KR100815292B1

KR100815292B1 - 위암 진단 마커로서의 미토콘드리아 에노일 조효소 ａ히드라타아제 1

Info

Publication number: KR100815292B1
Application number: KR1020070005212A
Authority: KR
Inventors: 박원선; 고재홍; 김나리; 한진; 김형규; 모하메드 와다
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2007-01-17
Filing date: 2007-01-17
Publication date: 2008-03-19
Also published as: US20080213816A1; US8741594B2

Abstract

본 발명은 위암 세포의 미토콘드리아에서 특이적으로 과발현되는 미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1을 포함하는 위암 진단용 마커에 관한 것으로서, 위암의 조기 진단에 유용하다.

Description

위암 진단 마커로서의 미토콘드리아 에노일 조효소 Ａ 히드라타아제 1 {MITOCHONDRIA ENOYL COENZYME A HYDRATASE 1 AS STOMACH CANCER DIAGNOSTIC MARKER}

도 1은 위암 세포의 미토콘드리아 단백질 변화를 확인하기 위해 실시한 2차원 전기영동의 겔 사진을 도시한다. 도 1a의 겔 사진은 정상 위 세포의 미토콘드리아 단백질을 분석한 것이고, 도 1b의 겔 사진은 위암 세포의 미토콘드리아 단백질을 분석한 것이다. 도 1a 및 도 1b에 원으로 표시한 스팟은 하기 설명되는 35번 단백질이다.

도 2는 도 1에 도시된 전기영동 결과 정상 세포와 위암 세포간에 큰 차이를 보이는 단백질 상을 도시한다. 도면의 상단은 도 1에 도시된 겔에서 정상 세포와 위암 세포간에 큰 차이를 보이는 단백질 상을 확대한 것이고, 하단은 이의 3차원 입체상이다(좌측: 정상 세포, 우측: 위암 세포). 정상 세포와 비교하여 위암 세포에서 과발현된 단백질은 35번 단백질이었다.

도 3은 상기 35번 단백질을 MALDI-TOF MS 분석법을 통하여 분석한 결과이며, 분석 결과 35번 단백질은 미토콘드리아의 에노일 조효소 A 히드라타아제 1으로 확인되었다.

본 발명은 위암 조기 진단용 마커로서 사용될 수 있는 미토콘드리아 단백질에 대한 것으로서, 더욱 상세하게는 정상 세포에서보다 위암 세포에서 보다 높은 발현율을 보이는 단백질과 이를 이용한 위암 진단용 조성물 또는 키트, 위암 진단 방법 및 위암 치료, 억제 또는 예방을 위한 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다.

위암은 한국 및 일본 등의 아시아에서 발생하는 가장 흔한 암으로서 사망률 1위를 나타내는 암이다. 따라서, 위암의 조기 진단이 필수적이다. 이를 위해 다양한 생물학적 지표 물질을 세포 수준과 혈액 수준에서 찾으려는 시도들이 이루어져 왔으나, 기술의 부족과 측정 장비의 한계로 인하여 효과적인 지표 물질의 발굴이 어려웠던 것이 사실이다. 특히, 암과 세포내 소기관인 미토콘드리아의 연관성에 관한 연구가 지속되면서 미토콘드리아의 구조적 또는 기능적 변화가 암의 발생과 밀접한 영향을 가진다는 연구 결과들이 선행되었다. 하지만, 실제 생체내에서 가장 활발한 기능성을 가지는 단백질에 대한 미토콘드리아의 수준의 연구는 매우 부족하였다. 본 발명자들은 놀랍게도 암의 조기 발견과 항암 치료 목표 물질을 개발하는 기술분야에서 새로운 후보물질인 미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 위암 조기 진단을 위한 마커로서 미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1을 이용한 위암 진단용 조성물 또는 키트, 위암 진단 방법, 위암 치료, 억제 또는 예방을 위한 약물 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

위암의 조기 발견을 위한 생리적 지표 물질 개발이 활발히 진행되고 있는 가운데, 본 발명에서는 세포속에 풍부하게 존재하는 소기관인 미토콘드리아와 암 발생간의 연관성에 주목하여 미토콘드리아에 존재하는 단백질을 위암 지표물질로 개발하기 위하여 사람의 위암 세포주와 위의 정상 위 세포주의 미토콘드리아 단백질 군을 비교하였다. 2차원 전기영동 분석(2DE-proteomics analysis)은 세포나 조직의 단백질을 전체적인 묶음으로 인지하여 단백질을 개체가 아닌 총체적 변화에 대하여 단백질의 전기적, 물리적 성상을 이용하여 전기영동방법으로 확인하는 학문으로서, 최근 전 세계에서 활발히 이용되고 있는 연구 기법이며, 이 기법은 크게 1차원 등전점 분리와 2차원 단백질 질량 겔 분리를 통해 이루어진다. 두 단계의 단백질 분리를 통해 겔 상에 넓게 분포된 단백질의 이미지는 영상 분석 장치를 통하여 양적인 발현을 비교하고 그 중 큰 차이를 보이는 단백질을 채취하여 MALDI-TOF MS라는 분자질량측정방법을 통하여 단백질의 작은 절편 단위인 펩티드의 질량을 측정한다. 측정된 펩티드의 질량은 다시 펩티드를 구성하는 아미노산의 질량으로 계산되어 최종적으로 이미 공지된 펩티드의 질량 데이터베이스와 비교하여 원래 단백질의 성상을 밝혀낸다. 본 발명에서는 이러한 2차원 전기영동 분석을 이용하여 위암 세포의 미토콘드리아에서 특이적으로 9배 이상 발현되는 미토콘드리아 에노일 조효 소 A 히드라타아제 1이라는 물질을 발견하였으며 이를 통해 위암이 의심되는 환자의 발병 여부를 조기에 발견할 것으로 기대된다.

이에 따라, 본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1을 포함하는 위암 진단용 마커를 제공한다. 미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1(enoyl coenzyme A hydratase 1)은 지방산 대사에 관여하는 효소로서 알려져 있으며 엔씨비아이 진뱅크 허가 번호(NCBI Gene Bank Accession No.) 14286220가 부여되어 있다.

또한, 본 발명은 미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1 또는 이의 면역원성 단편에 대해 특이적인 항체를 포함하는 위암 진단용 조성물 또는 키트를 제공한다.

본 발명에 따르면, 면역원성 단편이란 생체내에서 면역반응을 일으키고 본 발명에 따른 단백질에 대해 특이적인 항체에 의해 인식될 수 있는 전장 단백질의 부분 또는 일부를 의미한다.

바람직하게는, 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 단클론 항체가 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 항체는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 따라 본 발명에 따른 마커 단백질 또는 그 단편을 마우스, 래트 등과 같은 포유동물을 포함하는 숙주에 주사하고, 후속하여 당업계에 통상적인 방법에 의해 정제함으로써 제조될 수 있거나, 적절한 제공원으로부터 구입될 수 있다. 일반적으로 항원성을 증가시키기 위해서 애쥬번트와 함께 투여될 수 있다. 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 불멸화된 세포주 생성 기술 또는 파지 항체 라이브러리 기술 등에 의해 의해 제조될 수 있거나, 적절한 제공원으로부터 구입될 수 있다(예를 들어, 노버스(Novus)로부터 ECHS1 항체, 클론 1G9).

본 발명에 따른 진단용 조성물 또는 키트는 상기 위암 진단용 마커인 미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1을 사용하여 당업계에서 사용되는 통상의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 면역학적 분석에 사용되는 도구 또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 위암이 의심되는 피검체로부터 위 세포를 채취하고, 이 위 세포에서 미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1의 발현양을 측정하는 단계를 포함하여 위암을 진단하는 방법을 제공한다. 여기서, 피검체는 바람직하게는 포유동물이고, 특히 인간이다.

또한, 본 발명은 위암 세포주로부터의 세포와 시험물질을 접촉시키고 상기 세포에서 미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1의 발현 변화를 측정하는 것을 포함하는, 위암을 치료, 억제, 또는 예방하는 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 본 발명에서, 단백질 마커인 미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1의 발현 변화를 측정하는 것은 위암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 위암 마커로서의 단백질의 발현 정도를 확인하는 과정으로 당업계에 공지된 방법에 따라 측정될 수 있다. 예를 들어, 이차원 전기영동법, 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 조직면역염색, 면역침전분석법, FACS, 단백질 칩 등을 이용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 단백질 마커의 발현양은 mRNA 수준을 측정함으로써 간접적으로 측정될 수 있다. 이를 위한 분석법으로는 RT-PCR, DNA 칩 분석법 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명은 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명된다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

실시예

세포배양

2차원 전기영동 분석을 위해 위 정상 세포주(RGM-1)과 위암 세포주(AGS)를 준비하였다. DMEM F/12와 RPMI 1640 455㎖ 각각에 FBS 50㎖과 페니실린/스트렙토마이신 5㎖을 혼합하여 배지를 제조하였다. 제조된 배지 10㎖을 15㎖ 튜브에 담고 준비된 세포를 혼합하였다. 원심분리(12000rpm, 5분)하여 상층액을 제거하고 다시 배지 5㎖을 가한 후 볼텍싱하여 세포 현탁액을 취하였다. 배양 플레이트에 배지 10㎖을 미리 넣고 세포 현탁액 5㎖을 넣어 플레이트 전체에 고르게 퍼지도록 하였다. 세포가 잘 깔렸는지 현미경으로 확인한 후에 CO₂ 인큐베이터(37℃, 50㎖/L CO₂ 함유 가습 대기)에서 배양하였다.

2차원 전기영동용 미토콘드리아 시료 준비

트립신 처리를 하여 플레이트로부터 분리한 AGS 및 RGM 세포주를 medium fitting glass-teflon potter-Elvehjem 균질기에 50mM 수크로오스, 200mM 만니톨, 5mM 인산칼륨, 1mM EGTA, 5mM MOPS, 0.1% BSA, 프로테아제 억제제 칵테일이 함유된 pH 7.4의 미토콘드리아 분리 용액과 혼합하였다. 세포막을 파쇄하기 위하여 6 내지 7회 유리관 내에서 으깨어주며 균질화하였다. 균질화된 세포를 원심분리 튜브에 옮긴 후에 4℃에서 1,500×g에서 5분간 원심분리하여 큰 밀도의 세포 부속물을 제거하였다. 상층액을 4℃의 새로운 원심분리 튜브에 옮긴 후 10,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 침전물은 높은 농도의 미토콘드리아를 함유하는 펠릿 형태였다. 상층액을 제거하고 펠릿을 7M 우레아, 2M 티오우레아, 4% CHAPS, 40mM Tris base, 1% DTT, 0.5% IPG 완충액, 0.5% 트리톤 X-114, 단백질분해효소억제제가 들어 있는 단백질 용해액에 넣어 1시간 가량 실온에서 녹였다. 용해액 중에 녹은 미토콘드리아 단백질을 2D Quant 키트(GE 헬쓰케어, 미국)로 그 양을 적정하고 2차원 전기영동 단백질 분리 단계에 사용하였다.

2차원 전기영동 단백질 분리

1차 단백질 등전점 분리

단백질의 고유 성질인 전기적 등전점(isoelectric point)을 이용하여 단백질을 일차적으로 분리하는 방법이다. 13cm의 건조 상태의 고정화 pH 구배(immobilized pH gradient, IPG) 스트립에 50㎍의 단백질을 함유하는 250㎕의 등전점 분리 용액을 더하여 10 시간 이상 재수화시켰다. 재수화된 IPG 스트립에 대해 IPG 포어(phore)(GE 헬쓰케어, 미국) 장치 상에서 등전점 분리를 수행하였다. 등전점 분리시의 조건은 500 볼트 1시간, 1000 볼트 1시간, 최종적으로 8000 볼트로 최종 누적 볼트가 60000 볼트가 될 때까지 시행하였다. 이 때, 최고 전류를 스 트립 당 50μA로 조절하였다. 등전점 분리를 마친 스트립을 1차 상동화 용액(6M 우레아, 30% 글리세롤, 2% SDS, 브로모페놀 블루, 1% DTT를 함유하는 50mM Tris-HCl, pH 8.8 용액)에서 15분간 천천히 교반시켰다. 1차 상동화를 마친 스트립을 2차 상동화 용액(6M 우레아, 30% 글리세롤, 2% SDS, 브로모페놀 블루, 2.5% 요오도아세트아미드를 함유하는 50mM Tris-HCl, pH 8.8 용액)에 담가 다시 15분간 교반시켰다.

2차원 단백질 전기영동

폴리아크릴아미드 겔에서 단백질의 분자량에 따라 분리하는 단계이다. 12.5%의 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔을 13cm 크기에 맞추어 SE 600 루비(Ruby) 전기영동 세트(애머샴, 미국)를 통해 제작하였다. 상동화 과정을 마친 스트립을 겔 위에 올려 놓고 실링(sealing ) 아가로 스트립과 겔 사이를 막아주었다. 구동 완충액(running buffer)(25mM Tris, 192mM 글리신, 2.5mM SDS, pH 8.3)을 세트에 채우고 처음 20분간 80v에서 스트립의 단백질이 겔로 옮겨가도록 하고 이후 5 시간 가량 240V에서 전기영동을 진행하였다. 전기영동을 마친 겔을 질산은을 이용하여 염색하였다.

겔의 스캔과 이미지 분석

염색된 겔을 평판 스캐너(UMAX 파워 룩 1100, 미국)을 통해 스캐닝하였다. 스캐닝시, 300dpi, 투과형으로 옵션을 조절하였다. 스캐닝된 겔의 이미지를 이미지 분석 프로그램(이미지 매스터 2D 플래티늄, GE 헬쓰케어, 미국)을 통해 분석하였다. 본 발명에서는 이미지 분석 결과를 통해 두가지 세포주에서 170% 이상의 차 이를 보이는 단백질들을 선별하여 최종 단백질 동정을 수행하였다.

단백질 동정

사용된 두 세포주에서 현격한 차이를 보이는 단백질(35번 단백질)을 채취 후에 (주)인투젠(IN2GEN)에 MALDI-TOF MS 기법을 이용한 단백질 질량 분석을 의뢰하였다. 분석된 단백질 질량 피크를 MASCOT PMF(http://www.matrixscience.com)에서 NCBI 데이터베이스를 기준으로 검색한 결과 미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1(진뱅크 ID 14286220)임을 확인하였다. 확인된 단백질의 서열은 하기와 같았다:

maalrvllsc vrgplrppvr cpawrpfasg anfeyiiaek rgknntvgli qlnrpkalna

61 lcdglideln qalkifeedp avgaivltgg dkafaagadi kemqnlsfqd cysskflkhw

121 dhltqvkkpv iaavngyafg ggcelammcd iiyagekaqf aqpeiligti pgaggtqrlt

181 ravgkslame mvltgdrisa qdakqaglvs kicpvetlve eaiqcaekia snskivvama

241 kesvnaafem tltegsklek klfystfatd drkegmtafv ekrkanfkdq

이 단백질은 정상 세포주에서보다 위암 세포주에서 특이적으로 9배 이상 발현되었다.

본 발명에서는 이러한 2차원 전기영동 분석을 이용하여 위암 세포의 미토콘드리아에서 특이적으로 9배 이상 발현되는 미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1이라는 물질을 발견하였으며 이를 통해 위암이 의심되는 피검체의 위암 진단이 가능하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1을 포함하는 위암 진단용 마커.
미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1 또는 이의 면역원성 단편에 대해 특이적인 항체를 포함하는 위암 진단용 조성물.
제 2 항에 있어서, 항체가 단클론 항체임을 특징으로 하는 위암 진단용 조성물.
미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1의 발현양을 측정하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 위암을 진단하는 방법.
위암 세포주로부터의 세포와 시험물질을 접촉시키고 상기 세포로부터 미토콘드리아 에노일 조효소 A 히드라타아제 1의 발현 변화를 측정하는 것을 포함하는, 위암의 치료, 억제 또는 예방을 위한 약물의 스크리닝 방법.