 수 있다.The oligonucleotides bound to the phase change catalysts dissolved in the organic solvent according to the present invention, and the oligonucleotide derivatives and the phase change catalysts (PTC) conjugates protecting them with reactive blockers can be applied to various fields. The oligonucleotide derivative and a phase inversion catalyst (PTC) conjugate may be used as a marker in various oils, paints, foods, security systems, and vehicles.

특정한 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 차량 마커로서 차량 외부 도막에 사용할 경우, 차량 도색용 페인트와 혼합하여 차량에 도색하면, 교통사고시 차량이 도주하였을 경우 차량으로부터 떨어진 조그만 페인트 조각으로 부터 올리고뉴클레오티드를 분리하여 중합효소연쇄반응(PCR)로 증폭시킨 후, 상기 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 분석하면 상기 염기 서열에 해당하는 차량을 추적할 수 있게 된다.When an oligonucleotide having a specific sequence is used as a vehicle marker for the exterior coating of a vehicle, when the vehicle is mixed with a vehicle paint, the oligonucleotide is separated from a small piece of paint away from the vehicle when the vehicle escapes in a traffic accident. After amplification by PCR, the nucleotide sequence of the oligonucleotide can be analyzed to track the vehicle corresponding to the nucleotide sequence.

상기의 방법에 있어서, 올리고뉴클레오티드 서열은 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T)의 4가지의 염기조합에 의해 식별표지(암호) 기능을 할 수 있게 된다. 예를들면, 올리고뉴클레오티드의 크기를 40염기쌍으로 하면 양 말단의 15개의 염기쌍 부분은 각각 중합효소연쇄반응(PCR)에 의한 증폭시에 프라이머가 붙는 주형 서열로서 알려진 염기서열로 만들고, 중간의 10염기쌍 부분은 상기 4종의 염기에서 선택하여 조합하면 410가지의 경우의 수를 얻을 수 있다. 따라서, 10염기쌍 길이의 올리고뉴클레오티드는 410가지의 식별 표지 역할을 할 수 있게 되어 물체마다 식별표지 부분을 서로 다른 염기서열로 된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표지할 수 있게 된다. In the above method, the oligonucleotide sequence can function as an identification label (password) by four base combinations of adenine (A), cytosine (C), guanine (G), and thymine (T). For example, if the size of the oligonucleotide is 40 base pairs, the 15 base pair portions at both ends are each made of a base sequence known as a template sequence to which a primer is attached during amplification by PCR. The part can be selected from the above four bases and combined to obtain the number of 4 10 cases. Accordingly, the oligonucleotide of 10 base pairs in length can serve as 4 10 kinds of identification markers, and thus the identification marker portion of each object can be labeled using oligonucleotides having different base sequences.

따라서, 물체로부터 채집된 올리고뉴클레오티드를 증폭한 후, 염기 서열을 분석하면 식별 표지 부분 염기 서열에 해당하는 원래의 물체를 감식할 수 있게 된다. Therefore, after amplifying the oligonucleotide collected from the object, analyzing the nucleotide sequence, it is possible to identify the original object corresponding to the identification label partial nucleotide sequence.

또한, 차량과 같이 검색되어야 하는 물체가 다수일 때에는 제1올리고뉴클레오티드, 제2올리고뉴클레오티드, 제3올리고뉴클레오티드를 조합하여 사용할 수 있다. 각 올리고뉴클레오티드의 식별 표지 부분이 10염기쌍이라면 410가지의 조합을 만들 수 있고, 3종류의 올리고뉴클레오티드의 식별 표지 부분을 조합하면 410×410×410가지의 경우의 수를 얻을 수 있어 아무리 다수의 차량이라도 이러한 조합을 이용하여 확인할 수 있다. 여기서, 상기 3종의 올리고뉴글레오티드의 양말단의 15염기쌍은 서로 다른 프라이머가 사용될 수 있도록 설계하는 것이 좋으며, 이러한 말단 서열이 중간의 식별 표지 영역의 서열과 동일한 서열이 되지 않도록 설계해야 한다.In addition, when a large number of objects to be searched, such as a vehicle, the first oligonucleotide, the second oligonucleotide, and the third oligonucleotide may be used in combination. If the identification label portion of each oligonucleotide is 10 base pairs, 4 10 kinds of combinations can be made. If the identification label portions of three types of oligonucleotides are combined, the number of 4 10 × 4 10 × 4 10 cases can be obtained. However many vehicles can be identified using this combination. Here, the 15 base pairs of the sock ends of the three oligonucleotides may be designed so that different primers may be used, and the terminal sequence should be designed so that the terminal sequence is not the same sequence as that of the intermediate identification label region.

염기 서열 조합을 통하여 얻어진 식별 표지 부분을 가진 올리고뉴클레오티드를 표지체로서 활용할 경우, 올리고뉴클레오티드의 표지 방법 및 올리고뉴클레오티드 표지체의 분석을 통한 식별표지 인식 방법은 다음과 같다. When using an oligonucleotide having an identification label portion obtained through the base sequence combination as a label, the method for labeling the oligonucleotide and the method for recognizing the identification label through analysis of the oligonucleotide label are as follows.

본 발명에 있어서, 올리고뉴클레오티드 염기 서열은 중합효소연쇄반응(PCR)을 통한 증폭을 고려하여 설계한다. 보다 구체적으로는, 식별 표지를 부여하는 부분은 10개의 염기쌍의 조합으로 10염기쌍의 올리고뉴클레오티드를 합성(410가지의 식별표지가 부여가능)하고, 그 양편으로는 염기 서열이 이미 알려진 15염기쌍의 올 리고뉴클레오티드를 연결시켜 결과적으로 40염기쌍의 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 염기 서열이 이미 알려진 양말단의 15염기쌍 부분들은 중합효소연쇄반응 (PCR)수행시 전방향 프라이머와 후방향 프라이머에 대한 주형 역할을 하게 된다. 표지하여야 하는 대상에 따라, 식별 표지 부여 부분(10mer)의 염기 서열을 10염기쌍이상으로 길게 함으로서, 식별 표지의 경우의 수를 늘릴 수 있어서, 더 많은 대상에 식별 표지를 부여할 수 있다.In the present invention, the oligonucleotide base sequence is designed in consideration of amplification through polymerase chain reaction (PCR). More specifically, the part to which an identification label is assigned synthesizes 10 base pair oligonucleotides by combination of 10 base pairs (4 10 types of identification labels can be given), and both bases of the 15 base pair whose base sequence are already known Oligonucleotides are linked to result in the synthesis of 40 base pairs of oligonucleotides. The 15 base pair portions of the sock end, of which the nucleotide sequence is already known, serve as a template for the forward primer and the backward primer during polymerase chain reaction (PCR). Depending on the object to be labeled, by lengthening the base sequence of the identification labeling portion 10mer by 10 base pairs or more, the number of cases of the identification label can be increased, so that the identification label can be given to more objects.

사용하고자 하는 올리고뉴클레오티드는 다음과 같이 설계하였다. The oligonucleotide to be used was designed as follows.

1) 식별 표지 영역 서열 디자인1) Identification Labeling Region Sequence Design

기본 디자인 알고리즘은 스미스(Smith)등의 방법을 이용하였다. 먼저 각 올리고머마다 고유의 식별 표지 서열을 무작위로 만들어낸다. 식별 표지 서열을 국부 정렬(local alignment)를 시켜 식별 표지 서열간에 유사성이 존재하는 것들은 제외시키고 서로간에 교차 혼성화(cross hybridization)되는 것들도 제외시킨다 (Smith, T.F., and M.S. Waterman, 1981. Identification of common molecular subsequences. J. Mol. Biol. 147, 195-197). 이같은 과정을 동적 프로그래밍 (dynamic programing)방법으로 구현했으며, 유사성 측정시 사용한 변수는 미스매치 패널티(mismatch panelty) 3, 매치 스코어(match score) 10, 갭 패널티(gap panelty) 3으로 정했다. 상기 과정을 통하여 얻어진 국부 정렬(local alignment)값이 75보다 낮은 값만을 취하였다. 상기 과정을 통해 식별표지 올리고머 서열을 생성해 냈으며, 결과를 데이터베이스화하였다.The basic design algorithm used Smith et al. First, a unique identification label sequence is generated randomly for each oligomer. Local alignment of identification label sequences excludes similarities between the identification label sequences and those that cross hybridize with each other (Smith, TF, and MS Waterman, 1981. Identification of common molecular) subsequences. J. Mol. Biol. 147, 195-197). This process was implemented by dynamic programming, and the variables used to measure similarity were defined as mismatch penalty 3, match score 10, and gap panel 3. Only local alignment values obtained through the above procedure were lower than 75. Through this procedure, the identification oligomeric sequence was generated and the results were databased.

2) 가장자리 서열 디자인 2) edge sequence design                     

상기에서와 같이 15염기쌍(15mer)의 올리고머 서열을 무작위로 만들어 낸 후, 그 중에서 녹는점(Tm, Melting Temperature)값이 50 내지 55℃ 사이가 되는 염기 서열만을 선택한다. 이때, 녹는점 값은 인접 빈도(nearest-neighbor)방법으로 구한다(Breslauer, K.J., Frank, R., Blocker,H., and Marky,L.A. , 1986, Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 3746-3750). 이 방법은 GC값(Guanine-Cytosine content value)을 이용한 방법보다 정확한 것으로 알려져 있다. 이같이 얻어진 올리고머는 중합효소연쇄반응(PCR)을 통한 증폭시 서로 교차 혼성화(cross hybridization)되는 경우에 실험에 치명적인 결과를 유발할 수 있다. 따라서, 상기 문제점을 해결하기 위해 전방향 프라이머와 후방향 프라이머간에 국부 정렬(local alignment)를 수행하여 그 값이 50보다 낮은 올리고머를 취하였다. 또한, 왼쪽 올리고머(전방향 프라이머, FOR)값과 식별표지 서열값과 오른쪽 올리고머(후방향 프라이머,REV)의 값의 합이 100보다 낮은 것만을 최종적으로 택하여 서로간의 교차 혼성화(cross hybridization)가 되지 않도록 하였다. 이때 수행되어진 변수는 미스매치 패널티(mismatch panelty) 5, 매치 스코어(match score) 10, 갭 패널티(gap panelty) 5로 정했다.As described above, after randomly generating oligomeric sequences of 15 base pairs (15mer), only base sequences having a melting point (Tm, Melting Temperature) value between 50 and 55 ° C are selected. At this time, the melting point value is obtained by a neighbor-neighbor method (Breslauer, KJ, Frank, R., Blocker, H., and Marky, LA, 1986, Predicting DNA duplex stability from the base sequence.Proc.Natl Acad.Sci. USA, 83, 3746-3750). This method is known to be more accurate than the method using the Guanine-Cytosine content value. The oligomers thus obtained can cause fatal results in the case of cross hybridization with each other during amplification through polymerase chain reaction (PCR). Therefore, in order to solve the problem, a local alignment was performed between the forward primer and the backward primer to obtain an oligomer having a value lower than 50. In addition, only the sum of the value of the left oligomer (forward primer, FOR), the identification sequence value, and the value of the right oligomer (rear primer, REV) is less than 100. It was not. Variables performed at this time were determined as mismatch panel 5, match score 10, and gap panel 5.

상기와 같이, 디자인된 올리고뉴클레오티드를 자동 올리고뉴클레오티드 합성장치를 이용하여 합성하고 정제한 후 올리고뉴클레오티드 수용액과 유기 용매(톨루엔 또는 에틸에테르 사용)를 상전환촉매(PTC)와 함께 넣고 충분히 혼합한 후 층분리시킨 다음, 유기용매층만을 분리하고 수용액층에 올리고뉴클레오티드가 자외선(UV)에 보이지 않을 때까지 이 과정을 반복한다. 이 과정을 통해 얻어진 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드들은 유기 용매에 대하여 균일한 상을 형성하여 극저농도로 유기 용매 내에 분산이 가능하게 된다. 이렇게 함으로써 기존의 수용성인 올리고뉴클레오티드를 간단한 방법으로 지용성으로 바꿀 수 있게 된다.As described above, the synthesized oligonucleotide is synthesized and purified using an automatic oligonucleotide synthesizer, and then an aqueous oligonucleotide solution and an organic solvent (using toluene or ethyl ether) are added together with a phase inversion catalyst (PTC), followed by sufficient mixing. After separation, only the organic solvent layer is separated and the process is repeated until the oligonucleotides are not visible in the aqueous solution layer. The oligonucleotides combined with the phase inversion catalyst obtained through this process form a uniform phase with respect to the organic solvent, and can be dispersed in the organic solvent at extremely low concentration. This makes it possible to convert existing water-soluble oligonucleotides into fat-soluble in a simple way.

상기 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드는 친유성 물질, 예를 들어 자동차 피복용 페인트, 락카, 도로 차선 표시용 페인트, 석유, 페인트 희석제, 화약, 천연 오일, 건축용 페인트, 유기 용매, 접착제, 유성 물감, 육류 및 해산물과 같은 유성 제품 중에서 선택하여 사용할 수 있게 된다.Oligonucleotides combined with the phase inversion catalyst are lipophilic materials, such as automotive coating paints, lacquers, road lane marking paints, petroleum, paint thinners, gunpowder, natural oils, construction paints, organic solvents, adhesives, oil paints Oily products such as fish, meat and seafood are available for selection.

그러나, 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드의 염기의 아민기나 산소 및 당의 수산화기는 친유성 물질의 종류에 따라 상기 친유성 물질과 반응성을 가지게 되어 상기 올리고뉴클레오티드를 친유성 물질에 바로 혼합하게 되면 친유성 물질과 화학 반응을 일으켜서 추후 올리고뉴클레오티드 회수 단계에서 상기 올리고뉴클레오티드가 제대로 회수되지 않는 문제가 발생한다.However, the amine group of the base of the oligonucleotide combined with the phase inversion catalyst or the hydroxyl group of oxygen and sugar have reactivity with the lipophilic substance according to the type of lipophilic substance, and when the oligonucleotide is directly mixed with the lipophilic substance, There is a problem that the oligonucleotide is not properly recovered in the oligonucleotide recovery step by causing a chemical reaction with the substance.

따라서, 상기 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드를 친유성 물질에 첨가하기 이전에 할로겐화 아실과 같은 반응성 차단 보호기를 도입하여 친유성 물질과 반응이 가능한 부분을 먼저 보호시키는 반응을 도입시켜 반응성을 차단하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 상기 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드에 도입시키는 할로겐화 아실로서 반응성이 없는 치환체를 갖는 아세틸 클로라이드를 사용하거나, 페인트의 구성 수지와 강한 화학적 결합이 가능한 치환체를 갖는 아크릴로일 클로라이드를 사용하였다. 그 결과, 하기 실시예에서 나타나는 것처럼 원 래의 올리고뉴클레오티드 모두 회수 가능한 결과를 얻었다.Therefore, prior to adding the oligonucleotides associated with the phase inversion catalyst to the lipophilic substance, a reactive blocking protecting group such as acyl halide is introduced to protect the portion capable of reacting with the lipophilic substance, thereby blocking the reactivity. It is preferable. In the present invention, acetyl chloride having an inactive substituent is used as the halogenated acyl introduced into the oligonucleotide combined with the phase inversion catalyst, or acryloyl chloride having a substituent capable of strong chemical bonding with the constituent resin of the paint is used. . As a result, all of the original oligonucleotides were recovered as shown in the following Examples.

상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체를 친유성 물질에 첨가시킨 후, 이들로부터 다시 올리고뉴클레오티드를 회수하는 방법은 다음과 같다. 예를 들면, 상전환 촉매가 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체가 첨가된 페인트 조각으로부터 올리고뉴클레오티드를 추출하는 과정은 페인트 조각을 유기 용매로 처리하여 미량의 올리고뉴클레오티드 유도체를 용해시켜 추출한 뒤, 추출된 올리고뉴클레오티드 유도체를 암모니아로 처리하여 반응성 차단 보호기를 제거하여 원래 올리고뉴클레오티드가 갖고 있던 포스포디에스테르 구조로 환원시킨다.The method for recovering the oligonucleotide from the oligonucleotide derivatives combined with the phase inversion catalyst to the lipophilic substance and then again is as follows. For example, the process of extracting an oligonucleotide from a piece of paint to which an oligonucleotide derivative to which a phase inversion catalyst is bound is extracted by dissolving a small amount of oligonucleotide derivative by treating the paint piece with an organic solvent, and then extracting the extracted oligonucleotide derivative. Is treated with ammonia to remove the reactive blocking protecting group and reduced to the phosphodiester structure originally possessed by the oligonucleotide.

이렇게 추출된 올리고뉴클레오티드로부터 원래의 물체를 추적 및 확인하는 방법은 다음과 같다. 암모니아로 처리하여 보호기를 제거하여 얻어진 올리고뉴클레오티드를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통하여 증폭한다. 이 때, 40염기쌍(40mer)의 염기 배열 중 양말단의 15염기쌍(15mer)은 그 서열이 알려져 있으므로 그 염기서열에 맞춰 제작된 프라이머를 각각 전방향 프라이머와 후방향 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 증폭한 후, 증폭된 산물을 염기서열 분석반응을 수행함으로써 중앙에 위치한 10염기쌍(10mer)의 염기서열을 밝혀내어 그 서열에 해당하는 식별표지로 표지된 물체를 추적 및 확인한다. 이러한 과정을 통하여 물체의 정체를 알아낼 수 있게 된다.The method of tracking and confirming the original object from the extracted oligonucleotide is as follows. The oligonucleotide obtained by treatment with ammonia to remove the protecting group is amplified by polymerase chain reaction (PCR). At this time, 15 base pairs (15mer) of the sock end of the base sequence of 40 base pairs (40mer) is known, so that the polymerase chain reaction using primers prepared according to the base sequence as the forward primer and the backward primer, respectively After amplification through PCR, the amplified product is subjected to sequencing to identify the base sequence of 10 base pairs (10mers) located at the center, and to track and confirm the object labeled with the identification label corresponding to the sequence. . Through this process, it is possible to find out the identity of an object.

이하 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 보통의 범위가 하기 실시예의 내용으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, but the general scope of the present invention is not limited to the following Examples.

실시예 1Example 1

올리고뉴클레오티드의 농도 결정Determination of Oligonucleotide Concentration

페인트와 첨가할 올리고뉴클레오티드의 농도를 결정하기 위해서 40염기쌍 (40mer)크기의 올리고뉴클레오티드를 합성하여 10pmole/㎕부터 1ztmole/㎕까지 10배를 단계적으로 희석(serial dilution)하여 중합효소연쇄반응(PCR)로 증폭하였다. 증폭 후 그 산물을 아가로스겔에서 전기영동하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 올리고뉴클레오티드의 농도가 1ztmole인 경우에도 중합효소연쇄반응(PCR)을 통하여 잘 증폭됨을 확인할 수 있었다. To determine the concentration of the oligonucleotide to be added to the paint, 40-base pair (40mer) oligonucleotides were synthesized, and serial dilution was performed 10 times from 10 pmole / μl to 1ztmole / μl to polymerase chain reaction (PCR). Amplified by. After amplification, the product was electrophoresed on agarose gel, and the results are shown in FIG. 3. As shown in FIG. 3, even when the concentration of the oligonucleotide was 1 ztmole, it was confirmed that the amplification was well through the polymerase chain reaction (PCR).

따라서, 본 실시예에서는 페인트에 첨가할 올리고뉴클레오티드 양 및 페인트 조각에서 올리고뉴클레오티드를 분리할 때 망실될 수 있는 양을 고려하여 페인트와 혼합할 올리고뉴클레오티드 농도를 100atmole로 결정했고 다음 실험에 사용하였다. 도 3에서 각 레인은 올리고뉴클레오티드 농도를 나타내는 것으로, 레인 1은 10pmole, 레인 2는 1pmole, 레인 3은 100ftmole, 레인 4는 10ftmole, 레인 5는 1ftmole, 레인 6은 100atmole, 레인 7은 10atmole, 레인 8은 1atmole, 레인 9는 1atmole, 레인 10은 100ztmole, 레인 11은 10ztmole, 레인 12는 1ztmole를 나타낸다.Therefore, in this example, the oligonucleotide concentration to be mixed with the paint was determined to be 100 atmole in consideration of the amount of oligonucleotide to be added to the paint and the amount to be lost when separating the oligonucleotide from the paint piece, and was used in the next experiment. In Figure 3, each lane represents the oligonucleotide concentration, lane 1 is 10pmole, lane 2 is 1pmole, lane 3 is 100ftmole, lane 4 is 10ftmole, lane 5 is 1ftmole, lane 6 is 100atmole, lane 7 is 10atmole, lane 8 Is 1 atmole, lane 9 is 1 atmole, lane 10 is 100 ztmole, lane 11 is 10 ztmole, and lane 12 is 1 ztmole.

실시예 2Example 2

상전환 촉매(PTC)에 의한 올리고뉴클레오티드의 유기 용매에 대한 용해성 검사.Solubility Test of Organic Oligonucleotides by Phase Inversion Catalyst (PTC).

원하는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 자동 올리고뉴클레오티드 합성 장치를 이용하여 합성하고 정제한 후, 올리고뉴클레오티드 수용액과 톨루엔 또 는 에틸에테르등의 유기 용매에 상전환 촉매(PTC)와 함께 충분히 혼합한 후 층분리시킨 다음, 유기용액층만을 분리하고 수층에 존재하는 올리고뉴클레오티드가 자외선(UV)에 보이지 않을 때까지 이 과정을 반복하였다. 상전환 촉매(PTC)로서 테트라 부틸암모니움 하이드록사이드와 헥사데실 트리메틸 암모니움 브로마이드를 이용하여 자외선(UV)빛 흡수에 의한 검사를 거친 결과, 상전환 촉매(PTC)를 넣지 않을 때에는 모두 수층 (5ml)에만 용해되어 있던 올리고뉴클레오티드에 상전환 촉매(PTC)를 첨가한 결과 유기용매층(톨루엔 또는 에틸에테르 5ml)에서 추출되는 것을 확인하였다.The oligonucleotide having the desired base sequence is synthesized and purified using an automatic oligonucleotide synthesis apparatus, and then sufficiently mixed with an aqueous oligonucleotide solution and an organic solvent such as toluene or ethyl ether together with a phase inversion catalyst (PTC), followed by layer separation. Then, only the organic solution layer was separated and the process was repeated until the oligonucleotides in the aqueous layer were not visible in the ultraviolet (UV). As a phase shift catalyst (PTC), it was tested by ultraviolet (UV) light absorption using tetra butyl ammonium hydroxide and hexadecyl trimethyl ammonium bromide. It was confirmed that the phase shift catalyst (PTC) was added to the oligonucleotide dissolved only in 5 ml) and extracted from the organic solvent layer (5 ml of toluene or ethyl ether).

유기용매층의 추출을 5회 이상(5ml) 반복한 후, 수층을 자외선(UV)으로 검사한 결과, 대부분의 올리고뉴클레오티드는 유기용매층에 용해되고 수층에는 거의 남아 있지 않음을 알 수 있었다. 또한, 유기용매층에 녹아 있는 상전환 촉매(PTC)와 결합된 올리고뉴클레오티드를 말디-토프 질량 분석기(Maldi-Tof mass spectrum)으로 측정한 결과 변함없이 처음의 올리고뉴클레오티드임을 확인하였다.After the extraction of the organic solvent layer was repeated five times or more (5 ml), the aqueous layer was examined by ultraviolet (UV), and it was found that most of the oligonucleotides were dissolved in the organic solvent layer and hardly remained in the aqueous layer. In addition, oligonucleotides coupled to the phase inversion catalyst (PTC) dissolved in the organic solvent layer were measured by Maldi-Tof mass spectrum, and as a result, it was confirmed that the oligonucleotide was the first oligonucleotide.

실시예 3Example 3

올리고뉴클레오티드에 보호기를 도입시키기 위한 보호반응실험 Protective reaction experiment to introduce protecting group into oligonucleotide

유기층에 용해된 상전환 촉매(PTC)와 결합된 40염기쌍(40mer)의 올리고뉴클레오티드를 페인트에 첨가하기 전에 올리고뉴클레오티드를 보호하기 위한 반응실험을 실시하였다. 실시예 2에서 얻어진 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드가 함유된 유기용매층을 과량의 아크릴로일 클로라이드와 반응시켰다. 상기 반응을 통하여 생성된 염(salt)을 수용액으로 추출하여 제거한 후, 유기용매층을 말디-토 프 질량 분석기(Maldi-Tof mass spectrum)을 이용하여 검사하여 계산된 값에 의하면 염기 하나당 평균 1.8개의 아크릴로일기로 치환되었다. 아크릴로일기는 케톤과 이중결합을 포함하고 있어서 페인트의 수지 성분과 첨가반응을 하여 공유결합을 할 수 있다. A reaction experiment was carried out to protect the oligonucleotides before adding 40 base pairs (40mer) of oligonucleotides combined with a phase inversion catalyst (PTC) dissolved in the organic layer to the paint. The organic solvent layer containing the oligonucleotide combined with the phase inversion catalyst obtained in Example 2 was reacted with excess acryloyl chloride. The salt generated through the reaction was extracted and removed by an aqueous solution, and then the organic solvent layer was examined by using a Maldi-Tof mass spectrum. Substituted with acryloyl group. The acryloyl group contains a ketone and a double bond, and thus can be covalently bonded by addition reaction with the resin component of the paint.

실시예 4Example 4

상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체와 페인트를 혼합하여 피복시키고 회수하는 실험 Experiment of coating and recovering a mixture of oligonucleotide derivatives combined with a phase inversion catalyst and paint

실시예 3의 과정을 거친 상전환 촉매와 결합된 40염기쌍(40mer)의 올리고뉴클레오티드 유도체를 자동차용 코팅 락카와 혼합한 다음, 피복시키고 회수하는 실험을 하였다. 자동차용 코팅 락카와 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체를 혼합시킨 후, 유리 표면에 피복한 후, 피복된 락카를 오븐에서 약 80℃이상으로 12시간 이상 건조시키고, 상온으로 냉각한 뒤, 세제와 물로 여러 번 세척하였다. 그 후, 락카로부터 다시 올리고뉴클레오티드를 회수하기 위해서, 남아 있는 락카 조각을 아세토나이트릴과 디메틸포름아미드(dimethylformamide,DMF)로 녹인 후, 락카와 올리고뉴클레오티드의 염기의 아민기와 당의 수산화기에 결합된 보호기를 제거하기 위해, 80℃에서 12시간이상 암모니아처리를 거쳤다. 그 후 에틸에테르를 이용하여 락카 성분을 추출하였고 수용액층만을 얻은 뒤, 짧은 Reverse-Phase컬럼을 통과시켜, 원래의 올리고뉴클레오티드 형태로 회수하였다. 회수된 올리고뉴클레오티드를 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 증폭시킨 후, 증폭된 산물을 가지고 염기서열 분석 반응을 수행하였다. 40 base pairs (40mer) oligonucleotide derivatives combined with the phase conversion catalyst after the process of Example 3 was mixed with a coating lacquer for automobiles, and then coated and recovered. After mixing the coating lacquer for automobile and the oligonucleotide derivative combined with the phase inversion catalyst, and coating it on the glass surface, the coated lacquer is dried in an oven at about 80 ° C. or more for at least 12 hours, cooled to room temperature, and then detergent And washed several times with water. Then, in order to recover the oligonucleotide from the lacca again, the remaining lacca fragment is dissolved with acetonitrile and dimethylformamide (DMF), and then the protecting group bound to the amine group of the base of the lacca and oligonucleotide and the hydroxyl group of the sugar To be removed, ammonia treatment was performed at 80 ° C. for at least 12 hours. Thereafter, the lacca component was extracted using ethyl ether, and only an aqueous layer was obtained, and then passed through a short reverse-phase column to recover the original oligonucleotide form. The recovered oligonucleotide was amplified by polymerase chain reaction (PCR), and then subjected to sequencing reaction with the amplified product.                     

상기 올리고뉴클레오티드의 중합효소연쇄반응(PCR) 및 염기서열을 분석하는 반응을 다음과 같이 수행하였다. 사용한 40염기쌍(40mer)의 올리고뉴클레오티드 서열은 5'- agc att ttg tgg ggc gtg ata gcc tcc ttg gcc gca aag a -3' 였고(서열번호 1), PCR 반응을 수행시 전방향 프라이머의 서열은 5'-agc att ttg tgg ggc-3'(15mer, 서열번호 2)를, 후방향 프라이머의 서열은 5'-ccg cga ggt ggt ggt ctt tgc ggc caa gg(29mer)-3' 를 사용하였다. 중합효소연쇄반응(PCR)의 효율을 높이기 위해서 후방향 프라이머의 서열을 15염기쌍(15mer)으로 하지 않고 29염기쌍(29mer, 서열번호 3)으로 하였다. 중합효소연쇄반응(PCR)을 통하여 증폭된 올리고뉴클레오티드를 염기서열분석하기 위해서 디엔에이 프렙메이트 II(DNA PrepMate II,㈜바이오니아 제품)로 정제한 후, 10% 폴리아크릴아마이드 겔에서 직접적인(direct) 염기서열 분석 (sequencing) 반응을 수행하였다. 그 결과를 도 4a와 도4b에 나타내었다. 도 4a는 본 발명에 따라 자동차 코팅 락카와 혼합하여 피복시킨 후 추출하여 중합효소 연쇄반응(PCR)로 증폭한 후 아가로스겔에 전기영동한 결과를 나타낸 것이다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의해 올리고뉴클레오티드가 정상적으로 회수됨을 알 수 있었다. 도 4b는 도 4a의 증폭 산물을 염기 서열 분석한 결과를 나타낸다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 처음 염기 서열과 결과 염기서열이 일치함을 알 수 있다. 특히, 전방향 프라이머와 후방향 프라이머를 제외한 식별표지영역을 나타내는 10개(gtg ata gcc t, 서열번호 4)의 염기서열이 일치함을 확인할 수 있어, 상기 10개의 염기서열을 서로 다르게 식별표지화함으로써 표지체로서 사용할 수 있음을 확인하였다. The reaction of analyzing the polymerase chain reaction (PCR) and the nucleotide sequence of the oligonucleotide was performed as follows. The oligonucleotide sequence of the 40 base pair (40mer) was 5'- agc att ttg tgg ggc gtg ata gcc tcc ttg gcc gca aag a -3 '( SEQ ID NO: 1 ). '-agc att ttg tgg ggc-3' (15mer, SEQ ID NO: 2 ) was used, and the sequence of the backward primer was 5'-ccg cga ggt ggt ggt ctt tgc ggc caa gg (29mer) -3 '. In order to increase the efficiency of the polymerase chain reaction (PCR), the rear primer sequence was set to 29 base pairs (29mer, SEQ ID NO: 3 ) instead of 15 base pairs (15mers). Direct sequencing on 10% polyacrylamide gel after purification with DNA PrepMate II (Bionia Co., Ltd.) for sequencing oligonucleotides amplified by polymerase chain reaction (PCR). Sequencing reactions were performed. The results are shown in FIGS. 4A and 4B. Figure 4a shows the result of electrophoresis on agarose gel after amplification by a polymerase chain reaction (PCR) by coating and then mixed with a coating coating car coating lacquer according to the present invention. As shown in Figure 4a, it can be seen that the oligonucleotide is normally recovered by the present invention. Figure 4b shows the results of sequencing the amplification product of Figure 4a. As shown in Figure 4b, it can be seen that the first nucleotide sequence and the resulting nucleotide sequence. In particular, it can be confirmed that the base sequences of ten (gtg ata gcc t, SEQ ID NO: 4 ) representing the identification marker region except for the forward primer and the backward primer are identical, and by differently identifying the 10 base sequences It was confirmed that it can be used as a label.

그러나, 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통한 증폭 산물을 바로 염기서열 분석반응에 적용한 경우 불순물이 나타나 사진이 선명하지 못하였고, 시퀀싱 프라이머가 붙는 위치 바로 다음의 염기가 분석되지 않는 현상이 관찰되어 이후에는 증폭 산물을 바로 염기서열 분석반응을 수행하지 않고 벡터(vector)에 클로닝한 후 염기서열 분석반응을 수행하였다. However, when the amplification product through PCR was applied directly to the sequencing reaction, impurities appeared and the photograph was not clear, and the base immediately after the sequencing primer was not analyzed. The amplification product was cloned into a vector without performing sequencing immediately and then subjected to sequencing.

처음 염기서열: 5'-agc att ttg tgg ggc gtg ata gcc tcc ttg gcc gca aag a -3' First Sequence: 5'-agc att ttg tgg ggc gtg ata gcc tcc ttg gcc gca aag a -3 '

결과 염기서열: 5'- g ata gcc tcc ttg gcc gca aag acc acc acc -3'(서열번호 5) Result Sequence: 5'- g ata gcc tcc ttg gcc gca aag a cc acc acc -3 '( SEQ ID NO: 5 )

도 4a에서 M은 사이즈 마커, 레인 1부터 레인 7은 100atmole/㎕ 올리고뉴클레오티드로 실험한 결과를 나타낸다. 도 4b에서 왼쪽의 4개의 레인은 본 발명에 따라 회수한 올리고뉴클레오티드의 염기서열을, 오른쪽 4개의 레인은 대조군으로서 자동차 코팅용 락카와 혼합하지 않고 그대로 염기서열을 분석한 결과를 나타낸다. In FIG. 4A, M denotes a size marker, and lanes 1 to 7 show results of experiments with 100 atmole / μL oligonucleotides. In FIG. 4B, the left four lanes show the nucleotide sequences of the oligonucleotides recovered according to the present invention, and the right four lanes show the nucleotide sequences as they are, without being mixed with a lacquer for automobile coating.

실시예 5Example 5

아세틸 치환체가 붙어 있는 올리고뉴클레오티드 유도체-PTC 결합체를 페인트와 코팅시키고 회수하는 실험 Experiment of coating and recovering oligonucleotide derivative-PTC conjugate with acetyl substituent with paint

실시예 3의 과정을 아크릴로일 클로라이드 대신 아세틸 클로라이드를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 수행하였다. 그 후, 상전환 촉매와 결합된 40염기쌍 (40mer)의 올리고뉴클레오티드 유도체를 실시예 4와 같은 과정으로 수행하여 중합효소연쇄반응(PCR)과 염기서열 분석을 수행하였다. 그 후 상기 중합효소연쇄반응 (PCR)을 통하여 증폭된 올리고뉴클레오티드를 염기서열 분석하기 위해서 디엔에이 프렙메이트 II(DNA PrepMate II,㈜바이오니아 제품)로 정제한 후, T-벡터(vector)로 클로닝하고, 10% 폴리아크릴아마이드 겔에서 T-벡터(vector)내의 T7 프로모터에 상보적인 T7 프라이머를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과를 도 5a와 도 5b로 나타내었다. 도 5a는 자동차 코팅 락카와 혼합하여 코팅시킨 후 추출하여 PCR로 증폭한 결과를 나타낸 것이다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라서 올리고뉴클레오티드가 정상적으로 회수됨을 알 수 있었다. 도 5b는 도 5a의 산물을 염기서열을 분석한 결과로서 처음의 염기서열과 정확히 일치함을 알 수 있었다. The procedure of Example 3 was carried out in the same manner except that acetyl chloride was used instead of acryloyl chloride. Thereafter, 40 base pair (40mer) oligonucleotide derivatives combined with a phase inversion catalyst were carried out in the same manner as in Example 4 to perform polymerase chain reaction (PCR) and sequencing. Thereafter, the oligonucleotides amplified by the polymerase chain reaction (PCR) were purified with DNA PrepMate II (Bionia Co., Ltd.) for sequencing, and then cloned into T-vectors. Sequences were analyzed using a T7 primer complementary to the T7 promoter in a T-vector on a 10% polyacrylamide gel. The results are shown in Figures 5a and 5b. Figure 5a shows the result of amplification by PCR after coating and coating the mixture with car coating lacquer. As shown in Figure 5a, it can be seen that the oligonucleotide is normally recovered according to the present invention. 5b shows that the product of FIG. 5a is identical to the first nucleotide sequence as a result of analyzing the nucleotide sequence.

처음 염기서열: 5'-agc att ttg tgg ggc gtg ata gcc tcc ttg gcc gca aag a-3' First Sequence: 5'-agc att ttg tgg ggc gtg ata gcc tcc ttg gcc gca aag a-3 '

결과 염기서열: 5'-ggt ggt ctt tgc ggc caa gga ggc tat cac gcc cca caa aat gct-3'(후방향(reverse)으로 클로닝 됨, 서열번호 6)Result Sequence: 5'-ggt gg t ctt tgc ggc caa gga ggc tat cac gcc cca caa aat gct -3 '(cloned in reverse, SEQ ID NO: 6 )

분석 염기서열: 5'-agc att ttg tgg ggc gtg ata gcc tcc ttg gcc gca aag acc acc-3'(서열번호 7) Analytical Sequence: 5'- agc att ttg tgg ggc gtg ata gcc tcc ttg gcc gca aag a cc acc-3 '( SEQ ID NO: 7 )

도 5a에서 M은 사이즈 마커, 레인 1부터 레인 7은 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체를 자동차용 코팅 락카와 혼합한 후, 회수하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통하여 증폭한 후 아가로스겔에 전기영동한 사진이다. 도 5b는 도 5a의 산물을 본 실시예에 따라 염기 서열을 분석한 결과를 나타내는 것으로 본 발명에 따라서 염기서열이 처음서열과 일치함을 알 수 있다. In Figure 5a, M is a size marker, lanes 1 to 7 are oligonucleotide derivatives combined with a phase inversion catalyst mixed with a coating lacquer for automobiles, and then recovered and amplified by polymerase chain reaction (PCR), followed by agarose gel. It is photographed electrophoresis on. 5B shows the result of analyzing the nucleotide sequence of the product of FIG. 5A according to the present embodiment, and it can be seen that the nucleotide sequence is identical to the first sequence according to the present invention.

실시예 6Example 6

상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드(A)와 상전환 촉매와 결합된 올리 고뉴클레오티드 유도체(B)를 페인트와 혼합하여 피복시키고 회수하는 실험 Experiment to coat and recover oligonucleotide (A) combined with phase inversion catalyst and oligonucleotide derivative (B) combined with phase inversion catalyst by mixing with paint

실시예 2의 반응을 거친 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드(A)와 실시예 3의 과정을 거친 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체(B)를 페인트의 종류를 달리하여 혼합, 건조 후, 실시예 4에서와 동일한 회수과정을 거친 후, 중합효소연쇄반응(PCR)과 염기 서열 분석 반응을 하였다. 그 결과를 도 6a와 6b에 나타내었다. 도 6a에서 레인 1은 결합체 A를 우레탄 페인트와 혼합한 후 회수한 결과를, 레인 2는 결합체 A를 자동차용 코팅 페인트와 혼합한 후 회수한 결과를, 레인 3은 결합체 B를 자동차용 코팅 페인트와 혼합한 후 회수한 결과를 나타낸 것으로 도면에 나타낸 바와 같이 레인 2의 결합체 A는 제대로 회수가 되지 않았다. 그 후 염기 서열을 분석 반응을 수행하여 염기 서열을 분석한 결과 다음과 같았다. 예상 염기서열: 5'-agc att ttg tgg ggc tgc ctg gcg ccc ttg gcc gca aag acc acc acc tcg cgg-3'(서열번호 8)After mixing and drying the oligonucleotide (A) combined with the phase inversion catalyst after the reaction of Example 2 and the oligonucleotide derivative (B) combined with the phase inversion catalyst after the process of Example 3 with different kinds of paints, After the same recovery process as in Example 4, polymerase chain reaction (PCR) and sequencing reactions were performed. The results are shown in Figures 6a and 6b. In FIG. 6A, lane 1 shows a result obtained by mixing binder A with a urethane paint, and lane 2 shows a result obtained by mixing binder A with a coating paint for automobiles, and lane 3 shows a result of combining binder B with a coating paint for automobiles. As shown in the figure, the result of recovery after mixing was shown. As shown in FIG. Thereafter, the base sequence was analyzed by analyzing the base sequence, and the results were as follows. Expected Sequence: 5'-agc att ttg tgg ggc tgc ctg gcg ccc ttg gcc gca aag acc acc tcg cgg-3 '( SEQ ID NO: 8 )

레인 1의 결과 염기서열(A): 5'-agc att ttg tgg ggc tgc ctg gcg ccc ttg gcc gca aag acc acc acc tcg c-3'(서열번호 9)Resulting sequence of lane 1 (A): 5'-agc att ttg tgg ggc tgc ctg gcg ccc ttg gcc gca aag acc acc tcg c-3 '( SEQ ID NO: 9 )

레인 3의 결과 염기서열(B): 5'-agc att ttg tgg ggc tgc ctg gcg gcc cac aaa atc gt-3'(서열번호 10)Result nucleotide sequence of lane 3 (B): 5'-agc att ttg tgg ggc tgc ctg gcg gcc cac aaa atc gt-3 '( SEQ ID NO: 10 )

자동차용 코팅 페인트와 혼합한 후 회수한 결합체A는 중합효소연쇄반응 (PCR)을 통한 증폭 산물을 정제하는 과정 중 아가로스겔에서 전기영동시킨 후 관찰한 결과, 겔에서 밴드가 제대로 형성되지 않았고 T-벡터를 이용하여 클로닝하는 과정에서 제대로 클로닝이 되지 않았다. 본 실시예에서 중합효소연쇄반응(PCR)시에 이용한 전방향 프라이머 서열은 agc att ttg tgg ggc이며, 그다음 10개(tgc ctg gcg c)의 서열은 표지체 역할을 하는 서열로서 염기서열이 정확히 일치함을 확인하였다. 후방향 프라이머의 서열은 5-cc ttg gcc gca aag acc acc acc tcg cgg-3'(29mer, 서열번호 11)를 사용하였다. 결합체 A는 페인트의 종류에 따라 결과가 달랐는데, 우레탄 페인트와 혼합한 경우에는 회수가 잘 되어 후에 염기서열이 잘 분석되었고, 자동차용 코팅 페인트와 혼합한 경우에는 제대로 클로닝이 되지 않아 염기서열을 분석하지 못했다. 이는 아민이나 산소부분의 보호 반응을 수행하지 않아서 올리고뉴클레오티드의 염기가 자동차용 코팅 페인트와 혼합시 직접적으로 반응하여 회수가 잘 되지 않았음을 보여준다. 도 6b에서 왼쪽 4개의 레인은 도6a 레인1의 올리고뉴클레오티드 서열을, 중앙의 4개의 레인은 레인2의 올리고뉴클레오티드 서열을, 오른쪽 4개의 레인은 레인3의 올리고뉴클레오티드 서열을 분석한 결과를 나타낸다.Conjugate A recovered after mixing with automotive coating paint was observed after electrophoresis on agarose gel during the purification of amplification products through polymerase chain reaction (PCR). -Cloning using vector did not work properly. In this embodiment, the forward primer sequence used during PCR was agc att ttg tgg ggc, and the next 10 sequences (tgc ctg gcg c) were sequenced as markers, and the base sequence was exactly identical. It was confirmed. The sequence of the backward primer was used 5-cc ttg gcc gca aag acc acc tcg cgg-3 '(29mer, SEQ ID NO: 11 ). The result of binder A was different according to the type of paint, but when it was mixed with urethane paint, the recovery was good and the sequence was well analyzed later. When it was mixed with automotive coating paint, the sequence was not properly cloned. I couldn't. This shows that the base of the oligonucleotide reacts directly when mixed with the automotive coating paint because the protection reaction of the amine or the oxygen moiety is not performed, and the recovery is poor. In FIG. 6B, the left four lanes show the oligonucleotide sequence of lane 1 of FIG. 6A, the four lanes in the middle, the oligonucleotide sequence of lane 2, and the right four lanes show the oligonucleotide sequence of lane 3.

실시예 7Example 7

서로 다른 3종의 올리고뉴클레오티드를 조합하여 사용Combination of three different oligonucleotides

본 실시예에서는 서로 다른 염기서열로 이루어진 40염기쌍(40mer)의 올리고뉴클레오티드를 조합하여 사용하였다. 여기서 각 올리고뉴클레오티드는 서로 다른 프라이머가 사용될 수 있도록 서열을 다르게 하였으며, 중앙의 식별표지 영역부분도 가장자리 서열과 겹치지 않도록 설계하였다. 이렇게 설계된 3종의 올리고머 서열은 다음과 같았다.In this example, a combination of 40 base pairs (40mer) of oligonucleotides consisting of different base sequences was used. Here, each oligonucleotide has a different sequence so that different primers can be used, and the central identification region is also designed not to overlap with the edge sequence. The three oligomeric sequences thus designed were as follows.

올리고 서열 1: ctg atg ggc cgc aac ctt cag tac att ttg ggc gca cca t(서열번호 12)Oligo SEQ ID NO: 1: ctg atg ggc cgc aac ctt cag tac att ttg ggc gca cca t ( SEQ ID NO: 12 )

올리고 서열 2: tca ttc ccc gac cgg agc agt cga tgg cgt ttc acc ggg t(열번호 13)
올리고 서열 3: cgc gcg gtg ttg aat tca tgg cca gtg gaa cgc ttt ccg c(열번호 14)
Oligo sequence 2: tca ttc gac ccc cgg agc tgg cgt agt cga acc ggg ttc t (standing column No. 13)
Oligonucleotide SEQ ID 3: cgc gcg gtg ttg aat tca tgg cca gtg gaa cgc ttt ccg c (standing column No. 14)

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각 3종의 올리고뉴클레오티드를 실시예 2와 3의 과정을 수행한 다음, 실시예 4의 과정에 따라 상전환 촉매와 결합된 3종의 올리고뉴클레오티드 유도체를 자동차용 코팅 락카와 함께 혼합하여, 피복하고 건조시킨 후, 다시 피복된 락카로부터 올리고뉴클레오티드를 회수하였다. 회수된 올리고뉴클레오티드를 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 증폭시켰다. 그 결과를 도 7a에 나타내었다. 여기서 프라이머는 3종의 올리고뉴클레오티드에 맞게 서로 다른 3종의 프라이머쌍을 사용하였다. 사용된 프라이머 서열은 다음과 같았다.Each of the three oligonucleotides were subjected to the procedures of Examples 2 and 3, and then the three oligonucleotide derivatives combined with the phase inversion catalyst were mixed with the coating lacquer for automobiles and coated according to the procedure of Example 4. After drying, the oligonucleotides were recovered from the coated lacquer again. The recovered oligonucleotides were amplified by polymerase chain reaction (PCR). The results are shown in Figure 7a. Here, primers were used in three different primer pairs to match the three oligonucleotides. Primer sequences used were as follows.

프라이머 1(전방향: ctg atg ggc cgc aac 서열번호 15, 후방향: atg gtg cgc cca aaa 서열번호 16)Primer 1 (forward: ctg atg ggc cgc aac SEQ ID NO: 15 , backward: atg gtg cgc cca aaa SEQ ID NO: 16 )

프라이머 2(전방향: tca ttc ccc gac cgg 서열번호 17, 후방향: acc cgg tga aac gcc 서열번호 18)Primer 2 (forward: tca ttc ccc gac cgg SEQ ID NO: 17 , backward: acc cgg tga aac gcc SEQ ID NO: 18 )

프라이머 3(전방향: cgc gcg gtg ttg aat 서열번호 19, 후방향: gcg gaa agc gtt cca 서열번호 20)Primer 3 (forward: cgc gcg gtg ttg aat SEQ ID NO: 19 , backward: gcg gaa agc gtt cca SEQ ID NO: 20 )

이어서, PCR 증폭산물을 가지고 염기서열 분석 반응을 수행하였다. 그 결과를 도 7b에 나타내었다. 도 7a에서 M은 사이즈 마커를, 레인 1과 레인 2는 프라이머 1로 PCR 증폭한 결과, 레인 3과 4는 프라이머 2로 증폭한 결과, 레인 5와 레인 6은 프라이머 3으로 증폭한 결과를 나타내고, 도 7b에서 왼쪽의 4개의 레인은 올리고뉴클레오티드 1을, 중앙의 4개의 레인은 올리고뉴클레오티드 2를, 오른쪽의 4개의 레인은 올리고뉴클레오티드 3을 나타낸다. 염기서열을 분석한 결과 원래의 올리고뉴클레오티드 서열과 동일함을 확인하였다. 따라서, 3종의 서로 다른 올리고뉴클레오티드를 조합하여 원래의 서열을 확인할 수 있었다. 그러므로, 실제 적용시 서로 다른 서열로 이루어진 2종 이상의 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티 드 유도체를 조합하여 사용할 수 있었다. 따라서, 더욱 많은 조합수가 생성되므로 식별해야 할 물체가 많을 경우에 효율적으로 사용될 수 있다.Subsequently, sequencing reactions were performed with the PCR amplification products. The results are shown in Figure 7b. In FIG. 7A, M is a size marker, lanes 1 and 2 are PCR amplified by primer 1, lanes 3 and 4 are amplified by primer 2, and lanes 5 and 6 are amplified by primer 3. In FIG. 7B, the four lanes on the left represent oligonucleotide 1, the four lanes in the middle represent oligonucleotide 2, and the four lanes on the right represent oligonucleotide 3. Analysis of the nucleotide sequence confirmed that it is identical to the original oligonucleotide sequence. Therefore, the original sequence was confirmed by combining three different oligonucleotides. Therefore, in practical applications, oligonucleotide derivatives bound to two or more phase inversion catalysts of different sequences could be used in combination. Therefore, more combinations are generated and can be used efficiently when there are many objects to identify.

본 발명은 유성제품 내에서 강한 안정성과 결합성을 유지하여 외부 조건에 의한 변형 및 유실을 최소화하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다.The present invention is to provide an oligonucleotide that maintains strong stability and binding in the oil-based product to minimize modification and loss due to external conditions.

본 발명의 의하면, 유기 용매에 용해되는 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체를 각종 친유성 물질에 첨가시키면, 후에 이들의 물체로부터 다시 올리고뉴클레오티드를 추출하여 분석함으로써 물체를 추적 및 확인할 수 있다. 즉, 상기 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드 유도체를 페인트에 첨가하여 차에 피복하면, 후에 소량의 페인트 파편으로부터 식별 표지 서열을 확인하여, 원래의 차량을 추적할 수 있으므로 유용하게 쓰일 수 있으며, 또한 이와 유사한 다양한 용도에 쓰일 수 있다.According to the present invention, when an oligonucleotide derivative combined with a phase inversion catalyst dissolved in an organic solvent is added to various lipophilic substances, the object can be tracked and confirmed by later extracting and analyzing the oligonucleotide from these objects. That is, when the oligonucleotide derivatives combined with the phase inversion catalyst are added to the paint and then coated on the car, the identification label sequence can be later identified from a small amount of paint debris, so that the original vehicle can be traced. It can be used for a variety of similar uses.

현재 사회적으로 증가하고 있는 교통사고에 있어서, 사고 차량의 도주시 차량으로부터 떨어진 페인트 조각으로부터 원래의 차량을 추적 및 확인할 수 있게 됨으로써 사회적 범죄를 줄일 수 있는 동기 부여를 할 뿐 아니라 결정적인 증거를 확보함으로써 억울한 사례를 줄일 수 있으며 동시에 사회 범죄로부터의 안전망을 확보할 수 있게 된다.In today's socially increasing traffic accidents, it is not only possible to motivate to reduce social crime, but also to obtain conclusive evidence by being able to track and verify the original vehicle from pieces of paint away from the vehicle when the accident vehicle escapes. It can reduce cases and at the same time secure a safety net from social crime.

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Claims (24)

4차 암모늄염을 갖는 화합물 또는 양이온계 계면활성제인 상전환 촉매(PTC, phase transfer catalyst)와 올리고뉴클레오티드가 결합된 물체 감식 표지용 올리고뉴클레오티드.Oligonucleotide for object identification label in which a phase transfer catalyst (PTC) and an oligonucleotide are combined with a compound having a quaternary ammonium salt or a cationic surfactant. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 20 내지 1,000염기쌍으로 이루어진 것임을 특징으로 하는 물체 감식 표지용 올리고뉴클레오티드.According to claim 1, wherein the oligonucleotide is an object identification label oligonucleotide, characterized in that consisting of 20 to 1,000 base pairs. 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 상전환 촉매가 테트라부틸암모니움 하이드로퍼옥사이드 또는 헥사데실 트리메틸 암모니움 브로마이드인 것을 특징으로 하는 물체 감식 표지용 올리고뉴클레오티드.The oligonucleotide according to claim 1, wherein the phase inversion catalyst is tetrabutylammonium hydroperoxide or hexadecyl trimethyl ammonium bromide. 제1항에 있어서, 상기 물체 감식 표지용 올리고뉴클레오티드에 할로겐화 아실 또는 질소와 아마이드 결합을 하고 산소와 에스테르 결합을 하는 카보닐 화합물, N-Si와 O-Si결합을 하는 실라닐화합물, N-S와 O-S결합을 하는 술포닐화합물, N-C와 O-C결합을 하는 포화 또는 불포화탄화수소, 방향족탄화수소, 헤테로원자가 포함된 포화 또는 불포화탄화수소로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 반응성 차단 보호기가 추가로 더 결합된 것임을 특징으로 하는 물체 감식 표지용 올리고뉴클레오티드.The method according to claim 1, wherein the object identification label oligonucleotide is a halogenated acyl or a carbonyl compound having an amide bond with nitrogen and an ester bond with oxygen, a silanyl compound having an N-Si and O-Si bond, NS and OS Reactive blocking protecting group, which is any one selected from the group consisting of a sulfonyl compound to be bonded, a saturated or unsaturated hydrocarbon which is OC-bonded with NC, an aromatic hydrocarbon, and a saturated or unsaturated hydrocarbon containing a hetero atom, is further bonded. Oligonucleotide for object identification label to be. 삭제delete 삭제delete 제5항에 있어서, 상기 할로겐화 아실이 아세틸클로라이드 및 아크릴로일클로라이드로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 물체 감식 표지용 올리고뉴클레오티드.The oligonucleotide for object identification label according to claim 5, wherein the halogenated acyl is selected from the group consisting of acetyl chloride and acryloyl chloride. 1)유기용매중에서 4차 암모늄염을 갖는 화합물 또는 양이온계 계면활성제인 상전환 촉매와 올리고뉴클레오티드간에 결합을 형성시키는 단계;1) forming a bond between the oligonucleotide and the phase inversion catalyst which is a compound having a quaternary ammonium salt or a cationic surfactant in an organic solvent; 2)상전환 촉매가 결합된 올리고뉴클레오티드에 할로겐화 아실 또는 질소와 아마이드 결합을 하고 산소와 에스테르 결합을 하는 카보닐 화합물, N-Si와 O-Si결합을 하는 실라닐화합물, N-S와 O-S결합을 하는 술포닐화합물, N-C와 O-C결합을 하는 포화 또는 불포화탄화수소, 방향족탄화수소, 헤테로원자가 포함된 포화 또는 불포화탄화수소로 이루어진 군에서 선택되는 반응성 차단 보호기를 결합시켜 반응성을 제거하는 단계; 2) Carbonyl compounds having halogenated acyl or amide bonds with nitrogen and ester bonds with oxygen, silanyl compounds having N-Si and O-Si bonds to the oligonucleotides to which the phase inversion catalyst is bound, and OS bonds with NS Combining a reactive blocking protecting group selected from the group consisting of a sulfonyl compound, a saturated or unsaturated hydrocarbon having an OC bond with NC, an aromatic hydrocarbon, and a saturated or unsaturated hydrocarbon including a hetero atom to remove reactivity; 를 포함하는 상전환 촉매가 결합된 물체 감식 표지용 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.Method for producing an object identification label oligonucleotides is coupled to a phase inversion catalyst comprising a. 제9항에 있어서, 상기 상전환 촉매가 테트라부틸암모니움 하이드로퍼옥사이드 또는 헥사데실 트리메틸 암모니움 브로마이드인 것임을 특징으로 하는 물체 감식 표지용 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.The method of claim 9, wherein the phase inversion catalyst is tetrabutylammonium hydroperoxide or hexadecyl trimethyl ammonium bromide. 삭제delete 제9항에 있어서, 상기 할로겐화 아실이 아세틸클로라이드 또는 아크릴로일클로라이드를 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 물체 감식 표지용 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.10. The method of claim 9, wherein the halogenated acyl is selected from the group containing acetyl chloride or acryloyl chloride. 4차 암모늄염을 갖는 화합물 또는 양이온계 계면활성제인 상전환 촉매와 결합된 올리고뉴클레오티드를 할로겐화 아실 또는 질소와 아마이드 결합을 하고 산소와 에스테르 결합을 하는 카보닐 화합물, N-Si와 O-Si결합을 하는 실라닐화합물, N-S와 O-S결합을 하는 술포닐화합물, N-C와 O-C결합을 하는 포화 또는 불포화탄화수소, 방향족탄화수소, 헤테로원자가 포함된 포화 또는 불포화탄화수소로 이루어진 군에서 선택되는 반응성 차단기로 보호시킨 물체 감식 표지체를 식별하고자 하는 물체에 첨가하는 단계를 포함하는 물체 식별 표지 방법.Oligonucleotide combined with a compound having a quaternary ammonium salt or a phase inversion catalyst, which is a cationic surfactant, has an amide bond with a halogenated acyl or nitrogen and an ester bond with oxygen, and an N-Si and O-Si bond. Object identification label protected by a reactive blocker selected from the group consisting of silanyl compounds, sulfonyl compounds which combine with NS and OS, saturated or unsaturated hydrocarbons which combine with NC and OC, aromatic hydrocarbons, and saturated or unsaturated hydrocarbons containing heteroatoms And adding the sieve to the object to be identified. 제13항에 있어서, 상기 물체가 자동차 코팅용 페인트, 락카, 도로 차선표시용 페인트, 석유, 페인트 희석제, 화약, 자연에서 얻은 오일, 건축용 페인트, 유기 용매, 접착제, 유성물감, 육류 및 해산물로 이루어진 군에서 선택되는 친유성 물질인 것임을 특징으로 하는 물체 식별 표지 방법.The method of claim 13, wherein the object is made of paint for car coating, lacquer, paint for road lane marking, petroleum, paint thinner, gunpowder, oil derived from nature, construction paint, organic solvent, adhesive, oil paint, meat and seafood. Object identification labeling method characterized in that the lipophilic substance selected from the group. 1) 4차 암모늄염을 갖는 화합물 또는 양이온계 계면활성제인 상전환 촉매와 올리고뉴클레오티드가 결합된 올리고뉴클레오티드를 할로겐화 아실 또는 질소와 아마이드 결합을 하고 산소와 에스테르 결합을 하는 카보닐 화합물, N-Si와 O-Si결합을 하는 실라닐화합물, N-S와 O-S결합을 하는 술포닐화합물, N-C와 O-C결합을 하는 포화 또는 불포화탄화수소, 방향족탄화수소, 헤테로원자가 포함된 포화 또는 불포화탄화수소로 이루어진 군에서 선택되는 반응성 차단기로 보호시킨 물체 감식 표지에 의해 표지된 물체로부터 상기 감식 표지를 추출하는 단계; 1) A compound having a quaternary ammonium salt or a carbonyl compound having an amide bond with an acyl halide or nitrogen and an ester bond with oxygen, and an oligonucleotide to which an oligonucleotide is bound to a phase inversion catalyst, which is a cationic surfactant, and N-Si and O -A reactive blocker selected from the group consisting of silanyl compounds having Si bonds, sulfonyl compounds having OS bonds with NS, saturated or unsaturated hydrocarbons having NC and OC bonds, aromatic hydrocarbons, and saturated or unsaturated hydrocarbons containing heteroatoms; Extracting the identification label from the object labeled by the protected object identification label; 2)추출된 감식 표지를 암모니아로 처리하여 올리고뉴클레오티드에 결합된 반응성 차단 보호기를 제거하는 단계;2) treating the extracted identification label with ammonia to remove reactive blocking protecting groups bound to the oligonucleotides; 3)올리고뉴클레오티드의 식별 표지 부분의 염기서열을 인식하는 단계; 3) recognizing the nucleotide sequence of the identification label portion of the oligonucleotide; 4) 3)에서 인식된 염기 서열을 갖는 감식 표지로 표지된 물체를 인지하는 단계를 포함하는 물체 감식 방법.4) object identification method comprising the step of recognizing the object labeled with the identification label having the base sequence recognized in 3). 제15항에 있어서, 상기 식별 표지 부분을 염기 서열을 인식하기 전에 식별 표지 부분 올리고뉴클레오티드를 중합효소연쇄반응을 통하여 증폭시키는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 물체 감식 방법.16. The method of claim 15, further comprising amplifying the identification label portion oligonucleotide through a polymerase chain reaction prior to recognizing the nucleotide sequence. 제16항에 있어서, 상기 중합효소증폭반응에 의한 증폭단계이후 증폭된 올리고뉴클레오티드를 벡터(vector)에 클로닝하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 물체 감식 방법.17. The method of claim 16, further comprising cloning the amplified oligonucleotide into a vector after the amplification step by the polymerase amplification reaction. 제15항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 20 내지 1,000염기쌍으로 이루어진 것임을 특징으로 하는 물체 감식 방법.The method according to claim 15, wherein the oligonucleotide consists of 20 to 1,000 base pairs. 삭제delete 제15항에 있어서, 상기 상전환 촉매가 테트라부틸암모니움 하이드로퍼옥사이드 또는 헥사데실 트리메틸 암모니움 브로마이드인 것을 특징으로 하는 물체 감식 방법.The object identification method according to claim 15, wherein the phase inversion catalyst is tetrabutylammonium hydroperoxide or hexadecyl trimethyl ammonium bromide. 제15항에 있어서, 상기 물체 감식 표지용 올리고뉴클레오티드에 할로겐화 아실 또는 질소와 아마이드 결합을 하고 산소와 에스테르 결합을 하는 카보닐 화합물, N-Si와 O-Si결합을 하는 실라닐화합물, N-S와 O-S결합을 하는 술포닐화합물, N-C와 O-C결합을 하는 포화 또는 불포화탄화수소, 방향족탄화수소, 헤테로원자가 포함된 포화 또는 불포화탄화수소로 이루어진 군에서 선택되는 반응성 차단 보호기가 추가로 더 결합된 것임을 특징으로 하는 물체 감식 방법.The method according to claim 15, wherein the object identification label oligonucleotide is a halogenated acyl or a carbonyl compound having an amide bond with nitrogen and an ester bond with oxygen, a silanyl compound having an N-Si and O-Si bond, NS and OS Recognition of the object further characterized in that the reactive blocking protecting group selected from the group consisting of a sulfonyl compound to be bonded, a saturated or unsaturated hydrocarbon with an OC bond with NC, an aromatic hydrocarbon, a saturated or unsaturated hydrocarbon containing heteroatoms. Way. 삭제delete 삭제delete 제21항에 있어서, 상기 할로겐화 아실이 아세틸클로라이드 및 아크릴로일클로라이드로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 물체 감식 방법.22. The method of claim 21, wherein said acyl halide is selected from the group consisting of acetyl chloride and acryloyl chloride.
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