KR100834733B1 - 혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달시스템 - Google Patents

혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다음을 포함하는 혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템에 관한 것이다:
(a) 다음을 포함하는 수화젤 복합체: (a-1) (ⅰ) 생분해성 고분자를 포함하는 코어; (ⅱ) 상기 코어 상에 형성된 생체적합성 고분자로 이루어진 제1수화젤; 및 (ⅲ) 상기 코어 및 제1수화젤에 비공유결합된 다당류 분자를 포함하는 다당류-기능화(functionalized) 나노입자; 그리고 (a-2) 상기 나노입자를 함유하는 담체로서 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자로 이루어진 제2수화젤; 그리고,
(b) 상기 다당류 분자에 특이적으로 비공유결합된 VEGF(vascular endothelial cell growth factor), FGF(fibroblast growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor) 또는 이의 조합.
나노입자, 다당류, 수화젤, 피브린, 서방형 국소 약물전달시스템, 성장인자

Description

혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템{Drug Delivery System for Controlled Release of Angiogenesis-Promoting Protein Drugs}
도 1은 헤파린 함량이 다른 나노입자로부터 방출되는 모델 단백질 라이소자임(lysozyme)의 누적 방출량(%)을 나타낸 그래프이다. 도면에서, HEP는 헤파린, 숫자는 헤파린의 함량, NP는 나노입자를 나타낸다.
도 2는 헤파린 기능화 나노입자(헤파린 4.7 중량%) 및 PLGA 나노입자(헤파린 0.0 중량%)를 포함하는 수화젤 복합체와 피브린 수화젤만으로 구성된 시스템으로부터 방출되는 모델 단백질인 BMP-2(bone morphogenetic protein-2)의 누적 방출량(%)을 나타낸 그래프이다. 여기서, BMP-NP-Fibrin과 BMP-PLGA NP-Fibrin은 각각 BMP-2가 충진된 헤파린 기능화 나노입자 또는 헤파린으로 기능화 되지 않은 PLGA 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체이고, BMP-Fibrin은 BMP-2가 충진된 피브린 수화젤을 나타낸다.
도 3는 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor: VEGF)가 충진된 헤파린으로 기능화된 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체를 우측대퇴동맥 절제가 이루어진 토끼하지허혈모델에 이식하고 2주 후 혈관신생을 관측한 혈관 조영상이다. 패널 A는 피브린 수화젤만을 이식한 결과, 패널 B는 VEGF가 충진된 피브린 수화젤을이식한 결과, 및 패널 C는 VEGF가 충진된 본 발명의 수화젤 복합체를 이식한 결과를 보여준다.
도 4은 혈관조영상을 기반으로 대퇴심동맥 및 내장골동맥으로부터 분지되는 측부혈관을 스코어링하여 통계적으로 처리한 그래프이다. 대조군은 피브린만을 이식한 군, VEGF는 VEGF가 충진된 피브린 수화젤을 이식한 실험군, 그리고 VEGF in NPs는 VEGF가 충진된 본 발명의 수화젤 복합체를 이식한 실험군을 나타낸다.
도 5는 VEGF가 충진된 헤파린으로 기능화된 나노입자를 포함하는 본 발명의 수화젤 복합체를 우측대퇴동맥 절제가 이루어진 토끼하지허혈모델에 이식하고 13일 후 도플러 초음파를 이용하여 측정된 혈압의 회복속도를 관찰한 그래프이다.
본 발명은 혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
성장인자 및 호르몬과 같은 치료용 단백질이나 펩타이드는 생체 내에서 반감기가 매우 짧고 친수/소수 계면 상에서 쉽게 변성이 되므로, 소수성의 합성 약물에 비해 서방형 전달시스템의 개발이 매우 어렵다. 이러한 면에서 친수성 수화젤제 의 사용은 계면 상에서의 단백질 약물의 변성을 근본적으로 해결할 수 있으며 특히 성장인자와 같은 단백질 약물의 사용에 있어서 국소적 적용을 가능하게 하므로 다양한 경우의 단백질 약물전달계에 적용되어 왔다.
그러나, 일반적인 수화젤제의 경우 대상물질이 수화젤 안에서 확산에 의해서 방출되는 방법에 의존하기 때문에 긴 방출 시간을 얻을 수 없고, 초기 약물방출(initial burst)이 매우 크게 나타나는 문제점이 지적되어 왔다. 또한, 일부 수화젤의 경우 충진된 단백질 약물이 수화젤을 구성하는 물질과 비가역적 결합을 형성하여 단백질의 활성 저하를 야기하는 문제점이 발생하였다. 따라서, 이와 같은 수화젤제 적용상의 한계를 극복하기 위한 구체적인 방법들이 제시되었다.
콜라겐과 황산화 다당류로 구성된 수화젤의 경우(EP 1374857), 약물의 안정화와 방출조절을 위하여 화학적 가교를 도입하였으며, 특이적 결합을 통한 성장인자의 안정화를 위하여 황산화 다당류와의 화학적 가교가 시도되었다(WO 00/78356). 하지만 가교도입 시, 화학적 반응으로 인하여 단백질 약물의 활성저하가 야기되는 문제점이 있다.
WO 03/028779호는 비황산화 음이온성 다당류인 알지네이트와 단백질 상호간의 이온 복합체 형성을 이용하여 로딩된 약물의 방출조절을 유도하였으며, 유럽특허 제0321277호는 콜라겐을 이용한 수화젤제를 개시하고 있다. 전자의 경우에는 수화젤 형성 시, 성장인자의 비가역적 결합으로 인한 활성저하가 발생하며, 후자의 경우 과다한 초기방출로 인해 고가인 성장인자를 과량으로 지지체내에 로딩해야 하는 경제적인 부담과 질병 전이의 잠재적인 위험성이 존재한다.
히알루론산 수화젤을 이용한 골 형성 단백질의 서방형 약물전달시스템의 경우(CA 2486113), 소수성 기능기의 도입으로 지지체내의 계면 상에서 단백질 입체구조가 불안정해지고, 잔류 유기용매로 인한 단백질의 비활성화가 발생한다.
피브린 수화젤 내에 서방형 시스템을 도입하기 위해 헤파린을 포함하는 피브린 수화젤이 개발되었으며, 분자내에 헤파린 결합부위가 있는 성장인자들을 대상으로 서방형 시스템의 구성이 보고 되었다. 이 경우 헤파린과 정전기적 상호작용이 가능한 펩타이드를 우선 수화젤내에 공유결합시키는 방식으로 헤파린을 수화젤 내에 고정시켰다[J. Control Release 65(3):389-402(2000); 미국 특허 제6468731호 및 제 6723344호]. 그러나, 제조과정이 복잡하고 재료비가 고가라는 단점이 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 특히 혈관신생-촉진 단백질 약물의 서방성(controlled-release potential)을 개선하고 비교적 간단한 공정으로 제조될 수 있는 약물전달 시스템을 개발하기 위하여, 예의 연구 노 력하였다. 그 결과, 다당류로 기능화된 나노입자를 포함하는 수화젤을 제조하되 두 종의 수화젤 층을 형성시켜 약물전달 시스템을을 제조하면, 운반되는 단백질 약물의 안정성 및 서방성이 크게 개선되며, 특히 VEGF와 같은 혈관신생-촉진 단백질 약물의 초기방출을 크게 감소시켜 서방성을 개선함으로써 단백질 약물의 국소적 전달 효과를 극대화하여, 혈관의 폐쇄와 연관된 질환 또는 허혈성 질환의 치료가 매우 유용한다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 서방형 국소 약물전달 시스템을 포함하는 혈관의 폐쇄와 연관된 질환 또는 허혈성 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 서방형 국소 약물전달 시스템을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 도면을 통하여 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템을 제공한다:
(a) 다음을 포함하는 수화젤 복합체: (a-1) (ⅰ) 생분해성 고분자를 포함하는 코어; (ⅱ) 상기 코어 상에 형성된 생체적합성 고분자로 이루어진 제1수화젤; 및 (ⅲ) 상기 코어 및 제1수화젤에 비공유결합된 다당류 분자를 포함하는 다당류-기능화(functionalized) 나노입자; 그리고 (a-2) 상기 나노입자를 함유하는 담체로서 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자로 이루어진 제2수화젤; 그리고,
(b) 상기 다당류 분자에 특이적으로 비공유결합된 VEGF(vascular endothelial cell growth factor), FGF(fibroblast growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor) 또는 이의 조합.
본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 특히 VEGF와 같은 혈관신생-촉진 단백질 약물의 서방성(controlled-release potential)을 개선하고 비교적 간단한 공정으로 제조될 수 있는 약물전달 시스템을 개발하고자 하였다. 그 결과, 다당류로 기능화된 나노입자를 포함하는 수화젤을 제조하되 두 종의 수화젤 층을 형성시켜 약물전달 시스템을을 제조하면, 운반되는 단백질 약물의 안정성 및 서방성이 크게 개선되며, 특히 단백질 약물의 초기방출을 크게 감소시켜 서방성을 개선함으로써 단백질 약물의 국소적 전달 효과를 극대화 할 수 있다는 사실을 발견하였다.
본 발명은 혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템을 제공한다.
본 발명의 수화젤 복합체에서 코어를 형성하는 것은 생분해성 고분자이다. 본 명세서에서 용어 "생분해성 고분자"는 pH 6-8인 생리적 용액(physiological solution)에 노출되었을 때 분해되는 고분자를 의미하며, 바람직하게는 생체 내에서 체액 또는 미생물 등에 의해서 분해될 수 있는 고분자를 의미한다. 본 발명에서 사용가능한 생분해성 고분자는, 상술한 분해성을 가지는 고분자이면 어떠한 것도 가능하며, 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(이하, "PLGA"라 한다), 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시부틸레이트), 폴리(하이드록시발러레이트) 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 다당류가 첨가된 유화제 수용액에 첨가되어 다당류로 기능화된 나노입자를 제조하기에 충분하기만 하면 위에 예시한 고분자에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게는, 상기 생분해성 고분자는 미국 FDA에서 생체 내 독성이 없는 것으로 승인을 받은 PLGA이며, 가장 바람직하게는 화학식 1로 표시되는 PLGA이다.
Figure 112006066354251-pat00001
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생분해성 고분자의 중량평균분자량은 5,000-100,000이며, 보다 바람직하게는 10,000-20,000이다. 분자량이 5,000 미만이면 나노입자를 형성하는데 분자 자체의 응집이 어려워 수율이 감소하며 입자내에 다당류가 불안정하게 고정되는 문제가 발생한다.
본 발명에서 제1수화젤은 생체적합성 고분자로 형성되어 있다. 본 발명의 수화젤 복합체 및 단백질 약물 전달시스템에서 제1수화젤은 헤파린과 같은 다당류 를 생분해성 나노입자에 고정시켜 주며, 또한 단백질 약물이 안정된 상태로 충진되어 유지되도록 하는 역할을 한다.
본 명세서에서 용어 "생체적합성 고분자"는 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성(tissue compatibility) 및 항응혈성(blood compatibility)을 가지고 있는 고분자를 의미한다. 본 명세서 용어 "생체적합성 고분자 유화제(emulsifier)"란 상술한 생체적합성을 가지면서, 분리된 2개 이상의 상을 혼화시키는 유화성을 함께 지닌 고분자를 의미한다.
본 발명에서 사용가능한 생체적합성 고분자 유화제는 상술한 특성을 가지는 고분자이면 어떠한 것도 가능하며, 폴락사머, 폴락사민, 폴리(비닐 알코올), 알킬 알코올의 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 및 플루론을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 생체적합성 고분자 유화제는 수중유형(o/w 형)의 유제를 형성시키는 것이며, 보다 바람직하게는, 폴락사머 또는 폴락사민이며, 가장 바람직하게는 생체 내 독성이 없는 것으로 미국 FDA가 승인한 폴락사머이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 고분자 유화제의 중량평균분자량은 5,000-100,000, 보다 바람직하게는 10,000-20,000이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 생체적합성 고분자 유화제를 이용하는 경우, 유화제 분자에 있는 친수성기 및 소수성기에 의해 결정되는 친수성-친유성 균형(HLB)이 본 발명의 목적에 적합하도록 고분자 유화제를 선택한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 적합한 생체적합성 고분자 유화제를 선택할 때 친수성 부분이 전체 분자 구조에서 60-80%가 되는 것을 선택한다. 상기 범위를 벗어나는 경우 나노입자의 불안정한 분산으로 인한 수득율 감소 및 기능성 다당류의 고정화가 어려운 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명의 나노입자에 포함되는 다당류는, VEGF, FGF 및/또는 PDGF, 이의 단편(fragments) 또는 펩타이드와 특이적으로 상호작용을 하며, 이를 통해 상기 단백질의 3차원 구조를 유지하고 생물학적 활성(즉, 혈관신생 촉진 활성)을 증가시키며 가수분해를 저해하여 단백질을 안정화시키는 역할을 한다.
본 발명에서 이용될 수 있는 다당류 분자는 상술한 작용을 할 수 있는 어떠한 다당류도 가능하며, 헤파린, 알지네이트, 히아루론산, 키토산, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 5-설페이트(dermatan 5-sulfate), 케라탄 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 다당류 분자는 헤파린, 알지네이트, 히아루론산 및 키토산이며, 보다 바람직하게는 생체 내 독성이 없는 것으로 미국 FDA가 승인한 음이온성 다당류인 헤파린이고, 가장 바람직하게는 하기 화학식 2로 표시되는 헤파린이다.
Figure 112006066354251-pat00002
본 발명에 이용되는 다당류의 분자량은, 수화젤 복합체 내에서 코어 및 수화젤막과 충분한 물리/정전기적 결합력을 얻고 또한 제조된 나노입자의 안정성 측면을 고려하여, 바람직하게는 3,000-100,000이고, 보다 바람직하게는 8,000-15,000이 다. 다당류는 나노입자 1 mg 당 2-100 ㎍이 포함되는 것이 바람직한데, 상기 범위를 벗어나는 경우에 각각 단분산성의 나노입자 수득이 어려운 문제점 및 나노입자의 서방출 효과가 감소하는 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명의 나노입자는 바람직하게는, 평균 지름이 1-400 nm의 입자, 보다 바람직하게는 10-300 nm의 입자, 가장 바람직하게는 50-200 nm의 입자이다.
본 발명의 나노입자의 표면전하(대부분 다당류에 의해 결정된다)는 충진되는 대상 단백질에 따라 결정되며, 효과적인 충진을 고려하여 +20 mV 이상인 것과 -40 mV 이하인 것이 바람직하다. 본 발명의 나노입자가 음전하를 가지는 다당류, 예컨대 헤파린으로 기능화되는 경우, 본 발명의 나노입자의 표면전하는 바람직하게는, -30 mV ~ -70 mV, 보다 바람직하게는 -40 mV ~ -60 mV, 가장 바람직하게는 -40 mV ~ -50 mV이다. 나노입자의 표면전하는 수화젤 막 내 단백질의 효과적인 충진을 고려하여 -40 mV 이하인 것이 유리하다.
또한 나노입자의 다분산(polydispersity) 지수는 0.1 이하인 것이 유리하며, 이는 일반적으로 다분산 지수가 0.1 이하인 경우 안정적인 단분산 분포를 갖는 나노입자로 간주하기 때문이다. 나노입자의 바람직한 다분산 지수는 0.01-0.1 이다.
본 발명의 수화젤에 포함되어 있는 나노입자는 다당류-기능화 나노입자이다. 본 명세서에서 용어 "다당류-기능화 나노입자"는 다당류를 통해서 단백질과 특이적으로 비공유결합을 할 수 있는 기능성이 부여된 나노입자를 의미한다.
본 발명에서 제2수화젤은 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자로 형성되 어 있다. 제2수화젤은 표면에 수화젤층을 포함하는 상기 나노입자들을 함유하는 담체(또는 매트릭스)의 역할뿐만 아니라, 초기 결손 공간을 채우고 본 발명의 VEGF를 함유하는 수화젤 복합체가 투여된 위치의 주위에서 수화젤 복합체 안쪽으로 신생혈관 등이 생장하여 들어 올 수 있도록 하는 역할을 한다. 또한, 본 발명의 수화젤 복합체 내에 충진된 단백질 약물은 1차적으로 나노입자에 결합된 다당류와 결합을 형성하여 안정화되고, 나아가서 제2수화젤 내에서 부가적으로 안정화 된다. 제2수화젤 내에는 상기 나노입자뿐만 아니라, 다른 생리활성물질들이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자"는 상술한 생체적합성 고분자의 특성을 가지면서도 인 비보(in vivo) 또는 엑스 비보(ex vivo)에서 세포에 대한 부착능력이 있는 고분자를 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자는 상술한 특성을 가지는 고분자이면 어떠한 것도 가능하며, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴락사머, 폴리(오르가노포스파젠) 및 올리고(폴리(에틸렌 글리콜)푸마레이트)와 같은 합성고분자; 그리고 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산 및 알지네이트와 같은 천연고분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자는 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산 또는 알지네이트이며, 보다 바람직하게는 펩타이드 고분자인 콜라겐, 젤라틴 및 피브린이고, 가장 바람직하게는 피브린이다. 피브린은 분자 내에 세포 결합자리와 당아미노글라이칸 결합자리가 공존하며, 수화젤 제조가 용이하고 조직접합 및 국소지혈제로서 임상적 적용이 일반화되어 있다.
제2수화젤의 탄성강도는 이용되는 생체적합성 고분자 및 이 고분자에 대한 가교인자의 종류와 사용량에 결정될 수 있다. 본 발명의 수화젤 복합체가 생체 내에 적용되는 경우, 이식된 위치의 주위 세포가 제2수화젤에 결합하여 증식 및 분화를 할 수 있다. 이러한 주위 세포의 생존, 증식 및 분화를 고려하면, 제2수화젤의 탄성강도는 1,000-10,000 Pa이다.
본 발명의 단백질 약물전달 시스템에서 운반되는, VEGF, FGF 및/또는 PDGF는 본 발명의 시스템에서 다당류에 특이적으로 비공유결합 되어 운반될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "비공유결합"은 공유결합, 이온결합 및 배위결합을 제외한 물리/화학적 결합을 나타내기 위하여 사용된다. 예컨대, 용어 "비공유결합"은 흡착(adsorption), 응집(cohesion), 사슬엉킴(entanglement) 및 잡힘(entrapment) 등과 같은 물리적 결합뿐만 아니라, 수소결합 및 반데르발스결합과 같은 상호작용이 단독으로 또는 상기 물리적 결합과 함께 작용하여 발생되는 결합을 포함하는 개념이다.
VEGF, FGF 및/또는 PDGF는 다당류, 특히 헤파린 결합 도메인을 가지고 있기 때문에, 이들 단백질과 다당류 사이의 결합은 특이적 결합이라 할 수 있다.
방출경향 및 약물의 국소적 유효량을 고려하여, 상기 나노입자 1 mg 당 0.01-5 μg의 단백질 약물이 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명의 서방형 국소 약물전달 시스템을 포함하는 혈관의 폐쇄와 연관된 질환 또는 허혈성 질환의 치료 용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여하는 것이 바람직하고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 국소 투여 (topical administration 또는 local site에 직접 주입 또는 이식 포함) 등으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 국소 투여된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 질환의 종류, 단백질 약물의 종류, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 ㎎/㎏(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 수화젤 복합체의 제조방법 및 통상적인 방법에, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 혈관(예컨대, 동맥, 정맥 또는 모세혈관)의 폐쇄(obstruction)과 연관된 질환 또는 허혈성 질환의 치료에 이용될 수 있으며, 상기 질환은 관상폐색질환, 경동맥폐색질환, 동맥폐색질환, 말초동맥질환, 아테롬성동맥경화증, 폐색성 혈전맥관염, 혈전성 질환 및 맥관염을 포함하나 이에 한정되 는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 예방될 수 있는 질환 또는 상태는 심장마비(심근경색) 또는 다른 혈관 사멸, 발작 및 혈류 감소와 연관된 림(limbs)의 사멸 또는 손실을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 상처 또는 궤양의 치료 촉진, 피부이식물 또는 재결합된 림의 혈관신생 촉진, 문합수술의 치료 촉진, 또는 피부 또는 모발의 성장 촉진에도 이용될 수 있다.
단백질 약물 치료는 다양한 질환, 특히 치료적 혈관신생에 의한 허혈성 질환의 치료 전략의 하나로서 많은 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 치료학적 효과를 나타내기 위해서는 고순도의 단백질 약물을 다량 사용해야 하므로 막대한 비용이 소요되는 문제점이 있었다. 본 발명의 단백질 약물전달 시스템 및 약제학적 조성물은 이러한 종래의 기술적 문제점 및 한계를 극복하는 것으로서, 단백질 약물의 서방출 및 안정화를 크게 개선시켜 종래의 단백질 약물 치료의 한계를 극복하고 있다. 허혈성 질환에 대해서는 줄기세포를 이용한 치료방법들도 많이 제시되고 있는데, 본 발명의 단백질 운반시스템 또는 약제학적 조성물을 이러한 치료용 줄기세포와 병행하여 이용하거나, 본 발명의 수화젤 복합체 내에 줄기세포를 포함시켜 이용하면 허혈성 질환의 치료를 극대화시킬 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템의 제조방법을 제공한다:
(a) 다음의 소단계를 포함하는 다당류-기능화 나노입자의 제조단계: (a-1) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해하여 생분해성 고분자 용액을 수득하는 단계, (a-2) 다당류 분자 및 생체적합성 고분자 유화제를 친수성 용매에 용해하여 다당류와 생체적합성 고분자 유화제의 혼합용액을 수득하는 단계, 및 (a-3) 상기 생분해성 고분자 용액을 상기 다당류와 생체적합성 고분자 유화제의 혼합용액의 첨가 및 분산시켜, 생분해성 고분자가 코어에 존재하고 상기 코어 상에 생체적합성 고분자로 이루어진 제1수화젤이 형성되어 있으며, 그리고 상기 코어 및 제1수화젤에 다당류 분자가 비공유결합된 다당류-기능화 나노입자를 제조하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 형성된 나노입자를 회수하는 단계; (c) 상기 회수된 나노입자를 분산매에 재분산시키는 단계; (d) 상기 재분산된 나노입자 분산액 및 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합의 용액을 혼합하여 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합을 상기 나노입자에 충진시키는 단계로서, 상기 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합은 나노입자에 있는 다당류 분자에 특이적으로 비공유결합되고; (e) 상기 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합이 충진된 나노입자 분산액을 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자 용액에 분산시키는 단계; 그리고, (f) 상기 단계 (e)의 결과물에 가교제, 가교활성제 및 물리적 가교인자로 구성된 군으로 선택되는 가교인자를 제공하여 상기 생체적합성 고분자를 가교시켜 제2수화젤을 형성시키는 단계.
본 발명의 제조방법은 상술한 본 발명의 서방형 국소 약물전달 시스템을 제조하기 위한 것이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다. 예를 들어, 코어를 형성하는 생분해성 고분 자, 제1수화젤, 다당류 분자, 제2수화젤 및 단백질 약물에 대한 설명은 상기 두 발명 사이에 공통적이다.
단계 (a)는 수화젤 복합체에서 다당류-기능화 나노입자를 제조하는 단계이다. 우선, 생분해성 고분자(예컨대, PLGA)를 유기용매에 용해하여 생분해성 고분자 용액을 얻는다. 상기 유기용매는 "저농도에서 세포독성이 없는 유기용매"가 바람직하며, 보다 바람직하게는 디메틸술폭사이드, 테트라글리콜, 에틸 락테이트 또는 에탄올이며, 보다 더 바람직하게는 10 %(w/w) 이하의 농도에서 세포독성이 없다고 보고된 디메틸술폭사이드 또는 테트라글리콜이며, 가장 바람직하게는 디메틸술폭사이드이다. 생분해성 고분자 용액을 준비하는 경우 생분해성 고분자의 사용량은, 나노입자 제조단계 시 생분해성 고분자의 응집으로 인한 손실을 최소화하는 측면에서 0.5-2.0 %(w/v)인 것이 바람직하다.
다당류 분자 및 생체적합성 고분자 유화제를 친수성 용매[예를 들어, 물 또는 완충액, 바람직하게는 물)에 용해하여 다당류와 생체적합성 고분자 유화제의 혼합용액을 얻는다. 상기 (a-2) 단계에서, 생분해성 고분자의 입자 외부에 형성되는 수화젤막의 두께, 효율적인 입자형성을 위한 수용액의 점도를 고려하여 생체적합성 고분자 유화제의 농도가 0.01-5 %(w/v)인 것이 바람직하다. 생분해성 고분자가 용해되어 있는 유기용매는 이후에 다당류가 첨가된 생체적합성 고분자 유화제가 용해된 수용액에 분산되어 다당류-기능화 나노입자를 형성시키는데, 생체적합성 고분자 유화제가 용해된 수용액에 첨가되는 다당류의 양은 나노입자의 다분산 지수(polydispersity)와 수득율을 고려하여 수용액 상의 생체적합성 고분자 유화제 질량 대비 10% 이하를 유지하는 것이 바람직하다.
상기 생분해성 고분자 유기용액을 상기 다당류와 생체적합성 고분자 유화제의 수용액에 첨가 및 분산시켜, 생분해성 고분자가 코어에 존재하고 상기 코어 상에 생체적합성 고분자로 이루어진 제1수화젤이 형성되어 있으며, 그리고 상기 코어 및 제1수화젤에 다당류 분자가 비공유결합된 다당류-기능화 나노입자를 제조한다. 이 과정에서 생분해성 고분자 유기용액 및 다당류와 생체적합성 고분자 유화제의 수용액의 함량비율은 특별한 한정이 요구 되지 않지만, 나노입자 내 유기용매의 잔류와 이로 인한 세포독성을 고려하여, 유기용액의 부피를 혼합용액 부피 대비 10% 이하로 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 물은 특별한 독성 등을 나타내지 않는 생체 내 적합성을 보이는 것이라면 모두 사용가능하며, 증류수 등에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에서 유기용액을 수용액에 첨가하여 분산시키는 방법은 통상적으로 사용되는 분산방법이 모두 사용 가능하다.
상기 과정을 통해 생성된 다당류-기능화 나노입자를 회수(예컨대, 원심분리에 의해)하고 회수된 나노입자를 적합한 분산매에 재분산시킨다. 상기 적합합 분산매는 PBS(phosphate-buffered saline), PB(phosphate buffer), 물(탈이온수 또는 증류수), 트리스(Tris) 및 헤페스(Hepes) 완충액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 적합합 분산매는 PBS, PB, 탈이온수 또는 증류수이며, 가장 바람직하게는 PBS이다.
이어, 상기 재분산된 나노입자 분산액 및 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합을 혼합하여 단백질 약물을 상기 나노입자에 충진시킨다. 이 경우, 상기 단백질 약물은 나노입자에 있는 다당류 분자에 비공유적으로 결합 된다. 이용되는 단백질 약물 용액에서 용매는 단백질 입체구조의 안정성 측면을 고려하여 완충력이 있는 PBS, PB, 트리스 또는 헤페스 완충액이 바람직하며, 가장 바람직하게는 PBS이다. 상기 다당류-기능화 나노입자 재분산액은 최종 수화젤 복합체의 부피 및 강도를 고려하여 농도가 25 %(w/v) 이상인 것이 바람직하고, 상기 단백질 용액에서 단백질의 농도는 최종 수화젤 복합체의 부피 및 강도를 고려하여 0.01-0.5 %(w/v)로 하는 것이 바람직하다.
그런 다음, 상기 단백질 약물이 충진된 나노입자 분산액을 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자 용액에 분산시키고, 가교제, 가교활성제 및 물리적 가교인자로 구성된 군으로 선택되는 가교인자를 첨가하여 상기 생체적합성 고분자를 가교시켜 제2수화젤을 형성시켜, 최종적으로 단백질이 충진된 수화젤 복합체를 제조한다.
가교제, 가교활성제 및/또는 물리적 가교인자는 생체적합성 고분자를 가교(cross-linking)시켜, 적합한 탄성강도(elastic modulus, G')를 가지는 제2수화젤을 제공한다. 제2수화젤의 탄성강도는 세포부착성을 가지는 생체적합성 고분자 용액 및 가교인자의 사용량에 의해 결정될 수 있으며, 1,000-10,000 Pa이다.
가교제, 가교활성제 및/또는 물리적 가교인자는 사용되는 세포부착성을 가지는 생체적합성 고분자의 종류에 따라 다양하다. 예를 들어, 생체적합성 고분자로 피브리노겐이 이용되는 경우, 트롬빈을 가교활성제로 이용할 수 있으며, 트롬빈에 의해 피브리노겐이 가교되어 피브린으로 이루어진 제2수화젤을 형성하게 된다. 상기 물리적 가교인자는 예컨대, 온도, pH 및 분자간 특이적 상호작용(specific interaction)을 포함한다.
생체적합성 고분자로 피브리노겐이 이용되는 경우, 제2수화젤을 형성시키기 위한 용액에는 세린 프로테아제 억제제의 일종인 아프로티닌(aprotinin)을 항피브린분해제(antifibrinolytic agent)로서 추가적으로 포함시키는 것이 바람직하다. 또한, 제2수화젤을 형성시키기 위한 반응용액에는 혈액항고인자인 FXⅢ을 추가적으로 포함시키는 것이 바람직한데, 이 혈액항고인자는 가교결합 되어 형성된 피브린의 강도를 높이는 작용을 한다.
상술한 본 발명의 서방형 단백질 약물전달 시스템의 제조방법에 있어서, (ⅰ) 단계 (a-2)에서 다당류 분자의 농도를 변화시키거나, 또는 단계 (a-3)에서 상기 유기용액 및 수용액의 혼합비율을 변화시킴으로써, 상기 나노입자 단위질량 당 다당류의 함량을 변화시키는 방법; (ⅱ) 상기 단계 (e)의 제2수화젤 제조용 생체적합성 고분자 용액에서, 다당류-기능화 나노입자 및 제2수화젤 제조용 생체적합성 고분자의 농도비를 변화시킴으로써 수화젤 복합체 단위질량 당 나노입자의 함량을 변화시키는 방법; 또는 상기 (ⅰ) 방법 및 (ⅱ) 방법을 병용하여 수행함으로써 단백질 약물의 방출속도를 조절할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점(advantages)을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 다당류로 기능화된 나노입자를 포함하며 두 종의 수화젤층으로 이루어 진 본 발명의 수화젤 복합체는 운반하는 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합의 초기 방출을 감소시키고 국소적 서방출 효과를 크게 개선한다.
(ⅱ) 본 발명의 수화젤 복합체는 운반하는 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합의 안정성을 크게 개선한다.
(ⅲ) 물질의 성질이 변화되는 화학적인 공정 없이 비교적 간단한 공정에 의해 제조될 수 있다.
(ⅳ) 물질의 성질이 변화되는 화학적인 공정 없이 생체적합성이 우수한 물질을 이용하여 제조되기 때문에, 본 발명의 단백질 약물 운반시스템은 생체 적합성이 매우 우수하다.
(ⅴ) 본 발명의 단백질 약물 운반시스템은 FDA에서 임상 사용이 허가된 물질로만 구성될 수 있어, 의약의 상업화에 소요되는 시간 및 비용을 크게 격감시킬 수 있다.
(ⅴ) 본 발명의 수화젤에 포함되는 나노입자의 평균 지름을 400 nm 이하로 유지하는 경우에는 간단한 필터 과정만으로 멸균 처리가 가능하다.
(ⅵ) 줄기세포 치료법과 병행하여 이용하면 허혈성 질환의 치료를 극대화시킬 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통 상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 헤파린으로 기능화된 나노입자를 포함하는 피브린 수화젤 복합체의 제조
헤파린(Celsus Laboratories (Cincinnati, OH, USA))이 각각 30 mg 및 120 mg 포함된 폴락사머 수용액(BASF Corp.(Seoul, Korea)) 30 ml에 PLGA(Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Germany)) 40 mg가 용해된 디메틸술폭사이드 2 ml을 천천히 첨가하여 나노입자를 제조하였다. 나노입자 용액에 존재하는 과량의 헤파린, 폴락사머 및 디메틸술폭사이드를 고속 원심분리 후 상층액을 분리하는 방식으로 제거시켰다. PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4) 40 ㎕를 이용하여 회수된 나노입자를 재분산시킨 후, PBS에 용해되어 있는 모델 단백질(라이소자임, Sigma (St. Louis, MO, USA) 및 BMP-2, PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)) 또는 대상 단백질(VEGF, PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA))을 충진하였다. 상기 단백질 약물이 충진된 나노입자 분산액 62.5 ㎕를 피브리노겐 용액(Greencross (Yongin, Korea)) 200 ㎕와 균일하게 혼합한 후 가교활성제인 트롬빈 용액(Greencross (Yongin, Korea))을 피브리노겐 용액과 동일부피로 추가 혼합함으로써 피브린 수화젤 복합체를 제조하였다. 이때 이용되는 피브리노겐 용액은 피브리노겐(fibrinogen, 71.5-126.5 mg), 혈액응고인자 XⅢ(44-88 Units) 및 아프로티닌(aprotinin, 1,100 Kallikrein Inhibitor Units)을 주성분으로 하며, 트롬빈 용액은 트롬빈(thrombin, 400-600 IU)이 용해된 염화칼슘 용액이다.
실시예 2: 헤파린-기능화 나노입자의 입자크기, 표면전하, 구성성분 질량비, 다분산 지수 관찰
오츠카 전자(Otsuka Electronics Co.)의 ELS-8000을 사용하여 동적 광산란법에 의해 제조된 나노입자의 크기를 측정하였으며 전기영동 광산란법을 이용하여 입자의 표면 전하를 측정하였다.
폴락사머 수용액 상의 헤파린 양을 증가시킴에 따라 합성된 나노입자의 표면전하는 -26.0± 1.1에서 -44.4± 1.2 mV로 증가하였으며 크기는 123.1± 2.0 nm에서 188.1± 3.9 nm로 변화하였다. 헤파린이 강한 음전하를 띤 물질이므로, 음의 값으로 증가하는 표면전하는 생성된 입자의 표면에 더 많은 헤파린이 존재함을 나타낸다.
입자를 구성하는 각 성분의 질량비를 얻기 위해 우선 나노입자 용액을 동결 건조하여 나노입자의 건조 무게를 계산하였다. 입자 상태로 anti-factor Xa 분석(C. Chauvierre et al., Biomaterials 25:3081-3086(2004))을 통해 입자 표면층에 존재하는 헤파린의 내의 헤파린 양을 계산하였고, 입자를 녹여 전체 헤파린을 수거한 후 anti-factor Xa 분석을 통하여 입자내 전체 헤파린 양을 계산하였다. 최종적으로 1H NMR 분석을 통해 입자 내 PLGA와 폴락사머의 비를 계산하여 각 성분의 질량비를 결정하였다(표 1).
표 1에 기재된 바와 같이, 물리적으로 고정화된 헤파린은 대부분 입자표면층 에 존재하고, 또한, 제조된 입자에서 강하게 결합되지 않은 헤파린과 폴록사머는 고속 원심분리에 의해서 제거되었으므로, 헤파린이 PLGA 나노입자 내에 물리적 방법에 의해 고정화되었으며 대부분 폴락사머로 구성된 입자 표면층내에 존재한다는 것을 알 수 있었다. 수화젤층을 만드는 폴록사머는 폴록사머의 소수성부분과 역시 소수성인 PLGA와의 인력에 의해서 입자제조시 안정화되는 것으로 생각되고, 헤파린의 카르복실그룹이 폴록사머의 친수성부분인 폴리에틸렌글리콜부분과의 인력에 의해서 입자생성 중 헤파린이 표면층에 고정화되는 것으로 생각된다.
제조된 나노입자를 구성하는 각 성분의 질량비를 표 1에 나타내었다.
나노입자 내 각 성분의 질량비
수용액 내 헤파린(mg) PLGA(mg) 폴락사머(mg) 입자 표면층의 헤파린(mg) 입자 내 전체 헤파린(mg)
0 36.8± 1.6 (72.7%) 13.8± 0.6 (27.3%) 0.0 (0.0) 0.0 (0.0)
30 34.7± 0.9 (70.6%) 13.3± 0.4 (27.0%) 0.94± 0.04 (1.9%) 1.20± 0.04 (2.4%)
120 29.0± 1.8 (66.9%) 12.3± 0.8 (28.4%) 1.71± 0.09 (4.0%) 2.01± 0.10 (4.7%)
표 1에 기재된 바와 같이, 폴락사머 수용액 내에 용해된 헤파린의 양이 증가할수록 입자 표면의 수화젤에 존재하는 헤파린의 양도 따라서 증가하는 결과를 보였다. 그러나, 나노입자의 다분산 지수와 수득률을 고려하여 폴락사머 수용액내에 첨가되는 헤파린의 양은 120 mg 이하를 유지 하는 것이 바람직하다. 특히, 폴락사머 수용액 내 헤파린 양이 0, 30, 120 mg인 조건에서 제조한 나노입자의 경우에 각각 0, 2.4 및 4.7 중량%의 헤파린이 포함된 나노입자가 제조되었다.
실시예 3: 나노입자로부터 방출되는 모델 단백질의 시험관내( in vitro ) 서방출 효과
실시예 1에서 제조된 단백질 약물이 충진된 나노입자에 대해서 약물의 서방출 효과를 확인하기 위하여, 다음과 같은 시험관 내 조건으로 방출양상을 측정하였다. 라이소자임 1 mg이 충진된 나노입자 분산용액을 투석용 튜브(dialysis tube, MWCO 500 kDa)에 넣은 후, 무한 희석조건을 만족하는 과량의 PBS 용액을 이용하여 방출된 라이소자임을 회수하고, 그 양을 Micro BCA 단백질 정량법(C.J.R. Thorne, in Techniques in Protein and Enzyme Biochemistry, Part I, Section B 104, Elsevier-North Holland(1978))을 이용하여 정량하였다. 라이소자임 회수에 사용되는 PBS 용액은 매일 새로운 PBS 용액으로 교체되었고 단백질 정량 시까지 샘플은 4℃에서 보관되었다.
도 1은 이러한 방출실험의 결과로서 시간의 경과에 따라 나노입자로부터 방출되는 라이소자임의 누적 방출량(%)을 나타낸 그래프이다. 헤파린이 포함되지 않은 나노입자의 경우에는 3일 이내에 충진량의 2/3가 방출되었으나, 나노입자 내 고정화된 헤파린 양이 증가함에 따라 단백질의 서방출 형태가 관찰되었다. 한편, 헤파린 함량이 4.7 중량%인 나노입자의 경우 초기 약물방출 없이 최대 19일까지 방출이 진행되었다.
실시예 4: 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체로부터 방출되는 모델 단백질의 시험관내( in vitro ) 서방출 효과
실시예 1에서 제조된 단백질 약물이 충진된 수화젤 복합체에 관해 약물의 서방출 효과를 확인하기 위하여, 다음과 같은 시험관 내 조건으로 모델 단백질인 BMP-2 (bone morphogenetic protein-2)의 방출양상을 측정하였다. 대상 단백질인 VEGF 경우, 대상 단백질의 항원-항체 특이적 결합 외에 피브린 구성 단백질의 비특이적 결합으로 인해 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용한 정량분석이 불가능하였다. 따라서 헤파린과 특이적 결합이 가능하며 ELISA를 통한 정량분석이 가능한 BMP-2를 VEGF에 대한 대체 모델 단백질로 선정하였다. BMP-2가 충진된 헤파린 기능화 나노입자(헤파린 4.7 중량%)를 포함하는 수화젤 복합체(BMP-NP-Fibrin), PLGA 나노입자(헤파린 0.0 중량%)를 포함하는 수화젤 복합체(BMP-PLGA NP-Fibrin) 및 담체인 피브린 수화젤(BMP-Fibrin)만으로 구성된 시스템을 제작하여 방출용기에 넣은 후, 무한 희석조건을 만족하는 과량의 PBS 용액을 이용하여 각각의 시스템으로부터 방출된 BMP-2를 회수하고, 회수된 BMP-2의 방출량은 ELISA를 이용하여 정량하였다. PBS 용액은 매일 새로운 용액으로 교체하였고 단백질 정량 시까지 회수된 샘플은 -30℃ 이하에서 보관하였다.
실시예 1에서 제조한 바와 같이, 헤파린 기능화 나노입자 1 mg당 156 ng의 BMP-2를 충진하여 수화젤 복합체를 제조한 경우, 초기방출이 관찰되지 않았으며 15일까지 충진된 BMP-2의 약 25%가 지속적으로 방출되었다(도 2). 반면 PLGA 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체 및 피브린 수화젤의 경우, 초기 24시간 이내에 총 BMP-2 충진량의 23%와 18%가 각각 방출되었으며, 15일까지 약 60%의 BMP-2가 유사한 방출경향을 보이며 방출되었다. 이를 통해 서방형 단백질 약물전달을 위한 헤파린 기능화 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체의 활용 가능성을 확인하였다.
실시예 5: 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체로부터 방출되는 대상 단백질의 생체내( in vivo ) 국소적 서방출 및 안정화 효과
실시예 1의 과정을 통해 대상 단백질인 VEGF 2.5 μg이 충진된 나노입자-수화젤 복합체를 준비하고, 단백질 약물의 국소적 방출 효과를 확인하였다. 다당류로 기능화된 나노입자를 포함하는 본 발명의 수화젤 복합체(C: VEGF loaded Hep-NP in Fibrin, n = 4)로부터 방출되는 단백질 약물의 생체내 국소적 서방출 및 안정화 효과에 대한 유의한 차이를 확인하기 위하여, 피브린 수화젤만 이식한 경우(A: Fibrin, n = 4)와 피브린 수화젤에 VEGF를 충진하고 이식한 경우(B:　VEGF in Fibrin, n = 4)를 포함하여 모두 3군에 대한 동물실험을 진행하였다.
일반적으로 단백질 약물치료의 경우 국소적으로 일정수준의 활성단백질 농도를 지속적으로 유지하는 것이 매우 중요하다는 것은 이미 알려진 사실이므로 동물실험에서의 유의적 차이를 통해 직접적으로 단백질 약물에 대한 수화젤 복합체의 국소적 서방출 및 안정화 효과를 확인할 수 있다. 대조군(A: Fibrin) 및 실험군(B:　VEGF in Fibrin, C: VEGF loaded Hep-NP in Fibrin)으로 설정된 총 12마리의 토끼를 이용하여 우측대퇴동맥을 결찰 후 절제하여 하지허혈 모델을 만든 후 즉시 각 군의 해당 시스템을 절제부위에 이식하고 수술 부위를 봉합하였다. 토끼하지허혈모델에 대해 이식 13일후 도플러 초음파를 이용하여 혈압의 회복속도를 측정하였으며, 2주후 혈관조영을 시행하여 대퇴심동맥 및 내장골동맥으로부터 분지되는 측부혈관을 혈관조영상을 통해 직접 관찰하였다.
도 3은 VEGF가 충진된 헤파린으로 기능화된 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체를 우측대퇴동맥 절제가 이루어진 토끼하지허혈모델에 이식하고 2주 후 혈관신생을 관측한 혈관조영상이며, 도 4는 이를 기반으로 대퇴심동맥 및 내장골동맥으로부터 분지되는 측부혈관을 스코어링하여 통계적으로 처리한 그래프이다. 혈관조영상 및 혈관조영 스코어링 결과로부터 이식부위 내의 혈관신생 정도는 실험군 C(VEGF loaded Hep-NP in Fibrin)의 경우 나머지 실험군 및 대조군에 비해 유의하게 높음을 알 수 있다.
도 5는 VEGF가 충진된 헤파린으로 기능화된 나노입자를 포함하는 수화젤 복합체를 우측대퇴동맥 절제가 이루어진 토끼하지허혈모델에 이식하고 13일 후 도플러 초음파를 이용하여 측정된 혈압의 회복속도를 관찰한 그래프이다. 혈압이 회복되는 정도는 실험군 C(VEGF loaded Hep-NP in Fibrin) ＞ 실험군 B(VEGF in Fibrin) > 대조군(A: Fibrin) 순으로 측정되었으며 유의적인 차이를 나타내었다. 토끼하지허혈모델에서의 혈압 회복속도는 동맥절제부위 부근 조직의 측부혈관 발달정도와 밀접한 관계가 있다는 사실을 고려할 때, 혈압 회복속도 결과는 혈관조영 스코어링 결과와 일치됨을 알 수 있다.
결론적으로, 본 발명의 수화젤 복합체는 단백질의 국소적 서방출 및 안정화를 상당히 개선시켜, 약물로서의 단백질의 생체 내 작용을 크게 개선 시킬 수 있음을 알 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 혈관신생-촉진 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템은 운반하는 단백질 약물의 초기 방출을 감소시키고 국소적 서방출 효과를 크게 개선할 수 있으며, 또한 단백질 약물의 안정성을 크게 개선한다. 한편, 물질의 성질이 변화되는 화학적인 공정 없이 비교적 간단한 공정에 의해 제조될 수 있기 때문에, 본 발명의 단백질 약물 운반시스템은 생체 적합성이 매우 우수하다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (22)

  1. 다음을 포함하는 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템:
    (a) 다음을 포함하는 수화젤 복합체:
    (a-1) (ⅰ) 생분해성 고분자를 포함하는 코어; (ⅱ) 상기 코어 상에 형성된 생체적합성 고분자로 이루어진 제1수화젤; 및 (ⅲ) 상기 코어 및 제1수화젤에 비공유결합된, 헤파린, 알지네이트, 히아루론산, 키토산, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 5-설페이트(dermatan 5-sulfate), 케라탄 설페이트, 덱스트란 및 덱스트란 설페이트로 구성된 군으로부터 선택되는 다당류 분자를 포함하는 다당류-기능화(functionalized) 나노입자; 그리고 (a-2) 상기 나노입자를 함유하는 담체로서 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자로 이루어진 제2수화젤; 그리고,
    (b) 상기 다당류 분자에 특이적으로 비공유결합된 혈관내피성장인자(VEGF, vascular endothelial cell growth factor), 섬유아세포성장인자(FGF, fibroblast growth factor), 혈소판유래성장인자(PDGF, platelet-derived growth factor) 또는 이의 조합.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 코어를 형성하는 생분해성 고분자는 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산), 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시부틸레이트) 및 폴리(하이드록시발러레이트)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)인 것을 특징으로 하는 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 코어 상에 형성된 생체적합성 고분자로 이루어진 제1수화젤은 폴락사머, 폴락사민, 폴리(비닐 알코올), 알킬 알코올의 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 및 플루론으로 구성된 군으로부터 선택되는 생체적합성 고분자 유화제로 이루어진 것을 특징으로 하는 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자 유화제는 폴락사머 또는 폴락사민인 것을 특징으로 하는 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 다당류 분자는 헤파린인 것을 특징으로 하는 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 제2수화젤을 형성하는 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자는 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산 또는 알지네이트인 것을 특징으로 하는 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 피브린인 것을 특징으로 하는 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 나노입자는 직경이 400 nm 이하이고 표면전하가 -40 mV 이하이며 다분산 지수가 0.1 이하인 것임을 특징으로 하는 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템.
  11. 다음의 단계를 포함하는 단백질 약물에 대한 서방형 국소 약물전달 시스템의 제조방법:
    (a) 다음의 소단계를 포함하는 다당류-기능화 나노입자의 제조단계: (a-1) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해하여 생분해성 고분자 용액을 수득하는 단계, (a-2) 헤파린, 알지네이트, 히아루론산, 키토산, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 5-설페이트(dermatan 5-sulfate), 케라탄 설페이트, 덱스트란 및 덱스트란 설페이트로 구성된 군으로부터 선택되는 다당류 분자 및 생체적합성 고분자 유화제를 친수성 용매에 용해하여 다당류와 생체적합성 고분자 유화제의 혼합용액을 수득하는 단계, 및 (a-3) 상기 생분해성 고분자 용액을 상기 다당류와 생체적합성 고분자 유화제의 혼합용액의 첨가 및 분산시켜, 생분해성 고분자가 코어에 존재하고 상기 코어 상에 생체적합성 고분자로 이루어진 제1수화젤이 형성되어 있으며, 그리고 상기 코어 및 제1수화젤에 다당류 분자가 비공유결합된 다당류-기능화 나노입자를 제조하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 형성된 나노입자를 회수하는 단계;
    (c) 상기 회수된 나노입자를 분산매에 재분산시키는 단계;
    (d) 상기 재분산된 나노입자 분산액 및 혈관내피성장인자(VEGF, vascular endothelial cell growth factor), 섬유아세포성장인자(FGF, fibroblast growth factor), 혈소판유래성장인자(PDGF, platelet-derived growth factor) 또는 이의 조합의 용액을 혼합하여 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합을 상기 나노입자에 충진시키는 단계로서, 상기 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합은 나노입자에 있는 다당류 분자에 특이적으로 비공유결합되고;
    (e) 상기 VEGF, FGF, PDGF 또는 이의 조합이 충진된 나노입자 분산액을 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자 용액에 분산시키는 단계; 그리고,
    (f) 상기 단계 (e)의 결과물에 가교제, 가교활성제 및 물리적 가교인자로 구성된 군으로 선택되는 가교인자를 제공하여 상기 생체적합성 고분자를 가교시켜 제2수화젤을 형성시키는 단계.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 코어를 형성하는 생분해성 고분자는 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산), 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시부틸레이트) 및 폴리(하이드록시발러레이트)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 코어 상에 형성된 생체적합성 고분자로 이루어진 제1수화젤은 폴락사머, 폴락사민, 폴리(비닐 알코올), 알킬 알코올의 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 및 플루론으로 구성된 군으로부터 선택되는 생체적합성 고분자 유화제로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자 유화제는 폴락사머 또는 폴락사민인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 삭제
  17. 제 11 항에 있어서, 상기 다당류 분자는 헤파린인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 11 항에 있어서, 상기 제2수화젤을 형성하는 세포부착능을 가지는 생체적합성 고분자는 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산 또는 알지네이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 피브리노겐인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 11 항에 있어서, 상기 나노입자는 직경이 400 nm 이하이고 표면전하가 -40 mV 이하이며 다분산 지수가 0.1 이하인 것임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 11 항에 있어서, 상기 세포부착성을 가지는 생체적합성 고분자 용액 및 가교인자의 사용량은 제2수화젤의 탄성강도(elastic modulus, G')가 1,000-10,000 Pa이 되는 양인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 상기 가교활성제는 트롬빈인 것을 특징으로 하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2011133685A2 (en) * 2010-04-21 2011-10-27 President And Fellows Of Harvard College Nanoparticle targeting to ischemia for imaging and therapy
WO2012162555A2 (en) * 2011-05-24 2012-11-29 The Regents Of The University Of California Heparin nanoclusters
KR101983653B1 (ko) * 2015-04-14 2019-05-29 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 관절강 투여 약물용 담체
WO2017077066A1 (en) * 2015-11-06 2017-05-11 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Composition comprising a biocompatible and biodegradable polymer, nanocarries and a drug and methods of making and using the same
CN116284866B (zh) * 2023-03-31 2023-10-27 南方医科大学口腔医院 一种负载纳米木质素-纳米铌复合材料的水凝胶及其制备方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001233786A (ja) 2000-02-28 2001-08-28 Ltt Institute Co Ltd ヘパリン結合性成長因子用徐放基材、およびヘパリン結合性成長因子徐放剤
KR20030082017A (ko) * 2002-04-15 2003-10-22 노인섭 약물방출 능을 가진 생분해성 고분자를 이용한 조직공학용생분해성 고분자 지지체 및 그의 제조 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001233786A (ja) 2000-02-28 2001-08-28 Ltt Institute Co Ltd ヘパリン結合性成長因子用徐放基材、およびヘパリン結合性成長因子徐放剤
KR20030082017A (ko) * 2002-04-15 2003-10-22 노인섭 약물방출 능을 가진 생분해성 고분자를 이용한 조직공학용생분해성 고분자 지지체 및 그의 제조 방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101288474B1 (ko) 2011-11-08 2013-07-26 광주과학기술원 헤파린 친화성 생물질의 방출 조절방법

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