KR100849954B1 - Katp 채널의 과발현 검출을 위한 프라이머 세트, 이를포함하는 검출 키트 및 동정 방법 - Google Patents

Katp 채널의 과발현 검출을 위한 프라이머 세트, 이를포함하는 검출 키트 및 동정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 저산소증 또는 허혈성 질환으로부터 심장을 보호하는 효과를 가지는 ATP 감수성 칼륨 채널(KATP 채널)(Kir6.1)의 mRAN 증가를 확인하기 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트, 이를 이용한 심장 허혈 관련 질환 치료제를 동정하는 방법을 제공한다.

Description

KATP 채널의 과발현 검출을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 검출 키트 및 동정 방법 {PRIMER SET FOR DETECTING OVEREXPRESSION OF KATP CHANNEL AND KIT AND IDENTIFICATION METHOD COMPRISING SAID PRIMER SET}
도 1은 정상 마우스(무처치군, Cont)과 심장 적출 후 관류를 통해 허혈 전처치(IPC)를 유도한 마우스(실험군, IPC)의 심장 세포로부터 분리한 전체 RNA를 이용하여 KATP 채널의 발현양을 비교한 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 결과를 도시한 것이다.
도 2는 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 증폭된 무처치군과 실험군의 KATP 채널의 mRNA 각각을 하우스킵핑 유전자(β-액틴) mRNA 발현양으로 나누어 mRNA의 상대적인 발현 비율을 산출한 표를 도시한 것이다.
본 발명은 저산소증 또는 허혈성 질환으로부터 심장을 보호하는 효과를 가지는 ATP 감수성 칼륨 채널(KATP 채널)(Kir6.1)의 mRAN 증가를 진단하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다. 이러한 방법 및 키트는 허혈성 질환의 임상적 진단 또는 치 료제의 개발을 위해 매우 유용하다.
심장에서 수술 또는 심장 자체에 저산소증을 유도하는 질환 등으로 인하여 심장세포내로 산소 공급이 원활하지 못한 경우에 심장은 심각한 손상을 입게 된다. 우리 신체에서는 신체의 임의의 손상에 대하여 신체 보호 기전이 내적으로 일어나게 되는데, 이러한 심장의 손상에 대한 신체 보호 기전으로 미토콘드리아 KATP 채널의 활성화가 그 대표적인 예이다. 이러한 KATP 채널의 개방은 허혈 전처치, 열 쇼크, 및 아데노신, 아세틸콜린(Ach), 오피오이드 및 내독소 모노포스포릴 지질의 비독성 유도체를 포함하는 약리학적 제제에 의해 유도되는 심근보호 효과를 매개한다.
짧은 시간 동안 반복적으로 심근 허혈과 재관류를 유발시킨 후에 치명적인 장시간의 심근 허혈을 유발하면 심근은 이러한 전처치 없이 바로 치명적인 심근 허혈을 유발한 경우에 비하여 심근에 가해지는 손상이 덜 발생하는 현상이 관찰되었고 이러한 현상을 허혈 전처치에 의한 심근 보호 효과라고 하였다(참조: Murray and Jenning, 1986).
KATP 채널의 개방에서 심근세포보호 과정의 기전으로 초기에는 sarcKATP 채널이 열리면 작용 포텐셜 기간(action potential duration)이 줄어들고 이때 칼슘의 세포내 유입이 감소하여 세포내 칼슘의 과부하(calcium overload)를 피하게 되고 이로써 심근세포의 괴사를 억제함으로써 심근보호효과를 나타낸다고 알려져 있었다. 그러나, 그 이후의 연구들에서 작용 포텐셜 기간을 단축시키지 않아도 전처치 의 효과가 증명되었으며 KATP 채널이외의 칼륨 채널 차단제를 사용하여 작용 포텐셜 기간을 연장시켰을 때에도 허혈 전처치의 효과가 사라지지 않았다. 또한, mitoKATP 채널을 선택적으로 개방시켰을 때 허혈 전처치의 효과를 나타내었고 이를 5-하이드록시데카노에이트(5-HD)를 투여하여 mitoKATP 채널을 선택적으로 차단하였을 때 허혈 전처치의 심근보호효과가 소실되어, mitoKATP 채널이 허혈 전처치의 효과에 중요한 이펙터로서 관여하는 것으로 알려지고 있다. 또한, sarcKATP 채널의 선택적인 차단제인 HMR1098을 투여하여 sarcKATP 채널을 차단하였을 때 허혈 전처치의 효과를 차단할 수 없었다. 따라서 mitoKATP 채널의 작용이 허혈 전처치의 가장 중요한 부분이라고 인식이 되고 있다. 그리고 mitoKATP 채널의 개방이 심근 보호효과를 가져오는가 하는데 대한 기전은 역시 칼슘의 유입을 억제하는데 있다고 알려지고 있다. 5-하이드록시데카노에이트(5-HD)와 같은 mitoKATP 채널 차단제를 투여할 때 미토콘드리아내의 칼슘과부하(calcium overload)를 억제하지 못하고 허혈 전처치의 보호효과를 나타내지 못하였다. 미토콘드리아의 기능보호는 세포내 ATP 생성과 맞물려 있으며 이는 Na-K ATPase를 작동시키는 원동력이 되고 이는 세포내 축적되어 있던 Na을 세포밖으로 방출해내는데 매우 중요한 역할을 한다. 만일 이렇지 못하면 Na과 칼슘의 교환으로 세포내 칼슘의 과부하가 발생하게 되고 세포는 괴사에 이르게 된다. 이러한 의미에서 mitoKATP 채널의 개방은 미토콘드리아 칼슘의 과부하를 방 지하여 미토콘드리아의 기능을 좀 더 잘 유지가 되도록 하는데 매우 중요하다고 할 수 있다.
또한, 심근세포의 미토콘드리아 KATP 채널은 허혈 및 재관류 동안 KATP 활성화제의 항부정맥 및 항뇌경색 효과에 참여한다.
이러한 미토콘드리아 KATP 채널은 유전자적 수준에서 그 실체(유전자 클로닝)가 밝혀지지 않았고, 다만 Kir6.1 또는 Kir6.2의 서브타입 형태로 미토콘드리아 막에서 발현할 것이라고 추측되고 있다.
상기 기술한 바와 같이 심장세포에서 허혈성 질환 또는 저산소증 자극에 대하여 미토콘드리아 KATP 채널이 세포방어기전의 일환으로 활성화되어 심장 보호 효과를 가진다는 보고가 있으나, 미토콘드리아 KATP 채널은 그 유전적 실체가 아직 밝혀지지 않아 간접적인 추정만이 가능한 상황이다. 또한, 대부분의 실험들이 약물을 이용하여 패치 클램프(patch clamp) 또는 공초점 이미지(confocal image) 등의 복잡한 기술과 고가의 장비를 통해 어렵게 접근할 수밖에 없다는 치명적인 단점을 가지고 있다.
본 발명에서는 이러한 미토콘드리아 KATP 채널의 발현을 mRNA 수준에서 RT-PCR로 간단히 확인할 수 있는 방법 및 키트를 제공함으로써 심장 질환의 임상적 진단 또는 허혈성 질환에 관한 치료제 개발 등의 실험적 기초를 마련하고자 한다. 본 발명은 허혈성 질환을 다루는 기초/임상 의학 분야와 더불어 이러한 질환의 치료제 개발을 표적으로 하는 제약 관련 분야, 그리고 생명공학 연구 전반에 두루 걸쳐 손쉽고 저렴하게 활용 가능하다.
본 발명은 저산소증 또는 허혈성 질환으로부터 심장을 보호하는 효과를 가지는 ATP 감수성 칼륨 채널(KATP 채널)(Kir6.1)의 mRNA 증가를 확인하기 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트, 이를 이용한 심장 허혈 관련 질환 치료제를 동정하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 하기 서열을 가지는 미토콘드리아 KATP 채널의 과발현을 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다:
정방향 프라이머 염기서열: 5'-ATCCCGGAGGAGTATGTGCT-3' (서열번호: 1) 및
역방향 프라이머 염기서열: 5'-CGTGAATGACCTGACATTGG-3' (서열번호: 2).
본 발명의 다른 한 측면에 따르면, 본 발명은 상기 서열번호: 1의 정방향 프라이머 및 상기 서열번호: 2의 역방향 프라이머의 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용 프라이머 세트를 포함하는 미토콘드리아 KATP 채널의 과발현을 확인하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 키트는 중합효소연쇄반응에 필요한 통상적인 중합효소, dNTP 혼합물 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 한 측면에 따르면, 본 발명은 상기 서열번호: 1의 정방향 프라이머 및 상기 서열번호: 2의 역방향 프라이머의 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용 프라이머 세트를 포함하는 허혈 전처치 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 한 측면에 따르면, 본 발명은 상기 서열번호: 1의 정방향 프라이머 및 상기 서열번호: 2의 역방향 프라이머를 이용하여 미토콘드리아 KATP 채널 발현과 관련된 질환의 치료제를 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 서열번호: 1의 정방향 프라이머 및 상기 서열번호: 2의 역방향 프라이머의 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하고 심장 허혈 치료제 후보물질의 존재 및 부재하의 미토콘드리아 KATP 채널 발현양을 확인하는 것을 포함하여 심장 허혈 치료제를 동정하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 서열번호: 1의 정방향 프라이머 및 상기 서열번호: 2의 역방향 프라이머의 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하고 부정맥 또는 뇌경색 치료제 후보물질의 존재 및 부재하의 미토콘드리아 KATP 채널 발현양을 확인하는 것을 포함하여 부정맥 또는 뇌경색 치료제를 동정하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 당업계에 통상적으로 사용되는 심장 허혈 모델에 심장 허혈, 부정맥, 또는 뇌경색 등의 치료제 후보물질을 접촉시키고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 미토콘드리아 KATP 채널 발현양을 확인하고, 측정된 미토콘드리아 KATP 채널 발현양을 상기 후보물질의 부재하의 미토콘드리아 KATP 채널 발현양과 비교함으로써 심장 허혈, 부정맥, 또는 뇌경색 등의 치료에 유용한 치료제를 효과적으로 스크리닝할 수 있을 것이다.
실시예
심장에서 허혈 전처치에 의해 유도되는 KATP 채널 (Kir6.1) mRNA의 과발현(over-expression)을 PCR을 통해 측정하였다. 본 실험을 위해서는 먼저 마우스로부터 심장을 적출해 내어, 심장에 용액을 흘려주는 데 일반적으로 사용되는 란젠도르프 방법(Langendorff system)을 이용하여 심장의 관상동맥으로 용액을 흘려주었다. 관류용액으로는 허혈 용액(PO2가 5% 미만인 정상 타이로오드 용액)과 정상 타이로오드 용액(PO2가 20% 이상)을 번갈아 관류(각각 5분씩 x 2회)시키며 허혈 전처치 상태를 유도하였다. 정상 타이로오드 용액만을 관류시킨 심장을 대조군(도1 및 도2에서 "Cont"로 표시됨)으로 하고 허혈 전처치를 유도한 마우스의 심장을 실험군(도1 및 도2에서 "IPC"로 표시됨)으로 하여 각각의 심장조직을 실험실에서 일반적으로 수행하는 방법으로 전체 RNA를 분리해 내고 역전사효소와 올리고(dT)를 이용하여 cDNA를 합성하였으며, PCR을 30 사이클 실시하여 증폭된 KATP 채널 mRNA 발현양을 하우스킵핑 유전자(도1 및 도2에서 액틴)의 mRNA 발현양으로 나누어 각각의 그룹에서 발현양의 차이를 상대적으로 산출하였다(도2).
PCR 반응액의 조성은 다음과 같다.
10 x BD 어드밴티지 2 PCR 완충액 2㎕
2.5mM dNTP 혼합물 1㎕
정방향 프라이머(10pmol/㎕) 0.5㎕
역방향 프라이머(10pmol/㎕) 0.5㎕
cDNA 주형 1㎕
DNA 중합효소 적당량㎕
증류수 (13 - DNA 중합효소 양)㎕
본 발명에서 KATP 채널의 mRNA 증폭을 위해 제작된 프라이머 세트를 이용하여 얻은 밴드를 회수하여 염기서열을 확인해 본 결과, Kir6.1과 염기서열이 100% 일치함을 확인하였다.
상기 실험에서 RT-PCR을 수행하기 위한 PCR 장치 또는 시약(예를 들어, 역전사효소, 중합효소, 아가로오스 등)은 실험실에서 통상 사용되는 것들을 이용하였다. KATP 채널 mRNA를 PCR에서 증폭시키기 위해 제작한 프라이머들은 여러 포유동물들간의 Kir6.1의 상동성을 비교·검토하여 100% 일치하는 부분을 표적화했으며, 최상의 조건을 갖춘 프라이머 쌍을 선정하여 실험을 수행하였다. 그 중에서도 가장 우수하고 안정적인 하기 프라이머 쌍을 본 발명에 사용하였다.
정방향 프라이머 염기서열: 5'-ATCCCGGAGGAGTATGTGCT-3' (서열번호: 1)
역방향 프라이머 염기서열: 5'-CGTGAATGACCTGACATTGG-3' (서열번호: 2)
어닐링 온도: 60℃.
β-액틴(actin)을 하우스킵핑 유전자로 하여 상대적인 비율을 구하여 보다 정확한 비교를 실시하였다. 이 실험을 위해 사용된 β-액틴(actin)의 프라이머 쌍은 다음과 같다.
정방향 프라이머 염기서열: 5'-CATTGTGATGGACTCCGGAGACGG-3' (서열번호: 3)
역방향 프라이머 염기서열: 5'-CATCTCCTGCTCGAAGTCTAGAGC-3' (서열번호: 4)
어닐링 온도: 56℃.
본 발명은 심장이 허혈성 손상으로부터 심장을 보호하고 회복시키는 과정을 유전자 수준에서 빠르게 해석할 수 있는 진단 방법으로서, 허혈성 심장 질환 치료제의 개발 및 연구 또는 임상적인 진단 및 예방에 유용하다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

  1. 서열번호: 1의 정방향 프라이머 및 서열번호: 2의 역방향 프라이머로 구성되는 미토콘드리아 KATP 채널의 과발현을 검출하기 위한 프라이머 세트.
  2. 서열번호: 1의 정방향 프라이머 및 서열번호: 2의 역방향 프라이머의 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용 프라이머 세트를 포함하는 미토콘드리아 KATP 채널의 과발현을 확인하기 위한 키트.
  3. 서열번호: 1의 정방향 프라이머 및 서열번호: 2의 역방향 프라이머의 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용 프라이머 세트를 포함하는 허혈 전처치 진단용 키트.
  4. 삭제
  5. 삭제
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