KR100835677B1 - 히포스폰지아로부터 분리된 할리설페이트 화합물을함유하는 살진균용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해면동물인 히포스폰지아(Hippospongia sp.)로부터 분리된 할리설페이트(Halisulfates) 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 할리설페이트 화합물은 이소시트레이트 리아제(ICL)효소 억제, 벼 도열병균의 부착기 형성 억제 및 벼 도열병 감염 억제 효과를 나타내므로 유해 진균을 방제하는 살진균용 조성물로 이용될 수 있다.

히포스폰지아(Hippospongia sp.), 할리설페이트(Halisulfates) 화합물, 이소시트레이트 리아제, 벼 도열병균, 살진균용 조성물

Description

히포스폰지아로부터 분리된 할리설페이트 화합물을 함유하는 살진균용 조성물{Fungicidal composition comprising halisulfates compound isolated from Hippospongia sp.}

도 1은 벼 도열병균인 마그나포르테 그리시(Magnaporthe grisea) Guy 11로부터 제조된 재조합 단백질 이소시트레이트 리아제의 단백질 전기영동 분석을 나타낸 도이고,

도 2는 글리옥실레이트 사이클(Glyoxylate cycle)을 나타낸 도이며,

도 3은 야생종 벼 도열병 곰팡이 Guy 11 및 ICL결손(△icl) 돌연변이주 I-10에서 포자 발아에 대한 할리설페이트 1의 효과를 나타낸 도이고(■ : Guy 11 + 3-니트로프로피오네이트, ▲ : Guy 11 + 할리설페이트 1, ○ : I-10 + 할리설페이트 1),

도 4는 야생종 벼 도열병 곰팡이 Guy 11 및 ICL결손(△icl) 돌연변이주 I-10에서 부착기 형성에 대한 할리설페이트 1의 효과를 나타낸 도이며(■ : Guy 11 + 3-니트로프로피오네이트, ▲ : Guy 11 + 할리설페이트 1, ○ : I-10 + 할리설페이트 1),

도 5는 야생종 벼 도열병 곰팡이 Guy 11 및 ICL결손(△icl) 돌연변이주 I-10 에서 부착기 및 포자발아 형태에 대한 할리설페이트 1의 효과를 나타낸 도이고(화살표는 부착기 표시),

도 6은 야생종 벼 도열병 곰팡이 Guy 11의 도열병 유발에 대한 할리설페이트 1의 억제 효과를 낙동벼에서 확인한 도이며,

도 7은 야생종 벼 도열병 곰팡이 Guy 11 및 ICL결손(△icl) 돌연변이주 I-10의 병원성에 대한 할리설페이트 1의 억제효과를 나타낸 도이다.

본 발명은 히포스폰지아(Hippospongia sp.)로부터 분리된 할리설페이트(Halisulfates) 화합물을 유효성분으로 함유하는 유해 진균을 방제하는 살진균용 조성물에 관한 것이다.

글리옥실레이트 사이클 (Glyoxylate cycle)은 당류가 부족한 자연환경에서 미생물이 성장할 경우에 C₂ 탄소원인 아세테이트와 에탄올을 C₄ 디카보실릭산으로 전환하여 에너지 획득 및 세포의 생합성 물질을 공급하는데 있어서 매우 중요한 대사경로이다. 이러한 생육조건하에서는 세포내 해당경로의 활성은 감소되고, 지질 및 왁스 등을 베타산화 (β-oxidation)에 의해 분해하여 아세테이트와 같은 C₂ 탄소원을 만들고 글리옥실레이트 사이클을 활성화하여 그 중간 생성물 숙신 산(succinate)을 당신생(gluconeogenesis) 경로에 제공하여 생존하게 된다. 글리옥실레이트 사이클에는 독특한 두개의 효소가 존재하는데, 이소시트레이트 리아제 (isocitrate lyase, ICL) 및 말레이트 신타제 (malate synthase)이다. 글리옥실레이트 사이클은 대부분의 세균 및 진균 (효모, 곰팡이) 그리고 식물에 존재하지만, 척추동물에는 존재하지 않는다. 식물에서도 땅콩과 같은 지질이 풍부한 씨앗의 발아시에 이용함이 알려져 있으나 잎이 나와 광합성을 할 때에는 이용하지 않으므로 미생물이 주로 이용한다고 볼 수 있다. 또한, 이소시트레이트 리아제 (ICL) 효소가 결손된 세균 및 진균의 돌연변이주들은 C₂ 탄소원하에서는 생존하지 못한다(Lorenz MC, Fink GR, Nature, 412, pp83-86, 2001; McKinney JD, Honer Zu Bentrup K, Munoz-Elias EJ, Miczak A, Chen B, Chan WT, Swenson D, Sacchettini JC, Jacobs Jr WR, Russell G, Nature, 406, pp735-738, 2000).

최근, 폐 결핵균인 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)는 마크로파지 (macrophages) 감염 시에 이소시트레이트 리아제 (ICL)의 발현이 활성화 된다고 보고되었다 (McKinney JD, Honer Zu Bentrup K, Munoz-Elias EJ, Miczak A, Chen B, Chan WT, Swenson D, Sacchettini JC, Jacobs Jr WR, Russell G, Nature, 406, pp735-738, 2000; Munoz-Elias EJ, McKinne JD, Nat. Med ., 11, pp638-644, 2005). 또한, 인체 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 및 크립토코커스 네오폴만스(Cryptococcus neoformans) 등은 마우스모델 동물실험에서도 병원성 유발에 이소시트레이트 리아 제 (ICL)가 매우 중요하다고 보고되었다 (Lorenz MC, Fink GR, Nature, 412, pp83-86, 2001; Rude TH, Toffaletti DL, Cox GM, Perfect JR, Infect. Immun ., 70, pp5684-5694, 2002). 이러한 보고들은 광범위한 병원성 미생물의 숙주 감염 시에 글리옥실레이트 사이클이 광범위하게 작용하고 있다는 것을 보여준다.

벼 도열병균 마그나포르테 그리시 (Magnaporthe grisea)는 전형적인 이주성의 식물 자낭균이며 전세계적으로 재배되는 벼의 가장 심각한 도열병 원인균이다. 마그나포르테 그리시 (M. grisea)는 부착기(appressorium)라 불리는 독특한 둥근 돔 형태의 기관을 형성하여 식물표면에 부착하고, 식물의 세포벽을 뚫고 침입하기 위하여 부착기내에 엄청난 압력(팽압)을 만들어 낸다. 이러한 부착기(appressorium) 내의 높은 압력은 세포내 저장된 지질을 분해하여 글리세롤과 지방산을 만들 때 글리세롤에 의해 형성된다. 이 곰팡이에서 포자 발아와 부착기 형성을 하는 동안, 지질은 포자로부터 부착기 말단으로 이동되는 것으로 알려져 있다. 최근, 도열병균 마그나포르테 그리시 (M. grisea)가 벼에 감염될 때, 글리옥실레이트 사이클의 효소인 이소시트레이트 리아제 (ICL)가 균의 세포내에 높은 수준으로 유도 발현되며, 이 효소의 유전자가 결손된 돌연변이주는 야생종 보다 병발력이 감소하고, 병발력과 밀접한 관련성이 있는 부착기 형성 능력이 약화된다고 보고되었다 (Wang ZY, Thornton CR, Kershaw MJ, Debao L, Talbot NJ, Mol. Microbiol ., 47, pp1601-1612, 2003). 따라서, 이소시트레이트 리아제(ICL)는 벼 도열병 감염억제 및 항진균제 개발의 유용한 표적이라 할 수 있다.

이에 본 발명자들은 천연물로부터 이소시트레이트 리아제 (ICL) 억제 활성물 질의 발굴에 관심을 가지고 활성검색 실험을 진행하는 동안, 마이크로네시아 군도에서 채집된 해면 히포스폰지아(Hipposponigia sp.)의 추출물로부터 다양한 크로마토그래피 방법을 활용하여, 효소 억제물질로서 세스터터펜 설페이트 (sesterterpene sulfates)계 화합물인 2종의 할리설페이트(Halisulfates)를 분리하였고, 이 물질을 이용하여 마그나포르테 그리시 (M. grisea)에 대해 부착기 형성 억제 활성 및 벼에 대한 도열병 감염실험을 수행하여 벼 도열병 억제 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 히포스폰지아(Hippospongia sp.)로부터 분리된 할리설페이트(Halisulfates) 화합물을 유효성분으로 함유하는 유해 진균을 방제하는 살진균용 조성물을 제공한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 히포스폰지아(Hippospongia sp.)로부터 분리된 하기 구조식 (1) 또는 (2)의 화합물을 함유하는 유해 진균을 방제하는 살진균용 조성물을 제공한다.

할리설페이트(Halisulfate) 1

(1)

할리설페이트(Halisulfate) 5

(2)

상기 히포스폰지아(Hippospongia sp.)는 마이크로네시아 군도, 축 아톨(Chuuk Atoll)로부터 수심 1 내지 50m, 바람직하게는 5 내지 40m, 더욱 바람직하게는 10 내지 20m에서 채집된 해면(sponge)임을 특징으로 한다.

상기 유해 진균은 벼 식물 및 그의 종자에 대한 유해 진균, 바람직하게는 벼 도열병균(Magnaporthe grisea), 바이폴라리스(Bipolaris) 종, 드레슬라(Drechslera) 종 또는 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 더욱 바람직하 게는 벼 도열병균(Magnaporthe grisea)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 유해 진균을 방제하기 위한 살진균용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.

상기 화합물의 유형 및 목적하는 효과에 따라서, 상기 조성물을 5 내지 2000 g/ha, 바람직하게는 50 내지 1500 g/ha, 더욱 바람직하게는 50 내지 750 g/ha의 양으로 시용 가능하나, 이에 제한되지는 않는다.

종자에 상기 조성물을 처리시, 조성물을 일반적으로 종자 1 kg 당 0.001 내지 1 g, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 g, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.1 g의 양으로 시용 가능하나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 구조식 (1) 또는 (2)로 표시되는 본 발명의 화합물들은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p- 톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산 (maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산 (citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산 (glycollic acid), 글루콘산 (gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산 (glutaric acid), 글루쿠론산 (glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기 구조식 (1) 또는 (2)의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 구조식 (1) 또는 (2)의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트 (메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트 (토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 할리설페이트 화합물을 수득하는 방법을 설명하면, 우선 마이크로네시아 군도, 축 아톨(Chuuk Atoll)로부터 수심 1 내지 50m, 바람직하게는 5 내지 40m에서 스킨스쿠바 다이버를 이용해 채집한 해면 히포스폰지아(Hippospongia sp .) 중량의 약 0.1 내지 10배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 분량의 물, 에탄올, 메탄올과 같은 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 등의 극성용매 및 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄 등의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올 및 디클로로메탄으로 0 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 80℃ 추출온도에서 약 10시간 내지 40시간, 바람직하게는 20시간 내지 30시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 열수추출법으로 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7회 반복 추출한 후, 감압 농축하여 조추출물을 수득할 수 있다.

상기에서 수득한 조추출물을 물 또는 부탄올 용매로 분획하고 부탄올 분획층을 다시 메탄올 또는 핵산을 이용하여 재분획한 후, 여기에서 얻은 메탄올층을 메탄올과 물의 혼합비를 점차적으로 증가시키는 방법을 사용하여 역상 플래쉬 크로마토그래피를 시행하고 다시 메탄올로 용출된 분획을 감압 농축하여, 이를 다시 역상 HLPC를 시행하여 본 발명의 할리설페이트 화합물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 제법으로부터 수득된 구조식 (1) 또는 (2)의 화합물을 유효성분으로 함유하는 유해 진균을 방제하는 살진균용 조성물을 제공한다.

상기 화합물은 자낭균(Ascomycetes) 강, 불완전균(Deuteromycetes) 강 및 담 자균(Basidiomycetes) 강의 벼 병원체에 대한 현저한 작용을 나타내며, 그 사용부위에 한정하지는 않으나, 재배되는 진균 감염 식물의 종자, 잎 및 토양 작용성 살진균제로서 사용될 수 있다. 또한 상기 화합물은 벼, 보리 및 수수 등의 벼과 식물, 바람직하게는 벼의 종자 및 잎, 더욱 바람직하게는 벼의 잎에 직접 분무하여 적용한다.

벼 병원체인 유해 진균의 방제시, 상기 화합물을 시용하는 것은 식물의 씨를 뿌리기 전후에, 또는 식물이 발아하기 전후에 종자, 묘목 (seedling), 식물 또는 토양에 분무 또는 살포함 (dusting)으로써 수행된다.

본 발명의 살진균 조성물은 제제에 따라 조성물에 첨가가 가능한 공지의 첨가물을 추가로 포함할 수 있다.

상기 제제들은 공지된 방식, 예를 들어 화합물을 용매 및(또는) 담체로, 필요한 경우에 유화제 및 분산제를 사용하여 증량함으로써 제조할 수 있다.

상기 용매로는 물, 방향족 용매 (예를 들어 솔베소(Solvesso) 제품, 크실렌), 파라핀(예를 들어 광유 분획물), 알코올(예를 들어 메탄올, 부탄올, 펜탄올, 벤질 알코올), 케톤(예를 들어 시클로헥사논, 감마-부티로락톤), 피롤리돈(NMP, NOP), 아세테이트(글리콜 디아세테이트), 글리콜, 지방산 디메틸아미드, 지방산 및 지방산 에스테르(원칙적으로, 용매 혼합물을 사용할 수도 있음) 등이 포함된다.

상기 담체로는 예컨대 분쇄된 천연 광물(예를 들어 카올린, 점토, 활석, 백악) 및 분쇄된 합성 광물(예를 들어 고도로 분산된 실리카, 실리케이트); 유화제, 예컨대 비이온성 및 음이온성 유화제(예를 들어 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 에테 르, 알킬술포네이트 및 아릴술포네이트) 및 분산제, 예컨대 리그닌-술파이트 폐액 및 메틸셀룰로오스이다.

본 발명에 따른 화합물은 통상의 제제, 예를 들어 용액, 유탁액, 현탁액, 분제(dust), 분말, 페이스트 및 과립으로 전환될 수 있다. 시용 형태는 특정 목적에 의존적이며; 각각의 경우에 이들은 본 발명에 따른 화합물을 미세하고 균일하게 분산시켜야 한다.

바로 분무가능한 용액, 유탁액, 페이스트 또는 오일 분산액의 제조에 적합한 물질은 중간 내지 고비점을 갖는 광유 분획물, 예컨대 케로센 또는 디젤유, 또한 콜타르 오일, 및 식물성 또는 동물성 오일, 지방족, 시클릭 및 방향족 탄화수소, 예를 들어 톨루엔, 크실렌, 파라핀, 테트라히드로나프탈렌, 알킬화 나프탈렌 또는 이들의 유도체, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 시클로헥산올, 시클로헥사논, 이소포론, 고극성 용매, 예를 들어 디메틸 술폭시드, N-메틸피롤리돈 및 물이다.

본 발명의 과립, 예를 들어 코팅된 과립, 함침 과립 및 균질 과립은 화합물을 고상 담체에 결합시켜 제조할 수 있다. 고상 담체의 예는 광물토, 예컨대 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 카올린, 아타클레이(attaclay), 석회석, 석회, 백악, 교회점토, 황토, 점토, 백운석, 규조토, 황산칼슘, 황산마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄된 합성 물질, 비료, 예를 들어 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄 또는 우레아, 및 식물 기원의 생성물, 예컨대 곡물 가루, 나무껍질 가루, 목재 가루 및 견과류 껍질 가루, 셀룰로오스 분말 및 다른 고상 담체이다.

본 발명의 분말, 살포용 물질 및 살포가능한 생성물은 물질을 고상 담체와 함께 혼합 또는 동반분쇄하여 제조할 수 있다.

일반적으로, 화합물은 90 내지 100 ％, 바람직하게는 95 내지 100 ％의 순도(NMR 스펙트럼 측정시)로 사용된다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 할리설페이트 ( Halisulfates ) 화합물의 분리

2003년 6월과 2005년 7월에 마이크로네시아 군도, 축 아톨(Chuuk Atoll)로부터 수심 10~20m에서 스킨스쿠바 다이버를 이용하여 채집된 해면 히포스폰지아(Hippospongia sp.) 의 시료를 동결시킨 후, 실험실로 수송하여 해면 시료 (760g)를 메탄올(1.5L X 2) 및 디클로로메탄(1.5L)으로 반복 추출하여 추출물은 여과 후 감압 농축하여 87.7g의 조추출물을 얻었고, 그 조추출물은 물 및 부탄올로 분획하고 부탄올층에서 21.4g의 유기용매에 녹는 물질을 확보하였다. 부탄올층은 다시 15% 메탄올과 핵산을 이용하여 재분획 하였다. 메탄올층 추출물 (18.2g)은 메탄올 및 물의 혼합비를 점차적으로 증가시켜는 방법을 사용하여 C₁₈역상 플래쉬 크로마토그래피를 시행하였고, 30% 메탄올에서 용출된 분획을 감압 농축하여 3.36g을 얻었으며, 이를 다시 역상 HPLC을 통하여 주 물질로서 화합물 1을 2.28g 분리하였 다. 또한, 플래쉬 크로마토그래피에서 20% 메탄올에 용출된 일부 분획(470mg)은 역상 HPLC을 통하여 화합물 1 가105mg 및 화합물 2가 7.2mg 분리되었다. ¹H와 ¹³C NMR 스펙트럼(Varian Unity 500 Spectrometer)은 각각 500과 125MHz에서 측정하였으며, Mass 스펙트럼(JEOL JMS-HX 110mass spectrometer)을 사용하여 측정하였다.

¹H와 ¹³C NMR 스펙트럼, Mass 스펙트럼의 해석 결과, 이들 물질의 스펙트럼 데이터들은 보고된 결과(Kernan MR, Faulkner DJ, J. Org ., Chem ., 53, pp4574-4578, 1988)와 일치하였으며 화합물 1은 기지물질인 할리설페이트 1 (Halisurfate 1) 로, 화합물 2는 할리설페이트 5 (Halisulfate 5)로 동정되었다.

참고예 1. 실험의 준비

1-1. 시험균 및 성장배지의 준비

야생종 벼 도열병균인 마그나포르테 그리시 (Magnaporthe grisea) Guy11(영국 Exter대학교의 N. J. Talbot 교수 제공;School of Biological Sciences, University of Exeter, Washington Singer laboratories, Exter EX4 4QG, UK) 및 그것의 이소시트레이트 리아제 결손(△ icl) 변이주 I-10 (영국 Exter대학교의 N. J. Talbot 교수 제공; School of Biological Sciences, University of Exeter, Washington Singer laboratories, Exter EX4 4QG, UK)을 실험에 사용하였다. 배지로서는 실험목적에 따라 오트밀 한천배지 (오트밀: 50g /L, 한천: 20 g/L) 혹은 최소배지 (탄소원 10 g/L, NaNO₃ 6 g/L, KH₂PO₄ 1.5 g/L, MgSO_{4 ˙}7H₂O 0.5 g/L, KCl 0.5 g/L, 미량원소 0.1%, 비타민 용액 0.1%, 한천 20 g/L) (Wang ZY, Thornton CR, Kershaw MJ, Debao L, Talbot N, Mol . Microbiol., 47, pp1601-1612, 2003)를 사용하였다.

1-2. 재조합 단백질 이소시트레이트 리아제(ICL)의 제조

이소시트레이트 리아제 (ICL)의 저해활성 평가를 위해 유전자 조작 방법으로 재조합단백질을 제조하여 사용하였다(Kim SY, Park JS, Oh KB, J. Microbiol . Biotechnol . 16, pp1158-1162, 2006).

글루코스를 탄소원으로 하는 최소배지 (glucose 10 g/L, NaNO₃ 6 g/L, KH₂PO₄ 1.5 g/L, MgSO_4˙7H₂O 0.5 g/L, KCl 0.5 g/L, 미량원소 0.1%, 비타민 용액 0.1%, 한천 20 g/L)에 마그나포르테 그리시 (Magnaporthe grisea) Guy11를 접종하여 3일간 28℃에서 진탕배양 한 후 상법에 따라 지놈익 DNA(genomic DNA)를 추출하여 준비하고 PCR(polymerase chain reaction)방법으로 ICL 유전자를 증폭하였다. 서열번호 1로 기재되는 ICL의 cDNA (Genbank 등록번호: AAN28719) 1,560 염기서열을 이용하여, 제한효소 EcoRI 절단부위를 갖는 서열번호 2로 기재되는 PCR 프라이머 ZW-1 및 제한효소 NotI 절단부위를 갖는 서열번호 3으로 기재되는 PCR 프라이머 ZW-2를 제작하였다. 이 프라이머를 이용하여 PCR은 다음과 같은 조건에서 실시하였다; 94℃에서 5 분간 DNA를 변성시키고 이후 94℃에서 20초 55℃에서 2분 72℃에서 2분으로 30사이클을 반응시킨 후 72℃에서 10분간 최종 신장반응 후, PCR반응 시료를 아가 로스 젤 전기영동을 실시하여 1.6 kb의 DNA 밴드를 회수한 후, EcoRI 및 NotI 제한효소를 처리하고 pET32a 발현벡터 (69015, Novagen사, 영국) 에 삽입한 후, 이를 대장균 BLR (DE3) (200131, Stratagene사, 미국)에 도입하여 형질전환 시켰다. 형질전환된 대장균을 0.5mM의 IPTG (I-1284, Sigma사, 미국)가 첨가된 LB (Luria-Bertani) 액체배지에 접종한 후, 25℃, 200 rpm, 4시간 배양하였다. 배양액을 6,000ⅹg, 10분간 원심분리하여 균체를 모은 후 10ml의 증류수에 현탁하고 초음파 파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 이를 10,000ⅹg에서 30분간 원심분리하여 상등액을 회수 하였다. 발현된 이소시트레이트 리아제 단백질의 N-말단에는 단백질 정제를 용이하게 하기 위해 히스- 택(His-tag)이 융합(부착)되어있다. 따라서 상등액을 Ni-NTA 단백질 정제칼럼 (36111, Qiagen사, 독일)을 통과시켜 융합단백질을 분리한 후, 엔테로키나제 (E180-01, Invitrogen사, 미국)를 처리하여 히스- 택(His-tag)을 잘라서 최종 정제된 재조합 이소시트레이트 리아제(ICL)를 수득하였다. 단백질 전기영동 분석에서 이 단백질은 547개 아미노산으로 구성되었으며 분자량은 60 kDa 이었다 (도 1 참조).

실험예 1. 이소시트레이트 리아제 ( ICL ) 효소 활성측정

상기 실시예 1에서 수득한 화합물의 이소시트레이트 리아제 (ICL) 효소 저해활성 측정은 하기와 같이 수행하였다(Dixon GH, Kornberg HL, Biochem . J., 72, p3, 1959; Hautzel R, Anke H, Sheldrick WS, J. Antibiot., 43, pp1240-1244, 1990).

20mM 소듐인산완충액(pH7.0), 1,27mM threo-DL 이소시트레이트, 3.75mM 마그네슘클로라이드, 4.1mM 페닐하이드라진 및 2.5㎍/㎖의 이소시트레이트 리아제 (ICL) 효소로 구성된 혼합 용액을 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 이때 생성된 글리옥실레이트페닐하이드라존 화합물의 양을 분광계를 이용하여 324nm에서 측정하고 이때의 효소활성을 100%로 하였다. 이 효소반응을 이용하여 실시예 1에서 수득한 화합물 및 대조 표준물질로서 기존의 저해제로 알려진 3-니트로프로피오네이트(3-nitropropionate; N-5636, Sigma사, 미국)를 각각 첨가하여 효소 활성을 측정하고 효소활성을 50% 저해하는 농도(M)를 IC₅₀으로 표시하였다. 측정 화합물은 디메칠설폭시드 (DMSO)에 10㎎/㎖ 농도로 녹여서 효소 반응액에 농도별로 첨가하였고 디메칠설폭시드의 최종농도는 1% 이하가 되도록 조정하였다.

실험결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 할리설페이트 1 (Halisurfate 1)은 12.6±0.7μM에서 IC₅₀ 값을 보여 3-니트로프로피오네이트 (IC50 = 92.4 ± 4.6 μM)보다 7배 정도의 강한 활성을 보였다.

화합물	IC50 ( μM)
할리설페이트 1	12.6 ± 0.7
할리설페이트 2	67.4 ± 1.8
3-니트로프로피오네이트	92.4 ± 4.6

실험예 2. 벼 도열병균의 부착기( appressorium ) 형성 억제 활성 시험

벼 도열병균이 식물 조직으로부터 당류를 획득하기 전인 감염 초기단계에서는 아마도 지질대사가 도열병균의 분열 증식에 대한 매우 중요하다고 보며, 이때 글리옥실레이트 사이클(Glyoxylate cycle, 도 2 참조)이 포자 발아와 부착기 형성에 중요한 대사경로이므로, 따라서 벼 도열병균 야생종인 Guy11및 ICL결손(△icl)변이주 I-10을 대상으로 포자발아 및 부착기 형성에 대한 할리설페이트 1 (Halisurfate 1)의 효과를 소수성 젤본드 필름 (GelBond) (FMC Bioproducts사, 미국)을 이용하여 하기와 같이 측정하였다(Adachi K, Hamer JE, Plant Cell, 10, pp1361-1373, 1988).

벼 도열병균 마그나포르테 그리시 (M. grisea)를 오트밀 한천배지(오트밀: 50g /L, 한천: 20 g/L) 에 접종하고 25℃, 형광등 조명 아래 8일간 배양하여 포자를 형성시켰다. 배지로부터 증류수를 이용하여 포자를 회수하고 균액을 1.25 X 105 포자/ml로 조정하였다. 포자액(40㎕)을 젤본드 필름 위에 놓고, 습윤상자에 넣어 25℃에서 12시간 배양하였다. 발아된 포자에서 부착기 형성 측정은 직접 현미경을 이용하여 계수하였으며 100개의 포자수를 세어서 부착기가 형성된 포자의 백분율(%)로 계산하였고, 한 처리구당 3회 반복 실험을 실시하였다. 동일한 방법으로 상기 실시예 1에서 수득한 할리설페이트 1을 첨가하여 부착기(appressorium) 형성 억제 활성을 측정하였다. 측정 화합물은 디메칠설폭시드 (DMSO)에 10㎎/㎖ 농도로 녹여서 포자액에 농도별로 첨가하였고 디메칠설폭시드의 최종 농도는 1% 이하가 되도록 조정하였다.

실험결과, 도 3 및 도 4에서 보는 바와 같이, 할리설페이트 1 및 양성대조군(Positive control)인 3-니트로프로피오네이트 화합물을 처리한 Guy11 및 할리설페이트 1을 처리한 ICL결손(△icl)변이주 I-10 에서도 95%가 넘는 포자 발아율을 보였다. 이는 ICL 저해제가 도열병균의 포자 발아 및 균사성장에 영향을 주지 않음을 의미한다. 그러나 이때 부착기 (appressorium) 형성은 할리설페이트 1에 의해 강하게 저해되었다. Guy11의 부착기 형성은 할리설페이트 1에 의해 농도 의존적 (12.5-50 μM)으로 억제되었고 50μM 농도에서는 완전히 저해되었다. 이에 비해 3-니트로프로피오네이트 50 μM 에서는 30% 정도 제해되는 것으로 보아 할리설페이트 1 이 보다 강한 저해제임을 알 수 있었다. ICL결손(△icl)변이주 I-10의 경우 0 μM 에서도 부착기를 형성하지 않았으며 농도를 높여도 동일한 결과를 보였다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때 이소시트레이트 리아제 (ICL) 저해제인 할리설페이트 1은 도열병균의 포자발아 및 균사 성장은 억제하지 않으나 감염에 필요한 부착기 형성을 특이적으로 저해하였으며 (도 5 참조), 따라서 이소시트레이트 리아제 (ICL)가 부착기 형성에 중요함을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 벼 도열병 감염 시험

이소시트레이트 리아제 (ICL) 저해제에 의한 부착기 형성억제 및 도열병균의 병원성과 연관성을 알아보기 위해 벼에 대한 도열병균의 감염실험을 하기와 같이 실시하였다(Kim S, Ahn IP, Rho HS, Lee YH, Mol . Microbiol., 57, pp1224-1237, 2005).

한국의 재배용 벼인 낙동벼 (Oryza sativa L. cv. Nakdong)를 사용하여, 볍씨소독은, 16공으로 되어있는 파종용 포트(pot)에 약 4~5알이 들어갈 수 있도록 볍씨의 개수를 정하여 500ml에 플라스크에 볍씨를 채우고 100% 에칠알코올을 종자량의 2배를 넣고 30초간 진탕하였다. 에칠알코올을 버리고 볍씨 소독약 호마이금나락 (동부한농 제품)을 2%정도로 만들어 에칠알코올과 같은 양을 넣고 25분간 진탕한 후, 멸균 증류수로 여러 번 헹구어 주었다. 또한, 볍씨의 파종은, 패트리 디쉬(Petri dish)에 얇은 흡수지를 깔고 증류수를 충분히 부어준 후 28~30℃의 배양기에서 약 1.5일간 배양하여 볍씨의 발아를 유도하였다. 경량 수도용 상토를 파종용 포트(pot)에 단단하게 채운 후, 물을 충분히 주어서 상토 위로 약간 물기가 보이도록 하여 준비해 두었다. 이 준비된 상토에 한 포트(pot) 당 약 4~5개씩의 발아된 볍씨를 핀셋을 이용하여 파종하였다. 파종 후 식물 배양 성장상에 옮겨 21일간 배양 하여 3-4엽기의 유묘로 성장시켰다( 온도: 낮 28℃, 밤 20℃, gradient 변화 , 습도: 60% 일정, 광 : 주간 14.5 시간 /야간 9.5시간, 광량 : 2,000lux/day).

도열병균 포자액은 상기와 같이 8일간 배양된 오트밀 배지에서 0.2% 트윈-20(Tween-20)을 포함하는 증류수를 이용하여 포자액(104 포자/ml)을 제조하고 21일간 배양한 유묘에 고르게 살포하여 감염시켰다. 또한 별도의 격리된 실험구에서는, 상기 실시예 1의 할리설페이트 1을 각 농도별로 첨가한 포자액을 제조하여 유묘에 살포하여 감염시켰다. 감염시킨 유묘들을 25℃, 습윤 상자에서 암흑하에 24시간 방치한 후, 익일 식물성장상으로 옮기고 8일간 배양하였다( 온도: 낮 25℃, 밤 25℃, 습도: 80% 일정, 광: 주간 14.5 시간 /야간 9.5시간, 광량: 2,000lux/주간).

배양 8일 후 병발력의 정도를 정량하기 위하여 병반면적(DLA, diseased leaf area)과 병반의 장애유형에 기초한 병반 면적율 즉, 병반의 심경도를 오도네즈(Ordonez)의 수정된 하기의 수학식 1로 계산하였고,(Kim S, Ahn IP, Rho HS, Lee YH, Mol . Microbiol., 57, pp1224-1237, 2005) 장애유형은 저항 장애 유형(Pinpoint 또는 larger pinhead)=1, 중간 장애 유형(Necrotic grey spot with a brown margin)=2 및 감염되기 쉬운 장애 유형(ellipticallesion with a grayish center and brown margin)=3으로 분류하였다.

실험결과, 도 6에서 보여지는 바와 같이, 야생종 도열병균 Guy11에 감염된 벼 잎에서 (할리설페이트 1 농도 0 μM) 보듯이, 병반은 아이아몬드 형태 및 중앙이 회색인 형태의 병반이 발달 되었다. 그러나, ICL결손(△ icl)변이주 I-10 (할리설페이트 1 농도 0 μM)은 병원성에서 확연한 감소를 보였다. 이와 비교하여, 할리설페이트 1을 처리한 Guy11에 경우는 병반의 수가 급격히 감소하였으며 50 μM 농도가 처리된 벼에서는 발병 억제가 명확하게 나타났다.

이러한 벼에 대한 도열병균의 병원성 억제효과를 정량적으로 나타내기 위하여 병발 정도를 심경도(Disease severity, %)로 나타내었다.

실험결과, 도 7에서 보여지는 바와 같이, 감염 8일 후, 병의 심경도는 야생종 Guy11의 경우 11.194±2.311% 이었으나, Guy11에서 할리설페이트 1 을 50 μM 처리한 실험구에서는 (심경도=0.570±0.177%) 심경도가 94% 감소함을 나타내었으 며, 한편 ICL결손(△icl)변이주 I-10 (심경도=0.082±0.076%, 할리설페이트 1 을 처리하지 않음)은 심경도가 99% 감소됨을 나타내었다. 따라서 할리설페이트 1 이 도열병 감염 억제에 강한 활성을 가지고 있으며 이러한 이소시트레이트 리아제 (ICL) 저해제가 벼 도열병 방지에 유용함을 알 수 있었다.

실험예 4. 벼의 도열병에 대한 방제효과

직경 12cm의 다공성 자기제 포트(pot)에 각각의 벼(Aichiasahi) 종자 20개를 파종하여, 벼작물의 4 내지 5엽(葉)단계시, 상기 참고예 1-1에서 준비된 벼 도열병균의 포자현탄액을 포트 1개당 5cc씩 살포하였다. 접종 후, 포트를 2일간 포화습도 내에서 25℃로 유지되는 접종실에 유지한 후, 그 포트를 고습도실로 옮기고, 상기 실시예 1에서 수득한 할리설페이트 화합물을 희석시킨 조성물을 1m 거리에서 포트에 대하여 20cc의 양으로 회전대(回轉台) 및 분무총을 사용하여 분무시킨다. 식물체상의 분무액을 풍건하고, 그 포트로 포화습도 내에서 25℃의 접종실로 옮기고, 5일 후에 10엽당 병반수를 계산하여 하기 수학식 2를 이용하여 방제가를 평가하였다.

실험결과, 본 발명의 할리설페이트 화합물의 방제가가 80.5%를 나타내었다.

본 발명의 화합물을 포함하는 살진균용 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 농약조성물

실시예 1의 할리설페이트 1 3.0g

에디펜포스 2.5g

펜시쿠론 1.5g

Ⅲ형 무수 석고 20.0g

PAP 0.1g

점토 72.9g

제제예 2. 소독조성물

실시예 1의 할리설페이트 1 3.0g

과산화수소 7g

티몰 1.0g

에틸 파라벤 0.4g

글루타르알데하이드 0.8g

유제놀 0.5g

상기 조성물은 유럽 규격 위원회의 prEN 1276 시험(0.03% 알부민/경 수)을 통과하였다. 여기에 물 및 pH가 4.0이 되도록 하는 소량의 H₂SO₄를 가하여 전체 100ml에 맞추었다. 상기의 혼합물의 조성비는 비교적 소독조성물에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

본 발명의 해면동물인 히포스폰지아(Hippospongia sp.)로부터 분리된 할리설페이트(Halisulfates) 화합물은 이소시트레이트 리아제(ICL)효소 억제, 벼 도열병균의 부착기 형성 억제 및 벼 도열병 감염 억제 효과를 나타내므로 유해 진균을 방제하는 살진균용 조성물로 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

1. 히포스폰지아(Hippospongia sp.)로부터 분리된 할리설페이트 1 화합물을 함유하는 벼 도열병균(Magnaporthe grisea)을 방제하는 살진균용 조성물.
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