KR100834731B1 - A use of amnion as a substrate or basement membrane for cell culture, the method for preparing them and the use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체 소재인 양막 위에 각종 상피성 조직을 배양한 생인공 조직의 제조와 세포치료제로서의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 조직으로부터 자가세포를 분리하여 이를 태반으로부터 분리한 양막 위에 배양, 증식시킨 형태의 인공조직을 제공한다. 본 발명의 인공조직은 피부의 경우 심부 2도 이상의 화상, 각막의 경우 각막 이식을 필요로 하는 상처에 면역거부반응 없이 직접 적용이 가능하다. 이러한 기술은 양막을 각종 상피성 세포 배양에 대한 기저막으로서 이용함에 따라 최종 세포배양 후 플레이트로부터 세포를 분리할 필요가 없으며, 따라서 기존 배양 방법에 사용되던 세포 분리를 위한 효소의 사용 필요성이 없으며, 이에 따른 세포 손상이 없는 잇점을 제공한다. 또한 세포 배양의 기질로서 양막을 이용함에 따라 기존 피부 화상치료 방법인 바세린 거즈에 고정하는 방법과 비교하여, 물리적인 강도가 우수함에 따라 상처부위 적용시 수포의 형성이 없는 적절한 시술이 용이하며, 아울러 양막을 이용함에 따라 보다 높은 생착율을 가지며, 양막 자체의 상처 치유 촉진 효능을 갖는 잇점을 제공한다.
The present invention relates to the production of bio-artificial tissue cultured on amnion, which is a biological material, and its use as a cell therapy. More specifically, the present invention relates to separating autologous cells from tissues and culturing and proliferating them on the amnion separated from the placenta. Provides artificial tissue in form. Artificial tissues of the present invention can be applied directly to the wound of more than 2 degrees deep in the case of the skin, in the case of the cornea without a immunorejection reaction to the wound requiring corneal transplantation. This technique eliminates the need to separate cells from the plate after the final cell culture as the amnion is used as a base membrane for various epithelial cell cultures, thus eliminating the need for the use of enzymes for cell separation used in conventional culture methods. It provides the benefit of no cell damage. In addition, the use of amnion as a substrate for cell culture, compared to the method of fixing to petrolatum gauze, which is a conventional method for treating skin burns, has excellent physical strength, making it easy to perform appropriate procedures without formation of blisters when applying wounds. The use of amnion provides a higher engraftment rate and provides the benefit of promoting wound healing of the amnion itself.
양막, 기저막, 상피조직, 생인공조직, 세포치료제, 자가세포Amniotic membrane, basement membrane, epithelial tissue, bioartificial tissue, cell therapy, autologous cell
Description
도 1a 는 양막의 상피세포를 제거하기 전의 양막 표피면의 주사식 전자현미경 사진이고,Figure 1a is a scanning electron micrograph of the surface of the amniotic epithelium before removal of epithelial cells of the amnion,
도 1b 는 본 발명의 양막의 상피세포를 제거한 후의 양막 표피면의 주사식 전자현미경 사진이고,Figure 1b is a scanning electron micrograph of the surface of the amniotic membrane after removing the epithelial cells of the amniotic membrane of the present invention,
도 2a 는 양막의 상피세포를 제거하기 전의 양막 단면에 대한 투과식 전자현미경 사진이며,Figure 2a is a transmission electron micrograph of the cross-section of the amnion before removal of epithelial cells of the amnion,
도 2b 는 본 발명의 양막의 상피세포를 제거한 후의 양막 단면에 대한 투과식 전자현미경 사진이며,Figure 2b is a transmission electron micrograph of the amnion cross-section after removal of the epithelial cells of the amnion of the present invention,
도 3 은 본 발명의 양막의 상피세포를 제거한 후 인체 피부 각질세포를 배양한 조직검사(H&E 염색) 사진이고,3 is a histology (H & E staining) photograph of cultured human skin keratinocytes after removing the epithelial cells of the amniotic membrane of the present invention,
도 4a 는 외식 방법(explantation method)에 의해 토끼의 각막 윤부(limbal) 로부터 자라나오는 각막 상피세포에 대한 전자 현미경 사진이고,FIG. 4A is an electron micrograph of corneal epithelial cells growing from the corneal limbal of a rabbit by an explantation method, FIG.
도 4b 는 본 발명의 양막 위에 각막 윤부로부터 분리되어 배양된 각막상피세포의 침수 배양 1일째의 전자현미경 사진이며, Figure 4b is an electron micrograph of the first day submerged culture of corneal epithelial cells cultured separated from the corneal limbal on the amniotic membrane of the present invention,
도 4c 는 본 발명의 양막 위에 각막 윤부로부터 분리되어 배양된 각막상피세포의 기-액 배양 실시 7일째의 세포 분화 형태를 관찰한 조직검사 (H&E 염색)사진이고, 4C is a histological examination (H & E staining) photograph of the cell differentiation pattern of the gas-liquid culture on day 7 of corneal epithelial cells separated and cultured from the corneal limbus on the amnion of the present invention.
도 5 는 본 발명의 양막 위에 모낭으로부터 분리된 외측모근초 줄기세포를 이용하여 배양 표피로의 분화된 형태를 관찰한 조직검사 (H&E 염색) 사진이다.
5 is a biopsy (H & E staining) photograph of the morphology of the cultured epidermis using lateral hairy stem cells isolated from hair follicles on the amniotic membrane of the present invention.
본 발명은 태반으로부터 분리된 생체 소재인 양막상에 각종 상피조직세포를 배양한 것을 특징으로 하는 생인공조직의 제조 방법과 이의 세포치료제로서의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing bio-artificial tissue characterized by culturing various epithelial tissue cells on amnion, a biological material separated from the placenta, and to a use thereof as a cell therapeutic agent.
일반적으로, 2도 이내의 가벼운 화상의 경우처럼 피부의 손상이 표피에 국한될 경우에는 피부조직의 재생이 가능하지만 화상이 진피 심층부, 혹은 피하에 미친 경우 손상의 정도에 따라서는 상처부위에 피부 자체 재생능력이 없어져 버리는 경우가 있다. 이 경우에는 환자의 화상을 입지 않은 부분으로부터 피부를 채취하여 상처부위에 옮겨주는 피부이식수술이 필요하게 된다. 채취하는 피부의 두께는 피부 이식을 실시하는 부위와 상처의 정도에 따라서 결정되며, 1회의 수술로 체표면의 20%~30%에 해당하는 피부이식술도 행해지지만 수상면적이 그 이상이 되면 몇 회를 나누어 수술을 해야 하며 그에 따른 기간이 길어진 만큼 감염증을 일으키어 생명을 잃는 위험이 증가하게 된다. 또한 수상면적의 증대는 피부의 채취 가능한 면적의 감소를 의미해 피부를 채취한 후에 피부가 재생되는 것을 2주 정도 기다려 재차 피부를 채취하는 경우도 있다. 화재 등의 사고에 의한 체표면의 60%에 3도 화상을 입은 경우 남은 40%의 체표면도 어느 정도의 손상을 입는 경우가 많아서 충분히 피부를 채취하는 것이 불가능하여 생존율은 더욱 낮아져 버리는 것이 현실이며, 타인의 피부가 사용되는 경우 장기이식과 같은 거부 반응이 올 수 있으므로 전신적 또는 국소적으로 면역억제제를 사용하는데 이러한 약으로 인한 부작용이 올 수 있다. 그래서 이러한 현재의 치료기술은 좀 더 발전되어야 할 필요에 당면해 있으며, 이러한 소망을 현실적으로 가능하게 하여 줄 수 있는 학제간의 공동 연구 분야로 대두된 기술이 조직공학(Tissue Enginnering)이다. 현재 미국의 경우 조직이나 장기의 결함으로 고통받는 환자의 치료비가 매년 4천억 달러가 넘고, 수술횟수도 8백만 건 이상이 된다고 한다. 현재 추산으로는 조직공학 제품의 시장수요는 매년 800억불 규모로 보고되고 있다(Nurem et al.; Tissue Enginneering 1.3(1995)). 1980년대에 집중적으로 개발되기 시작한 생인공피부 (bioartificial skin)가 미국의 벤처기업인 오가노제네시스 (Organogenesis) 회사에 의해 1988년에 미국 FDA로부터 판매승인을 얻어 시판되어 임상에 이용된 후로, 현재 약 20여 가지의 다른 인체조직으로부터 유래된 조직공학제품이 연구개발 또는 임상실험에 들어가 있다. In general, when the skin damage is limited to the epidermis, such as a mild burn of less than 2 degrees, the skin tissue can be regenerated, but when the burn is in the deep dermis or subcutaneous, depending on the extent of the damage, the skin itself The regeneration ability may be lost. In this case, skin graft surgery is needed to remove the skin from the unburned part of the patient and transfer it to the wound. The thickness of the skin to be taken is determined by the area where the skin is transplanted and the extent of the wound. Skin grafts, which are 20% to 30% of the surface of the body, are performed in a single operation, but a few times after the water surface is over Surgery should be divided and accordingly the longer the duration of the infection will cause an increase in the risk of losing life. In addition, the increase in the water surface area means a reduction in the amount of skin that can be collected. In some cases, the skin may be collected again after waiting for two weeks for the skin to regenerate. If a third degree burn occurs on 60% of the body surface due to an accident such as a fire, the remaining 40% of the body surface is often damaged to some extent, and it is impossible to collect enough skin, so the survival rate is even lower. For example, when the skin of another person is used, rejection reactions such as organ transplantation may occur, and therefore, systemic or local immunosuppressive drugs may be used. Hence, these current therapeutic technologies are in need of further development, and tissue engineering (Tissue Enginnering) is emerging as an interdisciplinary field of research that can make this hope realistic. Currently in the United States, treatment costs for patients suffering from tissue or organ defects exceed $ 400 billion annually and over 8 million operations. The current estimated market demand for tissue engineering products are reported each year to 800 billion US dollars in size (Nurem et al;. Tissue Enginneering 1 .3 (1995)). Bioartificial skin, which began to be intensively developed in the 1980s, was marketed and clinically used by the US FDA in 1988 and marketed by the US venture company, Organogenesis, in 1988. Tissue engineering products derived from several different human tissues have been incorporated into research and development or clinical trials.
일본에서는 1988년 마리아나 (Marianna) 대학 의학부 성형외과에서 쿠마가이 등도 표피조직을 이용한 피부 조직편을 실제 치료에 이용하여 좋은 임상결과를 얻었음을 보고하였다(Kumagai et al.; Plast. Reconstruc. Surg., 82, pp99-108, 1988). 이들은 화상환자의 표피조직을 마우스 3T3 세포주와 함께 배양하여 2~3주만에 350~2250cm2의 조직을 만들어 화상부위에 이식하여 오염되지 않고 상처부위에 잘 생착하였음을 보고하였다. 또한 1995년 교토 (Kyoto) 대학의 스즈키 등은 야나스 (Yannas)와 버크 (Burke)의 전형적인 콜라겐 스폰지를 안쪽층으로하고 바깥층에는 실리콘막을 조합한 이층구조의 인공피부를 제조하여 23명의 환자에 임상시술을 한 바있다(Suzuki et al.; Br. J. Plast. Surg., 48, pp222-229, 1995).In 1988, Kumagai et al . Reported that the skin tissue using epidermal tissue was used for the actual treatment at the Department of Plastic Surgery, Mariana University Medical School in 1988 (Kumagai et al .; Plast.Reconstruc. Surg., 82) . , pp 99-108, 1988). They report that the epidermal tissue of burn patients with the mouse 3T3 cell line made 350 ~ 2250cm 2 tissue in 2-3 weeks and transplanted to the burned area, which was well adhered to the wounded area. In 1995, Suzuki et al. At Kyoto University prepared a two-layered artificial skin with typical collagen sponges from Yanas and Burke as the inner layer and a silicone film on the outer layer. (Suzuki et al .; Br. J. Plast. Surg., 48, pp222-229, 1995).
미국의 U.C 샌디에고 대학 의학센터의 보이스 (Boyce)는 1980년대 초부터 인공피부 연구에 관련된 제안을 많이 한 것으로 유명한데, 인체 피부의 각질세포 배양을 위한 무혈청배지의 조성을 개발하고 이를 통한 각질세포의 장기배양, 냉동저장 등에 대해 꾸준히 연구결과를 발표하고 있다. 특히 글리코사미노글리칸 (Glycosaminoglycans, GAGs)를 콜라겐의 다공성 복합막에 적용하여 인체 각질세포의 배양을 위한 인공피부의 진피 지지층으로 사용하였다. Boyce of the University of UC San Diego Medical Center, USA, is famous for making numerous proposals related to artificial skin research since the early 1980s. He developed a serum-free medium for culturing keratinocytes in human skin, and through which he developed organs of keratinocytes. The research results are steadily published in culture and freezing storage. In particular, glycosaminoglycans (Glycosaminoglycans, GAGs) were applied to the porous composite membrane of collagen and used as a dermal support layer of artificial skin for culturing human keratinocytes.
또한 국내에서도 환자의 표피 일부를 분리 및 배양하여 이를 다시 환자 자신에게 이식하는 배양피부에 대한 상품화가 진행 중이며, 자가세포치료제로서의 품목허가 및 임상시험 진행 중에 있다.In Korea, commercialization of cultured skin that separates and incubates a part of the patient's epidermis and transplants it back to the patient himself is in progress.
이러한 배양피부 또는 표피의 분리 및 배양 기술은 1980년 미국의 하워드 그 린 (Howard Green) 박사에 의한 개발된 방법으로서 환자의 표피 일부를 분리 및 배양하여 제조된 배양피부는 이식 후 환자 자신의 체액으로부터 영양분을 흡수해 분열, 증식을 재개하여 창상부위의 피하조직과 부착하면서 다층화된 표피를 갖는 것으로 체액 증발, 병원균 감염 등의 방어보호 및 이식된 자가표피세포에 의한 상처재생을 촉진하게 된다. 그러나 이러한 기술의 경우 훌륭한 방법임에도 불구하고 실제 임상 적용시 다음과 같은 단점을 가지고 있다.This cultured skin or epidermal separation and culture technology was developed in 1980 by Dr. Howard Green of the United States. The cultured skin produced by separating and culturing a part of the epidermis of the patient was recovered from the patient's own body fluid after transplantation. It absorbs nutrients, resumes division and proliferation, attaches to the subcutaneous tissue of the wound area, and has a multilayered epidermis, which promotes protection against body fluid evaporation, pathogen infection, and wound regeneration by transplanted autologous epidermal cells. However, this technique, despite its excellent method, has the following disadvantages in actual clinical application.
표피세포의 배양 후 디스파제(Dispase) 등의 효소처리를 통해 떼어낸 배양피부는 시술시 말리거나 찢어지는 단점을 보강키 위해 물리적강도 보완을 위한 보강재로서 바세린(vaselin) 가제를 배양표피의 각질층에 금속 크립으로 고정을 한 후 운반되며, 이식술시 바세린 가제를 외측(상처반대면)으로 하여 창상부위에 대고 밀착성을 유지하기 위해 가제와 함께 봉합을 하게 된다. 그러나 이러한 보강재로서의 바세린 가제는 배양표피의 운반 용이성, 의사의 시술조작 용이성을 위한 보강재이지 배양피부 자체의 기계적 강도를 개선하기 위한 것은 아니므로, 배양피부가 창상에 완전히 부착할 때까지의 기간, 외부로부터 가해지는 기계적인 힘에 약하다는 단점이 지적되고 있으며, 이러한 이유 때문에 환자는 이식피부위가 위쪽으로 가도록 하여 침대에 누워있어야 하며, 한번에 가능한 이식 면적에 한계가 있음으로, 예를 들면 가슴의 식피가 붙고 나서 등(back)을 하는 등 수술 일정이 길어지는 단점을 갖게 된다. After culturing the epidermal cells, the cultured skin separated through enzyme treatment such as dispase is applied to the stratum corneum of the epidermis as a reinforcing agent to supplement the physical strength to reinforce the disadvantages of drying or tearing during the procedure. It is transported after fixation with a metal creep, and the petrolatum gauze is lateral (wound opposing) at the time of implantation, and it is sealed together with the gauze to maintain adhesion to the wound site. However, the petrolatum gauze as a reinforcing material is a reinforcing material for the ease of transport of the culture epidermis and the manipulation of the doctor's procedure, not for improving the mechanical strength of the cultured skin itself. It is pointed out that it is weak to the mechanical force exerted from it. For this reason, the patient should lie in bed with the transplanted skin facing upwards, and there is a limit to the area of transplantation possible at one time, There is a disadvantage that the operation schedule is long, such as back after attaching.
또한 기존 배양피부의 경우, 생체내 시험(in vivo)의 기저막 성분이 없으며, 배양피부의 분리시 효소를 처리함에 따른 세포 손상이 있으며, 내구성이 약함에 따 라 이식술이 불편하며, 창상과 배양피부 사이에 수포가 형성되고, 생착율이 낮은 단점이 있으며, 이에 대한 해결 방안이 요구된다.In addition, existing cultured skin does not have a basement membrane component in an in vivo test, there is cell damage due to enzyme treatment when separating the cultured skin, and transplantation is inconvenient due to its weak durability, wounds and cultured skin. Blisters are formed in between, and the engraftment rate is low, there is a need for a solution.
따라서, 배양피부의 기계적 강도를 증가시키면서도 창상에 대한 좋은 생착율을 갖는 보다 적극적인 상처 치유 효과와 더불어 피부의 기저막 성분이 포함된 생체적합성 배양표피의 개발이 오래동안 희구되어 왔다.Therefore, the development of a biocompatible culture epidermis containing a basement membrane component of the skin with a more active wound healing effect having a good engraftment rate to the wound while increasing the mechanical strength of the culture skin has long been desired.
본 발명자의 연구팀은 이미 콜라겐 실을 망사(mesh)형태로 제조하여 이를 콜라겐 스폰지에 삽입함으로써 인장강도가 크게 개선된 강화형 콜라겐 스폰지를 제조한 바 있으며(한국특허 출원공고번호 제 2002-0304348호), 또한 생체소재인 양막과 생분해성 고분자로 구성된 이식용 진피대체물을 개발한 바 있는데(한국특허 출원공고번호 제2002-0059308호), 이에 대한 연구를 더욱 진전시켜, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 태반에서 분리된 생체소재인 양막을 이용하여 양막 위에 상피조직세포를 배양한 후 양막을 포함하여 창상에 이식하는 것으로서, 배양상피세포의 분리를 위하여 효소를 이용할 필요가 없으며, 양막 자체의 훌륭한 내구성과 좋은 생착율을 가진 보다 적극적인 창상 치유 효과를 가진 기저막이 포함된 배양피부를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
The research team of the present inventors have already produced the collagen yarn in the form of a mesh (mesh) and inserted it into the collagen sponge to prepare a reinforced collagen sponge with a greatly improved tensile strength (Korean Patent Application Publication No. 2002-0304348) In addition, there has been developed a dermal replacement for implants consisting of biomaterials of amniotic membrane and biodegradable polymers (Korean Patent Application Publication No. 2002-0059308), and further the research on this, the present inventors have solved the problem In order to cultivate epithelial tissue cells on the amniotic membrane using the amniotic membrane, a biomaterial separated from the placenta, and transplant them into the wound, including the amniotic membrane, there is no need to use enzymes for the separation of cultured epithelial cells, By developing cultured skin containing a basement membrane with a more aggressive wound healing effect with durability and good engraftment rate The invention has been completed.
따라서 본 발명의 목적은 배양된 상피 조직의 제조에 있어 생체적합성이 우수한 양막을 이용함으로써 좋은 내구성과 생착율을 가진, 보다 적극적인 창상 치유 효과를 가진 기저막 성분이 포함된 배양상피 조직을 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a cultured epithelial tissue containing a basement membrane component having a more active wound healing effect, having good durability and engraftment rate, by using amnion membranes having excellent biocompatibility in the production of cultured epithelial tissue.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 태반으로부터 분리된 생체적합성 양막과 이를 이용한 각종 세포 배양을 특징으로 하는 배양된 세포치료제의 제조 방법 및 이의 용도를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a biocompatible amnion separated from the placenta and a method for producing a cultured cell therapeutic agent characterized by various cell cultures using the same and its use.
또한, 상기 배양되는 세포는 각질형성세포, 연골세포, 골세포, 섬유모세포, 근육세포, 각막세포, 각막간세포, 모발간세포(외측모근초 줄기세포)로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되는 것을 포함한다.In addition, the cultured cells include one or more selected from the group consisting of keratinocytes, chondrocytes, bone cells, fibroblasts, muscle cells, corneal cells, corneal stem cells, hair stem cells (outer hair root stem cells).
상기 양막은 인양막, 소양막, 돼지 양막 등이 사용될 수 있으며, 양막 구조물의 형태는 더블링(double ring), 인서트(insert) 또는 실리콘 링(ring)을 이용한 막(sheet) 형태 구조물 또는 망사(mesh) 형태 구조물 또는 각막 치료를 위한 트레판과 같은 천공된 형태로 제조될 수 있으며, 이의 구조물 위에 세포를 배양하는 것을 포함한다.The amniotic membrane may be used for amnion, small amniotic membrane, porcine amnion, etc., and the amnion structure may be a sheet-like structure or mesh using a double ring, an insert, or a silicon ring. ) Form can be prepared in a perforated form, such as trepan for the treatment or corneal treatment, including culturing cells on the structure.
본 발명의 양막을 이용한 배양된 세포 조직을 제조하기 위해서는, 기저막 성분이 보존된 상태의 세포 기질로서의 양막을 제조한 후, 세포를 배양하는 것으로서 그 과정은 다음과 같다.In order to manufacture cultured cell tissues using the amnion of the present invention, after amnion is prepared as a cell substrate in which the basal membrane components are preserved, the cells are cultured as follows.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
각종 상피성 조직의 재생에 있어서 기저막(basement membrane)의 중요성은 널리 알려져 있다. 그러나 세포 분화에 대한 기저막의 역할이나 성분에 대한 정보는 아직 밝혀지지 않은 것이 많은 실정이다. 피부의 기저막이나 각막의 두 기저막인 보우만씨 막(Bowman's membrane) 및 데스메트 막(Descemet's membrane) 또한 인 위적으로 만들 수 없는 것이 현실이다. The importance of the basement membrane in the regeneration of various epithelial tissues is well known. However, information on the role and composition of the basement membrane for cell differentiation is still unknown. The reality is that neither the basement of the skin nor the two basements of the cornea, the Bowman's membrane and the Desmet's membrane, can be made artificially.
따라서 본 발명은 기저막 성분이 보존된 상태의 양막에 세포를 배양함으로써 기존 세포에 의한 치료 효과에 더하여 양막 자체의 특성을 이용한 치료 효과를 향상시킨 데에 그 특징이 있다. Therefore, the present invention is characterized by culturing cells in the amniotic membrane in which the basal membrane components are preserved, thereby improving the therapeutic effect using the properties of the amniotic membrane itself in addition to the therapeutic effect by existing cells.
본 발명의 배양 세포기질로서의 양막은 (a) 기저막이 보존된 상태로 양막을 처리하는 단계 및 (b) 상기 처리된 양막에 세포를 배양하는 단계를 필수적으로 포함하는 제조공정에 의해 제조될 수 있다.The amniotic membrane as a cultured cell substrate of the present invention can be prepared by a manufacturing process comprising essentially (a) treating the amniotic membrane with the base membrane preserved and (b) culturing the cells on the treated amniotic membrane. .
또한 본 발명의 양막은, (a)단계에서 기저막이 보존된 상태로 양막을 처리한 후, (c)양막 자체의 표피세포를 제거하는 단계, (d)상기 양막에 가교처리하는 단계 또는 (e)상피세포의 원할한 부착을 위하여 콜라겐 또는 생체활성인자 등으로 양막을 코팅처리하는 단계로부터 선택된 하나이상의 단계를 연속적으로 수행한 다음. 상기 (b)단계의 양막에 세포를 배양하는 단계를 수행하는 것을 필수적으로 포함하는 제조공정에 의해 제조될 수 있다.In addition, the amniotic membrane of the present invention is treated with the amniotic membrane in a state in which the basal membrane is preserved in step (a), (c) removing the epidermal cells of the amnion itself, (d) crosslinking the amniotic membrane or (e) ) One or more steps selected from the step of coating the amnion with collagen or a bioactive factor, etc., for successive attachment of epithelial cells, are successively performed. It may be prepared by a manufacturing process essentially comprising performing the step of culturing the cells on the amniotic membrane of step (b).
구체적으로, (a)단계의 사용 가능한 양막은 기저막 성분이 잘 보존되어 있으며, 세포가 잘 부착하여 증식 및 분화할 수 있는 기질로서의 역할을 하여야 하며, 이식 후 염증반응이나 이물반응을 일으키지 않도록 면역학적으로 불활성이어야 하며, 일정기간 지난 후에는 스스로 분해, 흡수되어 이물질로 남지 않아야 한다.Specifically, the available amniotic membrane in step (a) is well preserved in the basement membrane components, and should serve as a substrate for proliferation and differentiation of cells with good adhesion, and to prevent inflammatory or foreign body reaction after transplantation. It should be inert, and after a certain period of time it should not decompose and absorb itself and remain as foreign matter.
본 발명의 양막은 사람, 소, 돼지, 말, 양, 개, 토끼 또는 쥐 등으로부터 유래되며, 바람직한 실시예에서는 산모의 제왕절개시 자연적으로 적출되는 태반으로부터 인양막을 분리하여 사용하였다. Amniotic membrane of the present invention is derived from humans, cows, pigs, horses, sheep, dogs, rabbits or rats, etc. In a preferred embodiment, the salvage membrane was separated from the placenta which is naturally extracted during cesarean section of the mother.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 하나의 실시형태에 따르면, 세포 배양 기질로서 사용하기 위하여 양막의 상피세포를 제거하는 (c)단계가 제공된다.In order to achieve the above object, according to one embodiment of the present invention, step (c) of removing the epithelial cells of the amnion for use as a cell culture substrate is provided.
본 발명에 의한 양막의 상피세포 제거 단계에서, 태반으로부터 양막을 분리한 후, 단백질 분해 효소를 처리하거나 또는 용액의 이온강도를 변화시키거나 또는 계면활성제를 처리하여 상피세포를 제거하는 것이 바람직하다.In the epithelial cell removal step of the amnion according to the present invention, after the amnion is separated from the placenta, it is preferable to remove the epithelial cells by treating proteolytic enzymes, changing the ionic strength of the solution, or treating the surfactant.
이때 사용 가능한 단백질 분해 효소로는 트립신, 디스파아제(dispase) 등의 단백질 분해 효소를 이용하는 것이 가능하며, 용액의 이온강도 변화를 위해서는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 1몰 이상의 염화나트륨을 이용하는 것이 가능하다. 또한 세포막의 주성분이 인지질로 구성됨에 따라 여러 가지 계면활성제를 이용하여 조직의 손상없이 세포를 제거할 수 있으며, 이를 위하여 소듐도데실설페이트(SDS)와 같은 이온성 계면활성제 또는 트윈20 (Tween20), 트윈40, 트윈60, 트윈80, 트리톤 엑스-100과 같은 비이온성 계면활성제 등이 이용가능하다.Proteolytic enzymes can be used as proteolytic enzymes such as trypsin and dispase, and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and one or more moles of sodium chloride can be used to change the ionic strength of the solution. Do. In addition, since the main component of the cell membrane is composed of phospholipids, various surfactants can be used to remove cells without damaging the tissues. For this purpose, ionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate (SDS) or Tween20, Nonionic surfactants such as Tween 40, Tween 60, Tween 80, and Triton X-100 are available.
또한 본 발명의 또 다른 실시 형태에 따르면, 인체 이식시 분해되는 시간을 늦추기 위하여 양막을 종래의 가교 방법으로 가교시킴으로써 인체 이식시 생분해도를 지연시키는 (d)단계가 제공된다.According to yet another embodiment of the present invention, a step (d) of delaying biodegradation during human transplantation is provided by crosslinking amnion with a conventional crosslinking method in order to slow down the time of decomposition during human transplantation.
본 발명에 의한 가교처리 단계는 종래의 가교 방법인 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 나 1,3-카보디이미드(1,3-carbodiimide), 헥사메틸렌 디이소시아네이트(hexamethylene diisocyanate) 또는 글루코스(glucose), 리보오스(ribose), 디오스(diose), 트리오스(triose), 테트로스(tetrose), 펜토스 (pentose), 헥소스(hexose), 셉토스(septose), 옥토스(octose), 나노스(nanose), 데코스(decose), 글리세로스(glycerose), 트레오스(threose), 에리트로스 (erythrose), 리소스(lyxose), 자일로스(xylose), 아라비노스(arabinose), 알로오스 (allose), 알트로스(altrose), 만노스(mannose), 이도스(idose), 굴로스 (gulose), 갈락토스(galactose), 탈로스(talose) 등의 당을 이용함으로써 가교하는 것이 가능하다.Crosslinking step according to the present invention is a conventional crosslinking method of glutaraldehyde or 1,3-carbodiimide, hexamethylene diisocyanate or glucose (glucose), ribose (ribose), diose, triose, tetrose, pentose, hexose, septose, octose, nanos, Decose, glycerose, threose, erythrose, lyxose, xylose, arabinose, allose and altrose It is possible to crosslink by using sugars such as altrose, mannose, idose, gulose, galactose, and talos.
또한 본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 콜라겐 또는 생체 활성인자로 양막을 코팅함으로써 세포 배양을 위한 기질로서 이용하는 (e)단계가 제공된다.According to yet another embodiment of the present invention, step (e) is provided for use as a substrate for cell culture by coating the amnion with collagen or bioactive factor.
본 발명의 양막의 콜라겐 코팅 단계는 상기의 처리에 의하여 상피세포가 제거된 양막 또는 상피세포가 제거되지 않은 양막에 세포 배양을 위한 세포의 원할한 부착을 위한 것으로, 타입-Ⅰ 또는 타입-Ⅳ 콜라겐을 산이나 염 수용액, 또는 중성 용액에 0.01%~0.3%(w/v) 농도로 녹인 후 양막에 코팅하여 얻을 수 있다. 이때 콜라겐으로는 생체 유래의 타입-Ⅰ 콜라겐을 산 처리하여 얻은 텔로 콜라겐(Telo collagen) 또는 펩신 처리하여 텔로머 부분을 제거한 아텔로 콜라겐 (Atelo collagen)이거나, 또는 이의 열변성처리를 한 젤라틴을 사용하는 것이 바람직하다.The collagen coating step of the amnion of the present invention is for the smooth adhesion of cells for cell culture to the amnion from which the epithelial cells have been removed or the amnion from which the epithelial cells have not been removed by the above treatment, type-I or type-IV collagen It can be obtained by dissolving in an acid or salt aqueous solution, or a neutral solution at a concentration of 0.01% to 0.3% (w / v) and coating it on the amnion. At this time, as collagen, telona collagen obtained by acid treatment of type-I collagen derived from a living body, or atelo collagen from which telomer was removed by pepsin treatment, or gelatin subjected to heat denaturation thereof is used. It is desirable to.
또한, 본 발명에서는 양막의 세포배양 기질로서 뿐만 아니라 상처 치유 드레싱으로서의 상처 치유에 대한 상승 효과를 높이기 위하여 바람직하게 첨가될 수 있는 각종 생체 활성 인자를 양막에 처리하는 단계를 제공한다. The present invention also provides a step of treating the amnion with various bioactive factors, which may be preferably added to enhance the synergistic effect on wound healing as a cell culture substrate of the amnion as well as as a wound healing dressing.
이러한 생체 활성 인자는 각각의 적당한 용매에 녹여 사용 가능하며, 각각의 사용 농도는 배양되는 세포의 종류, 치료를 목적으로 하는 경우는 적용 부위 및 상 처 종류 등에 따라 적절하게 조절하는 것이 바람직하다.Such bioactive factors can be used after being dissolved in each appropriate solvent, and the concentration of each is preferably adjusted according to the type of cells to be cultured and the treatment site and the type of injury.
이러한 각종 생체 활성인자로는 파이브로넥틴, 비트로넥틴, 각질세포 성장인자 (keratinocyte growth factor ; KGF), 표피세포 성장인자 (epidermal growth factor ; EGF), 혈소판유래 성장인자 (platelet-derived growth factor; PDGF), 혈관내피세포 성장인자 (vascular endothelial growth factor; VEGF), 산성 섬유아세포 성장인자 (acidic fibroblast growth factor; aFGF), 염기성 섬유아세포 성자인자 (basic fibroblast growth factor; bFGF), 형질전환 성장인자-α(transforming growth factor-α; TGF-α), 형질전환 성장인자-β(TGF-β), 신경세포 성장인자 (neuronal growth factor; NGF), 헤파린결합 EGF (heparin binding EGF), 인터페론 (interferons), 인슐린 유사 성장인자 (insulin-like growth factor; IGF), 조직활성화 펩티드 (tissue activating peptides), 인터루킨-1 (interlukin-1; IL-1), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 적혈구 조혈인자 (erythropoietin)를 들 수 있으며, 이들을 단독 또는 조합된 형태로 사용할 수 있다. Such bioactive factors include fibronectin, vitronectin, keratinocyte growth factor (KGF), epidermal growth factor (EGF), and platelet-derived growth factor (PDGF). ), Vascular endothelial growth factor (VEGF), acidic fibroblast growth factor (aFGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), transforming growth factor-α (transforming growth factor-α; TGF-α), transforming growth factor-β (TGF-β), neuronal growth factor (NGF), heparin binding EGF (heparin binding EGF), interferons, Insulin-like growth factor (IGF), tissue activating peptides, interlukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL -6), interleukin-8 (IL-8), erythropoietic factor (erythropoieti) n), and these may be used alone or in combination.
이렇게 제조된 양막 구조물의 형태는 더블링 (double ring), 인서트 (insert) 또는 실리콘 링 (ring)을 이용한 막 (sheet) 형태 구조물 또는 망사 (mesh) 형태 구조물 또는 각막 치료를 위한 트레판과 같은 천공된 형태로 제조될 수 있으며, 이의 구조물 위에 세포를 배양할 수 있다.The resulting amnion structures can be formed into a perforated sheet, such as a double ring, insert or silicone ring, or a meshed structure or a trepan for corneal treatment. It can be prepared in the form, and the cells can be cultured on its structure.
본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 상기 방법으로 얻어진 세포 기질로서의 양막에 인체각질형성세포, 연골세포, 골세포, 섬유모세포, 근육세포, 각막세포, 각막간세포 또는 모발간세포(외측모근초 줄기세포)를 배양하는 (b)단계가 제공된다. 상기 배양할 수 있는 세포는 환자의 자가세포 또는 검증된 타인 또는 포유류의 세포를 사용할 수 있다.According to another embodiment of the present invention, human keratinocytes, chondrocytes, bone cells, fibroblasts, muscle cells, corneal cells, corneal stem cells or hair stem cells (external hairy stem cells) Step (b) of culturing) is provided. The cells that can be cultured may use autologous cells of the patient or cells of others or mammals verified.
예를 들어, 인체 각질 세포를 배양하는 방법은 상기에서 제조된 양막을 인서트나 링을 이용하여 각질세포를 0.1~50×105세포/cm2로 접종하며, EGF와 BPE가 첨가된 K-SFM 배지에서 1주간 침수 배양하며, 표피의 각질화를 위하여 1mM의 CaCl2를 첨가한 배지조건에서 기-액 계면 배양을 2주간 실시한다. For example, in the method of culturing human keratinocytes, the amnion prepared above is inoculated with keratinocytes at 0.1 to 50 × 10 5 cells / cm 2 using an insert or a ring, and K-SFM to which EGF and BPE are added. Submerged culture for 1 week in the medium, gas-liquid interfacial culture is carried out for 2 weeks under the medium condition added with 1 mM CaCl 2 for keratinization of the epidermis.
단, 응급사용이 요구되는 경우 7일 이내 배양한 표피조직을 이식할 수 있다.However, if emergency use is required, cultured epidermal tissue can be transplanted within 7 days.
또한 각막세포 배양의 경우 상기에서 제조된 양막을 인서트나 링을 이용하여 0.1~50×105세포/cm2로 접종하며, BPE(Bovine pituitary Extract), 소 인슐린 (Bovine insulin), 히드로코르티손(Hydrocortisone), 소 트랜스페린 (Bovine transferrin), 마우스 EGF (Mouse EGF)가 첨가된 에피라이프 (Epilife, Cascade Biologics사) 배지에서 5일간 침수 배양하며, 12일간 기-액 계면 배양을 실시한다.In addition, in the case of corneal cell culture, the amnion prepared above is inoculated at 0.1 to 50 × 10 5 cells / cm 2 using an insert or a ring. ), Bovine transferrin, Mouse EGF (Mouse EGF) added to Epilife (Epilife, Cascade Biologics) medium for 5 days immersion culture, 12-day gas-liquid interface culture is carried out.
또한 인체 모낭세포인 외측 모근초 줄기세포(outer root sheath stem cell)는 실제 피부조직의 상피세포와 연결이 되어 있으며, 상피세포의 근원이 되는 세포가 모낭에 분포되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 외측모근초 줄기세포를 이용하여 양막 위에서 배양표피를 구성하였으며, 배양방법은 상기에서 제조된 양막을 인서트나 링을 이용하여 0.1~50×105세포/cm2로 접종하며, 보충제(supplement)가 첨 가된 무혈청배지(K-SFM)에서 2일간 침수 배양 후 칼슘농도를 단계적으로 증가시키면서 3일째부터 기-액 계면 배양을 실시함으로서 배양피부를 제조하였다. In addition, the outer root sheath stem cells, which are human hair follicle cells, are actually connected to epithelial cells of skin tissue, and cells known to be the source of epithelial cells are distributed in hair follicles. Therefore, cultured epidermis was formed on the amniotic membrane using lateral hair follicle stem cells, and the culture method was inoculated at 0.1 ~ 50 × 10 5 cells / cm 2 using the insert or ring, and supplemented with a supplement. Cultured skin was prepared by adding gas-liquid interfacial culture from day 3 with gradual increase of calcium concentration after 2 days immersion culture in added serum-free medium (K-SFM).
이러한 적용범위의 일례로 본 발명의 양막 위에 환자의 자가 세포를 이식하거나 또는 인체에서 분리된 줄기 세포주(stem cell) 또는 성체 세포주(adult cell)을 배양하거나 불멸화 세포주를 배양하는 기질로 사용될 수 있다.As an example of such an application, it may be used as a substrate for transplanting autologous cells of a patient on the amniotic membrane of the present invention or for culturing stem cells or adult cells isolated from the human body or culturing immortalized cell lines.
이러한 본 발명의 방법에 의하여 얻어지는 양막을 이용한 배양된 세포조직은 종래의 배양표피에 비해 세포 기질로서 양막을 사용함에 따라 보다 우수한 기계적 강도를 가지며, 또한 상처 적용시 생착율이 향상되며 수포가 형성되지 않는 장점을 가짐에 따라 상처 치유용 드레싱으로서 유용하게 사용할 수 있다.The cultured cell tissue using the amniotic membrane obtained by the method of the present invention has better mechanical strength by using the amniotic membrane as a cell substrate than the conventional cultured epidermis, and also the engraftment rate is improved and no blisters are formed when the wound is applied. As it has advantages, it can be usefully used as a dressing for wound healing.
본 발명은 상기의 제조방법에 의하여 제조된 생체적합성 양막에 세포가 배양된 것을 특징으로 하는 세포치료제를 제공한다.The present invention provides a cell therapy agent, wherein the cells are cultured on a biocompatible amnion prepared by the above method.
상기 세포치료제는 세포 배양한 양막을 창상에 적용시 양막면이 창상에 적용되거나 또는 배양된 세포면이 창상면에 부착 또는 이식될 수 있다.The cell therapeutic agent may be applied to the amniotic membrane wound on the wound when the cell cultured amniotic membrane is applied to the wound, or the cultured cell surface may be attached to or implanted on the wound surface.
본 발명의 인공조직은 피부의 경우 심부 2도 이상의 화상, 각막의 경우 각막 이식을 필요로 하는 상처에 면역거부반응 없이 적용이 가능하다. 이러한 기술은 양막을 각종 상피성 세포 배양에 대한 기저막으로서 이용함에 따라 최종 세포배양 후 플레이트로부터 세포를 분리할 필요가 없으며, 따라서 기존 배양 방법에 사용되던 세포 분리를 위한 효소의 사용 필요성이 없으며, 이에 따른 세포 손상이 없는 잇점을 제공한다. 또한 세포 배양의 기질로서 양막을 이용함에 따라 기존 피부 화상치료 방법인 바세린 거즈에 고정하는 방법과 비교하여, 물리적인 강도가 우수함에 따 라 상처부위 적용시 수포의 형성이 없는 적절한 시술이 용이하며, 아울러 양막을 이용함에 따라 보다 높은 생착율을 가지며, 양막 자체의 상처치유 촉진 효능을 갖는 잇점을 제공한다.Artificial tissues of the present invention can be applied to the wounds that require deeper than 2 degrees deep in the case of the skin, in the case of the cornea without the immunorejection of the wound. This technique eliminates the need to separate cells from the plate after the final cell culture as the amnion is used as a base membrane for various epithelial cell cultures, thus eliminating the need for the use of enzymes for cell separation used in conventional culture methods. It provides the benefit of no cell damage. In addition, the use of amnion as a substrate for cell culture, compared to the method of fixing to petrolatum gauze, which is a conventional skin burn treatment method, is superior in physical strength, and thus, it is easy to perform appropriate procedures without formation of blisters when applying wounds. In addition, the use of the amniotic membrane has a higher engraftment rate, and provides an advantage of promoting wound healing of the amniotic membrane itself.
본 발명의 기저막 성분이 보존된 상태의 양막에 세포를 배양함으로써 인공피부, 인공각막, 인공연골, 인공근육, 인공모발조직 등의 다양한 조직공학을 이용한 인공장기 제조 및 세포 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.By culturing the cells on the amniotic membrane in which the basal membrane component of the present invention is preserved, it is useful to manufacture artificial organs and develop cell therapeutic agents using various tissue engineering such as artificial skin, artificial cornea, artificial cartilage, artificial muscle, and artificial hair tissue. Can be.
이하, 본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 제한되지는 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the content of the present invention is not limited to the following examples.
<참조예 1> 양막의 제조 Reference Example 1 Preparation of Amniotic Membrane
양막은 국내법상 감염성 폐기물로 분류되어 있으며, 이의 안전성 확보를 위하여 일반적으로 적용되는 조직은행 규정에 준하여 태반 모체에 대한 혈청학적 스크리닝을 한 후, 정상인 경우에 한해 양막을 태반으로부터 분리하였으며, 분리된 양막을 항균-항진균제 (antibiotic-antimycotic) 1%가 함유된 500㎖ PBS에 넣어 4℃의 상태를 유지하여 운반하였다. 운반된 양막을 트립틱 소이빈 카제인 다이제스트 배지 (Tryptic soybean casein digest medium, Difco사)로 미생물 배양을 하였다. 배양은 최소 7일간 37℃의 온도로 배양하였다. 배양 후 미생물이 나올 경우 폐기하였다. 미생물이 발견되지 않은 양막을 혈액과 혈흔을 씻어내기 위하여 멸균된 생리 식염수 500㎖이 함유된 병에서 진탕기 (shaker)를 이용하여 회당 10분 동안 세척하였다. 3회 세척 후에 얇은 양막 만을 얻기 위해 12시간 동안 침지시켰으며, 침지 후 4회 세척을 하였다. 마지막 8회 세척시에 증류수로 세척을 하였다.
The amniotic membrane is classified as infectious waste under the domestic law, and serological screening of placental maternal body was performed in accordance with the commonly applied tissue bank regulations to ensure its safety, and then the amniotic membrane was separated from the placenta only in normal cases. Was carried in 500 ml PBS containing 1% antibiotic-antimycotic and maintained at 4 ° C. The transported amnion was cultured with microorganisms with Tryptic soybean casein digest medium (Difco). The culture was incubated at a temperature of 37 ° C. for at least 7 days. If microorganisms emerge after incubation, discard them. The amniotic membrane where no microorganisms were found was washed for 10 minutes using a shaker in a bottle containing 500 ml of sterile saline solution to wash off blood and blood stains. After washing three times, to obtain only a thin amnion was immersed for 12 hours, after immersion was washed four times. The last eight washes were washed with distilled water.
<실시예 1> 양막의 상피세포 제거Example 1 Epithelial Cell Removal of Amnion
태반으로부터 양막을 적당한 크기(2cm ×2cm)로 자른 후 100mm 디쉬(dish)에 고르게 펴고 0.05% 트립신/EDTA(SIGMA사, USA)을 37℃에서 30분간 처리한 후 스크래퍼(scrapper)를 이용하여 양막 상피세포를 제거하였다. 상피세포가 제거된 양막을 그리드(grid) 위에 올려 놓은 후, 이를 세포배양용 링(ring)으로 고정함으로써 세포 배양을 위한 기질로 사용하였다.Cut the amniotic membrane into a suitable size (2cm × 2cm) from the placenta, spread it evenly on a 100mm dish, treat 0.05% trypsin / EDTA (SIGMA, USA) at 37 ° C for 30 minutes, and then use amnion using a scraper. Epithelial cells were removed. The amnion from which epithelial cells were removed was placed on a grid and used as a substrate for cell culture by fixing it with a cell culture ring.
도 1a는 양막의 상피세포를 제거하기 전의 주사식 전자현미경 사진이며, 도 1b는 상기의 처리과정을 통하여 양막의 상피세포가 제거된 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 2a와 도 2b는 양막 단면에 대한 투과식 전자현미경 사진으로서, 상기의 처리 과정을 통하여 양막의 상피가 완전히 제거되었음을 확인하였다.
Figure 1a is a scanning electron micrograph before the epithelial cells of the amniotic membrane, Figure 1b was confirmed that the epithelial cells of the amnion were removed through the above process. 2A and 2B are transmission electron micrographs of the amnion cross section, and it was confirmed that the epithelium of the amnion was completely removed through the above treatment.
<실시예 2> 가교 처리된 양막 제조Example 2 Preparation of Crosslinked Amniotic Membrane
인체 이식시 생분해되는 시간을 지연시키기 위하여, 참조예 1과 실시예 1에서 제조된 양막을 -196℃ 내지 0℃의 초저온 냉동고에서 동결시킨 다음, 다시 36시간 이상 동결 건조시켰다. 동결 건조된 양막을 종래의 가교 방법 기술인 40% 에탄올에 33mM 1,3-카보디이미드(carbodiimide)를 녹인 가교시약에 담궈 가교 시킨 후, 0.1M Na2HPO4(pH 9.1)로 2시간동안 세척한다. 그리고 이를 증류수로 충분히 세척한 후 초저온 냉동고에서 동결 및 동결건조 처리하였다.
In order to delay the time of biodegradation during human transplantation, the amniotic membrane prepared in Reference Example 1 and Example 1 was frozen in an ultra-cold freezer at -196 ° C to 0 ° C, and then freeze-dried for at least 36 hours. The lyophilized amniotic membrane was crosslinked by dissolving 33 mM 1,3-carbodiimide in a crosslinking reagent dissolved in 40% ethanol, a conventional crosslinking method, and then washed with 0.1M Na 2 HPO 4 (pH 9.1) for 2 hours. do. And this was sufficiently washed with distilled water and then frozen and lyophilized in an cryogenic freezer.
<실시예 3> 콜라겐 코팅된 양막 제조Example 3 Collagen Coated Amniotic Membrane Preparation
콜라겐(Matrixen, 바이오랜드사)을 산 처리하여 얻은 텔로 콜라겐 또는 펩신 처리하여 텔로머 부분을 제거한 아텔로 콜라겐을 pH 3.0, 농도 0.3%(w/v)인 용액으로 제조한 뒤, 참조예 1과 실시예 1, 2에서 제조된 양막을 콜라겐 용액에 담구어 양막을 골고루 코팅이 되도록 하였다. 코팅이 된 양막을 클린벤치 (clean bench) 내에서 공기(air)를 통해 건조시켰으며, 방사선조사(감마 광선 조사, 5kGy, 광선원;Co60)방법으로 멸균 처리 하였다.
After telogen collagen obtained from acid treatment of collagen (Matrixen, Bioland Co., Ltd.) or pepsin treatment, telomer collagen from which telomer was removed was prepared in a solution having a pH of 3.0 and a concentration of 0.3% (w / v), followed by Reference Example 1. The amniotic membranes prepared in Examples 1 and 2 were soaked in the collagen solution so that the amnion was evenly coated. The coated amniotic membrane was dried by air in a clean bench and sterilized by irradiation (gamma light irradiation, 5 kGy, light source; Co60).
<실시예 4> 파이브로넥틴(fibronectin) 코팅된 양막 제조Example 4 Preparation of Fibronectin Coated Amniotic Membrane
참조예 1과 실시예 1에서 제조한 양막을 인산완충용액에 50ng/㎖ 농도로 희석한 파이브로넥틴(fibronectin) 용액에 담구어 코팅한 후, 이를 실시예 3에서와 동일한 과정으로 건조시켰다. 다만 멸균은 254nm의 UV를 24시간 동안 20cm의 거리를 두고 조사함으로써 살균 처리하였다.
The amniotic membranes prepared in Reference Example 1 and Example 1 were dipped in a fibronectin solution diluted to a concentration of 50 ng / ml in a phosphate buffer solution and coated, and then dried in the same manner as in Example 3. However, sterilization was sterilized by irradiating UV at 254 nm at a distance of 20 cm for 24 hours.
<실시예 5> 양막을 이용한 배양피부 제조Example 5 Preparation of Cultured Skin Using Amniotic Membrane
상기 실시예 1, 2, 3, 4에서 제조된 양막 위에 인체각질세포를 배양하여 배양표피를 제조하였다. Cultured epidermis was prepared by culturing human keratinocytes on the amnion prepared in Examples 1, 2, 3, and 4.
먼저, 인체의 신생아 표피조직을 6㎖의 디스파제(1mg/㎖) 효소 용액에 담가 4℃에서 13시간 처리하여 표피층과 진피층을 분리하였다. 표피층을 0.25% 트립신 3㎖에 넣고 37℃에서 20분간 처리한 후 DMEM 배지로 옮겨 충분한 파이펫팅 (pipetting)을 통해 각질세포를 분리하였다. 분리된 세포용액은 40×g에서 실온으로 10분 원심 분리 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, 이때 사용한 배지는 각질세포용 무혈청 배지인 K-SFM(GIBCO사, EGF, BPE 첨가됨)을 사용하였다. 또한 세포배양을 위하여, 3㎛ 세공(pore)의 폴리카보네이트 막이 달린 배양플레이트 인서트(millicell, Millipore사)를 6-웰 플레이트에 넣은 후, 인서트 위에 상기 실시예 1에서 제조된 양막을 올려 놓은 다음, 상기에서 일차배양된 각질세포를 그 위에 접종하였다. 직경 30㎜의 인서트 1개당 5×105 개의 각질세포를 양막 위에 접종하고, 인서트 안에는 각질세포용 무혈청 배지인 K-SFM(GIBCO사, EGF, BPE 첨가됨) 2㎖을, 밖에는 배지 3㎖로 채웠다. 이와 같이 만들어진 조직을 배지에 잠긴 상태로 1주일간 배양하면 각질세포가 자라서 표면을 가득 채우게 된다. 이 후 기-액 계면 배양시 EGF가 제외된 K-SFM(GIBCO사, supplemented with BPE, 1mM 칼슘)을 사용하였으며, 인서트 안의 배지를 제거하고 인서트 밖에만 배지를 채웠다. 이는 모든 영양성분 및 성장인자들은 인서트 아래쪽으로부터 양막을 통해 확산에 의해서 표피세포층에 전달되므로 생체표피와 유사한 환경이라고 볼 수 있으며, 이와 같이 대기상과 액체 배지의 경계면에서 2주일간 배양하여 각질세포를 다층으로 성장 및 분화시켰다.First, human epidermal tissue was soaked in 6 ml of dispase (1 mg / ml) enzyme solution and treated at 4 ° C. for 13 hours to separate the epidermal and dermal layers. The epidermal layer was placed in 3 ml of 0.25% trypsin, treated at 37 ° C. for 20 minutes, and transferred to DMEM medium to separate keratinocytes by sufficient pipetting. The separated cell solution was centrifuged at 40 × g for 10 minutes at room temperature, and then cultured in a 37 ° C. and 5% CO 2 incubator. The medium used was K-SFM (GIBCO, EGF, BPE, serum-free medium for keratinocytes). Is used). In addition, for cell culture, a culture plate insert (millicell, Millipore Co., Ltd.) with a 3 μm pore polycarbonate membrane was placed in a 6-well plate, and then the amnion prepared in Example 1 was placed on the insert. The primary cultured keratinocytes were inoculated thereon. 5 × 10 5 keratinocytes are inoculated on the amniotic membrane per insert 30 mm in diameter, and 2 ml of K-SFM (with GIBCO, EGF and BPE), which is a serum-free medium for keratinocytes, is inserted into the insert, and 3 ml of the medium outside. Filled with When the tissue thus produced is immersed in the medium for one week, keratinocytes grow and fill the surface. Subsequently, K-SFM (GIBCO, supplemented with BPE, 1 mM calcium) excluding EGF was used for gas-liquid interfacial culture. The medium in the insert was removed and only the insert was filled with the medium. This means that all the nutrients and growth factors are transferred to the epidermal cell layer by diffusion through the amnion from the bottom of the insert, so it can be regarded as an environment similar to the biological epidermis. And differentiated.
상기와 같이 제조된 본 발명의 양막을 이용한 배양표피에 대하여 세포의 부 착형태와 분화된 형태를 확인하기 위하여 H&E 염색을 통한 관찰을 수행하였다.Observation through H & E staining was performed to confirm the adherence and differentiation of cells to the culture epidermis using the amnion of the present invention prepared as described above.
도 3은 양막의 표피세포를 제거한 후에 피부각질세포(keratinocyte)를 배양한 것으로 실제 피부에서 관찰되는 것과 유사하게 잘 분화된 형태를 보이고 있다.
3 is a culture of keratinocytes after removal of the epidermal cells of the amniotic membrane and shows well differentiated forms similar to those observed in real skin.
<실시예 6> 양막을 이용한 배양각막 제조<Example 6> Cultured cornea preparation using amnion
상기 실시예 1, 2, 3, 4에서 제조된 양막 위에 각막세포를 배양하여 배양된 인공 각막 조직을 제조하였다. Cultured artificial corneal tissue was prepared by culturing corneal cells on the amnion prepared in Examples 1, 2, 3, and 4.
먼저, 토끼를 안락사시킨 후 안구를 분리, 세척한 후 각막에서 스트로마 (stroma)를 기준으로 표피와 내피층을 분리하며, 외식방법(explantation method)를 이용하여 표피세포를 분리하였다. 도 4a는 토끼의 각막 윤부(limbal)로부터 자라나오는 각막표피세포를 보여준다. 분리된 각막 표피 세포를 앞의 실시 예 1,2,3,4에서 제조한 직경 10mm의 양막 위에 5×105개의 세포로 접종하였으며, 소 뇌하수체 추출액, 소 인슐린, 히드로코르티손, 소 트랜스페린, 마우스 EGF가 첨가된 상피세포 배양용 무혈청 배지(Epilife, Cascade Biologics사)를 사용하였으며, 2일간 침수 배양 후 3일째부터 1mM 칼슘 첨가 후 7일간 기-액 배양을 실시하였다. 도 4b는 본 발명의 양막 위에 각막 윤부로부터 분리되어 배양된 각막표피세포의 침수 배양 1일째의 전자현미경 사진이며, 도 4c는 상기와 같이 기-액 배양 실시 후 조직검사(H&E)를 통하여 세포의 분화 형태를 관찰한 것으로서, 본 발명의 양막 위에 세포를 배양한 경우 세포층의 제일 아래쪽의 기저층(basal layer)은 생체 내(in vivo)에서 관찰되는 형태와 거의 유사한 입방형의 세포 형태를 나타냄을 확인할 수 있었다.
First, after euthanizing rabbits, eyeballs were separated and washed, the epidermis and endothelial layer were separated from the cornea on the basis of stroma, and epidermal cells were separated using an explantation method. 4A shows corneal epidermal cells growing from the corneal limbal of rabbits. The isolated corneal epithelial cells were inoculated with 5 × 10 5 cells on 10 mm diameter amniotic membrane prepared in Examples 1, 2, 3, and 4, and bovine pituitary extract, bovine insulin, hydrocortisone, bovine transferrin, and mouse EGF. Serum-free medium for epithelial cell culture (Epilife, Cascade Biologics Co., Ltd.) was used, and gas-liquid culture was performed for 7 days after 1 mM calcium addition from day 3 after 2 days submersion culture. Figure 4b is an electron micrograph of the first day submerged culture of corneal epidermal cells cultured separated from the corneal limbus on the amniotic membrane of the present invention, Figure 4c is a cell-through culture (H & E) after the gas-liquid culture as described above As a result of observing the differentiation morphology, when the cells were cultured on the amniotic membrane of the present invention, the basal layer at the bottom of the cell layer showed a cubic cell morphology almost similar to that observed in vivo . Could.
<실시예 7> 양막을 이용한 외측 모근초(Outer root sheath) 줄기 세포 배양Example 7 Outer Root Sheath Stem Cell Culture Using Amniotic Membrane
외측 모근초 줄기세포(ORSC)는 표피 또는 모낭으로 분화될 수 있는 두 가지 능력을 가진 것으로 피부조직에서 모낭을 손상되지 않은 채로 분리하여 외식 배양 (explant culture, out growth) 방법을 이용하여 일차 배양하였다.Outer hair follicle stem cells (ORSCs) have two abilities to differentiate into epidermis or hair follicles. The hair follicles were isolated from skin tissues without damage and were first cultured using an explant culture (out growth) method. .
즉, 항생제에 담겨 있는 모낭을 디스파제(2㎎/㎖, 1.4U/㎖, Sigma사)와 콜라게나아제(collagenase, 3mg/㎖, 5000U/㎖, Sigma사)를 1:1로 혼합한 용액으로 옮긴 뒤 37℃에 30분간 배양시킨다. 그리고 35mm 디쉬 바닥에 FBS 100㎕를 바른 후 모낭을 옮겨 바닥에 붙힌 후 약 6-10시간 동안 배양시킨 후 꺼내어 각 모낭에 배지를 200㎕씩 넣고 하루동안 배양시킨 뒤 K-SFM 배지를 2㎖씩 첨가하였다. That is, a solution in which hair follicles contained in antibiotics were mixed with dispase (2 mg / ml, 1.4 U / ml, Sigma) and collagenase (collagenase, 3 mg / ml, 5000 U / ml, Sigma) in a 1: 1 ratio. Transfer to and incubate for 30 minutes at 37 ℃. Apply 100 μl of FBS to the bottom of the 35mm dish, transfer the hair follicles, attach them to the bottom, incubate for about 6-10 hours, remove them, add 200 μl of medium to each hair follicle, and incubate for one day. Added.
상기의 일차 배양된 외측 모근초 줄기세포(ORSC)를 앞의 실시예 1,2,3,4에서 제조한 직경 10mm의 양막 위에 5×105 개의 세포로 접종하였으며, 배지는 무혈청 배지(K-SFM)를 사용하였다. 또한 대조군으로 실시예 5의 포피에서 일차배양한 피부 각질세포를 같은 농도로 양막 위에 접종하였으며, 침수배양에는 보충제 (supplement)가 첨가된 무혈청배지를 이용하였으며, 2일간 80mm 디쉬에 17㎖의 배지를 넣었다. 그리고 3일째 기-액 배양을 실시하는데, 인서트 (insert)를 그리드 (grid) 위에 올려놓고 배지는 동일하게 17㎖을 첨가하여 주며 이 때부터 EGF를 제 거하며 칼슘의 농도를 0.1mM부터 1.3mM까지 단계적으로 증가시켜 분화를 유도하였다. 도 5는 7일간 배양한 후 조직검사(H&E)를 통하여 비교한 결과로서, 본 실시예의 ORSC를 이용하여 시험관내 시험 (in vitro)에서 표피로 분화를 유도하였으며, 그 결과 실제 피부에서 관찰되는 것과 유사한 중층화와 분화가 확인되었으며, ORSC를 이용한 배양표피를 제조할 수 있었다.
The primary cultured outer hair follicle stem cells (ORSC) were inoculated with 5 × 10 5 cells on 10 mm diameter amniotic membrane prepared in Examples 1, 2, 3, and 4 above, and the medium was serum-free medium (K -SFM) was used. In addition, the keratinocytes primary cultured in the foreskin of Example 5 was inoculated on the amniotic membrane at the same concentration as the control group, and serum-free medium supplemented with supplements was used for immersion culture. Put it. And on day 3, gas-liquid culture was carried out. The insert was placed on the grid and the medium was added in the same amount to 17 ml. From this time, EGF was removed and the concentration of calcium was 0.1 to 1.3 mM. Differentiation was induced step by step until differentiation was induced. FIG. 5 is a result of incubation for 7 days, followed by histology (H & E) to induce differentiation into the epidermis in vitro in vitro using the ORSC of this Example, and as a result, it was observed in actual skin. Similar stratification and differentiation were identified, and cultured epidermis was prepared using ORSC.
본 발명에 의하면, 환자 자신의 각종 세포를 분리하여 이를 태반으로 분리된 양막 위에 배양한 형태의 생인공조직을 제공한다. 따라서 기존 화상 치료 방법인 바세린 거즈에 물리적으로 고정하는 방법과 비교하여, 본 발명은 양막을 피부의 기저막으로 이용하여 양막 위에 세포를 직접 배양한 후 양막과 함께 상처에 적용함으로써, 최종 세포 배양 후 플레이트(plate)로 부터 세포를 분리할 필요가 없으며, 따라서 기존 배양 방법에 사용되던 세포 분리를 위한 효소의 사용 필요성이 없으며, 이에 따른 세포 손상이 없는 잇점을 제공한다. 또한 물리적 강도가 우수함에 따라 상처에 대한 적절한 시술이 용이하며, 아울러 양막 자체의 상처 치유 촉진 효능을 갖는 잇점을 제공한다. 그리고 본 발명의 기저막 성분이 보존된 상태의 양막에 세포를 배양함으로써 인공피부, 인공각막, 인공연골, 인공근육, 인공모발조직 등의 다양한 조직공학을 이용한 인공장기 제조 및 세포 치료제개발에 유용하게 이용될 수 있다.
According to the present invention, it provides a bio-artificial tissue in the form of isolating the various cells of the patient himself and cultured on the amniotic membrane separated by placenta. Therefore, the present invention compared to the method of physically fixing to petrolatum gauze, a conventional burn treatment method, by using the amnion as a basal membrane of the skin and directly culturing the cells on the amnion and then applied to the wound together with the amniotic membrane, the plate after the final cell culture There is no need to separate cells from the plate, thus eliminating the need for the use of enzymes for cell separation used in conventional culture methods, thus providing the advantage of no cell damage. In addition, the excellent physical strength facilitates the proper treatment of the wound, and also provides the advantage of promoting wound healing of the amniotic membrane itself. In addition, by culturing the cells in the amniotic membrane in which the basal membrane component of the present invention is preserved, it is useful for the preparation of artificial organs and the development of cell therapeutics using various tissue engineering such as artificial skin, artificial cornea, artificial cartilage, artificial muscle, and artificial hair tissue. Can be.
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