KR100836711B1 - Pharmaceutical composition containing arazyme for the prevention of liver dysfunction - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 정상(WT) 마우스와 SMP30 제거(KO) 마우스에서 급성으로 손상된 간의 조직학적 사진이다(H&E 염색, A: 보통배율 × 33, B: 보통배율 × 132): 1 is a histological picture of acutely injured liver in normal (WT) and SMP30 depleted (KO) mice (H & E staining, A: normal × 33, B: normal × 132):
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; 빨간선 : 정맥중심(CV) 주위의 괴사성 부분; 및 화살표 : 손상된 간세포. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, treated with carbon tetrachloride; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; Red line: necrotic part around the central vein (CV); And arrows: damaged hepatocytes.
도 2는 간손상에 대해 조직생리학적으로 관찰된 수치를 나타낸 그래프이다: 2 is a graph showing histophysiologically observed values for liver injury:
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; 간 손상 정도 0 : 손상의 형태적 증거가 없음; 간 손상 정도 1 : 중심정맥 주위 5개의 간세포에서만 흩어진 주변 괴사가 균등하게 보임; 간 손상 정도 2 : 손해를 당하지 않은 부분과 중심정맥 주위 5개의 간세포에서만 주변 괴사가 균등하게 보임; 및 간 손상 정도 3 : 중심정맥 5개의 간세포의 외의 중앙부까지 침범한 광범위한 간세포의 괴사. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, treated with carbon tetrachloride; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; Degree of liver damage 0: no morphological evidence of injury; Degree of liver damage 1: Evenly scattered peripheral necrosis appeared only in 5 hepatocytes around the central vein; Degree of hepatic damage 2: peripheral necrosis appears evenly only in the intact area and five hepatocytes around the central vein; And degree of liver damage 3: central vein Necrosis of extensive hepatocytes invading the outer central portion of 5 hepatocytes.
도 3은 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스에서 급성 간손상에 대한 SMP30의 면역조직화학적 사진이다(보통배율 × 13.2 및 × 66): 3 is an immunohistochemical picture of SMP30 for acute liver injury in normal and SMP30 depleted mice (typically × 13.2 and × 66):
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, treated with carbon tetrachloride; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; And G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated.
도 4는 SMP30의 면역조직화학적 발현 정도를 나타낸 그래프이다: 4 is a graph showing the degree of immunohistochemical expression of SMP30:
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, treated with carbon tetrachloride; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; And G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated.
도 5는 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스에서 급성 간손상에 대한 SMP30의 면역블롯팅(Immunoblotting)을 나타낸 사진이다: 5 is a photograph showing immunoblotting of SMP30 against acute liver injury in normal and SMP30 depleted mice:
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, treated with carbon tetrachloride; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; And G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated.
도 6은 SMP30의 면역블롯팅 발현 정도를 나타낸 그래프이다:6 is a graph showing the degree of immunoblotting expression of SMP30:
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, treated with carbon tetrachloride; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; And G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated.
도 7은 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스에서 급성 간손상에 대한 P-smad3 의 면역조직화학적 사진이다(보통배율 × 132): 7 is an immunohistochemical picture of P-smad3 for acute liver injury in normal and SMP30 depleted mice (typically × 132):
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, treated with carbon tetrachloride; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; And G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated.
도 8은 P-smad3의 면역조직화학적 발현 정도를 나타낸 그래프이다: 8 is a graph showing the degree of immunohistochemical expression of P-smad3:
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염 화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treatment; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, treated with carbon tetrachloride; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; And G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated.
도 9는 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스에서 급성 간손상에 대한 P-smad3의 면역블롯팅을 나타낸 사진이다:9 is a photograph showing immunoblotting of P-smad3 for acute liver injury in normal and SMP30 depleted mice:
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, treated with carbon tetrachloride; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; And G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated.
도 10은 P-smad3의 면역블롯팅 발현 정도를 나타낸 그래프이다: 10 is a graph showing the degree of immunoblotting expression of P-smad3:
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, treated with carbon tetrachloride; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; And G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated.
도 11은 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스에서 급성 간손상에 대한 smad3의 면역조직화학적 사진이다(보통배율 × 66): FIG. 11 is an immunohistochemical picture of smad3 for acute liver injury in normal and SMP30 depleted mice (normal magnification × 66):
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염 화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treatment; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, treated with carbon tetrachloride; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; And G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated.
도 12은 Smad3의 면역조직화학적 발현 정도를 나타낸 그래프이다: 12 is a graph showing the immunohistochemical expression level of Smad3:
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, treated with carbon tetrachloride; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; And G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated.
도 13은 Smad3의 면역블롯팅 발현 정도를 나타낸 그래프이다: 13 is a graph showing the degree of immunoblotting expression of Smad3:
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, treated with carbon tetrachloride; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; And G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated.
도 14는 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스에서 급성 간손상에 대한 CYP2E1의 면역조직화학적 사진이다(보통배율 × 66): 14 is an immunohistochemical picture of CYP2E1 for acute liver injury in normal and SMP30 depleted mice (typically × 66):
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사 염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, carbon tetrachloride treated; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; And G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated.
도 15는 CYP2E1의 면역조직화학적 발현 정도를 나타낸 그래프이다: 15 is a graph showing the degree of immunohistochemical expression of CYP2E1:
G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리. G1: normal mice, olive treated; G2: normal mice, carbon tetrachloride treated; G3: normal mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; G4: normal mice, arazyme, carbon tetrachloride treated; G5: SMP30 removed mice, olive treated; G6: SMP30 removed mice, treated with carbon tetrachloride; G7: SMP30 removed mice, vitamin C, carbon tetrachloride treated; And G8: SMP30 removed mice, arazyme, carbon tetrachloride treated.
본 발명은 아라자임을 유효성분으로 하는 간기능 보호용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)가 생산하는 아라자임(arazyme)을 함유하는 간기능 보호용 약학적 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for protecting liver function using an arazyme as an active ingredient, and more particularly to a liver function-protecting pharmaceutical containing arazyme (arazyme) produced by Aranicola proteolyticus . It relates to a composition.
만성 간질환은 국내에서 성인병 및 사망의 중요한 원인으로 부각되고 있다. 간은 완충능력이 큰 기관으로 질환의 초기 단계에 자각증상이 없어 질병이 상당히 진전된 상태에 발견되는 경우가 많을 뿐 아니라 효과적인 치료제 및 진단방법이 부 족한 실정이다. 간 질환의 원인으로는 알코올, 약물, 화학약품, 바이러스성 간염, 담도질환과 같은 대사성 질환, 자가면역성 질환 등이 있으나 그 원인을 알 수 없는 경우도 많다. 또한 간은 인체에서 혈액의 저장과 순환, 혈액량 조절과 해독작용의 중추로서 최근 산업화에 따라 증가된 유해물질에 노출되는 기회가 증가되면서 끊임없는 해독작용에 시달리고 있으며 특히 정신적 스트레스의 증가와 과음, 흡연 등의 원인에 의해 간손상이 증가됨으로서 면역체계의 이상 초래와 더불어 다른 질병의 원인이 되는 경우가 증가하고 있다.Chronic liver disease is emerging as an important cause of adult disease and death in Korea. The liver is a large buffering organ, and there are no cases of self-awareness in the early stages of the disease. Therefore, the liver is often found in a very advanced state, and there is a lack of effective treatments and diagnostic methods. The causes of liver disease include alcohol, drugs, chemicals, viral hepatitis, metabolic diseases such as biliary tract diseases, autoimmune diseases, etc., but the cause is often unknown. In addition, the liver is the backbone of blood storage and circulation, blood volume control, and detoxification in the human body, and as the chance of exposure to harmful substances increased with recent industrialization, the liver suffers from constant detoxification. Liver damage is increased due to the cause of the immune system, and the cause of other diseases is increasing.
대부분의 만성 간질환에 있어서 질환의 예후에 중대한 영향을 미치는 여러 합병증과 간암 등은 일단 간섬유화(hepatic fibrosis)와 간경변으로 진행된 이후 발생하는 경우가 대부분이므로 간섬유화의 과정에 대한 이해와 간섬유화의 진전을 억제하는 치료제의 개발이 필요한 실정이다. 현재 임상에서 이용되고 있는 간질환 조절약으로는 1970년대 독일 마다우스(Madaus)사에서 분리한 실리마린(Silymarin), 미국 파크 데이비스(Park Davis)사의 아라-AMP(Ara-AMP), 이탈리아 셀비(Selvi)사의 카바이카(Carbaica) 및 1980년대 중국 중약연구소의 DDB 등이 이용되고 있으나 상기 약의 부작용이나 치료효과가 떨어지는 등의 문제점이 발견되고 있다. 따라서 보다 경제적이고 안전한 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.In most chronic liver diseases, many complications and liver cancer, which have a significant effect on the prognosis of the disease, usually occur after hepatic fibrosis and liver cirrhosis. There is a need for the development of therapeutic agents that inhibit progress. Liver disease modulators currently used in clinical practice include Silymarin isolated from Madus, Germany in the 1970s, Ara-AMP from Park Davis, and Selvi, Italy. Carbaica Co., Ltd. and DDB of the Chinese Institute of Chinese Medicine in the 1980s have been used, but problems such as side effects and poor therapeutic effects of the drug have been found. Therefore, the development of more economical and safe treatments is urgently needed.
최근 간섬유화와 간경화는 세포, 사이토카인(cytokine) 및 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)간의 복잡한 상호작용에 의해 유발되는 것으로 알려 져 있다. 손상을 받은 간세포는 쿠퍼(kupffer) 세포에 의해 식세포작용이 일어나고 이로써 활성화된 쿠퍼 세포가 각종 사이토카인을 분비하여 간성상세포를 활성화시킨다는 것이 일반적인 기전인데 손상된 간세포가 직접적으로 간성상세포를 활성화시킨다는 자가분비(autocrine)에 대한 보고도 있다. 즉 여러 가지 원인에 의해 간세포가 손상을 받아 세포자멸사(apoptosis)가 일어나면 TGF-1이 발현되고 이로 인해 간성상세포가 활성화 되면, 활성화된 간성상세포에 의해 TGF-1이 다시 발현되어 간세포의 사멸이 더욱 유발되는 악순환이 진행될 수 있으므로 심각한 간질환이 유발될 수 있다(Sun F, et al ., Biochim Biophys Acta. 2001 Feb 14;1535(2):186-191; Jeong WI, et al ., Liver Int . 2004 Dec;24(6):248-254; Marcin Stopa, et al ., J. Biol . Chem . 2000 Sep;29308-29317; Jeong W.I, et al ., Anticancer Res. 2002 Mar-Apr;22(2A):869-877; Ishak ㎏, et al ., Alcohol Clin Exp Res . 1991;15:45-66; 대한민국특허 제 2001-0036463호). Recently, hepatic fibrosis and cirrhosis have been known to be caused by complex interactions between cells, cytokines and extracellular matrix (ECM). Damaged hepatocytes are phagocytized by kupffer cells, and the activated cooper cells secrete various cytokines to activate hepatic stellate cells. There is also a report on autocrine. That is, when hepatic cells are damaged by various causes and apoptosis occurs, TGF-1 is expressed. When hepatic stellate cells are activated, TGF-1 is re-expressed by activated hepatic stellate cells, resulting in the death of hepatocytes. More vicious cycles can progress, leading to serious liver disease (Sun F, et. al ., Biochim Biophys Acta. 2001 Feb 14; 1535 (2): 186-191; Jeong WI, et al ., Liver Int . 2004 Dec; 24 (6): 248-254; Marcin Stopa, et al ., J. Biol . Chem . 2000 Sep; 29308-29317; Jeong WI, et al ., Anticancer Res. 2002 Mar-Apr; 22 (2A): 869-877; Ishak kg, et al ., Alcohol Clin Exp Res . 1991; 15: 45-66; Korean Patent No. 2001-0036463).
지금까지 간기능 보호용 약학적 조성물을 탐색하기 위해서 미생물, 식물 및 화학 합성제 등을 이용하여 많은 연구가 이루어져 있으나 재료 확보의 어려움 등으로 인하여 상업화는 어려운 실정이다.Until now, many studies have been conducted using microorganisms, plants, and chemical synthetic agents to search for pharmaceutical compositions for protecting liver function, but commercialization is difficult due to difficulties in securing materials.
한편, 본 발명자들은 새로운 단백질 분해효소를 개발하고자 노력한 결과, 한국산 무당거미(Nephila clavata)로부터 신규 미생물인 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3 균주(수탁번호 : KCTC 0268BP; WO 01/57222호) 를 분리하였으며, 본 균주로부터 신규한 단백질 분해효소인 아라자임(Arayzme)을 분리하였다. 아라자임(arazyme)은 저온과 높은 염 농도에서 안정된 단백질 분해 활성을 나타낼 뿐 만 아니라 사람의 체온인 37℃에서 가장 높은 활성을 보였으며 넓은 pH 범위에서도 안정된 활성을 나타내는 것을 발견하고 본 단백질 분해효소의 유전자를 확인하였다(WO 01/57222호). On the other hand, the present inventors have tried to develop a new proteolytic enzyme, a new microorganism Aranicolaa Proteoricicus ( Aranicola ) from the Nephila clavata of Korea proteolyticus ) HY-3 strain (Accession No .: KCTC 0268BP;
본 발명자들은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 균주에서 유래한 아라자임(arazyme)의 효과를 조사한 결과, 아라자임이 손상된 간을 효과적으로 보호하는 것을 확인하고 간기능 보호용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.The inventors have found that Aranicola As a result of investigating the effect of arazyme (arazyme) derived from the proteolyticus strains, the present invention was completed by confirming that arazyme effectively protects the damaged liver and found that it can be usefully used as a pharmaceutical composition for protecting liver function. .
본 발명의 목적은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolycius)가 생산한 아라자임(arazyme)을 간기능 보호용 약학적 조성물로서의 새로운 용도를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a new use of arazyme produced by Aranicola proteolycius as a pharmaceutical composition for protecting liver function.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 간기능 보호용 약학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for liver function protection containing arazyme (arazyme) as an active ingredient.
또한, 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자 임을 유효성분으로 함유하는 간기능 보호용 건강식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health food for liver function protection containing the culture solution of Aranicola proteoricicus or arazyme isolated therefrom as an active ingredient.
또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 세포사멸 억제제를 제공한다.The present invention also provides an apoptosis inhibitor containing arazyme as an active ingredient.
또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 P-smad3 발현억제제를 제공한다.In addition, it provides a P-smad3 expression inhibitor containing arazyme as an active ingredient.
아울러, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 중심정맥 주변의 간세포의 손상억제제를 제공한다.In addition, it provides an inhibitor of damage to liver cells around the central vein containing arazyme as an active ingredient.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 간기능 보호용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for liver function protection containing arazyme (arazyme) as an active ingredient.
본 발명의 아라자임은 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주가 생산하는 효소로서, 1) 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주를 배양하여 배양액을 얻는 단계; 2) 상기 배양액을 여과하여 상등액을 얻는 단계; 및 3) 상등액내 포함된 상기 아라자임을 수지를 이용하여 정제하는 단계로 제조할 수 있다(WO 01/57222호). 아라자임을 생산하는 미생물로서 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주를 이용하는 것이 바람직하며, 한국생명공학연구원 유전자은행에 1996년 7월 29일자로 기탁된 수탁번호 KCTC 0268BP호의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3를 이용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주는 거미 장내에서 분리한 호기성의 그람 음성 세균으로서, 0.5 ~ 0.8 ㎜ 크기의 구형이고 운동성을 가지고 있으며 카탈라아제(catalase)에는 양성 반응을, 옥시다아제(oxidase)에는 음성반응을 나타낸다(대한민국 특허 제 0220091호). 본 발명에서 는 상기와 같은 방법으로 수득된 아라자임을 이용하였다.Arazyme of the present invention is an enzyme produced by the aranicola proteoricicus strain, comprising the steps of: 1) culturing the aranicola proteoricicus strain to obtain a culture solution; 2) filtering the culture solution to obtain a supernatant; And 3) purifying the arazyme contained in the supernatant using a resin (
본 발명의 아라자임은, (a) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (b) 서열번호 1과 70% 이상 상동성을 가지며, (a)의 폴리펩티드와 생물학적으로 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드; 및 (c) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 서열을 가지나, (a)의 폴리펩티드와 생물학적으로 동등한 폴리펩티드를 포함하는 단백질이어도 무방하다. Arazyme of the present invention, (a) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (b) a polypeptide having at least 70% homology with SEQ ID NO: 1 and having a biologically equivalent function as the polypeptide of (a); And (c) a polypeptide sequence consisting of an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is substituted, deleted, added and / or inserted, but which is biologically equivalent to the polypeptide of (a) The protein may be used.
비타민 C(L-ascorbic acid)는 간에서 항산화 효과가 있는 것으로 알려져 왔으며, 사염화탄소(carbon-tetrachloride, CCl4)에 의한 급성 간손상을 유도했을 때 간내에 존재하던 비타민 C의 양의 감소됨과 동시에 사염화탄소의 산화적 스트레스가 간세포에 가해지고 이는 간세포의 세포사멸이나 괴사(necrosis)를 유발한다.Vitamin C (L-ascorbic acid) has been known to have antioxidant effects in the liver, and carbon tetrachloride decreases as well as the amount of vitamin C present in the liver when induced by acute liver damage by carbon-tetrachloride (CCl 4 ). Oxidative stress is applied to hepatocytes, leading to apoptosis or necrosis of hepatocytes.
SMP30(Senescence Marker Protein 30)은 생체의 노화 표지 단백질로서 간세포, 신장 세뇨관, 상피세포에서 많이 발현된다. 랫트에서 SMP30은 출생 후 간에서 12주령까지 점차적으로 증가하여 12주령 때 그 발현 정도가 최고치에 이르고 그 이후로는 점차적으로 노화가 진행됨에 따라 발현량이 줄어드는 것으로 알려져 있고 노화 진행 중에 SMP30의 발현량 감소는 성호르몬과는 상관없이 독립적으로 진행되는 것으로 알려져 있다. 상기 단백질의 주된 기능은 세포자멸사로부터 세포를 보호하고 생체 내 비타민 C의 생합성과정에서 글루코놀락토나제(gluconolactonase) 역할을 수행함으로서 비타민 C 생성을 증가시키고 생체 내 비타민 C 생합성을 증가시킨다. 결과적으로 SMP30에 의해 증가된 비타민 C는 손상된 세포에서 항산화제 역할을 하게 되고 따라서 세포의 자멸사와 괴사를 감소시킨다. 또한 SMP30은 세포의 자멸사(apoptosis)시 세포질 내로 유입되는 칼슘을 세포 밖으로 배출시키는 기능을 수행함으로서 세포의 자멸사를 방지하는 기능도 가진다.Senescence Marker Protein 30 (SMP30) is an aging marker protein in vivo, and is expressed in hepatocytes, kidney tubules and epithelial cells. In rats, SMP30 is gradually increased from birth to 12 weeks of age, reaches its peak at 12 weeks of age, and then decreases as expression progresses gradually as aging progresses. Is known to be independent of sex hormones. The main function of the protein is to protect the cells from apoptosis and to play a role of gluconolactonase in the biosynthesis of vitamin C in vivo, thereby increasing vitamin C production and increasing vitamin C biosynthesis in vivo. As a result, vitamin C, increased by SMP30, acts as an antioxidant in damaged cells, thus reducing cell death and necrosis. In addition, SMP30 has a function of preventing the apoptosis of the cell by performing the function of discharging the calcium entering the cytoplasm out of the cell during apoptosis.
본 발명자들은 SMP30의 부재시 아라자임의 간보호 효능을 비타민 C와 비교 관찰하기 위하여 SMP30를 제거(knock out)한 마우스를 이용하였다. 정상의 C57BL/6(WT) 마우스와 SMP30 제거(Knock-out) C57BL/6(KO) 마우스에서 비타민 C와 아라자임을 투여하고 급성 간손상을 유도한 경우, 간세포의 괴사가 억제되는 것을 조직학적으로 관찰할 수 있었으며 이는 간손상이 적다는 것을 의미한다(도 1, 2 참조).The present inventors used mice knocked out of SMP30 to observe the hepatoprotective efficacy of arazyme in the absence of SMP30 with vitamin C. Hepatic necrosis was inhibited when normal C57BL / 6 (WT) mice and SMP30-knock-out C57BL / 6 (KO) mice were administered vitamin A and arazyme and induced acute liver injury. It can be observed that this means less liver damage (see Fig. 1, 2).
또한 SMP30 제거 마우스의 간세포에서는 SMP30의 면역반응이 관찰되지 않았으나 정상 마우스의 간세포에서는 특이적으로 SMP30 면역 양성 반응이 관찰되었으며 비타민 C와 아라자임을 처리한 마우스에서는 처리하지 않은 마우스에서보다 SMP30가 더 강하게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다(도 3, 4, 5, 6 참조). SMP30는 세포손상에 있어서 칼슘의 세포질 내 축적 억제나 항산화 작용을 가지므로 아라자임을 처리한 마우스에서의 SMP30 단백질의 발현은 세포 자멸사와 괴사를 억제시키는 것으로 보인다.SMP30 immunoreactivity was not observed in hepatocytes of SMP30-removed mice, but SMP30-immune positive responses were observed in hepatocytes of normal mice. SMP30 was stronger in mice treated with vitamin C and arazyme than in untreated mice. It can be observed that the expression (see Fig. 3, 4, 5, 6). Since SMP30 has a cytoplasmic accumulation or antioxidant activity of calcium in cell damage, the expression of SMP30 protein in arazyme-treated mice seems to inhibit apoptosis and necrosis.
P-smad3는 간에 손상이 가해져 염증과 섬유화가 진행될 때 발현이 높게 나타 난다. 간에 손상이 가해지면 TGF-1가 간세포, 임파구, 비만세포, 대식세포에서 합성되며 이 TGF-1는 간세포에 존재하는 TGF-1 수용체 Ⅱ(TGF-1 receptor II)에 결합하여 TGF-1 수용체 II을 활성화시키고, 활성화된 TGF-1 수용체 II는 TGF-1 수용체 I을 인산화시켜 활성화시킨다. 인산화된 TGF-1 receptor I는 Smad2, Smad3를 인산화시키고 인산화된 Smad2, Smad3(P-smad2/3)는 Smad4와 헤테로올리고머(heterooligomer)를 형성하여 간세포의 핵 내로 이동하여 표적 유전자(target gene)의 전사를 자극하게 된다. 그러므로 P-smad3가 강하게 발현되었다면 그것은 그만큼 간세포에 많은 손상이 왔음을 의미한다고 볼 수 있다. P-smad3 is highly expressed when damage to the liver causes inflammation and fibrosis. When the liver is damaged, TGF-1 is synthesized in hepatocytes, lymphocytes, mast cells, and macrophages, which bind to TGF-1 receptor II, which is present in hepatocytes. Activated TGF-1 receptor II is activated by phosphorylating TGF-1 receptor I. Phosphorylated TGF-1 receptor I phosphorylates Smad2, Smad3, and phosphorylated Smad2, Smad3 (P-smad2 / 3) forms a heterooligomer with Smad4, which migrates into the nucleus of hepatocytes to target the target gene. Will stimulate transcription. Therefore, if P-smad3 is strongly expressed, it means that much damage to hepatocytes has occurred.
정상 마우스 그룹에서는 비타민 C와 아라자임을 처리한 그룹(G3, G4)보다 사염화탄소만 투여한 그룹(G2)에서 P-smad3의 강한 면역반응이 관찰되었다. SMP30 제거 마우스에서는 아라자임을 처리한 그룹(G8)보다 사염화탄소 단독 또는 비타민 C를 투여한 그룹(G6, G7)에서 강한 면역 양성 반응이 관찰되었다(도 7, 8, 9, 10 참조). 사염화탄소에 의해 같은 손상을 가하더라도 SMP30이 발현되지 않은 SMP30 제거 마우스의 그룹에서 더 큰 간세포 손상을 일으킴을 알 수 있었다. 또한 비타민 C를 투여한 마우스에서보다 아라자임을 투여한 마우스의 간에서 P-smad3의 발현이 적게 나타나고 있다. 이는 아라자임이 TGF-에 의한 만성 염증자극을 억제한다는 것을 뒷받침하며 간세포 보호의 효능이 매우 뛰어남을 보여 준다. 반면, Smad는 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스의 간세포에서 별다른 차이없이 발현했다(도 11, 12, 13 참조).In the normal mouse group, a stronger immune response of P-smad3 was observed in the group administered with carbon tetrachloride only (G2) than in the group treated with vitamin C and arazyme (G3, G4). In SMP30-removed mice, stronger immune positive responses were observed in carbon tetrachloride alone or vitamin C-treated groups (G6, G7) than in arazyme-treated groups (G8) (see FIGS. 7, 8, 9 and 10). The same damage caused by carbon tetrachloride caused more hepatocellular damage in the group of SMP30 deficient mice that did not express SMP30. In addition, the expression of P-smad3 is less expressed in the liver of mice treated with arazyme than in mice administered with vitamin C. This supports that arazyme inhibits TGF-induced chronic inflammatory stimuli and shows very good efficacy of hepatocyte protection. In contrast, Smad was expressed in the hepatocytes of normal mice and SMP30 deficient mice without any difference (see FIGS. 11, 12, 13).
CYP2E1의 발현은 아라자임을 투여한 마우스의 간세포에서만 증가하였다(도 14, 15 참조). 이는 아라자임을 처리하지 않은 그룹에서는 중심정맥 주변의 간세포가 이미 자멸사하였거나 괴사로 인해 CYP2E1이 발현되지 않고 아라자임의 간보호 효능으로 중심정맥 주변의 간세포에 어느 정도 손상만 가해져 CYP2E1이 발현된 것으로 사료된다.Expression of CYP2E1 was increased only in the hepatocytes of mice administered arazyme (see Figures 14 and 15). In the group not treated with arazyme, the hepatic cells around the central vein had already abolished or the CYP2E1 was not expressed due to necrosis. do.
사염화탄소의 대사과정에서 사이토크롬 P450(Cytochrome P450; CYP)에 의해 C-Cl 결합에서 전자가 이동하여 라디칼(radical)을 형성하는 것부터 대사가 시작된다. 트리클로로메틸 라디칼(Trichloromethyl radical)은 산화반응과 환원반응을 다 거칠 수 있으며 CYP2E1과 2B1/2B2이 사염화탄소를 불활성화시키며, 이 반응에 의해 CYP2E1의 단백질 총량이 감소하므로 결국은 CYP2E1의 발현을 지속적으로 증가시킨다.In metabolism of carbon tetrachloride, metabolism begins with the formation of radicals by the transport of electrons at C-Cl bonds by cytochrome P450 (CYP). Trichloromethyl radicals can undergo both oxidation and reduction reactions, and CYP2E1 and 2B1 / 2B2 inactivate carbon tetrachloride, which reduces the total amount of CYP2E1 protein, eventually leading to continued expression of CYP2E1. Increase.
위와 같이 아라자임을 처리하면 손상된 간세포에서 간세포의 괴사를 막고, SMP30의 발현이 증대되며 P-smad3의 발현은 감소했으며 아라자임의 간보호 효능으로 화학물질등으로 인한 중심정맥 주변의 간세포의 손상을 억제화하여 CYP2E1의 발현이 나타났다. 이로써 본 발명의 아라자임은 효과적으로 간을 보호함을 확인할 수 있었다. 또한 아라자임을 암컷 위스터(Wistar) 랫트에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 0, 1250, 2500 및 5000 ㎎/㎏ 농도에서 일반증상과 육안 병리 소견에서 아무런 이상 소견이 나타나지 않았다. 이상과 같이 경구 투여 독성시험 에 의한 50% 치사량(LD50)은 적어도 5,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단된다. 그러므로 본 발명의 아라자임은 간기능 보호용 약학적 조성물로서 제공될 수 있으며, 간질환 예방 및 치료에 사용되는 간기능 보호용 약학적 조성물로서도 제공될 수 있다. 상기 간질환에는 급성간염, 만성간염, 지방간, 간경변증, 간성 혼수, 알코올성 간질환 및 간암 등이 포함된다.The treatment of arazyme prevents the necrosis of hepatocytes in damaged hepatocytes, increases the expression of SMP30, decreases the expression of P-smad3, and reduces the damage of hepatocytes around the central vein due to chemicals, etc. Inhibition showed expression of CYP2E1. This confirmed that the arazyme of the present invention effectively protects the liver. Toxicity experiments were performed by oral administration of arazyme to female Wistar rats. There were no abnormalities in general symptoms and gross pathological findings at concentrations of 0, 1250, 2500 and 5000 mg / kg. As described above, the 50% lethal dose (LD 50 ) by the oral administration toxicity test is considered to be a safe substance of at least 5,000 mg / kg or more. Therefore, the arazyme of the present invention may be provided as a pharmaceutical composition for protecting liver function, and may also be provided as a pharmaceutical composition for protecting liver function used for preventing and treating liver disease. The liver disease includes acute hepatitis, chronic hepatitis, fatty liver, cirrhosis, hepatic coma, alcoholic liver disease and liver cancer.
본 발명의 아라자임에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.In addition to the arazyme of the present invention, it may contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions. For administration, it may be prepared further comprising one or more pharmaceutically acceptable carriers. Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, as necessary, including antioxidants, buffers, Other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to formulate into main dosage forms, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like. Furthermore, it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).
본 발명의 간기능 보호용 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있 으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 아라자임의 일일 투여량은 0.01 ~ 5000 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 0.01 ~ 10 ㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다. The pharmaceutical composition for protecting liver function of the present invention may be administered parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) or orally according to a desired method. The range varies depending on sex, health status, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of disease. The daily dose of arazyme according to the present invention is 0.01 to 5000 mg / kg, preferably 0.01 to 10 mg / kg, and more preferably administered once to several times a day.
또한, 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 유효성분으로 함유하는 간기능 보호용 건강식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health food for protecting liver function, which comprises a culture solution of aranicola proteoricicus or arazyme isolated therefrom as an active ingredient.
본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 식품 첨가물로 이용할 경우, 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 상기의 아라자임을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 이용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 이용될 수 있다. 아라자임은 상기와 같은 동일한 방법으로 수득하여 이용한다. 유효 성분의 혼합양은 이용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임은 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량부, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량부의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 이용될 수 있다.When using the culture solution of aranicola proteoricicus of the present invention or the arazyme separated from it as a food additive, the culture medium of aranicola proteoricicus or the arazyme as described above is used as it is or used with other food or food ingredients. It may be used and may be appropriately used according to a conventional method. Arazyme is obtained and used in the same manner as described above. The mixed amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment). In general, in the preparation of food or beverage, the culture solution of aranicola proteoricicus of the present invention or arazyme separated therefrom is added in an amount of 0.01 to 10 parts by weight, preferably 0.05 to 1 part by weight based on the raw materials. . However, in the case of long-term intake for health and hygiene or health control, the amount may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety. .
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식 품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.There is no particular limitation on the kind of food. Examples of foods to which the above substances can be added include dairy products including meat, sausages, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, drinks, Alcoholic beverages and vitamin complexes, etc., includes all of the health food in the conventional sense.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 이용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 음료 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.The health beverage composition of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates, etc. as additional components, as in the general beverage. The natural carbohydrates described above are glucose, monosaccharides such as fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. As the sweetener, natural sweeteners such as tautin and stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin, aspartame, and the like can be used. The proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 ml of the beverage composition of the present invention.
상기 외에 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 이용되는 탄산화제 등에 첨가할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육에도 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 첨가할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 이용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또 는 이로부터 분리된 아라자임 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.In addition to the above, Aranicola proteoricicus culture medium or arazyme isolated therefrom is a variety of nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH It can be added to regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks and the like. In addition to the pulp for the production of natural fruit juices, fruit juice beverages and vegetable beverages can be added to the culture solution of aranicola proteoricicus or arazyme separated therefrom. These components can be used independently or in combination. The ratio of such additives is not critical, but is usually selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the culture or arazyme isolated therefrom.
또한, 본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 세포사멸 억제제를 제공한다.The present invention also provides an apoptosis inhibitor containing arazyme as an active ingredient.
또한, 본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 P-smad3 발현억제제를 제공한다.The present invention also provides a P-smad3 expression inhibitor containing arazyme as an active ingredient.
아울러, 본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 중심정맥 주변의 간세포의 손상억제제를 제공한다.In addition, the present invention provides an inhibitor of damage to liver cells around the central vein containing arazyme as an active ingredient.
이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by Examples, Experimental Examples and Formulation Examples.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제제예에 한정되는 것은 아니다.However, the following Examples, Experimental Examples, and Formulation Examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following Examples, Experimental Examples, and Formulation Examples.
<< 실시예Example 1> 1> 아라자임Arazyme (( arazymearazyme )의 제조Manufacturing
본 발명의 유효성분인 아라자임(arazyme)을 제조하기 위하여, 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주(KCTC 0268BP)를 배양배지(박토 트립톤 0.5 %, 효모 추출물 0.5 %, 염화 나트륨 0.1 %, 염화 칼륨 0.05 %, 염화 칼슘 0.02 %, 황산 마그네슘 0.02 %)에서 22℃로 18 시간 동안 배양하였다. 배양액을 2 ㎛ 막여과를 이용해서 균체와 상등액을 분리한 다음 분리된 상등액을 10 kDa의 막 여과를 이용하여 농 축하였다. 본 발명의 아라자임은 기본적으로 음이온의 특성을 가지므로 농축액을 50 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 전처리한 DEAE-셀룰로오즈(DEAE-cellulose)를 이용한 이온 교환 수지(ion exchange resin)와 20 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 전처리한 세파덱스 G-75(Sephadex G-75)를 이용한 젤 여과 교환수지(gel filtration exchange resin)를 이용해 정제를 했다. 정제된 효소액은 10% SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)로 전기영동(electrophoresis)을 하여 밴드 경향을 확인하였는데 그 결과 본 발명의 아라자임은 소단위를 갖지 않는 단일체(monomer)로서 약 51.5 kDa의 분자량을 갖는 밴드를 나타냄을 확인하였다. 단, 아라자임의 생산을 위한 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주(KCTC 0268BP)는 다양한 산업용 배지에서 생산을 할 수 있으며 생산된 배양액 또한 다양한 방법으로 분리 및 정제하여 이용할 수 있다. 본 발명의 아라자임은 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드 서열을 가지며, 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 가진다.In order to prepare arazyme (arazyme), the active ingredient of the present invention, Aranicola proteoricicus HY-3 strain (KCTC 0268BP) was cultured in a culture medium (bacto tryptone 0.5%, yeast extract 0.5%, sodium chloride 0.1%, 0.05% potassium chloride, 0.02% calcium chloride, 0.02% magnesium sulfate) was incubated at 22 ° C. for 18 hours. The culture solution was separated by cell membrane and supernatant using 2 μm membrane filtration, and then the separated supernatant was concentrated using membrane filtration of 10 kDa. Since the arazyme of the present invention basically has anion properties, the ion exchange resin and the ion exchange resin using DEAE-cellulose, which have been pretreated with 50 mM tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.6), and 20 mM Purification was carried out using a gel filtration exchange resin using Sephadex G-75 pretreated with Tris-HCl buffer (pH 7.6). The purified enzyme solution was subjected to electrophoresis with 10% SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel), and the band tendency was confirmed. As a result, the arazyme of the present invention was a monomer having no subunit and was approximately 51.5 kDa. It was confirmed that a band having a molecular weight of? However, Aranicola proteoricicus HY-3 strain (KCTC 0268BP) for the production of arazyme can be produced in a variety of industrial media, and the produced culture solution can also be separated and purified by various methods. The arazyme of the present invention has a polypeptide sequence as set out in SEQ ID NO: 1 and a polynucleotide sequence as set out in SEQ ID NO: 2.
<< 실험예Experimental Example 1> 1> 시험군의Test group 구성 및 투여 Composition and Administration
SMP30은 중요한 노화 표지단백질이며 체내의 비타민 C 합성 과정에 관여해 비타민 C 합성을 증가시킴으로서 항산화제로서의 역할도 한다. 본 발명에는 12주령, 수컷, 정상의 C57BL/6(WT) 마우스와 SMP30 제거(Knock-out) C57BL/6(KO) 마우스를 이용해 사염화탄소에 의한 간손상시 SMP30과 아라자임(arazyme)의 연관성을 관찰하였다. SMP30 제거(Knock-out) C57BL/6(KO) 마우스는 도쿄 노인 대사 협 회(Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology)에서 SMP30 KO C57BL/6 마우스를 수컷 10두 및 암컷 20두를 분양받아 경북대학교 수의과대학 병리학교실 동물실에서 사육하였다. 사육을 통해 태어난 F1 마우스 중에 PCR을 이용한 꼬리 DNA 지노타이핑(tail DNA genotyping)을 통해 녹아웃(knock out) 마우스만을 선별 하였다. SMP30 is an important aging marker protein and is involved in the body's vitamin C synthesis process, increasing vitamin C synthesis and acting as an antioxidant. In the present invention, the association between SMP30 and arazyme in liver damage by carbon tetrachloride using 12-week-old, male, normal C57BL / 6 (WT) mice and SMP30-knockout C57BL / 6 (KO) mice Observed. SMP30-knockout C57BL / 6 (KO) mice received 10 male and 20 female SMP30 KO C57BL / 6 mice from the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Breeding in the classroom animal room. Among the F1 mice born through breeding, only knockout mice were selected through tail DNA genotyping using PCR.
정상 마우스는 입수 후 동물실에서 약 7일간 검역 및 순화시켰으며, 순화기간 중 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만을 선발하여 시험에 이용하였다. 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스는 모두 12주령으로 그룹간의 주령의 차이는 배제하였다.Normal mice were quarantined and purified for about 7 days in the animal room after acquisition, and only healthy animals were selected and used for the test by observing general symptoms during the acclimation period. Normal mice and SMP30-removed mice were all 12 weeks old, excluding differences in age between groups.
본 발명에서 이용된 랫트의 경우, 온도 22± 3℃, 상대습도 50± 10%, 조명시간 12 시간(08:00 점등 ~ 20:00 소등)으로 설정된 자동 온습도 조절 장치가 설치된 동물실에서 순화 및 사육되었다. 환경조건은 정기적(3개월 1회)으로 측정되었다. 환경 측정의 결과, 시험에 영향을 미칠 것으로 사료되는 변동은 인정되지 않았다. 전 시험기간 동안 폴리카보네이트제 사육상자[240 W × 390 L × 175 H (mm)]에 5마리 이하씩 수용하였다. 개별 식별은 유성 매직펜을 이용한 피부표식법과 사육상자별 개체식별 카드표시법을 이용하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(PMI Nutrition International, 505 North 4th Street Richmond, in 47374, USA)를 방사선 조사(13.2 kGy) 멸균하여 자유 섭취시켰다. 물은 카본 필터를 통해 정화된 상수도수를 물병을 이용하여 자유 섭취 시켰다. 본 발명의 간손상 물질로 이용된 사염화탄소는 0.4 ㎖/㎏의 농도로 올리브 오일(olive oil)에 희석하여 단회 투여하고 투여 후 24 시간째 부검을 실시하였다. In the rat used in the present invention, the temperature was 22 ± 3 ℃, relative humidity 50 ± 10%, and the lighting time was adjusted in an animal room equipped with an automatic temperature and humidity control device set at an illumination time of 12 hours (08:00 to 20:00 lights out). Breeding Environmental conditions were measured regularly (once every three months). As a result of environmental measurements, no fluctuations that are expected to affect the test were accepted. Less than 5 animals were housed in polycarbonate breeding boxes [240 W x 390 L x 175 H (mm)] during the entire test period. Individual identification was done using the skin marker method using oily magic pen and the individual identification card marking method by breeding box. Feed was freely ingested by irradiation (13.2 kGy) sterilization of experimental animal solid feed (PMI Nutrition International, 505 North 4th Street Richmond, in 47374, USA). Water was freely ingested by tapping the tap water purified through a carbon filter. Carbon tetrachloride used as the liver damage material of the present invention was diluted in olive oil at a concentration of 0.4 ml / kg and administered once, and autopsy was performed 24 hours after administration.
정상 마우스와 SMP30 제거 마우스를 각각 음성 대조군(G1, G5), 양성 대조군(G2, G6), 실험군 1(G3, G7), 실험군 2(G4, G8)의 8 그룹으로 5 마리씩 구분하였다(표 1). 음성대조군(G1, G5)의 마우스에는 올리브 오일을 복강으로 단회 투여하였고, 양성대조군(G2, G6)에는 사염화탄소(0.4 ㎖/㎏)를 단회 복강 투여하였다. 실험군 1(G3, G7)은 사염화탄소를 투여하기 하루 전에 비타민 C를 100 ㎎/㎏의 농도로 상수도수(tap-water)에 용해시켜 경구 투여 후 사염화탄소(0.4 ㎖/㎏)를 복강 투여하였다. 실험군 2(G4, G8)에는 역시 사염화탄소를 투여하기 1 일전에 아라자임을 100 ㎎/㎏의 농도로 상수도수에 용해시켜 경구 투여 후 사염화탄소(0.4 ㎖/㎏)를 복강으로 단회 투여하였다. 사염화탄소를 복강 투여하고 24 시간 후에 모든 마우스의 부검을 실시하였으며 병리조직학적 검사를 위해 각 동물마다 장기 샘플을 채취하였다.Normal mice and SMP30-removed mice were divided into eight groups of negative control group (G1, G5), positive control group (G2, G6), experimental group 1 (G3, G7), and experimental group 2 (G4, G8), respectively (Table 1). ). The mice in the negative control group (G1, G5) were given a single intraperitoneal olive oil, and the positive control group (G2, G6) was intraperitoneally administered with carbon tetrachloride (0.4 ml / kg). Experimental group 1 (G3, G7) was dissolved in tap water with vitamin C at a concentration of 100 mg / kg one day prior to the administration of carbon tetrachloride and orally administered with carbon tetrachloride (0.4 ml / kg). Experimental group 2 (G4, G8) was also dissolved in tap water at a concentration of 100 mg / kg 1 day before administration of carbon tetrachloride, and orally administered with carbon tetrachloride (0.4 ml / kg) once intraperitoneally. 24 hours after intraperitoneal administration of carbon tetrachloride, all mice were necropsied and organ samples were taken for each animal for histopathological examination.
실험군의 구성은 아래의 표 1과 같다.The composition of the experimental group is shown in Table 1 below.
동물 : 12주령, 수컷, 정상의 C57BL/6(WT) 마우스 및 SMP30 제거(Knock-out: KO) C57BL/6 마우스Animals: 12-week-old, male, normal C57BL / 6 (WT) mice and SMP30 removal (Knock-out: KO) C57BL / 6 mice
아라자임 처리 : 사염화탄소 처리 전 경구 투여(100 ㎎/㎏) Arazyme treatment: Oral administration before treatment with carbon tetrachloride (100 mg / kg)
비타민 C 처리 : 사염화탄소 처리 전 경구 투여(100 ㎎/㎏)Vitamin C treatment: Oral administration before carbon tetrachloride treatment (100 mg / kg)
사염화탄소 처리 : 복강 투여(0.4 ㎖/㎏ = 10% CCl4 4 ㎖/㎏)Carbon tetrachloride treatment: intraperitoneal administration (0.4 ml / kg = 10% CCl 4 4 ml / kg)
<실험예 2> 간세포의 조직병리학적 관찰Experimental Example 2 Histopathological Observation of Hepatocytes
사염화탄소에 의한 간 손상시 아라자임의 효과를 조직병리학적으로 검사하기 위해서 부검시 채취된 간을 10% 중성 포르말린을 이용하여 고정하고 저장한 후 고정 조직을 10% 중성 포르말린을 이용한 고정 조직을 자동 조직 처리기구(automatic tissue processor)로 조직 처리를 수행하였다. 조직 처리과정을 거친 간 세포는 파라핀 포매 후 4 ㎛의 두께로 조직절편을 한 후 건조시켜 헤마톡살린-에오신 염색(Hematoxylin-eosin staining, H&E 염색)을 한 후 광학현미경으로 관찰하였다.In order to examine the effect of arazyme on liver damage caused by carbon tetrachloride, the livers collected at autopsy were fixed and stored with 10% neutral formalin, and the fixed tissues were fixed with 10% neutral formalin. Tissue treatment was performed with an automatic tissue processor. After the tissue treatment, hepatic cells were paraffin-embedded, and the tissue sections were dried to a thickness of 4 μm, dried, and observed by optical microscope after hematoxylin-eosin staining (H & E staining).
사염화탄소를 투여하고 24 시간 후 부검한 마우스 간의 H&E 염색결과에서는 전체적으로 정상 마우스(G1-G4)에 비해 SMP30 제거 마우스(G5-G8)에서 소엽중심성 괴사 소견과 염증반응이 많은 것을 관찰 할 수 있었다. 또한 정상 마우스(G1-G4)와 SMP30 제거 마우스(G5-G8) 모두 비타민 C와 아라자임을 투여한 그룹에서 간세포의 괴사소견이 억제되는 것을 관찰 할 수 있었다(도 1, 2).The H & E staining of the livers of rats autopsied 24 hours after the administration of carbon tetrachloride showed more lobular-centered necrosis and inflammatory responses in SMP30-removed mice (G5-G8) than in normal mice (G1-G4). In addition, normal mice (G1-G4) and SMP30-removed mice (G5-G8) were observed to suppress the necrosis of hepatocytes in the group administered with vitamin C and arazyme (Fig. 1, 2).
간손상에 대한 조직생리학적으로 관찰된 수치는 아래의 표 2와 같다. Histophysiologically observed values for liver damage are shown in Table 2 below.
<< 실험예Experimental Example 3> 간세포에서 3> in hepatocyte SMP30SMP30 의 발현 관찰Observation of Expression
<3-1> 간세포에서 SMP30의 면역조직화학적 관찰<3-1> Immunohistochemical Study of SMP30 in Hepatocytes
SMP30의 면역조직화학적 관찰을 위하여, 포르말린에 고정한 후 제작된 파라핀 포매조직을 4 ㎛의 두께로 박절하여 탈파라핀시킨 후 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위해 3% H2O2에 30분간 처리하고 0.01 M 인산완충식염수(phosphate-buffer saline, PBS)로 세척한 다음, 조직의 항원 발현을 증가시키기 위하여 0.01 M 구연산염(citrate) 완충액으로 처리하고, 마이크로파(microwave)로 고열처리 하였다. 비특이적 반응을 억제하기 위하여 20 g/㎖ 프로테이나제(Proteinase) K로 37℃에서 10분간 처리한 후 인산완충식염수로 세척 후 1 시간 동안 차단(blocking)시켰다. 그 후, 1차 항체인 SMP30(1:5000, Akihito Ishigami, Japan)을 4℃에서 하룻밤 동안 처리한 다음 PBS 완충액으로 5분간 3회 세척하고 비오틴(biotin)과 결합시켰다. 비오틴과 결합된 1차 항체를 완충액으로 세척한 후 스트렙트아비딘(Streptavidin)으로 접합된 HRP(Horse-Rradish Peroxidase)를 부착 시키고, 완충액으로 세척한 후 Histostantin-plus bulk kit(Zymed Laboratories Inc, USA)로 37℃에서 30분간 반응시켜 충분히 세척한 후 3,3-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloried; DAB, Zymed Laboratories Inc, USA) 용액으로 발색시키고 증류수로 세척한 다음 Meyer's hematoxylin(Research genetics, USA)으로 대조 염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다.For immunohistochemical observation of SMP30, paraffin-embedded tissues fixed in formalin were cut to 4 μm thickness and deparaffinized, and then treated with 3% H 2 O 2 for 30 minutes to inhibit endogenous peroxidase activity. After washing with 0.01 M phosphate-buffer saline (PBS), the tissues were treated with 0.01 M citrate buffer to increase the antigen expression of the tissues, followed by high temperature treatment with microwaves. In order to inhibit the nonspecific reaction, 20 g / ml Proteinase K was treated for 10 minutes at 37 ° C., and then washed with phosphate buffered saline and then blocked for 1 hour. Subsequently, the primary antibody SMP30 (1: 5000, Akihito Ishigami, Japan) was treated at 4 ° C. overnight, washed three times with PBS buffer for 5 minutes and bound with biotin. The primary antibody bound to biotin was washed with buffer, and then HRP (Horse-Rradish Peroxidase) conjugated with streptavidin was attached. After washing with buffer and reacting with Histostantin-plus bulk kit (Zymed Laboratories Inc, USA) for 30 minutes at 37 ° C., the solution was sufficiently washed and then washed with 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloried (DAB, Zymed). Laboratories Inc, USA) solution, washed with distilled water, and then stained with Meyer's hematoxylin (Research genetics, USA) was observed by light microscopy.
SMP30의 면역조직화학적 관찰 결과, SMP30 제거 마우스에서는 SMP30의 면역반응이 관찰되지 않았으며, 정상 마우스에서는 간세포에서 특이적으로 SMP30 면역 양성 반응이 관찰되었다(도 3, 4). 정상 마우스 그룹의 음성 대조군(G1)에서 발현되는 SMP30의 발현 정도가 사염화탄소 손상을 받은 그룹(G2)의 SMP30 발현 정도보다 월등함을 관찰할 수 있다. 반면에 비타민 C 또는 아라자임을 처리한 그룹(G3, G4)에서는 SMP30 발현이 사염화탄소만을 처리한 양성대조군(G2, G6)보다 더 강하게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다.As a result of immunohistochemical observation of SMP30, no immune response of SMP30 was observed in the SMP30-removed mice, and SMP30 immune positive response was specifically observed in hepatocytes in normal mice (FIGS. 3 and 4). It can be observed that the expression level of SMP30 expressed in the negative control group (G1) of the normal mouse group is superior to the expression level of SMP30 of the group (G2) that received carbon tetrachloride damage. On the other hand, in the group treated with vitamin C or arazyme (G3, G4), it was observed that the expression of SMP30 was stronger than the positive control group treated with carbon tetrachloride only (G2, G6).
<3-2> 간세포에서 SMP30의 면역블롯팅(immunoblotting)에 의한 단백질 발현의 분석<3-2> Analysis of Protein Expression by Immunoblotting of SMP30 in Hepatocytes
간세포에서 SMP30의 면역블롯팅(immunoblotting)에 의한 단백질 발현의 분석을 위하여, -70℃에 냉동된 간 조직을 0.1 mM 나트륨오르토바나드산염(sodium orthovandate, Na3VO4)과 단백질분해효소 억제제 칵테일 타블렛(protease inhibitor coctail tablet, Roche, Mannheim, Germany)을 용해시킨 RIPA 완충액에 균질화시켰다. 균질화된 간 샘플을 4,000 rpm 4℃에서 10분간 원심분리하여 지방을 제거 후 상등액을 수득하였다. 상등액을 다시 14,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 수득하였다. 브래드포드 방법(Bradford method)을 이용하여 단백질 농도를 측정하고 각 단백질 샘플을 80 g/well로 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에 전기영동하였다. 전기영동된 겔 내의 단백질을 PVDF 막(PVDF membrane ; Schleicher & Chuell, Dassel, Germany)에 전기이동(electro-transfer)을 수행하였다. 같은 양의 단백질이 로딩(loading)된 것을 쿠마시 블루 염색(Coomassie blue staining)을 통해 확인했다. 3% 우혈청 알부민(Bovine serum albumin)을 인산완충식염수에 용해시킨 차단용액(Blocking solution)에 1 시간 동안 차단 과정 후, 1차 항체인 SMP30(1:5,000, Akihito Ishigami, Japan), β-Actin(1:500 Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)에 반응시켰다. 0.5% 트윈(Tween) 200이 용해된 TBS 완충액에 충분히 세척하고 1차 항체에 대응하는 2차 항체인 항-토끼-HRP-항체(Akihito Ishigami, Japan)를 1:1,000 ~ 1:2,000의 비율로 희석하고 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 다시 TBS 완충액으로 충분히 세척 후 특이적인 반응을 관찰하기 위해 super signal West Dura Extended Duration Substrate(PIERCE, USA)와 반응시키고 의학용 X-ray 필름(Kodak, Tokyo, Japan)에 노출시켰다.For analysis of protein expression by immunoblotting of SMP30 in hepatocytes, liver tissues frozen at −70 ° C. were prepared with 0.1 mM sodium orthovandate (Na 3 VO 4 ) and protease inhibitor cocktails. The tablets (protease inhibitor coctail tablet, Roche, Mannheim, Germany) were homogenized in lysed RIPA buffer. Homogenized liver samples were centrifuged at 4,000 rpm 4 ° C. for 10 minutes to remove fat to obtain a supernatant. The supernatant was again centrifuged at 14,000 rpm and 4 ° C. for 20 minutes to obtain a supernatant. Protein concentration was measured using the Bradford method and each protein sample was electrophoresed on a 10% SDS-polyacrylamide gel at 80 g / well. Proteins in the electrophoretic gels were subjected to electro-transfer to a PVDF membrane (PVDF membrane; Schleicher & Chuell, Dassel, Germany). Loading of the same amount of protein was confirmed by Coomassie blue staining. After blocking for 1 hour in a blocking solution in which 3% bovine serum albumin was dissolved in phosphate buffered saline, the primary antibody SMP30 (1: 5,000, Akihito Ishigami, Japan), β-Actin (1: 500 Santa Cruz Biotechnology Inc, USA). After washing sufficiently in TBS buffer in which 0.5% Tween 200 was dissolved, the anti-rabbit-HRP-antibody (Akihito Ishigami, Japan), a secondary antibody corresponding to the primary antibody, in a ratio of 1: 1,000 to 1: 2,000. Diluted and reacted at room temperature for 1 hour. After washing sufficiently with TBS buffer, it was reacted with super signal West Dura Extended Duration Substrate (PIERCE, USA) to observe specific reaction and exposed to medical X-ray film (Kodak, Tokyo, Japan).
SMP30의 단백질 발현 분석 결과, 정상 마우스에서는 SMP30의 발현을 관찰할 수 있었으나, SMP30 제거 마우스의 전 그룹에서는 SMP30에 대한 면역 양성 반응이 관찰되지 않았다(도 5, 6). As a result of protein expression analysis of SMP30, expression of SMP30 was observed in normal mice, but no immune positive response to SMP30 was observed in all groups of SMP30-removed mice (FIGS. 5 and 6).
정상 마우스 그룹에 있어서는 올리브 오일을 단일 투여한 음성대조군에서 SMP30가 가장 강하게 발현되었으며, 사염화탄소만 투여한 그룹(G2)의 SMP30 발현이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 또 비타민 C(G3)와 아라자임(G4)을 투여한 그룹에서는 사염화탄소 단독 투여군보다 SMP30의 발현이 높게 관찰되었다. In the normal mouse group, SMP30 was most strongly expressed in the negative control group administered with olive oil, and SMP30 expression was suppressed in the group (G2) administered with carbon tetrachloride only. In the group administered with vitamin C (G3) and arazyme (G4), the expression of SMP30 was higher than that of carbon tetrachloride alone group.
<실험예 4> 간세포에서 P-smad3의 발현 관찰Experimental Example 4 P-smad3 Expression in Hepatocytes
<4-1> 간세포에서 P-smad3의 면역조직화학적 관찰<4-1> Immunohistochemical Observation of P-smad3 in Hepatocytes
간세포에서 P-smad3의 면역조직화학적 관찰을 위하여, 상기 실험예 3-1과 같은 과정으로 수행하였으며 1차 항체는 SMP30대신으로 1차 항체 P-smad3(1:200, Cell Signaling Technology Inc, USA)을 이용하였다. For immunohistochemical observation of P-smad3 in hepatocytes, In the same manner as in Experiment 3-1, the primary antibody was used as the primary antibody P-smad3 (1: 200, Cell Signaling Technology Inc, USA) instead of SMP30.
P-smad3의 면역조직화학적 관찰 결과, 정상 마우스 그룹에서는 비타민 C와 아라자임을 처리한 그룹(G3, G4)보다 사염화탄소만 투여한 그룹(G2)에서 P-smad3의 강한 면역 양성 반응이 관찰되었다. SMP30 제거 마우스에서는 아라자임을 처리한 그룹(G8)보다 사염화탄소 단독 또는 비타민 C를 투여한 그룹(G6, G7)에서 강한 면역 양성 반응이 관찰되었다(도 7, 8). 또한 비타민 C(G3, G7)보다 아라자임을 투여한 그룹(G4, G8)에서 P-smad3의 발현이 낮았다.Immunohistochemical observations of P-smad3 showed a strong immunopositive response of P-smad3 in the normal mouse group and the carbon tetrachloride-treated group (G2) than the vitamin C and arazyme-treated groups (G3, G4). In SMP30-removed mice, stronger immune positive responses were observed in carbon tetrachloride alone or vitamin C-treated groups (G6, G7) than in arazyme-treated groups (G8) (FIGS. 7, 8). In addition, the expression of P-smad3 was lower in the arazyme group (G4, G8) than vitamin C (G3, G7).
<4-2> 간세포에서 P-<4-2> P- in Hepatocytes smad3smad3 의 of 면역블롯팅에On immunoblotting 의한 단백질 발현의 분석 Analysis of protein expression by
간세포에서 P-smad3의 면역블롯팅에 의한 단백질 발현의 관찰을 위하여, 상기 실험예 3-2와 같은 과정으로 수행하였으며 1차 항체 SMP30 대신으로 1차 항체 P-smad3(1:200, Cell Signaling Technology Inc, USA)를 이용하였으며 2차 항체로 항-토끼-HRP-항체(1:1,000 ~ 1:2,000, Cell Signaling Technology Inc, USA)를 이용하였다.For observation of protein expression by immunoblotting of P-smad3 in hepatocytes, The same procedure as in Experiment 3-2 was carried out. Instead of the primary antibody SMP30, the primary antibody P-smad3 (1: 200, Cell Signaling Technology Inc, USA) was used. The secondary antibody was anti-rabbit-HRP-antibody. (1: 1,000 to 1: 2,000, Cell Signaling Technology Inc, USA) was used.
P-smad3는 전체적으로 정상 마우스(G1, G2, G3, G4)보다 SMP30 제거 마우스(G5, G6, G7, G8)에서 강하게 발현되었고 그 중에서도 사염화탄소만 투여한 SMP30 제거 마우스 그룹(G6)에서 가장 강하게 발현되었으며 비타민 C를 투여한 그룹과 아라자임을 투여한 그룹에서는 발현이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(도 9, 10).P-smad3 was expressed more strongly in SMP30-removed mice (G5, G6, G7, G8) than overall mice (G1, G2, G3, G4), and was most strongly expressed in the group of SMP30-removed mice (G6) treated with carbon tetrachloride alone. In the group administered with vitamin C and the group administered with arazyme, expression was observed to be suppressed (FIGS. 9 and 10).
<< 실험예Experimental Example 5> 간세포에서 5> in hepatocytes Smad3Smad3 의 관찰Observation of
<5-1> 간세포에서 <5-1> in hepatocytes Smad3Smad3 의 면역조직화학적 관찰Immunohistochemical observation
간세포에서 Smad3의 면역조직화학적 관찰을 위하여, 상기 실험예 3-1과 같은 과정으로 수행하였으며 1차 항체는 SMP30 대신으로 1차 항체 Smad3(1:100, Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)를 이용하였다. For immunohistochemical observation of Smad3 in hepatocytes, The same procedure as in Experiment 3-1 was carried out, and the primary antibody was used as the primary antibody Smad3 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc, USA) instead of SMP30.
Smad3의 면역조직화학적 관찰 결과, 각 그룹마다 발현되는 총 Smad3의 발현정도는 비슷하고 일정하게 나타났다. SMP30 제거 마우스와 정상 마우스 간에서도 차이는 크게 관찰되지 않는다. 전 실험군에서 Smad3 면역반응에 있어서 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 11, 12). Immunohistochemical observations of Smad3 showed similar and constant levels of total Smad3 expression in each group. No significant difference was observed between SMP30 deficient mice and normal mice. No significant difference in Smad3 immune response was observed in all experimental groups (FIGS. 11 and 12).
<5-2> 간세포에서 <5-2> in hepatocytes Smad3Smad3 의 of 면역블롯팅에On immunoblotting 의한 단백질 발현의 분석 Analysis of protein expression by
간세포에서 Smad3의 면역블롯팅에 의한 단백질 발현의 관찰을 위하여, 상기 실험예 3-2와 같은 과정으로 수행하였으며 1차 항체 SMP30 대신으로 1차 항체 Smad3(1:100, Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)를 이용하였으며 2차 항체로 항-토끼-HRP-항체(1:1,000 ~ 1:2,000, Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)를 이용하였다.For observation of protein expression by immunoblotting of Smad3 in hepatocytes, The same procedure as in Experimental Example 3-2 was carried out, and instead of the primary antibody SMP30, the primary antibody Smad3 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology Inc, USA) was used, and as the secondary antibody, anti-rabbit-HRP-antibody (1 : 1,000 ~ 1: 2,000, Santa Cruz Biotechnology Inc, USA) was used.
Smad3의 단백질 발현을 분석한 결과, Smad3의 발현에 있어서는 전 시험군에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도 13). 정상 마우스 그룹(G1, G2, G3, G4)과 SMP30 제거 마우스 그룹(G5, G6, G7, G8) 사이의 smad3 발현차이는 없었고 모든 그룹에서 일정하게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다 As a result of analyzing the protein expression of Smad3, no significant difference was observed in the expression of Smad3 in all the test groups (Fig. 13). There was no difference in smad3 expression between the normal mouse group (G1, G2, G3, G4) and the SMP30 depleted mouse group (G5, G6, G7, G8), and the expression was consistently observed in all groups.
<< 실험예Experimental Example 6> 간세포에서 6> in hepatocytes CYP2E1CYP2E1 의 면역조직화학적 관찰Immunohistochemical observation
간세포에서 CYP2E1의 면역조직화학적 관찰을 위하여, 상기 실험예 3-1과 같은 과정으로 수행하였으며 1차 항체는 SMP30 대신으로 1차 항체 CYP2E1(1:800 Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)을 이용하였다.For immunohistochemical observation of CYP2E1 in hepatocytes, The same procedure as in Experiment 3-1 was carried out, and the primary antibody was used as the primary antibody CYP2E1 (1: 800 Santa Cruz Biotechnology Inc, USA) instead of SMP30.
CYP2E1의 면역조직화학적 관찰 결과, CYP2E1의 발현이 아라자임을 투여한 그룹에서만 강한 면역 양성 반응이 관찰되었고 다른 그룹에서는 발현정도에 있어서 큰 차이를 관찰할 수 없었다(도 14, 15). 아라자임이 처리된 그룹(G4, G8)에서만 발현되는 경향을 보였다.As a result of immunohistochemical observation of CYP2E1, a strong immunopositive reaction was observed only in the group in which CYP2E1 expression was arazyme and no significant difference was observed in the other groups (FIGS. 14 and 15). Arazyme showed a tendency to be expressed only in the treated groups (G4, G8).
<< 실험예Experimental Example 7> 7> 아라자임의Arazyme 급성 독성실험 Acute Toxicity Test
본 발명의 아라자임에 대한 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.In order to determine the acute toxicity for arazyme of the present invention, the following experiment was performed.
위스터(Wistar) 계통의 9주령 특정병원체부재 (SPF) 암컷 랫트((주)오리엔트, 대한민국, 서울)에 대해 각각 4마리씩 4개군으로 나누어, 온도 22± 3℃, 습도 55± 10%, 조명 12L/12D 조건의 동물실 내에서 사육하였다. 랫트 입수 후 동물실에서 1 주일간 검역 및 순화과정을 거쳤다. 전 시험기간 동안 폴리카보네이트제 사육상자[240 W X 390 L X 175 H (mm)]에서 5마리 이하씩 수용하였다. 개체식별은 유성 매직펜을 이용한 피부표식법과 사육상자별 개체식별 카드표시법을 이용하였다. 실험 동물용 고형사료(PMI Nutrition International, 미국)는 멸균하였으며, 물은 상수도수를 물병을 이용하여 자유 섭취 시켰다.Nine-week-old SPF female rats of the Wister system (Orient, Seoul, Korea) were divided into four groups of four each, temperature 22 ± 3 ℃, humidity 55 ± 10%, and illumination. It was bred in an animal room at 12L / 12D conditions. After the rats were obtained, they were quarantined and purified for one week in the animal room. Up to five animals were housed in a polycarbonate breeding box [240 W X 390 L X 175 H (mm)] for the entire testing period. For individual identification, skin marker using oil-based magic pen and individual identification card marking method by breeding box were used. Solid animal feed (PMI Nutrition International, USA) was sterilized and water was freely ingested using tap water.
상기 실시예의 아라자임을 0, 1250, 2500 및 5000 ㎎/㎏ 농도로 주사용 멸균주사용수에 용해하여 10 ㎖/㎏의 용량으로 조재하여 랫트에 경구투여용 존대(zonde)를 이용하여 단회 경구 투여하였다. 일주일간의 순화 기간을 거쳐서 4개의 그룹으로 분리 한 후 10 주령의 랫트에 아라자임 농도별로 투여한 후 일반 증상 관찰을 실시한 후 아라자임의 실질 장기에 대한 독성을 평가하기 위해서 24 시간 후 부검을 실시하였다. Arazyme of the above example was dissolved in sterile injectable water for injection at concentrations of 0, 1250, 2500 and 5000 mg / kg, prepared at a dose of 10 ml / kg, and orally administered to rats using a zonde for oral administration. It was. After a week-long purifying period, the rats were divided into four groups, administered to arazyme concentrations in 10-week-old rats, followed by general symptoms observation, and autopsies were performed 24 hours later to evaluate the toxicity of arazyme to the organs. .
암컷 랫트에 아라자임을 경구 투여한 후 시험물질 투여에 따른 일반증상을 정확하게 관찰하고 독성을 평가하기 위해서 동물의 행동, 외관, 기능에 대한 관찰을 실시하였다. Oral administration of arazyme to female rats was performed to observe the behavior, appearance and function of animals in order to accurately observe the general symptoms and to evaluate toxicity.
실험결과, 아라자임 투여 후 동물의 활동성, 보행, 기질, 경련 등에 있어서는 아무런 이상 증상이 관찰되지 않았으며, 피모 상태, 안구주변, 귀, 생식기, 사지 상태, 꼬리 상태 등의 동물의 외관 관찰 및 호흡 상태, 타액분비, 분변, 구토 등의 기능 관찰에서도 아무런 이상 증상이 관찰되지 않았다. 아라자임 투여 후 24 시간에 부검을 실시하였다. 육안부검 소견에서도 전장기에서 아라자임 투여에 의한 아무런 이상도 관찰되지 않았다. 아라자임 치사랑(LD50)은 5000 ㎎/㎏이상의 고농도인 것으로 판단된다. 현미경학적 관찰에 있어서 간, 심장, 폐, 췌장 등의 실질 장기에서는 아무런 병리학적 이상 소견이 관찰되지 않았다.As a result, no abnormal symptoms were observed in the activity, gait, temperament and spasms of the animals after arazyme administration, and the appearance and breathing of the animals such as the skin condition, periphery, ears, genitals, limbs, tail, etc. No abnormal symptoms were observed in the observation of status, saliva secretion, feces, and vomiting. An autopsy was performed 24 hours after arazyme administration. In the gross autopsy findings, no abnormalities were observed in the long-term. Arazyme chisarang (LD 50 ) is believed to be a high concentration of 5000 mg / kg or more. Microscopic observations showed no pathological abnormalities in parenchymal organs such as liver, heart, lung, and pancreas.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.Examples of preparations for the compositions of the present invention are illustrated below.
<< 제제예Formulation example 1> 약학적 제제의 제조 1> Preparation of Pharmaceutical Formulations
<1-1> <1-1> 산제의Powder 제조 Produce
아라자임 2 g2 g of arazyme
유당 1 g1 g lactose
상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.After mixing the above components, the airtight cloth was filled to prepare a powder.
<1-2> 정제의 제조<1-2> Preparation of Tablet
아라자임 100 ㎎Arazyme 100 mg
옥수수전분 100 ㎎Corn starch 100 mg
유 당 100 ㎎Lactose 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 ㎎2 mg magnesium stearate
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.After mixing the above components, tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
<1-3> 캡슐제의 제조 <1-3> Preparation of Capsule
아라자임 100 ㎎Arazyme 100 mg
옥수수전분 100 ㎎Corn starch 100 mg
유 당 100 ㎎Lactose 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 ㎎2 mg magnesium stearate
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.After mixing the above components, the capsule was prepared by filling in gelatin capsules according to the conventional method for producing a capsule.
<1-4> 주사액제의 제조<1-4> Preparation of Injection Solution
아라자임 10 ㎍/㎖Arazyme 10 μg / ml
묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지Dilute hydrochloric acid BP until pH 3.5
주이용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖Main sodium chloride BP up to 1 ml
적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 아라자임을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 3.5로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.Arazyme was dissolved in an appropriate volume of main sodium chloride BP and the pH of the resulting solution was adjusted to pH 3.5 with dilute hydrochloric acid BP, and the volume was adjusted with a main volume of sodium chloride BP and thoroughly mixed. The solution was filled into a 5 ml Type I ampoule made of clear glass, encapsulated under an upper grid of air by dissolving the glass, and sterilized by autoclaving at 120 ° C. for at least 15 minutes to prepare an injection solution.
<< 제제예Formulation example 2> 식품의 제조 2> Manufacture of food
아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.Food containing a culture of Aranicola proteoricicus or arazyme isolated therefrom was prepared as follows.
<2-1> 밀가루 식품의 제조<2-1> Preparation of Flour Food
아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 10.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 통상의 방법으로 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.Foods for health promotion by adding 0.1 to 10.0 parts by weight of the culture solution of Aranicola proteoriticus or the arazyme separated therefrom to flour, and preparing breads, cakes, cookies, crackers and noodles using the mixture in a conventional manner. Was prepared.
<2-2> <2-2> 스프soup 및 육즙( And juicy ( graviesgravies )의 제조Manufacturing
아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 1.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.0.1-1.0 parts by weight of the culture solution of Aranicola proteoriticus or arazyme isolated therefrom was added to soups and broth to prepare meat products for health promotion, soups of noodles and broth in a conventional manner.
<2-3> 그라운드 <2-3> ground 비프(ground beef)의Ground beef 제조 Produce
아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.10 parts by weight of the culture solution of Aranicola proteoricicus or arazyme isolated therefrom was added to the ground beef to prepare ground beef for health promotion in a conventional manner.
<2-4> 유제품(<2-4> dairy products ( dairydairy productsproducts )의 제조Manufacturing
아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 1.0 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 통상의 방법으로 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.0.1-1.0 parts by weight of the culture solution of Aranicola proteoricicus or arazyme isolated therefrom was added to milk, and various dairy products such as butter and ice cream were prepared in a conventional manner using the milk.
<2-5> <2-5> 선식의Linear 제조 Produce
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.Brown rice, barley, glutinous rice, and yulmu were alphad by a known method, and then dried and roasted to prepare a powder having a particle size of 60 mesh.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.Black beans, black sesame seeds, and perilla were also steamed and dried by a known method, and then ground to a powder having a particle size of 60 mesh.
아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 진공 농축기에서 감압, 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.Araniacola proteoricicus medium or arazyme separated therefrom was decompressed and concentrated in a vacuum concentrator, dried by spraying and drying with a hot air dryer, and then pulverized with a particle size of 60 mesh to obtain a dry powder.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 통상의 방법으로 제조하였다.The grains, seeds and the culture solution of Aranicola proteoriticus prepared above or the dry powder of arazyme separated therefrom were combined in the following ratio to prepare a conventional method.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),Cereals (30 parts by weight brown rice, 15 parts by weight brittle, 20 parts by weight of barley),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),Seeds (7 parts by weight perilla, 8 parts by weight black beans, 7 parts by weight black sesame seeds),
아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임의 건조분말(1 중량부),Aranicola proteoricicus culture or dry powder of arazyme isolated therefrom (1 part by weight),
영지(0.5 중량부),Ganoderma lucidum (0.5 parts by weight),
지황(0.5 중량부)Foxglove (0.5 part by weight)
<< 제제예Formulation example 3> 음료의 제조 3> Manufacture of beverage
아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 포함하는 음료를 다음과 같이 제조하였다.A beverage comprising a culture solution of Aranicola proteoricicus or arazyme isolated therefrom was prepared as follows.
<3-1> <3-1> 건강음료의Health drink 제조 Produce
액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후, 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.Substances such as liquid fructose (0.5%), oligosaccharides (2%), sugars (2%), salts (0.5%), water (75%) and cultures of aranicola proteoricicus, or arazyme isolated therefrom After homogenizing and homogeneously blending, it was packaged in small packaging containers such as glass bottles and plastic bottles to prepare healthy drinks.
<3-2> <3-2> 야채쥬스의Vegetable juice 제조 Produce
아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.5 g을 토마토 또는 당근 등의 야채의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.A culture solution of aranicola proteoricicus or 0.5 g of arazyme isolated therefrom was added to 1,000 ml of a vegetable juice such as tomato or carrot to prepare a vegetable juice for health promotion in a conventional manner.
<3-3> <3-3> 과일쥬스의Fruit juice 제조 Produce
아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 g을 사과 또는 포도 등의 과일의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.A culture solution of Aranicola proteoricicus or 0.1 g of arazyme isolated therefrom was added to 1,000 ml of fruit juices such as apples or grapes to prepare fruit juice for health promotion in a conventional manner.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 (Aranicola proteolyticus)가 생산하는 아라자임(arazyme)은 손상된 간세포에서 간세포의 괴사를 막고, SMP30의 발현을 증가시키고, P-smad3의 발현은 감소시키며, 아라자임의 간보호 효능으로 중심정맥 주변의 간세포 손상을 억제화하므로 간기능 보호용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.As described above, arazyme produced by Aranicola proteolyticus of the present invention prevents necrosis of hepatocytes in injured hepatocytes, increases the expression of SMP30, and expresses P-smad3. It can be used as a pharmaceutical composition for protecting liver function by reducing hepatic cell damage around the central vein with the hepatoprotective effect of arazyme.
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