KR100836186B1

KR100836186B1 - 에틸 피루베이트를 유효성분으로 포함하는 간질성 발작에의한 신경세포 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR100836186B1
Application number: KR1020060132382A
Authority: KR
Inventors: 이자경; 김승우; 한평림
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2008-06-09

Abstract

본 발명은 간질성 발작 예방 및 치료의 효과를 갖는 에틸 피루베이트에 관한 것으로, 구체적으로 카이네이트에 의해 유도된 해마체의 CA1 및 CA3 부위에서의 신경세포사멸, 염증성 미세아교세포와 성상세포 활성 및 염증전구성 표지인 사이토카인 활성을 억제하여, 간질성 발작에 의한 신경세포 손상 예방 및 치료 효과가 있는 에틸 피루베이트에 관한 것이다. 본 발명의 에틸 피루베이트를 포함하는 조성물은 간질성 발작 및 신경장애로 인한 경련성 질병 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

간질, 에틸 피루베이트, 카이네이트, 인지장애

Description

에틸 피루베이트를 유효성분으로 포함하는 간질성 발작에 의한 신경세포 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for the prevention and treatment of epilepsic seizure-derived neuronal death contatining ethyl pyruvate as an active ingredient}

도 1은 해마체 CA1 및 CA3에서 카이네이트-유도된 신경세포사멸 점수화를 나타낸 사진도면이고,

도 2는 해마체 CA1 및 CA3에서 카이네이트-유도된 신경세포사멸에 대한 에틸 피루베이트의 농도의존적 억제효과를 수치화한 도면이고,

도 3은 해마체 CA1 및 CA3에서 카이네이트-유도된 신경세포사멸에 대한 에틸 피루베이트의 주입-시기에 따른 억제효과를 나타낸 도면이고,

(1) 염류 처리 대조군, 염류와 카이네이트 처리군 및 카이네이트와 에틸 피루베이트 복합 처리군에 대한 해마체 절편의 크레실 바이올렛 염색 사진도면이고,

(2) 카이네이트 주입 후 에틸 피루베이트 처리 시기에 따른 해마체 CA1 및 CA3에서 신경세포사멸 정도를 수치화한 도면이고,

도 4는 해마체 CA1 및 CA3에서 카이네이트-유도된 염증성 미세아교세포와 성상세포 활성에 대한 에틸 피루베이트의 억제효과를 나타낸 사진도면이고,

(1) 염류 처리 후 3일 뒤, 해마체에서의 미세아교세포의 활성을 항-OX-42 항 체로 염색하여 나타낸 사진도면이고,

(2) 염류 처리 후 3일 뒤, 해마체에서의 성상세포의 활성을 항-GFAP 항체로 염색하여 나타낸 사진도면이고,

(3) 카이네이트 주입 후 3일 뒤, 해마체에서의 미세아교세포의 활성을 항-OX-42 항체로 염색하여 나타낸 사진도면이고,

(4) 카이네이트 주입 후 3일 뒤, 해마체에서의 성상세포의 활성을 항-GFAP 항체로 염색하여 나타낸 사진도면이고,

(5) 카이네이트와 에틸 피루베이트 복합 주입 후 3일 뒤, 해마체에서의 미세아교세포의 활성을 항-OX-42 항체로 염색하여 나타낸 사진도면이고,

(6) 카이네이트와 에틸 피루베이트 복합 주입 후 3일 뒤, 해마체에서의 성상세포의 활성을 항-GFAP 항체로 염색하여 나타낸 사진도면이고,

도 5는 해마체 CA1 및 CA3에서 카이네이트-유도된 염증전구성 표지인 사이토카인의 활성에 대한 에틸 피루베이트의 주입 시기별 억제효과를 나타낸 도면이고,

(1) CA1 및 CA3 부위에서 사이클로옥시지네이즈의 전구체의 발현량을 나타낸 도면이고,

(2) CA1 및 CA3 부위에서 종양괴사인자-α의 전구체의 발현량을 나타낸 도면이고,

(3) CA1 및 CA3 부위에서 인터루킨-1β와 GAPDH의 전구체의 발현량을 나타낸 도면이고,

도 6은 수동성 회피 검사에서 카이네이트-유도 인지장애에 대한 전신적 에틸 피루베이트 투여에 의한 개선효과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 간질성 발작 예방 및 치료의 효과를 갖는 에틸 피루베이트에 관한 것으로, 구체적으로 카이네이트에 의해 유도된 해마체의 CA1 및 CA3 부위에서의 신경세포사멸, 염증성 미세아교세포와 성상세포 활성 및 염증전구성 표지인 사이토카인 활성을 억제하여, 간질성 발작에 의한 신경세포 손상 예방 및 치료 효과가 있는 에틸 피루베이트에 관한 것이다.

흥분성 아미노산 L-글루타메이트 유사체인 카이네이트의 동물 내 투여에 의해 간질성 발작의 특징적인 경향을 유발한다고 보고되어 있다(Coyle JT . J Neurochem, 41, 1-11, 1983; Sperk G, Prog Neurobiol, 42, 1-32, 1994). 또한, 카이네이트-유도에 의한 신경의 과다-흥분은, 몇 시간 안에 뇌의 해마체의 CA1 및 CA3 부위에서 흥분독성(excitotoxicity)- 및 Zn⁺²-관련 급성 신경세포사멸을 유발하여(Frederickson CJ et al ., Brain Res , 480, 317-321, 1989; Choi DW , Cerebrovasc Brain Metabol Rev , 2, 105-147, 1990; Weiss J et al ., Trend Pharmacol Sci , 21, 395-401, 2000), 결과적으로 발작(limbic seizures) 또는 경련(convulsion)을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이러한 과정 다음에는 동일한 부 위에서 여러 주에 걸쳐 천천히 진행하는 세포사멸이 이어진다(Weise J et al ., Neurobiol Dis , 18, 582-590, 2005). 즉, 카이네이트에 의한 생체 내 세포사멸 모델은 뇌의 비교적 제한된 부위 내에서 급성 및 지연성 세포사멸의 특징을 동시에 보여준다.

카이네이트-유도 급성 신경세포사멸에 의해, 해마체에서 염증성 반응, 염증전구성 사이토카인 발현, 활성산소종(ROS) 생성, 및 산화적 스트레스를 생성한다고 밝혀졌다(Carrasco et al ., Eur J Neurosci, 12, 2311-2322, 2000; Chung and Han , J Pineal Res, 34, 95-102, 2003; Lehtimaki et al ., Brain Res Mol Brain Res , 110, 253-260, 2003). 또한 최근에 많은 연구들을 통해 상기의 카이네이트-유도 지연성 신경세포사멸이 해마체의 미세아교세포와 성상세포의 활성(항원에 자극받음)과 연관되었음이 밝혀졌다. 그리고 활성화된 미세아교세포는 NO(nitrogen oxide), 활성산소, 아라키돈산 유도체(arachidonic acid derivatives), 및 염증전구성인 사이토카인과 같은 독성 분자를 생성한다고 밝혀졌다(Giulian D, New York : Academic Press , 117-124, 1997).

따라서 상기 카이네이트는 시험용 동물에서 측두엽 간질(temporal lobe epilepsy)을 유도하는 약물로서 이용되어 왔다(Lassman et al , Neuroscience , 13, 691-704, 1984; Ben - Ari , Neuroscience, 14, 375-403, 1985).

피루베이트는 해당과정 중간생성물로, 활성산소종을 효과적으로 제거하고, 뇌를 포함하는 다양한 기관에서 산화성 스트레스를 억제하는 것으로 알려졌 다(O'Donnell - Tormey J et al ., J Exp Med , 165, 500-514, 1987; Dobsak P et al ., J Cardiovasc Pharmacol , 34, 651-659, 1999; Lee JY et al ., J Neurosci , 21, RC171, 2001). 피루베이트의 간단한 지방족 에스테르인 에틸 피루베이트는 피루베이트와 달리(von KorffRW , Anal Biochem, 8, 171-178, 1964), 특히 칼슘- 과 칼륨-포함 평형염액에서 안정적인 것으로 알려져(Sims CA et al ., Crit Care Med, 29, 1513-1518, 2001), 피루베이트의 대체물질로 개발되어 왔다.

다양한 생체 내 및 실험관 실험을 통해서 에틸 피루베이트가 염증성 반응을 감소시키는 것이 여러 차례 보고되었다(Varma SD et al ., Free Rad Res, 28, 131-135, 1998; Chavez A et al ., Gut , 44, 659-665, 1999; Sims CA et al ., Crit Care Med, 29, 1513-1518, 2001). 근래의 연구에서 염증성 및 세포괴사 과정이 다양한 뇌 장애에 의한 손상 유도의 최종단계뿐만 아니라, 신경학적 결과에 불리한 영향을 미치는 것으로 제안되었다(Kim SW et al ., Brain Res, 1007, 188-191, 2004; Weiss J et al ., Trend Pharmacol Sci, 21, 395-401, 2000; Penkowa M et al ., J Neurosci Res, 79, 522-534, 2005). 또한 에틸 피루베이트가 미세아교세포와 같은 식세포에서 잠재적 항염증성 메커니즘으로 보고된 세포내 활성산소종 제거 특성을 가짐으로써, 미세아교세포 활성에 영향을 미치는 것이 가능하다고 제안되었다(Forman HJ, Torres M. Am J Respir Crit Care Med, 166, S4-S8, 2002; Qin L et al., J BioI Chem, 279, 1415-1421, 2004). 더욱 상세하게는, 에틸 피루베이트에 의하여 에틸 피루베이트-의존성 미세아교세포와 성상세포 활성 억제와 동반되는 염증성 표지 발현의 억제 현상이 관찰됨으로써, 에틸 피루베이트가 항염증성 메커니 즘에서 신경보호 효과를 나타내는 것으로 나타났다.

예를 들어, 에틸 피루베이트가 패혈증 또는 출혈성 쇼크에 의해 유발되는 전신적 염증의 마우스의 치사를 예방한다고 보고되었고(Ulloa L et al ., Proc Nad Acad Sci USA, 99, 12351-12356, 2002; Yang R et al ., J Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol , 283, G212-G221, 2002), 에틸 피루베이트가 LPS(lipopolysaccharide)-활성된 BV2 세포(Kim JB et al ., Brain Res, 1060, 188-192, 2005)와 LPS-자극된 RAW 264.7 쥣과 동물(murine) 대식세포-유사 세포에서 iNOS와 염증전구성 사이토카인의 유도가 감소하는 것이 밝혀졌다(Ulloa L et al ., Proc Nad Acad Sci USA , 99, 12351-12356, 2002; Song M et al ., J Pharmacol Exp Ther , 308, 307-316, 2004). 더불어, 뇌허혈 후 24 시간에 걸친 폭넓은 범위의 치료와 함께 에틸 피루베이트 투여에 의해 경색 형성이 뚜렷하게 감소한 것을 통해 에틸 피루베이트에 신경보호효과가 있음이 보고되었다(Yu YM et al ., Stroke , 36, 2238-2243, 2005).

최근 RAW264.7 대식세포를 포함하는 여러 세포주에서, 에틸 피루베이트가 항염증 분자의 역할을 수행하는 것이 보고되었다. 그러나 병리학적 뇌의 치료에 에틸 피루베이트의 잠재적 치료에 대한 가치는 충분히 조사되지 않았다. 이전의 보고에 의하면, 카이네이트의 뇌실내 투여에 의해 해마체 CA1 및 CA3 부위의 피라미드층에서 선택적인 신경의 사멸이 나타났다(Cho IH et al ., J Neurosci Res , 74, 736-743, 2003). 본 발명자들은 에틸 피루베이트가 카이네이트-유도 신경세포사멸, 염증성 과정, 및 염증전구성 사이토카인의 활성의 억제에 유익한 효과를 나타 내는지의 여부를 조사하였다.

상기한 바와 같이 에틸 피루베이트가 해마체의 CA1 및 CA3 부위에서 뇌허혈에 의한 신경세포사멸의 억제효과를 지니고, 염증성 세포사멸을 억제하고 있음이 이미 밝혀졌다. 그러나 에틸 피루베이트의 잠재적 치료에 대한 가치는 아직 충분히 조사되지 않았다.

이에, 본 발명자들은 카이네이트-유도 간질성 발작이 발생한 쥣과 동물(murine)에서 에틸 피루베이트가 해마체의 세포사멸을 현저하게 억제함을 관찰하여 카이네이트-유도 간질성 발작에 대해 치료 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 카이네이트에 의해 유도된 해마체의 CA1 및 CA3 부위에서의 신경세포사멸과 미세아교세포와 성상세포의 활성 및 염증전구성 사이토카인의 활성을 억제하여 인지장애 개선 효과를 나타내는 에틸 피루베이트를 유효성분으로 포함하는 간질성 발작 예방 및 치료용 조성물을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 에틸 피루베이트를 유효성분으로 함유하는 신경세포사멸 억제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 에틸 피루베이트를 유효성분으로 함유하는 미세아교세포 및 성상세포 활성 억제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 에틸 피루베이트를 유효성분으로 함유하는 염증전구성 사이토카인 생성 억제제를 제공한다.

아울러, 본 발명은 에틸 피루베이트를 유효성분으로 함유하는 간질성 발작 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

뇌실내에 카이네이트를 주입하여 해마체의 CA1 및 CA3 피라미드층에서 전형적인 신경세포사멸을 유발한 뒤, 에틸 피루베이트를 전신적 투여하여 세포사멸 억제 효과 정도를 측정하였다.

그 결과, 20 ㎎/㎏ 이상의 에틸 피루베이트 투여 시, 상기의 CA1 및 CA3 부위에서 카이네이트-유도 신경세포사멸을 현저히 감소시켰다. 또한, 에틸 피루베이트가 카이네이트-주입 후 12 시간 후에 주입되었을 경우에도, 상기의 CA1 및 CA3 부위에서 보호 효과를 발휘하는 것이 확인되었다. 카이네이트-주입 후 24 시간 후에 에틸 피루베이트 투여 시, CA1 부위 세포사멸은 주요하게 감소하였으나, CA3 부위에서는 이러한 효과가 나타나지 않았다(도 3-2 참고). 한편, 카이네이트-주입 후 48 시간 후에 에틸 피루베이트 투여 시, CA1 또는 CA3 부위에서 보호효과는 나 타나지 않았다.

뇌실내에 카이네이트를 주입하여 해마체의 CA1 및 CA3 피라미드층에서 전형적인 신경세포사멸을 유발한 뒤, 에틸 피루베이트를 전신적 투여하여 염증성 미세아교세포와 성상세포 활성에 대한 억제 효과 정도를 측정하였다.

그 결과, 카이네이트 주입 후 즉시 에틸 피루베이트를 투여하면, 카이네이트 주입에 의해 활성화된 미세아교세포의 증가를 뚜렷하게 억제하였고, 에틸 피루베이트 투여 후 검출된 대부분의 미세아교세포는 분지되거나 정지 상태에 있었다(도 4-5 참고). 또한, 뇌의 해마체에 카이네이트-유도된 성상세포의 활성은(도 4-2, 4-4 참고), 에틸 피루베이트 투여에 의해 감소하였다(4-6 참고). 상기의 결과는 에틸 피루베이트에 의해 해마체에서의 미세아교세포와 성상세포의 카이네이트-유도 활성이 효과적으로 억제되는 것을 나타낸다.

뇌실내에 카이네이트를 주입하여 해마체의 CA1 및 CA3 피라미드층에서 전형적인 신경세포사멸을 유발한 뒤, 에틸 피루베이트를 전신적 투여하여 염증전구성 표지인 사이토카인 활성에 대한 억제 효과 정도를 측정하였다.

그 결과, 에틸 피루베이트 투여시, 카이네이트 주입에 의해 활성화된 해마체에서의 사이클로옥시지네이즈의 발현을 기저수준으로 낮추었다(도 5-1 참고). 더 불어, 인터루킨-1β과 쥐 종양 괴사 인자-α 전사체 발현 유도의 억제가 발견되었다(도 5-2, 도 5-3 참고).

아울러, 본 발명은 에틸 피루베이트를 유효성분으로 함유하는 간질성 발작 에방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

에틸 피루베이트에 의해 카이네이트-유도 인지 장애가 뚜렷하게 개선되는지 여부를 수동회피 실험을 통해 관찰하였다.

그 결과, 에틸 피루베이트의 투여에 의해 카이네이트-유도 인지장애가 개선되는 것을 발견하였고(도 6 참고), 이로써 상기 에틸 피루베이트는 카이네이트에 의해 유도된 해마체의 CA1 및 CA3 부위에서의 신경세포사멸 또는 손상으로 발생되는 학습능력 감퇴, 인지능력 감퇴, 측두엽 간질, 경련성 질병 및 발작에 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있는 것으로 결론지을 수 있다.

본 발명의 에틸 피루베이트를 유효성분으로 함유하는 신경보호제는 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형 등으로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 신경보호제는 비경구 투여(예를 들어 정맥내, 피하, 복강내, 국소 또는 시각 경로에 적용)가 바람직하며, 정맥내의 경우, 5 ㎎/㎏의 용량으로 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 다양하게 조절될 수 있다.

이하, 본 발명을 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실험예 1> 카이네이트와 에틸 피루베이트의 투여

<1-1> 실험동물의 준비

실험 동물들은 이화 여자 대학교 의과대학의 실험동물 이용규정 http://research.ewhamed.ac.kr/ 에 따라 일괄적으로 취급하였다.

<1-2> 카이네이트의 뇌실내 투여

암컷 C57BL/6 쥐(19-21 g)를 케타민(ketamine, 전신마취제, 50 ㎎/ml)과 자일라진 염화수소산염(xylazine hydrochloride, 진정제, 23.3 ㎎/ml)의 3.5:1 혼합 물(1.0 ㎕/g 체중)을 복강내 주입하여 마취하고, 정위 장치에 놓았다(Stoelting Co., USA). 쥐의 우가측뇌실에 0.5 ㎕/분의 속도로 0.94 nmol(0.2 ㎍)의 카이네이트(Tocris, Ellisville, MO, USA)를 포함하는 생리 식염수의 4 ㎕를 주사하였다. 정수리점(bregma, 전정)에 관해서 밀리미터의 정위뇌고정좌표는 AP, -2.0; ML, -2.9; DV, -3.8이었다(Franklin KBJ , Paxinos P. San Diego: Academic Press Inc , 1997). 5분 후, 역류를 최소화하기 위해 중간 단계마다 3분씩 바늘을 제거하였고, 쥐가 깨어날 때까지 보온 패드(warm pad)에 두었다. 마취에서 깨어나는 동안 및 깨어난 직후에, 수술한 쥐는 발작 행위를 보여주었다(Cho IH et al ., J Neurosci Res , 74, 736-743, 2003).

<1-3> 에틸 피루베이트의 복강내 투여

에틸 피루베이트(Sigma-Aldrich Co., USA)은 에틸 피루베이트(28 mM), 나트륨(130 mM), 칼륨(4 mM), 칼슘(2.7 mM) 및 염화 이온(139 mM, pH 7.0)의 용액으로 준비하였다(Yu YM et al ., Stroke, 36, 2238-2243, 2005). 상기 실시예에서 카이네이트를 투여한 쥐에 상기 에틸 피루베이트 용액을 0.12 ㎖/회의 부피로 복강 내 주사하였다.

<1-4> 해마체 절편 입수

상기 실험예에서 카이네이트와 에틸 피루베이트를 투여한 쥐를, 카이네이트를 투여한 지 3일 후, 생리학적 식염수로 처리하고 이어서 새로이 준비한 0.1 M 인 산염 완충용액(pH 7.4)으로 희석한 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 쥐로부터 뇌를 분리하여 4℃에서 밤새도록 동일한 고정액으로 고정하였다. 뇌 절단편을 조직 절편기를 사용하여 30 ㎛로 관상으로 절단하였다.

각각의 동물의 해마체 절단편(정수리점에서 -1.82 ~ -2.06 mm)을 크레실 바이올렛(cresyl violet, 매염제)로 염색하였다.

< 실험예 2> 에틸 피루베이트 에 의한 카이네이트 유도 신경세포사멸의 억제

<2-1> 카이네이트 -유도된 신경세포사멸 점수화

카이네이트의 뇌실내 투여에 의해 해마체 CA1 및 CA3 부위의 피라미드층에서 선택적인 신경의 사멸이 나타나는 것으로 이미 보고되어 있으며(Cho IH et al ., J Neurosci Res , 74, 736-743, 2003), 본 발명자들은 해마체 CA1 및 CA3 피라미드층 부위에서 카이네이트-유도 신경의 손실을 0 내지 6 평점 척도화하기 위하여, 카이네이트 주입 3일 후 실험예 <1-3>의 방법으로 준비한 해마체 절편의 사진을 찍은 후, 피라미드층의 CA1 및 CA3 지역의 신경 손실을 관측하여, 0 내지 6 평점 척도(rating scale)를 위한 기준으로 삼았다(도 1, 표 1, 척도자 = 100 ㎛). 화살표는 죽은 세포에서 나타나는 뉴런의 응축된 핵을 지시하고 있다.

피라미드층에서의 신경세포 사멸률 점수화

사멸률	점수
발견된 세포 손상 없음	0
≤10%	+1
11-25%	+2
26-50%	+3
51-75%	+4
76-90%	+5
≥91%	+6

<2-2> 신경세포사멸에 대한 에틸 피루베이트 농도 의존적 억제효과 확인

실험예 <1-1>과 <1-2>의 방법으로 쥐에게 카이네이트 단독 또는 카이네이트와 에틸 피루베이트 복합 주입한 후 3일 뒤에 수행하였다. 에틸 피루베이트의 신경보호 여부를 관찰하기 위하여, 카이네이트 투여 후 즉시, 에틸 피루베이트를 5, 10, 20 또는 30 ㎎/㎏의 농도로 복강내 투여하였다. 실험예 <1-4>의 방법으로 해마체 절편을 입수하여 사진을 찍은 후, 피라미드층의 CA1 및 CA3 지역의 신경 손실을 0 내지 6 평점 척도(rating scale)를 사용하여서 측정하였다(도 2). 표 1에 따라 신경세포사멸을 점수화하였다.

카이네이트(0.2 ㎍) 투여 후 3일 뒤 측정한 동측 해마체의 CA1 및 CA3 부위의 평균 세포사멸 점수는 각각 3.80 ± 0.42 (n = 10)와 4.60 ± 0.31(n = 10)이었다(도 2, 도 3-4). 그러나 20 ㎎/㎏ 이상의 에틸 피루베이트 투여 시, 해마체의 CA1 및 CA3 부위에서 카이네이트-유도 신경의 사멸이 현저히 감소하는 것을 발견하였기 때문에[도 2; ± SEM(Standard error of the mean) 평균값; *, P<0.05; **, P<0.01(Newman-Keuls test)], 이후에 진행하는 실험에서 에틸 피루베이트의 농도는 20 ㎎/㎏으로 정하여 사용하였다.

<2-3> 신경세포사멸에 대한 에틸 피루베이트 주입시기에 따른 억제효과 확인

실험예 <1-1>과 <1-2>의 방법으로 카이네이트를 주입하여 발작이 유발된 쥐를 대상으로, 에틸 피루베이트의 주입 시기를 카이네이트 주입 후 즉시(0 시간), 12시간 후, 24 시간 후, 및 48 시간 후로 차별화하였다. 상기의 처리 후, 3일 뒤에 실험예 <1-3>의 방법으로 해마체 절편을 준비한 뒤 사진 촬영하였다. 표 1에 따라 신경세포사멸을 점수화하였다.

카이네이트 주입 후 즉시 에틸 피루베이트 투여 시, CA1 및 CA3 부위 세포사멸 점수는 각각 2.00 ± 0.65(n = 8, P < 0.05)와 2.50 ± 0.71(n = 8, P < 0.01)로 감소하였고(도 3-1 내지 3-4), 12 시간 후 투여 시, CA1 및 CA3 부위 세포사멸 점수는 각각 1.75 ± 0.51(n = 8, P < 0.05)과 3.23 ± 1.06(n = 8, P < 0.05)으로 감소하였다(도 3-4). 그러나 24 시간 후 투여 시, CA1 부위 세포사멸 점수는 2.13 ± 0.51(n = 8, P < 0.05)로 주요하게 감소하였으나, CA3 부위에서는 이러한 효과가 나타나지 않았고[도 3-4; ± SEM 평균값; *, P<0.05; **, P<0.01(Newman-Keuls test); 척도자 = 200 ㎛], 48 시간 후 투여 시에는, CA1 또는 CA3 부위에서 보호효과가 나타나지 않았다. 또한, 에틸 피루베이트만 투여 시, CA1 및 CA3 부위에서 주목할 만한 세포사멸이 나타나지 않는 것을 확인하였다.

또한 카이네이트를 주입하여 발작이 유발된 쥐를 대상으로 실시한 육안 관찰에서, 상기 쥐는 마취에서 깨어난 직후와 비교하여 카이네이트 주입 후 즉시 에틸 피루베이트 투여시, 12시간 후 투여시, 및 24시간 후 투여시, 유의하게 감소된 수준의 발작증세를 나타내었다.

< 실험예 3> 에틸 피루베이트에 의한 미세아교세포와 성상세포 활성의 억제 확인

면역조직화학적 분석은 조와 그 동료들에 의해 소개된 방법에 의해 수행하였다(Cho IH et al ., J Neurosci Res , 74, 736-743, 2003).

카이네이트-주입된 뇌에서 에틸 피루베이트가 염증성 과정에 영향을 미치는가를 조사하기 위하여 해마체에서 염증성 미세아교세포와 성상세포의 활성을 항-OX-42(CD11b; 1:100; Serotec Ltd., Oxford, UK)와 항-GFAP(glial fibrillary acidic protein, 1:10,000; DAKO, Denmark) 항체를 이용하여 면역조직화학적 분석을 수행하였다. 실험예 <1-1>과 <1-2>의 방법에 따라 쥐에게 염류, 카이네이트 또는 카이네이트(0.2 ㎍, 뇌실내 투여) 및 에틸 피루베이트(20 ㎎/㎏, 복강내 투여)를 주입한 후 3일 뒤에, 실험예 <1-3>의 방법으로 해마체 절편을 준비한 뒤 사진 촬영하였고, 염류 처리군을 대조군으로 사용하였다.

미세아교세포가 한번 활성화되면(항원에 반응하면) OX-42-면역반응성(OX-42-IR)으로 나타나고, 매우 짧고 진한 과정에 의해 확대된 세포체가 관찰되는 것으로 보고되어 있다(Che Y et al ., Mol Brain Res, 94, 157-165, 2001; Cho IH et al ., J Neurosci Res , 74, 736-743, 2003). 본 발명의 염류-처리 대조군 흰쥐에서 OX-42-IR 세포는 거의 검출되지 않았지만(도 4-1), 카이네이트를 투여한 흰쥐에서는 OX-42-IR 세포의 수가 동측 해마체의 CA1 및 CA3 부위에서 뚜렷하게 증가하였다(도 4-3). 흥미롭게도, 카이네이트 주입 후 즉시 에틸 피루베이트를 투여하면, 활성화된 미세아교세포의 증가가 뚜렷하게 억제되었으나, 에틸 피루베이트 투여 후 검출된 대부분의 미세아교세포는 분지되거나 정지 상태에 있었다(도 4-5). 또한, 성상세포는 카이네이트-투여된 뇌의 해마체에서 뚜렷하게 활성화되었고(도 4-2, 4-4), 에틸 피루베이트 투여에 의해 성상세포의 활성이 감소하였다(4-6; 척도자 = 100 ㎛). 도 4의 하단부 왼쪽과 상단부 오른쪽의 삽입부분은, 사각형으로 표지한 CA1 및 CA3 부위의 고배율 현미경 사진도면이다. 상기의 결과는 에틸 피루베이트가 해마체의 미세아교세포와 성상세포의 카이네이트-유도 활성을 억제하는 것을 나타낸다.

< 실험예 4> 에틸 피루베이트 에 의한 염증전구성 사이토카인 활성의 억제

카이네이트-유도 염증전구성 사이토카인 생산의 활성의 억제에 에틸 피루베이트가 영향을 미치는가를 알아보기 위하여, 카이네이트(0.2 ㎍, 뇌실내 투여) 주입 12 시간 또는 24 시간 후 다양한 염증전구성 표지의 전구체 발현량을 RT-PCR에 의해 실험하였다. 상기의 사이토카인은 면역세포가 분비하는 단백질의 총칭으로, 사이클로옥시지네이즈(cyclooxygenase-2; COX-2), 종양괴사인자-α(mouse tumor necrosis factor-α) 및 인터루킨-1β(interleukin-1β)등을 포함하며, GAPDH(Glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)는 내재성 발현 유전자로서, 실험적 처리에 상관없이 세포 내에서 항상 균일하게 발현되는 것으로 간주하여, 본 발명에서 대조군으로 사용되었다.

염류 처리 대조군, 염류와 카이네이트 단독 처리군 및 카이네이트와 에틸 피루베이트 복합 처리군에 대하여 실험예 <1-1>과 <1-2>의 방법으로 카이네이트(0.2 ㎍, 뇌실내 투여) 주입 후 12시간 후 또는 24시간 후 에틸 피루베이트를 주입(20 ㎎/㎏,복강내 투여)하였다. 3일 뒤 브레인 매트릭스 장치(brain matrix device, RBM-2000C, ASI instrument, MI, USA)에 의해 전두 피질의 전두극에서 6 내지 9 ㎜-분리-개시한, 3 ㎜의 관상 뇌 절편을 준비하고, 트리졸 용액(Invitrogen, CA, USA)을 이용하여 동축 해마체의 CA1 및 CA3 부위의 RNA를 정제하였다. 1 ㎍의 RNA를 사용하여 cDNA를 생합성하였고, 이어서 PCR 분석을 하였다(RT-PCR kit; Roche, Germany). 4마리의 동물로부터의 데이터를 축적하여 ± SEM의 평균값으로 나타내었고, TNF-α와 IL-1β, COX-2 및 GAPDH 유전자의 프라이머 시퀀스는 이전의 논문에 기록되어 있다(Yu YM et al ., Stroke , 36, 2238-2243, 2005).

그 결과, CA1 및 CA3 부위의 TNF-α, COX-2, 및 IL-β 발현량이 전신적 에틸 피루베이트(20 ㎎/㎏, 복강내 투여) 주입 후 현저히 감소하여[도 5; *, P<0.05; **, P<0.01(Student's t-test)], 전신적 에틸 피루베이트 투여에 의한 카이네이트-유도 염증전구성 사이토카인 생산의 활성의 억제를 확인할 수 있었다.

< 실험예 5> 에틸 피루베이트에 의한 인지장애의 개선효과

카이네이트-투여 동물에서의 인지장애에 대하여, 에틸 피루베이트에 의한 개선여부 조사를 위해 수동회피반응 실험을 수행하였다. 1) 염류 처리 대조군, 2) 카이네이트(0.2 ㎍, 뇌실내 투여) 단독 처리군, 및 3) 카이네이트(0.2 ㎍, 뇌실내 투여)와 에틸 피루베이트(20 ㎎/㎏,복강내 투여) 복합 처리군의 쥐의 수는 각각 9, 8, 및 9 마리였고, 염류, 카이네이트 단독 및 카이네이트와 에틸 피루베이트 복합 주입 7일 경과 후, 전기적 쇼크를 가하기 전과 전기적 쇼크 후에 쥐가 어두운 방으로 들어갈 때 걸리는 시간을 측정하였다. 더욱 상세하게는, 실험장치는 격자 마루를 갖추고 있으면서 밝은(1,600 Lux) 방과 어두운 방(각 15 × 15 × 15 ㎝)이 중간문으로 나누어져 구성되어 있다. 첫째 날, 흰쥐를 밝은 방에 5분간 두어 실험장치에 길들이고, 동시에 어두운 방도 드나들 수 있게 하였다. 둘째 날, 흰쥐를 밝은 방에 넣은 후, 30초 후 중간문을 개방하여 쥐가 어두운 방에 들어갈 때까지의 소요 시간을 측정하여 사전-검사 수치로 사용하였고, 흰쥐가 어두운 방에 들어갔을 때, 중간문을 닫고 격자-마루를 통해 2회 연속 전기 발바닥-충격(100 V, 0.3 mA, 2 초간)을 가했다. 처리 완료 후, 흰쥐를 우리에 다시 가두었다. 셋째 날, 쥐를 밝은 방에 다시 가두고, 어두운 방으로 들어갈 때까지의 유지시간을 측정하였다. 사전-검사 때의 300초의 수치를 컷-오프(cut-off) 시간으로 정하였다.

그 결과, 수동회피 실험에서, 전기충격이 가해지기 전의 카이네이트 단독-, 카이네이트와 에틸 피루베이트 복합-, 및 염류-처리 쥐들이 어두운 방으로 들어갈 때까지 걸리는 지연시간은 유사하였다. 그러나 전기충격후의 지연시간은 염류-처리 대조군에 비해 카이네이트-처리 쥐에서 현저하게 짧았고, 이러한 카이네이트-유도 기억력 장애는 카이네이트과 에틸 피루베이트의 동시 투여에 의해 개선되었다[도 6; *, P<0.05(Student's t-test)].

< 제제예 > 주사액제의 제조방법

본 발명의 에틸 피루베이트를 체중 1 ㎏ 당 1-10 ㎎ 을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

5′-클로로-3,2′-디하이드록시찰콘 또는 5′-클로로-2,3′-디하이드록시찰콘 염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

5′-클로로-3,2′-디하이드록시찰콘

또는 5′-클로로-2,3′-디하이드록시찰콘 염산염 1 g

염화나트륨 0.6 g

아스코르브산 0.1 g

증류수 정량

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 에틸 피루베이트는 카이네이트에 의해 유도된 해마체의 CA1 및 CA3 부위에서의 신경세포사멸, 염증성 미세아교세포와 성상세포 활성 및 염증전구성 표지인 사이토카인 활성을 억제하여 인지장애 개선효과가 있으므로 간질성 발작 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

에틸 피루베이트를 유효성분으로 함유하는 간질성 발작 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 간질성 발작은 해마체 신경세포사멸 또는 손상에 의한 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 간질성 발작은 카이네이트 투여에 의해 유도된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 미세아교세포 및 성상세포의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5항에 있어서, 사이토카인은 COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(mouse tumor necrosis factor-α) 또는 IL-β(interleukin-1β)인 것임을 특징으로 하는 조성물.