KR100812637B1 - Recombinant canine rotavirus vp4 protein comprising epitope and antibody - Google Patents
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Abstract
Description
도 1a는 개 로타바이러스의 전장 VP4 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 전기영동 사진이다.1A is an electrophoretic photograph of a gene encoding the full length VP4 protein of canine rotavirus.
도 1b는 본 발명의 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 전기영동 사진이다.Figure 1b is an electrophoresis picture of the gene encoding the recombinant canine rotavirus VP4 protein of the present invention.
도 1c는 본 발명의 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한 클로닝 벡터를 나타낸 것이다.Figure 1c shows a cloning vector comprising the gene encoding the recombinant canine rotavirus VP4 protein of the present invention.
도 2a는 본 발명의 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한 재조합 발현 벡터를 나타낸 것이다.Figure 2a shows a recombinant expression vector comprising a gene encoding the recombinant canine rotavirus VP4 protein of the present invention.
도 2b는 도 2a의 재조합 발현 벡터에 본 발명의 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질의 유전자가 삽입되었음을 보여주는 전기영동 사진이다.Figure 2b is an electrophoresis picture showing that the gene of the recombinant canine rotavirus VP4 protein of the present invention is inserted into the recombinant expression vector of Figure 2a.
도 2c는 본 발명의 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질이 유전자 재조합 기술을 통하여 발현 가능함을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다.Figure 2c is a Western blot showing that the recombinant canine rotavirus VP4 protein of the present invention can be expressed through genetic recombination techniques.
도 3은 본 발명의 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질이 면역원성을 발휘함을 보여주는 그래프이다.3 is a graph showing that the recombinant canine rotavirus VP4 protein of the present invention exerts immunogenicity.
도 4는 본 발명의 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질을 투여받은 산란계의 난황 중 항체가 변화를 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이다.Figure 4 is a graph showing the change in the antibody over time egg yolk of the laying hens receiving the recombinant canine rotavirus VP4 protein of the present invention.
도 5a는 본 발명의 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질에 대한 난황 항체를 투여받은 자견에게서 개 로타바이러스에 의한 감염증이 감소되는 것을 보여주는 그래프이다.Figure 5a is a graph showing that the dog rotavirus-induced infection is reduced in the dog receiving the yolk antibody to the recombinant dog rotavirus VP4 protein of the present invention.
도 5b는 본 발명의 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질에 대한 난황 항체를 투여받은 자견에게서 개 로타바이러스에 의한 감염증이 예방 및 치료되는 것을 보여주는 그래프이다.5B is a graph showing that dog rotavirus infection is prevented and treated in a dog receiving yolk antibody against the recombinant canine rotavirus VP4 protein of the present invention.
본 발명은 항원 결정기를 포함하는 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질 및 이에 대한 항체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 개 로타바이러스 VP4 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질을 함유하는 백신 조성물, 상기 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질에 대한 항체 및 상기 항체를 함유하는 개 로타바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant dog rotavirus VP4 protein comprising an antigenic determinant and an antibody thereto, and more particularly, to a recombinant dog rotavirus VP4 protein comprising an antigenic determinant of a dog rotavirus VP4 protein, a gene encoding the protein. , A recombinant expression vector comprising the gene, a host cell transformed with the recombinant expression vector, a vaccine composition containing the recombinant canine rotavirus VP4 protein, an antibody against the recombinant canine rotavirus VP4 protein, and the antibody containing the antibody. A pharmaceutical composition for treating or preventing canine rotavirus infection.
애완견에서 심각한 소화기 질환을 유발하여 경제적 및 정서적 폐해를 발생시키는 병원성 바이러스로는 개 파보바이러스 (canine parvovirus type 2; CPV-2), 개 아데노바이러스 (canine adenovirus; CAV), 개 코로나바이러스 (canine coronavirus; CCV), 개 로타바이러스 (canine rotavirus; CRV) 등이 알려져 있다(Mochizuki et al. 2001 J. Vet. Med. Science. vol.63, pp.573-575).Pathogenic viruses that cause serious digestive problems in dogs and cause economic and emotional harm include canine parvovirus type 2 (CPV-2), canine adenovirus (CAV), and canine coronavirus (canine coronavirus); CCV), canine rotavirus (CRV), and the like (Mochizuki et al. 2001 J. Vet. Med. Science. Vol . 63, pp. 573-575).
상기 언급한 병원성 바이러스에 의한 경제적 손실은 각각의 바이러스에 의한 이병율을 고려하여야 하나, 현재까지 국내에서는 그러한 바이러스에 의한 소화기 질환 이환견에 대한 통계가 없다. 그러나, 상황이 유사한 일본의 경우 각각의 바이러스에 의한 이병율은 개 파보바이러스 (CPV-2); 23.4%, 개 아데노바이러스 (CAV); 2.2%, 개 코로나바이러스 (CCV); 55.4%, 개 로타바이러스 (CRV); 2.1% 정도로 보고되었다(Mochizuki et al. 2001). 이러한 통계를 기초로 국내 전체 애완견 상황을 유추해보면 상기 바이러스들에 의해 유발되는 경제적 손실은 가히 엄청나다고 할 수 있다.The economic losses caused by the above mentioned pathogenic viruses should take into account the morbidity caused by each virus, but there are no statistics on the digestive disease disease caused by such viruses in Korea. However, in Japan, where the situation is similar, the prevalence of each virus is canine parvovirus (CPV-2); 23.4%, canine adenovirus (CAV); 2.2%, canine coronavirus (CCV); 55.4%, canine rotavirus (CRV); 2.1% was reported (Mochizuki et al. 2001). Based on these statistics, inferring the situation of the entire domestic dog can be said that the economic losses caused by the viruses are very huge.
애완견에서의 감염성 설사 예방용 백신 사용에 따른 문제점인 백신 브레이크 현상으로 인한 방어 능력 부재시에는 각 병원체에 대한 난황 항체를 경구 투여하여 일차적으로 장관에서 병원성 바이러스를 중화함으로써 병원체의 장관감염을 예방할 수 있다.In the absence of defense ability due to vaccine break, a problem caused by the use of vaccines to prevent infectious diarrhea in dogs, intestinal infection of pathogens can be prevented by neutralizing pathogenic viruses in the intestine by orally administering yolk antibodies to each pathogen.
기존에는 난황 항체 생산을 위한 항원으로 바이러스 배양액을 사용하였다. 이를 위해서는 숙주 세포를 배양한 후에 바이러스를 접종하고 다시 바이러스에 의해 감염된 숙주 세포를 배양하는 단계를 거쳐야 하는데, 이러한 항원생산 과정이 복잡하고 항원생산 기간이 길며, 또한 수득율이 낮아 생산단가가 매우 높고 난황 항체의 역가도 낮은 단점이 있다.In the past, virus culture was used as an antigen for egg yolk antibody production. To this end, the host cells must be cultured, followed by the inoculation of the virus, followed by culturing the host cells infected by the virus. The antigen production process is complicated, the antigen production period is long, and the yield is low, and the production cost is very high and egg yolk. The titer of the antibody is also low.
한편, "개 로타바이러스"는 강아지에 감염되어 설사증을 유발하는 바이러스로서, 녹색 · 점조한 설사변을 배설하나 혈액의 혼입은 보통 일어나지 않으며, 병변은 소장에 국한되지만, 전역에 걸쳐 충혈을 일으킨다. 조직학적으로 소장의 융모가 위축되고 융모원주상피세포가 파괴되어 인상 또는 입방상의 상피세포를 관찰할 수 있게 되며 흡수기능이 저하된다. 그러나, 아직까지 효율적인 백신이 실용화되지 않은 실정이다. On the other hand, "dog rotavirus" is a virus that infects puppies and causes diarrhea, and excretes green and viscous diarrhea, but blood incorporation usually does not occur, and the lesion is confined to the small intestine, but causes congestion throughout. Histologically, the small intestinal villi atrophy and the villi columnar epithelial cells are destroyed, so that epithelial cells in the impression or cuboid can be observed and the absorption function is reduced. However, an efficient vaccine has not been put to practical use yet.
본 발명자들은 개 로타바이러스의 VP4 단백질을 분석하여 이의 항원 결정기를 포함하도록 재조합 개 로타바이러스의 VP4 단백질과 이에 대한 항체를 제조한 후 개에게 투여한 결과, 개 로타바이러스의 감염증을 예방 및 치료할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.The inventors analyzed the VP4 protein of canine rotavirus and prepared the recombinant canine rotavirus VP4 protein and its antibody to include the antigenic determinant and then administered it to the dog, thereby preventing and treating the dog rotavirus infection. It was confirmed that the present invention was completed.
본 발명은 한 관점으로서, 개 로타바이러스 VP4 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질을 제공한다.In one aspect, the present invention provides a recombinant canine rotavirus VP4 protein comprising an antigenic determinant of canine rotavirus VP4 protein.
다른 관점으로서, 상기 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.In another aspect, a gene encoding the recombinant canine rotavirus VP4 protein is provided.
또 다른 관점으로서, 상기 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질을 코딩하는 유전자가 발현 벡터의 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 포함된 재조합 발현 벡터를 제공한다.In another aspect, there is provided a recombinant expression vector that is included such that the gene encoding the recombinant canine rotavirus VP4 protein is operably linked to a regulatory sequence of the expression vector.
또 다른 관점으로서, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.In another aspect, a host cell transformed with the recombinant expression vector is provided.
또 다른 관점으로서, (1) 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질을 코딩하는 유전자를 발현 벡터의 조절 서열에 작동가능하게 연결시켜 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; (3) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 상기 유전자를 발현시키는 단계; (4) 배양물로부터 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질을 분리하는 단계를 포함한 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질의 제조방법을 제공한다.As another aspect, (1) producing a recombinant expression vector by operably linking the gene encoding the recombinant dog rotavirus VP4 protein to the regulatory sequence of the expression vector; (2) transforming the host cell with the recombinant expression vector; (3) culturing the transformed host cell to express the gene; (4) It provides a method for producing a recombinant canine rotavirus VP4 protein comprising the step of separating the recombinant canine rotavirus VP4 protein from the culture.
또 다른 관점으로서, 상기 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질에 대한 항체, 특히 난황 항체를 제공한다.In another aspect, there is provided an antibody against the recombinant canine rotavirus VP4 protein, in particular an egg yolk antibody.
또 다른 관점으로서, (1) 상기 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질로 산란계를 면역화시키는 단계; (2) 상기 산란계로부터 산란된 알의 난황에서 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질에 대한 난황 항체를 분리하는 단계를 포함한 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질에 대한 난황 항체의 제조방법을 제공한다.As another aspect, (1) immunizing a laying hen with said recombinant canine rotavirus VP4 protein; (2) providing a method for producing an egg yolk antibody against a recombinant dog rotavirus VP4 protein, comprising the step of separating the egg yolk antibody against the recombinant dog rotavirus VP4 protein from the egg yolk from the egg laid.
또 다른 관점으로서, 상기 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질을 유효성분으로 함유하는 개 로타바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물을 제공한다.In another aspect, a vaccine composition for treating or preventing canine rotavirus infection containing the recombinant canine rotavirus VP4 protein as an active ingredient is provided.
또 다른 관점으로서, 상기 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질에 대한 항체를 유효성분으로 함유하는 개 로타바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of canine rotavirus infection containing an antibody against the recombinant canine rotavirus VP4 protein as an active ingredient.
또 다른 관점으로서, 상기 재조합 개 로타바이러스 VP4 단백질에 대한 항체를 유효성분으로 함유하는 개 로타바이러스 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 사료 조성물을 제공한다.In still another aspect, there is provided a feed composition for treating or preventing canine rotavirus infection containing an antibody against the recombinant canine rotavirus VP4 protein as an active ingredient.
또 다른 관점으로서, 상기 백신 조성물을 사람을 제외한 포유동물에 투여함으로써 개 로타바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for treating or preventing a dog rotavirus infection by administering the vaccine composition to a mammal other than a human.
또 다른 관점으로서, 상기 약제학적 조성물을 사람을 제외한 포유동물에 투여함으로써 개 로타바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for treating or preventing canine rotavirus infection by administering the pharmaceutical composition to a mammal other than a human.
본 발명은 개 로타바이러스(canine rotavirus) 유래 VP4 단백질의 항원 결정기(epitope)를 포함하도록 재조합된 개 로타바이러스(이하, "CRV"로 간략하게 표기함)의 VP4 단백질에 관한 것이다.The present invention relates to a VP4 protein of a canine rotavirus (hereinafter simply referred to as "CRV") recombined to include an epitope of a VP4 protein derived from canine rotavirus.
구체적으로 본 발명의 재조합 CRV VP4 단백질은 개 로타바이러스의 외피(outer capsid)를 구성하는 단백질인 VP4 단백질을 분석하여 항체가 결합하는 부위, 즉 항원 결정기를 포함하도록 절편화한 것으로서, 서열번호: 3, 서열번호: 6, 서열번호: 9, 서열번호: 12, 서열번호: 15, 서열번호: 18 및 서열번호: 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열번호에 기재된 아미노산 서열로 이루어지며, 이들은 각각 CRV Va, CRV Vb, CRV Vc, CRV Vd, CRV Ve, CRV Vf, CRV Vg로 간략하게 표기된다.Specifically, the recombinant CRV VP4 protein of the present invention is fragmented to include a site to which an antibody binds, ie, an antigenic determinant, by analyzing the VP4 protein, which is a protein constituting the outer capsid of a dog rotavirus. , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 21, consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: each of which is CRV Va, CRV Vb, CRV Vc, CRV Vd, CRV Ve, CRV Vf, CRV Vg.
본 발명에서 재조합 CRV VP4 단백질은 당해 서열번호에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하여 그 단백질을 포함한 당단백질 및 이로부터 유래 된 모든 유도체를 포함한다.In the present invention, the recombinant CRV VP4 protein includes a glycoprotein including the protein and all derivatives derived therefrom, including the protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO.
본 발명의 재조합 CRV VP4 단백질은 (1) 재조합 CRV VP4 단백질을 코딩하는 유전자를 발현 벡터의 조절 서열에 작동가능하게 연결시켜 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; (3) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 상기 유전자를 발현시키는 단계; (4) 배양물로부터 재조합 CRV VP4 단백질을 분리하는 단계를 거쳐서 제조할 수 있다.The recombinant CRV VP4 protein of the present invention comprises the steps of: (1) preparing a recombinant expression vector by operably linking a gene encoding the recombinant CRV VP4 protein to a regulatory sequence of the expression vector; (2) transforming the host cell with the recombinant expression vector; (3) culturing the transformed host cell to express the gene; (4) can be prepared by the step of separating the recombinant CRV VP4 protein from the culture.
전술된 유전자 재조합 기술로 본 발명의 재조합 CRV VP4 단백질을 제조하기 위해서는 상기 단백질을 코딩하는 유전자가 요구된다. 본 발명에 따른 재조합 CRV VP4 단백질을 코딩하는 유전자는 당해 유전자의 염기 서열을 참조하여 핵산 합성기 등을 이용하여 인공적으로 합성하거나, 개 로타바이러스의 게놈 DNA를 주형으로 목적한 재조합 CRV VP4 단백질을 코딩하는 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR을 실시함으로써 제조할 수 있다. 한편, 코돈의 축퇴성으로 인하여 본 발명의 재조합 CRV VP4 단백질을 코딩하는 유전자는 다양한 염기 서열로 존재할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다.Genes encoding the proteins are required to produce the recombinant CRV VP4 proteins of the present invention by the above-described genetic recombination techniques. The gene encoding the recombinant CRV VP4 protein according to the present invention may be artificially synthesized using a nucleic acid synthesizer or the like by referring to the nucleotide sequence of the gene, or encoding a recombinant CRV VP4 protein of interest as a template for genomic DNA of a dog rotavirus. It can be prepared by PCR using oligonucleotide having a sequence complementary to both ends of the gene as a primer. On the other hand, due to the degeneracy of the codon, the gene encoding the recombinant CRV VP4 protein of the present invention may exist in various base sequences, all of which are included in the scope of the present invention.
본 발명의 재조합 CRV VP4 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 단계 (1)에 따라 발현 벡터의 조절 서열에 작동가능하게 연결시켜 재조합 발현 벡터를 제조한다. 여기서, "발현 벡터"는 외래 유전자를 숙주 세포로 도입하고 발현시킬 수 있는 DNA 분자를 의미하는 것으로서, 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 특정한 숙주 세포에서 외래 유전자의 발현을 효과적으로 유도하 는 다양한 발현 벡터가 상업적으로 입수 가능한데, 본 발명에서는 예를 들면 pUC8, pBR322, pET/Rb, pGEX, pET28a 등을 이용할 수 있으며, pMAL-c2x를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 발현 벡터의 조절 서열에 본 발명의 재조합 CRV VP4 단백질을 코딩하는 유전자를 작동가능하게 연결시켜 수득한 DNA 분자를 "재조합 발현 벡터"라고 한다.The gene encoding the recombinant CRV VP4 protein of the present invention is operably linked to the regulatory sequence of the expression vector according to step (1) to produce a recombinant expression vector. Here, "expression vector" refers to a DNA molecule capable of introducing and expressing a foreign gene into a host cell, which may be a plasmid, phage particle or simply a potential genomic insert. Various expression vectors for effectively inducing the expression of foreign genes in specific host cells are commercially available. For example, pUC8, pBR322, pET / Rb, pGEX, pET28a, etc. can be used in the present invention, and pMAL-c2x may be used. It is preferable. A DNA molecule obtained by operably linking a gene encoding a recombinant CRV VP4 protein of the present invention to a regulatory sequence of such expression vector is referred to as a "recombinant expression vector".
이렇게 제조한 재조합 발현 벡터는 상기 단계 (2)에 따라 숙주 세포로 형질전환시킨다. 본 발명의 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들을 사용할 수 있으며, 대장균을 사용하는 것이 바람직하다.The recombinant expression vector thus prepared is transformed into host cells according to step (2) above. The host cell of the invention can be a prokaryotic or eukaryotic cell. A host having a high DNA introduction efficiency and a high expression efficiency of the introduced DNA is usually used. Known eukaryotic and prokaryotic hosts such as E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungi, yeast can be used, with E. coli being preferred.
숙주 세포로 형질전환하는 방법은 통상의 형질전환 방법, 예를 들면 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection), 전기천공(electroporation), DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DEAE-dextran mediated transfection), 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection)을 사용할 수 있다. 당업계에 공지된 바를 참조하여 숙주 세포 및 발현 벡터 등의 종류에 따라 또 다른 최적의 형질전환 방법을 도입할 수도 있다.Methods for transforming into host cells include conventional transformation methods such as cationic lipid-mediated transfection, electroporation, DEAE-dextran mediated transfection. Calcium phosphate transfection can be used. With reference to what is known in the art, another optimal transformation method may be introduced depending on the type of host cell, expression vector, and the like.
형질전환된 숙주 세포들은 상기 단계 (3)에 따라 본 발명에 따른 재조합 CRV VP4 단백질의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포들은 적합한 배지와 재조합 CRV VP4 단백질의 발현 및/또는 분리를 용이하게 하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 셰 이크 플라스크 배양에 의해 배양될 수 있다. 배양은 공지 기술을 사용하여 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양 배지에서 수행한다. 이러한 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 문헌 (예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그)에 공지된 바에 따라 제조할 수도 있다.The transformed host cells can be cultured in a nutrient medium suitable for the production of the recombinant CRV VP4 protein according to the invention according to step (3) above. For example, host cells may be cultured by small or large scale fermentation, shake flask culture in a laboratory or industrial fermentor conducted under conditions that facilitate expression and / or isolation of recombinant CRV VP4 protein with a suitable medium. Cultivation is carried out in a suitable nutrient medium containing carbon, nitrogen sources and inorganic salts using known techniques. Such suitable media may be obtained commercially or as known in the literature (eg, catalog of the American Type Culture Collection).
형질전환된 숙주 세포에서 생산된 재조합 CRV VP4 단백질은 상기 단계 (4)에 따라 통상의 단백질 분리 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 재조합 CRV VP4 단백질은 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 방법에 따라 배양물로부터 분리될 수 있다. 더 나아가 재조합 CRV VP4 단백질은 크로마토그래피 (예, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해도 (예, 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 방법을 통해서 정제될 수 있다.Recombinant CRV VP4 protein produced in transformed host cells can be isolated using conventional protein separation methods according to step (4) above. For example, the recombinant CRV VP4 protein can be isolated from the culture according to methods including, but not limited to, centrifugation, filtration, extraction, spray drying, evaporation or precipitation. Furthermore, recombinant CRV VP4 proteins may be purified via known methods, including chromatography (eg, ion exchange, affinity, hydrophobicity and size exclusion), electrophoresis, fractional solubility (eg, ammonium sulfate precipitation), SDS-PAGE or extraction. It can be purified.
한편, 본 발명의 재조합 CRV VP4 단백질에 대한 항체, 특히 난황 항체도 본 발명의 한 측면을 형성한다.On the other hand, antibodies to the recombinant CRV VP4 protein of the invention, in particular egg yolk antibodies, also form an aspect of the invention.
본 발명의 재조합 CRV VP4 단백질을 항원으로 하여 개 로타바이러스에 특이적인 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다. 폴리클로날 항체는 일반적으로 포유동물을 적절한 양의 항원으로 1회 이상의 회수로 면역화시키고 항체가가 일정 수치에 이르렀을 때, 상기 포유동물의 항혈청으로부터 회수하여, 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고, 사용시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 한편, 모노클로날 항체는 포유동물에 항원을 주입하여 생긴 B 림프구를 분리해서 마이엘로마 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 만들고 이를 배양하여 항 체를 제조할 수 있다. 이러한 공정의 상세한 사항들은 당업계에 잘 알려져 있다.Monoclonal and polyclonal antibodies specific for canine rotavirus can be prepared using the recombinant CRV VP4 protein of the present invention as an antigen. Polyclonal antibodies are generally immunized with one or more collections of a mammal with an appropriate amount of antigen and, when the antibody titer reaches a certain value, recovered from the antiserum of the mammal and purified using known procedures if desired. And store in frozen buffered solution until use. On the other hand, the monoclonal antibody can isolate the B lymphocytes generated by injecting the antigen into the mammal and fusion with myeloma cells to make hybridoma cells and culture the antibody. Details of this process are well known in the art.
난황 항체의 경우에는 (1) 상기 재조합 CRV VP4 단백질로 산란계를 면역화시키는 단계; (2) 상기 산란계로부터 산란된 알의 난황에서 재조합 CRV VP4 단백질에 대한 난황 항체를 분리하는 단계를 거쳐 제조할 수 있다.In the case of egg yolk antibodies, (1) immunizing the laying hen with the recombinant CRV VP4 protein; (2) can be prepared by separating the egg yolk antibody against the recombinant CRV VP4 protein from the egg yolk of the eggs laid from the laying hen.
본 발명에 이용되는 산란계는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 산란율이 높은 백색 레그혼계, 로드아일랜드계, 하이라인 브라운계 등을 이용하는 것이 바람직하다. 산란계에 항원을 투여하는 경로로는 복멤브레인내, 근육내, 안내 또는 피하 주사 등이 포함된다. 본 발명의 항원, 즉 재조합 CRV VP4 단백질은 보조제, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 사용하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.The scattering system used in the present invention is not particularly limited, and it is preferable to use, for example, a white leghorn system, a Rhode island system, a high-line brown system, etc. having a high scattering rate. Routes for administering antigens to laying hens include intravaginal, intramuscular, intraocular or subcutaneous injection, and the like. Antigens of the invention, ie recombinant CRV VP4 protein, can be increased in immunity by using an adjuvant such as Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant.
추가 항원 접종(booster)은 충분한 항체가 얻어질 때까지 실시할 수 있다. 바람직하게는 약 2주 간격으로 약 3회 면역을 실시하고, 필요할 경우에는 6 내지 10주 간격으로 실시한다. 면역화된 산란계로부터 알을 수집하고 이로부터 목적하는 항체를 분리한 후 유도된 항체의 양을 측정하여 그 증가량이 정체 상태에 도달하면, 최종적으로 알을 회수한다.Additional antigen boosters can be performed until sufficient antibodies are obtained. Preferably, about 3 times immunization at about 2 weeks interval, and 6 to 10 weeks interval if necessary. The eggs are collected from the immunized laying hens, the desired antibodies are isolated therefrom, the amount of antibody derived is measured, and when the increase reaches a steady state, the eggs are finally recovered.
상기 유도된 항체의 양은 당업계의 통상적인 방법에 따라 측정할 수 있다. 바람직하게는, 효소면역흡착법 또는 마이크로타이터법으로 측정한다. 더욱 바람직하게는, 마이크로플레이트에 부착된 본 발명의 항원(재조합 CRV VP4 단백질)과 본 발명에 따라 면역화된 알의 난황으로부터 분리한 항체를 반응시킨 후 2차 항체를 반응시키고 여기에 기질용액을 가하여 효소작용에 의한 발색반응을 일으킨 후 특정 한 파장에서 측정함으로써 유도된 항체를 정량할 수 있는 방법인 효소 결합된 면역흡착 검사법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay: ELISA)을 사용한다.The amount of the antibody derived can be measured according to conventional methods in the art. Preferably, it is measured by enzyme immunosorbent method or microtiter method. More preferably, after reacting the antigen of the present invention (recombinant CRV VP4 protein) attached to the microplate with the antibody isolated from egg yolk of the immunized egg according to the present invention, the secondary antibody is reacted and the substrate solution is added thereto. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) is used to quantify antibodies induced by enzymatic color reaction and measurement at specific wavelengths.
본 발명의 난황 항체는 상기 회수된 알에서 난황을 분리하고, 이를 증류수로 희석한 다음, 희석액의 pH를 4.0 내지 6.0으로 조절한 후 동결시키고, 동결체를 해동시켜 원심분리하며, 형성된 상등액을 여과함으로써 분리할 수 있다. 바람직하게는 회수된 알에서 난황을 분리하고 증류수를 가하여 5배 내지 15배로 희석한 다음, 희석액의 pH를 약 5.0으로 조절한 후 -10℃ 내지 -30℃에서 10 내지 20시간 이상 동결시키고, 동결체를 실온에서 해동시켜 5,000 내지 15,000×g, 1℃ 내지 10℃에서 20 내지 40분간 원심분리하며, 형성된 상등액을 여과지로 여과하여 분리한다.Egg yolk antibody of the present invention is to separate the egg yolk from the recovered eggs, dilute it with distilled water, adjust the pH of the dilution to 4.0 to 6.0, freeze, centrifugation by thawing the frozen body, and filter the formed supernatant Can be separated. Preferably, egg yolk is separated from the recovered eggs and diluted to 5 to 15 times by adding distilled water, and then the pH of the diluted solution is adjusted to about 5.0 and then frozen at -10 ° C to -30 ° C for at least 10 to 20 hours, and frozen. The sieve is thawed at room temperature and centrifuged for 20 to 40 minutes at 5,000 to 15,000 × g, 1 ° C to 10 ° C, and the supernatant formed is separated by filtration with filter paper.
이상, 본 발명의 재조합 CRV VP 4 단백질 및 이에 대한 항체는 모두 개 로타바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는데 이용될 수 있다. 재조합 CRV VP4 단백질은 능동 면역을 통하여, 재조합 CRV VP4 단백질에 대한 항체는 수동 면역을 통하여 개 로타바이러스 감염증을 치료 또는 예방할 수 있다. 능동 면역은 병원체가 침입하였을 때 생체 스스로가 자기 몸속에 항체가 생성되게 하여 면역되는 것을 의미하고, 수동 면역은 다른 생체에서 생성된 면역체를 자신의 체내에 받아들임으로써 얻어진 면역을 의미한다.In the above, both the
이러한 기작으로 개 로타바이러스 감염증을 치료 또는 예방할 수 있는 재조합 CRV VP4 단백질 및 이에 대한 항체는 백신 및 약제학적 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다. 이러한 경우 유효성분은 단독으로 이용되기 보다는 약제학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 이용하는 것이 적합하다.Recombinant CRV VP4 protein and antibody thereof which can treat or prevent canine rotavirus infection by this mechanism can be used as an active ingredient of vaccines and pharmaceutical compositions. In this case, the active ingredient is suitably used in the form of incorporation into a pharmaceutically acceptable carrier, rather than being used alone.
여기서, 약제학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 백신 조성물과 약제학적 조성물에 이용할 수 있는 약제학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.Here, pharmaceutically acceptable carriers include carriers, excipients and diluents commonly used in the pharmaceutical art. Pharmaceutically acceptable carriers for use in the vaccine compositions and pharmaceutical compositions of the invention include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, Alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
본 발명의 백신 조성물과 약제학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.The vaccine composition and the pharmaceutical composition of the present invention are each formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, or the like, external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions according to conventional methods. Can be used.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.When formulated, it may be prepared using conventional diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, and the like. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations contain at least one excipient in the active ingredient, for example starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin It can be prepared by mixing. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc can also be used. Liquid preparations for oral use include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used diluents such as water and liquid paraffin. have. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, water-insoluble solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories. As the non-aqueous solvent and suspending agent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
특히, 액상 제제의 경우에는 박테리아 포획 필터 등을 통한 여과에 의해 살균제 등을 혼입시켜 살균하는 것이 바람직하다. 이렇게 살균된 조성물은 예를 들면 동결건조에 의해 고형화시킬 수 있으며, 사용시에 이를 무균수 또는 무균 희석액에 용해시킨다.In particular, in the case of a liquid formulation, it is preferable to mix and sterilize a bactericide by filtration through a bacterial capture filter or the like. The so sterilized composition may be solidified, for example, by lyophilization, which, in use, is dissolved in sterile water or sterile diluent.
본 발명에 따른 백신 조성물과 약제학적 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 개, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.The vaccine composition and the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered to mammals such as mice, mice, livestock, dogs, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example by oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection.
본 발명에 따른 백신 조성물과 약제학적 조성물의 투여량은 동물의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 동물에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 CRV VP4 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로 각각의 용량은 본 발명의 재조합 CRV VP4 단백질 또는 항체의 면역원량의 멸균용액 ㎖ 당 0.1 내지 1000㎍의 단백질, 바람직하게는 0.1 내지 100㎍을 함유한다. 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원자극을 수행할 수 있다.The dosage of the vaccine composition and the pharmaceutical composition according to the present invention is selected in consideration of the age, weight, sex, physical condition, etc. of the animal. The amount necessary to induce an immunoprotective response in the animal without any adverse side effects may vary depending on the presence of any of the recombinant CRV VP4 proteins and excipients used as immunogens. Generally each dose contains 0.1 to 1000 μg protein, preferably 0.1 to 100 μg per sterile solution of the immunogenic amount of the recombinant CRV VP4 protein or antibody of the invention. In the case of vaccine compositions, an initial dose may optionally be followed by optionally repeated antigen stimulation.
한편, 본 발명의 재조합 CRV VP4 단백질에 대한 항체를 통상의 사료와 혼합하여 개 아데노바이러스의 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 사료 조성물로 제조할 수도 있다. 사료로는 돼지고기, 소고기 및 닭고기 등의 부산물을 비롯하여 옥수수, 쌀, 일반 볏짚, 야초, 목초, 앤시리지, 건초, 산야초 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사육에 사용되는 사료이면 무방하다. 이러한 사료에 본 발명의 재조합 CRV VP4 단백질에 대한 항체를 첨가하여 배합하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Meanwhile, the antibody against the recombinant CRV VP4 protein of the present invention may be mixed with a conventional feed to prepare a feed composition for treating or preventing the infection of dog adenoviruses. Feeds include by-products such as pork, beef, and chicken, as well as corn, rice, rice straw, grasses, grasses, ansiridge, hay, and wild grasses, but are not limited thereto. Do. The method of adding and blending the antibody against the recombinant CRV VP4 protein of the present invention to such a feed includes a method such as mechanical mixing, adsorption, occlusion, but is not limited thereto.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the examples are only for illustrating the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention, those skilled in the art. Will be self-evident.
실시예 1 : 개 로타바이러스 균주의 확보 및 유전자 재조합Example 1 Acquisition and Gene Recombination of Canine Rotavirus Strains
1-1 : 개 로타바이러스 균주의 확보1-1: Securing Canine Rotavirus Strain
10% FBS(Gibco Co. USA)와 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco Co. USA)을 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle medium[D-MEM(Gibco Co. USA)]에 MA104 세포를 단층이 되도록 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양된 MA104 세포에 개 로타바이러스(ATCC-VR964)를 감염시켰다. CRV에 의해 감염된 MA104 세포 중 약 80%에서 세포변성(cytopathic effect, CPE)이 일어날 때까지 37℃, 5% CO2 배양기에서 약 3일간 배양하였다.37 ° C., to monolayer MA104 cells in Dulbecco's Modified Eagle medium [D-MEM (Gibco Co. USA)] with 10% FBS (Gibco Co. USA) and 1% penicillin-streptomycin (Gibco Co. USA). Incubated in a 5% CO 2 incubator. Cultured MA104 cells were infected with canine rotavirus (ATCC-VR964). Approximately 70% of MA104 cells infected with CRV were treated in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator until cytopathic effect (CPE) occurred. 3 days Incubated.
1-2 : 개 로타바이러스의 RNA 추출 및 cDNA 합성1-2: RNA Extraction and cDNA Synthesis of Canine Rotavirus
Viral gene-spinTM viral DNA/RNA Extraction kit(iNtRON Biotechnology Inc. Korea)를 사용하여 CRV 게놈 RNA를 추출하였다. 이렇게 추출한 CRV 게놈 RNA는 DNase I(TaKaRa Co. Japan)으로 처리하고 M-MLV 역전사효소(iNtRON Biotechnology Inc. Korea)를 사용하여 제조업자의 메뉴얼에 따라 제 1 가닥 cDNA를 합성하였다.CRV genomic RNA was extracted using Viral gene-spin TM viral DNA / RNA Extraction kit (iNtRON Biotechnology Inc. Korea). The extracted CRV genomic RNA was treated with DNase I (TaKaRa Co. Japan) and M-MLV reverse transcriptase (iNtRON Biotechnology Inc. Korea) was used to synthesize the first strand cDNA according to the manufacturer's manual.
1-3 : 개 로타바이러스의 VP4 단백질을 코딩하는 유전자의 재조합1-3: Recombination of the gene encoding VP4 protein of dog rotavirus
개 로타바이러스의 VP4 단백질을 코딩하는 유전자는 CRV VP4 단백질의 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR을 통하여 제조하였는데, 상기 CRV VP4 단백질의 유전자에 특이적인 프라이머는 GenBank의 data (NCBI D13401)를 기초로 하여 CRV VP4 단백질의 전장 유전자 (2.2Kb, 서열번호: 22)를 증폭할 수 있도록 제작하였다(표 1의 CVR Va-F 및 CVR Vg-R 프라이머).The gene encoding the VP4 protein of the dog rotavirus was prepared by PCR using a primer specific for the gene of the CRV VP4 protein. The primer specific for the gene of the CRV VP4 protein was based on GenBank data (NCBI D13401). Was prepared to amplify the full-length gene (2.2Kb, SEQ ID NO: 22) of the CRV VP4 protein (CVR Va-F and CVR Vg-R primers in Table 1).
한편, 본 발명에 따른 재조합 CRV VP4 단백질을 코딩하는 유전자는 앞서 제조한 cDNA를 주형으로 하고 표 1에 나타낸 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하는 PCR을 통하여 증폭하였다. 즉, DNA 주형 1.0㎕, 25mM MgCl2 4㎕, 10× EX Taq. 완충용액 5㎕, 2.5mM dNTP 4㎕, 각각의 단편에 대한 포워드 프라이머 1㎕, 리버스 프라이머 1㎕, EX Taq DNA 중합효소 (5U/㎕) 0.5㎕에 전체반응 용량이 50㎕가 되도록 증류수를 첨가하고 94℃에서 10분간 개시 변성, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 2분 동안 연장하는 사이클을 30회 반복하고, 추가로 72℃에서 10분간 연장하는 과정을 통하여 실시하였다. 이렇게 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스 겔 상에서 100V로 30분간 전기영동한 후, 에티듐 브로마이드로 염색하여 밴드를 확인하였다.On the other hand, the gene encoding the recombinant CRV VP4 protein according to the present invention was amplified by PCR using the oligonucleotide shown in Table 1 as a template as a template and prepared as a primer. Namely, 1.0 μl of DNA template, 4 μl of 25 mM MgCl 2 , 10 × EX Taq. Distilled water was added to 5 µl of buffer solution, 4 µl of 2.5 mM dNTP, 1 µl of forward primer for each fragment, 1 µl of reverse primer, and 0.5 µl of EX Taq DNA polymerase (5U / µl) so that the total reaction volume was 50 µl. Initiate denaturation at 94 ° C. for 10 minutes, denaturation at 94 ° C. for 1 minute, annealing at 55 ° C. for 1 minute, and repeating for 30 minutes at 72 ° C. for 30 minutes, and further extending at 72 ° C. for 10 minutes. Was carried out. The PCR product thus amplified was electrophoresed at 100V for 30 minutes on a 1% agarose gel, and then stained with ethidium bromide to identify a band.
도 1a에 나타낸 바와 같이 상기 PCR을 통하여 수득한 산물은 2.3kb의 CRV VP4 단백질을 코딩하는 유전자임을 확인할 수 있었다(레인 1: 1kb DNA 래더, 레인 2: PCR 산물, 레인 3: PCR 산물의 제한효소 분해산물).As shown in Figure 1a, the product obtained through the PCR was confirmed that the gene encoding the 2.3kb CRV VP4 protein (lane 1: 1kb DNA ladder, lane 2: PCR product, lane 3: restriction enzyme of PCR product) Degradation products).
* 진한 글씨는 제한효소 인식 부위를 나타낸다.Dark text indicates restriction enzyme recognition sites.
한편, 본 발명에 따른 재조합 CRV VP4 단백질을 코딩하는 유전자는 앞서 제조한 cDNA를 주형으로 하고 표 1에 나타낸 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하는 PCR을 통하여 증폭하였다. 즉, DNA 주형 1.0㎕, 25mM MgCl2 4㎕, 10×EX Taq. 완충용액 5㎕, 2.5mM dNTP 4㎕, 각각의 단편에 대한 포워드 프라이머 1㎕, 리버스 프라이머 1㎕, EX Taq DNA 중합효소 (5U/㎕) 0.5㎕에 전체반응 용량이 50㎕가 되도록 증류수를 첨가하고 94℃에서 10분간 전 변성, 94℃에서 1분간 변성, 57℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 2분 동안 연장하는 사이클을 30회 반복하고, 추가로 72℃에서 10분간 연장하는 과정을 통하여 실시하였다. 이렇게 증폭된 PCR 산물은 1.2% 아가로스 겔 상에서 100V로 30분간 전기영동한 후, 에티듐 브로마이드로 염색하여 밴드를 확인하였다.On the other hand, the gene encoding the recombinant CRV VP4 protein according to the present invention was amplified by PCR using the oligonucleotide shown in Table 1 as a template as a template and prepared as a primer. Namely, 1.0 μl of DNA template, 4 μl of 25 mM MgCl 2 , 10 × EX Taq. Distilled water was added to 5 µl of buffer solution, 4 µl of 2.5 mM dNTP, 1 µl of forward primer for each fragment, 1 µl of reverse primer, and 0.5 µl of EX Taq DNA polymerase (5U / µl) so that the total reaction volume was 50 µl. And 10 cycles of total denaturation at 94 ° C for 10 minutes, 1 minute at 94 ° C for 1 minute, annealing at 57 ° C for 1 minute, and extended for 2 minutes at 72 ° C for 30 minutes, and further extended at 72 ° C for 10 minutes. Was carried out. The PCR product thus amplified was electrophoresed at 100V for 30 minutes on a 1.2% agarose gel, and then stained with ethidium bromide to identify a band.
상기 전기영동 분석 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 344, 362, 314, 331, 353, 353, 317bp(CRV Va, CRV Vb, CRV Vc, CRV Vd, CRV Ve, CRV Vf, CRV Vg)의 크기를 갖는 재조합 CRV VP4 단백질을 코딩하는 유전자 7개가 확인되었다(레인 1: 100bp DNA 래더, 레인 2: CRV Va, 레인 3: CRV Vb, 레인 4: CRV Vc, 레인 5: CRV Vd, 레인 6: CRV Ve, 레인 7: CRV Vf, 레인 8: CRV Vg).As a result of the electrophoresis analysis, the size of 344, 362, 314, 331, 353, 353, 317bp (CRV Va , CRV Vb , CRV Vc , CRV Vd , CRV Ve , CRV Vf , CRV Vg ) Seven genes encoding the recombinant CRV VP4 protein having were identified (lane 1: 100 bp DNA ladder, lane 2: CRV Va, lane 3: CRV Vb, lane 4: CRV Vc, lane 5: CRV Vd, lane 6: CRV Ve). Lane 7: CRV Vf, lane 8: CRV Vg).
확보된 PCR 산물을 도 1c에 나타낸 바와 같이 pGEM T easy vector(Promega Co, USA)에 클로닝하여 GenBank의 데이터베이스를 기초로 하여 염기서열을 확인하였고 분석된 염기서열의 상동성을 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST 프로그램으로 비교하였다. 그 결과, CRV VP4 단백질의 유전자와 99%의 유사성을 나타내었다.The obtained PCR product was cloned into pGEM T easy vector (Promega Co, USA) as shown in FIG. 1C to confirm the base sequence on the basis of GenBank's database, and the homology of the analyzed base sequence to the US National Center for NCBI Comparison was made with the BLAST program provided by Biotechnology Information. As a result, it showed 99% similarity with the gene of CRV VP4 protein.
실시예 2: 재조합 발현 벡터 구축과 단백질 발현 및 확인Example 2: Recombinant Expression Vector Construction and Protein Expression and Identification
2-1 : 재조합 발현 벡터 구축2-1: Recombinant Expression Vector Construction
앞서 확보한 7개의 재조합 CRV VP4 단백질의 유전자에 대한 양성 클론을 선발하여 각각의 플라스미드를 제한 효소 BamH I과 Sal I으로 절단하여 얻어진 344, 362, 314, 331, 353, 353, 317bp (CRV Va, CRV Vb, CRV Vc, CRV Vd, CRV Ve, CRV Vf, CRV Vg)의 DNA 단편과 동일한 제한효소로 절단하여 준비한 발현 벡터 pMAL-c2x를 라이게이션하였다(도 2a 참조). 이를 E. coli 컴페턴트 JM109에 형질전환시켜 양성 클론을 선택하였다.344, 362, 314, 331, 353, 353, and 317 bp (CRV Va ,) obtained by selecting positive clones for the genes of the seven recombinant CRV VP4 proteins previously obtained and cleaving each plasmid with restriction enzymes BamH I and Sal I The expression vector pMAL-c2x prepared by cleavage with the same restriction enzyme as the DNA fragment of CRV Vb , CRV Vc , CRV Vd , CRV Ve , CRV Vf , CRV Vg ) was ligated (see FIG. 2A). This was transformed into E. coli competent JM109 to select positive clones.
그로부터 재조합 발현 벡터를 분리한 후 제한효소 BamH I과 Sal I으로 절단하여 아가로스 겔을 이용하여 전기영동해본 결과 도 2b에 나타낸 바와 같이 재조합 CRV VP4 단백질을 코딩하는 유전자 7개가 확인되었다 (레인 1: λ DNA HindⅢ 크기 마커, 레인 2 : pDMCRVva, 레인 3 : pDMCRVvb, 레인 4: pDMCRVvc, 레인 5: pDMCRVvd, 레인 6: pDMCRVvf, 레인 7: pDMCRVvg, 레인 8: 100bp 래더 마커).The recombinant expression vector was separated therefrom, digested with restriction enzymes BamH I and Sal I, and subjected to electrophoresis using agarose gel. As shown in FIG. 2B, seven genes encoding the recombinant CRV VP4 protein were identified (lane 1: λ DNA HindIII size marker, lane 2: pDMCRVva, lane 3: pDMCRVvb, lane 4: pDMCRVvc, lane 5: pDMCRVvd, lane 6: pDMCRVvf, lane 7: pDMCRVvg, lane 8: 100 bp ladder marker).
2-2 : 대장균을 이용한 재조합 CRV VP4 단백질의 발현 및 분리2-2: Expression and Isolation of Recombinant CRV VP4 Protein Using Escherichia Coli
상기에서 얻어진 양성 클론을 취하여 100㎍ 암피실린이 첨가된 5㎖의 LB broth(Merck co.)에 접종한 후, 37℃, 200rpm에서 12~16시간동안 진탕배양한 후 배양된 세포를 100㎍ 암피실린이 첨가된 100㎖의 LB broth에 접종하여 37℃, 200rpm으로 흡광도(OD600)가 0.5-0.6이 될 때까지 배양하였다. 흡광도(OD600)가 0.5-0.6이 되면 0.3mM의 IPTG(isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside, DUCHEFA Co. Netherland)를 첨가한 후 3시간 30분-4시간 동안 배양하였다. 배양물은 6,000rpm으로 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 균체를 회수한 후 세포 용해 완충용액(100mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM imidazole, pH 8.0)으로 재 현탁하고, 리소자임을 1㎎/㎖로 첨가하여 얼음에서 15분간 방치하였다. 이러한 과정을 통하여 용해된 세포를 초음파 분쇄기(BRANSON SONIFIER 450, Branson Ultrasonic. USA)를 이용하여 분쇄한 후 4℃, 10,000×g에서 20분 동안 원심분리하여 상등액과 펠렛을 별도로 수집하여 재조합 CRV VP4 단백질을 수득하였다.The positive clones obtained above were taken and inoculated into 5 ml of LB broth (Merck co.) To which 100 μg ampicillin was added, followed by shaking culture at 37 ° C. and 200 rpm for 12 to 16 hours. Inoculated with 100 ml of LB broth added and incubated at 37 ° C. and 200 rpm until the absorbance (OD 600 ) became 0.5-0.6. When the absorbance (OD 600 ) was 0.5-0.6, 0.3 mM IPTG (isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside, DUCHEFA Co. Netherland) was added, and then incubated for 3 hours 30 minutes-4 hours. The culture was collected by centrifugation at 6,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to recover the cells, and then resuspended in cell lysis buffer (100 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) and
2-3 : 재조합 CRV VP4 단백질의 분석2-3: Analysis of Recombinant CRV VP4 Protein
앞서 수득한 단백질이 CRV VP4 절단된 단백질인지 여부는 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 이 때, SDS-폴리아크릴아미드 겔 두 장을 동시에 만들어 사용하였고, 단백질 역시 동일한 1.5㎖ 튜브에서 조작한 단백질을 절반씩 나누어 SDS-폴리아크릴아미드 겔 두 장에 각각 로딩하고 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 후 한 장은 쿠사미 블루 R-250(SIGMA Co. USA)으로 염색하여 육안으로 단백질의 양상을 보았고, 다른 한 장은 나일론 멤브레인(Amersham Pharmacia Biosciences, UK)에 블로팅시킨 후 3% BSA/PBS로 4℃에서 16시간 블로킹시켰다. 이후 멤브레인을 TBST(100mM Tris-Cl pH7.5, 0.9% NaCl, 0.1% Tween 20)로 1회 세정하고, 일차 항체로 항-MBP 항체(NEB Co. USA)를 20,000배 희석하여 실온에서 한 시간 반응시키고, TBST로 3차례 세정하였다. 여기에 이차 항체로 알칼리성 포스파타제 콘쥬게이티드 항-래비트 IgG(Sigma Co. USA)를 10,000배 희석하여 그 희석액을 멤브레인에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 멤브레인은 TBST로 3차례 각각 5분씩 세정하고, TNM(100mM Tris-Cl pH9.5, 100mM NaCl, 5mM MgCl2)으로 1회 세정한 다음 BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate, Amersham Pharmacia Bioscience, UK)와 NBT(Nitro blue tetrazolium, Amersham Pharmacia Bioscience, UK)로 발색반응을 유도하였다.Whether the protein obtained previously was a CRV VP4 truncated protein was confirmed by Western blot analysis. At this time, two sheets of SDS-polyacrylamide gel were simultaneously made and used, and the proteins were also loaded into two SDS-polyacrylamide gels in half and each was subjected to electrophoresis. After electrophoresis, one sheet was stained with Kusami Blue R-250 (SIGMA Co. USA) to visually see the protein, and the other sheet was blotted onto a nylon membrane (Amersham Pharmacia Biosciences, UK) and then 3% BSA. Blocked at 4 ° C. for 16 hours with / PBS. The membrane was then washed once with TBST (100 mM Tris-Cl pH7.5, 0.9% NaCl, 0.1% Tween 20), and the anti-MBP antibody (NEB Co. USA) was diluted 20,000 times with the primary antibody for 1 hour at room temperature. The reaction was carried out and washed three times with TBST. Here, a 10,000-fold dilution of alkaline phosphatase conjugated anti-rabbit IgG (Sigma Co. USA) with a secondary antibody was added to the membrane and allowed to react for 1 hour at room temperature. The membranes were then washed three times with TBST for 5 minutes each, once with TNM (100 mM Tris-Cl pH9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ) and then BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl). Phosphate, Amersham Pharmacia Bioscience, UK) and NBT (Nitro blue tetrazolium, Amersham Pharmacia Bioscience, UK) induced color development.
도 2c에 나타낸 바와 같이 레인 3-8에서 약 50-60kDa 크기의 단백질이 검출됨을 확인할 수 있었다(레인 1: 단백질 분자량 마커 (BIO-RAD, USA); 레인 2~8: 재조합 CRV Va~Vg 단백질). 이는 대장균에서 발현시킨 단백질이 항-MBP 항혈청과 특이적으로 반응하여 나타난 결과이고, 이로써 대장균에서 유도되어 발현된 단백질은 재조합 CVR Va~Vg 단백질임이 확인되었다.As shown in Figure 2c it was confirmed that the size of about 50-60kDa protein is detected in lanes 3-8 (lane 1: protein molecular weight marker (BIO-RAD, USA); lanes 2-8: recombinant CRV Va ~ Vg protein ). This is a result of the protein expressed in E. coli specifically reacted with anti-MBP antiserum, thereby confirming that the protein expressed in E. coli is a recombinant CVR Va ~ Vg protein.
2-4 : 재조합 CRV VP4 단백질의 정제 및 단백질의 농도 분석2-4: Purification of recombinant CRV VP4 protein and analysis of protein concentration
재조합 CRV VP4 단백질을 pMALTM protein fusion and purification system(NEB Co. USA)을 사용하여 정제하였다. 실시예 2-2를 참조하여 1ℓ의 LB broth에 균을 배양하고 원심분리한 후 균체를 확보하였고, 회수된 세포를 초음파 분쇄기로 분쇄하고 상등액만을 수거하여 상기 키트내에 포함된 수지와 혼합한 후 4℃에서 교반하면서 3시간동안 반응시켰다. 그 후 글래스 울을 장착하여 프로필렌글리콜 튜브에 앞서 반응시킨 단백질 수용액을 로딩하였다. 이 후 모든 과정은 제조업자의 메뉴얼에 따라 진행하였다. 또한 BCA(Bicinochoninic acid) Kit(Pierce Co.)를 사용하여 상기에서 획득한 정제된 재조합 CRV VP4 단백질 농도를 확인하였다.Recombinant CRV VP4 protein was purified using pMAL ™ protein fusion and purification system (NEB Co. USA). After incubating the bacteria in 1 L LB broth and centrifuging with reference to Example 2-2, the cells were secured. The recovered cells were crushed with an ultrasonic grinder, and only the supernatant was collected and mixed with the resin contained in the kit. The reaction was carried out for 3 hours with stirring at ℃. Thereafter, glass wool was loaded to load the aqueous protein solution reacted with the propylene glycol tube. After this, all procedures were performed according to the manufacturer's manual. In addition, the purified recombinant CRV VP4 protein concentration was obtained using the BCA (Bicinochoninic acid) Kit (Pierce Co.).
실시예 3 : 재조합 CRV VP4 단백질의 면역원성 조사Example 3: Immunogenicity Study of Recombinant CRV VP4 Protein
3-1 : 재조합 CRV VP4 단백질에 대한 항혈청 제조3-1: Antiserum Preparation for Recombinant CRV VP4 Protein
상기 실시예 2에서 획득한 재조합 CRV VP4 단백질에 대한 면역원성테스트를 실시하기 위해 8주령의 BALB/C 마우스(Samtako BioKorea. Korea)에 면역을 실시하였다. 재조합 CRV VP4 단백질 8종과 불활성화시킨 바이러스를 프라운즈 컴플리트 보조제(Sigma Chemical co.)와 동량으로 혼합하여 유화시켰다. 그 유화액 0.5㎖을 근육 주사하였으며, 추가 접종은 1차 접종 후 2주 간격으로 프라운즈 인컴플리트 보조제(Sigma Chemical co.)로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 총 2회 실시하였다. 각 접종 전에 마우스로부터 채혈하여 혈청을 분리하여, ELISA로 면역원성이 나타나는지 항체가를 통하여 확인하였다.In order to carry out an immunogenicity test for the recombinant CRV VP4 protein obtained in Example 2, immunization was performed to 8-week-old BALB / C mice (Samtako BioKorea. Korea). Eight recombinant CRV VP4 proteins and the inactivated virus were emulsified by mixing in equal amounts with the Frauns Complete Adjuvant (Sigma Chemical Co.). 0.5 ml of the emulsion was injected intramuscularly, and further inoculation was emulsified with a Freund's incomplete adjuvant (Sigma Chemical Co.) at two week intervals after the first inoculation, and performed twice in the same manner as the first inoculation. Blood was collected from mice before each inoculation, and serum was separated, and the antibody titer was confirmed by immunoassay for immunogenicity by ELISA.
도 3 및 표2에 나타낸 바와 같이 CRV Vd가 가장 높은 항체가(16,000)를 나타내었다. 또한 CRV 바이러스 자체를 면역한 것은 21,000으로 나타났으며 나머지 단백질의 항체가는 2,500, 2,700, 2,800 (CRV Vb, CRV Vc, CRV Vg )으로 나타났다.As shown in FIG. 3 and Table 2, the antibody having the highest CRV Vd (16,000) was shown. In addition, the immunity of the CRV virus itself was 21,000, and the antibody titers of the remaining proteins were 2,500, 2,700 and 2,800 (CRV Vb, CRV Vc, CRV Vg).
3-2: 재조합 CRV VP4 단백질에 대한 항혈청을 이용한 중화 테스트3-2: Neutralization test using antiserum against recombinant CRV VP4 protein
앞서 생산된 CRV VP4 단백질에 대한 각 항혈청이 CRV에 대하여 중화 효과를 발휘하는지 알아보기 위해 혈구응집억제반응(Hemagglutinin inhibition test)을 실시하여 중화 테스트를 실시하였다. 각 항혈청을 10배부터 2배씩 희석하여 96구판(NUNC,)에 분주하였다. 4HA CRV 바이러스를 동량 분주하고 37℃에서 1시간 반응시킨 후 1% 적혈구(RBC)를 50㎕ 분주하여 잘 혼합한 후 25℃에서 40분간 정치시킨 후 혈구응집반응을 관찰하였다. 이와 같은 혈구응집반응을 항혈청별로 3 반복으로 수행하였다.In order to determine whether the antiserum of each of the above-produced CRV VP4 protein has a neutralizing effect on CRV, hemagglutinin inhibition test was performed to conduct a neutralization test. Each antiserum was diluted from 10-fold to 2-fold, and dispensed into 96 spheres (NUNC,). An equal amount of 4HA CRV virus was reacted at 37 ° C. for 1 hour, and 50 μl of 1% red blood cells (RBC) were mixed and mixed well. After standing at 25 ° C. for 40 minutes, the hemagglutination reaction was observed. This hemagglutination reaction was performed three times for each antiserum.
표 2에 나타낸 바와 같이 항-CRV Vd에서 가장 우수한 중화 성적을 보여주었다.As shown in Table 2, it showed the best neutralization score in anti-CRV Vd.
실시예 4 : 재조합 CRV VP4 단백질을 이용한 난황 항체 생산 및 확인Example 4 Egg Yolk Antibody Production and Identification Using Recombinant CRV VP4 Protein
4-1 : 재조합 CRV VP4 단백질에 대한 난황 항체의 생산4-1: Production of Egg Yolk Antibody Against Recombinant CRV VP4 Protein
상기 실험에서 획득한 재조합 CRV VP4 단백질에 대한 항체 생산을 위해 28주령의 ISA-브라운계 산란계에 면역을 수행하였다. 산란계의 사육 및 사양관리는 경기도 H농장에서 수행하였으며, 정제된 재조합 CRV VP4 단백질과 프라운즈 컴플리트 보조제(Sigma Chemical Co.)를 각각 동량 혼합하여 유화하였다. 상기 유화액 1㎖를 산란계의 흉근에 0.25㎖씩 4곳에 근육 주사하였으며, 추가 접종은 1차 접종 후 2주 간격으로 프라운즈 인컴플리트 보조제(Gibco Co. USA)로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 총 3회 실시하였다. 각 접종 전에 산란계의 익하정맥에서 채혈하여 혈청을 분리하고 이를 -20℃에 저장하였고 난은 매일 회수하여 8℃의 저온실에 저장하여 실험에 이용하였다.Immunization was performed on 28-week-old ISA-Brown laying hens for antibody production against the recombinant CRV VP4 protein obtained in this experiment. Breeding and feeding control of the laying hens was carried out in H farm, Gyeonggi-do, and emulsified by mixing the same amount of purified recombinant CRV VP4 protein and Frowns complete adjuvant (Sigma Chemical Co.). 1 ml of the emulsion was intramuscularly injected into four places of 0.25 ml in the hen's pectoral muscle, and the additional inoculation was emulsified with a Freund's incomplete adjuvant (Gibco Co. USA) every two weeks after the first inoculation in the same manner as the first inoculation. Three times in total. Before each inoculation, blood was collected from the subarcacular vein of the laying hens and serum was separated and stored at -20 ° C. Eggs were collected daily and stored in a low temperature room at 8 ° C for use in the experiment.
4-2 : 산란계의 난황으로부터 난황 항체의 확인4-2: Confirmation of Egg Yolk Antibody from Egg Yolk of Laying Hens
분리한 항혈청과 난황으로부터 재조합 CRV VP4 단백질에 대한 항체가를 분석하기 위해 ELISA를 실시하였다. 재조합 CRV VP4 단백질을 5㎍/㎖이 되도록 카르보네이트-비카르보네이트 완충용액(pH 9.6)으로 희석하여 MicrotestⅢ flexible assay plate(Falcon 3911, BD Biosciences, USA)의 각 구에 100㎕씩 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 코팅이 완료된 플레이트를 세정용 완충용액(PBST, 0.02M NaH2PO4, 0.13M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.2)으로 3회 세정한 후 3% BSA(bovine serum albumin, pH 7.3, Sigma Co. USA)/PBS을 각 구에 175㎕씩 분주한 후 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. PBST로 5번 세정하고 3% BSA/PBS와 세정용 완충용액(PBST, phosphate buffered saline-Tween 20)을 동량으로 섞은 희석 완충용액을 이용하여 수득한 항혈청과 난황을 각각 2,000배 희석하여 3배씩 연속적으로 희석한 후 상기 재조합 CRV VP4 단백질이 코팅된 구에 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 2차 항체로는 알칼리성 포스파타제 콘쥬게이티드 래비트 항-치킨 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. USA)를 5,000배로 희석하여 37℃에서 2시간 동안 상기 판의 구에 분주하여 반응시켰다. 기질 완충용액으로는 인산 기질 타블렛(ρ-nitrophenyl phosphate, PIERCE Co. USA)을 0.5mM MgCl2 가 포함된 10% 디에탄올아민(pH 9.8)에 용해시킨 용액을 사용하여 37℃에서 20분간 반응시켰다. 정지 용액으로 5M NaOH을 사용하여 반응을 블로킹시킨 후 마이크로 플레이트 리더(EL-800, BIO-TEK Instrument Inc. USA)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 반응을 조사하였다.ELISA was performed to analyze the antibody titer of the recombinant CRV VP4 protein from the antiserum and egg yolk isolated. Dilute the recombinant CRV VP4 protein to 5 μg / ml with carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.6) and dispense 100 μl into each sphere of the Microtest III flexible assay plate (Falcon 3911, BD Biosciences, USA). Coating overnight at 4 ° C. The coated plate was washed three times with a washing buffer (PBST, 0.02M NaH 2 PO 4 , 0.13M NaCl, 0.05
도 4에 나타낸 바와 같이 항체가는 면역 후 3주부터 꾸준하게 항체가가 상승하다가 6주에 최고의 항체가를 나타내었다(항체가 약 500,000). 그 후부터는 항체가가 측정 만료일까지 일정수준 유지되는 경향을 보여주었다. 이와 같은 현상은 면역 직후부터 2주경까지 혈중에 형성된 항체가 3주경부터 난황으로 이전되어 축적됨으로써 나타나는 현상으로 추정된다.As shown in FIG. 4, the antibody titer steadily increased from 3 weeks after immunization, and showed the highest antibody titer at 6 weeks (antibody is about 500,000). From then on, antibody titers tended to remain constant until the measurement expiration date. This phenomenon is presumed to be caused by the accumulation of antibodies formed in the blood from the
4-3 : 난황 항체의 분리4-3: Isolation of Egg Yolk Antibodies
면역 접종한 산란계로부터 수득한 알을 채집하여 김 등(1998, 석사학위논문, 단국대학교)의 방법에 의해 난황 단백 부분을 분리하였다. 먼저, 채집된 알에서 난황만을 분리하여 증류수로 10배 희석하였다. 희석된 난황 용액을 pH 5.0으로 조절한 후 -20℃에서 하룻밤 동안 동결하였다. 동결된 난황을 실온에서 해동시킨 후 30분간 4℃에서 10,000×g 로 원심분리하여 상등액를 수거하였다. 상등액을 여과하여 수용성 분획(WSF)을 분리하여 동결 건조한 후 보관하였다. 난황 항체의 정제를 위해 DEAE를 이용한 이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)를 실시하였다. 즉, DEAE가 함유된 컬럼에 0.025M 인산 완충용액으로 평형시키고 컬럼에 난황 항체가 포함된 0.025M 인산 완충용액을 분주한 후 컬럼을 세척해 주고, 0.25M 인산 완충용액(pH 8.0)으로 용출하였다. 이 때 용출된 단백질을 튜브 당 3㎖씩 분획하고 분광광도계를 이용하여 280nm에서 흡광도를 측정하여 정제여부를 확인하였다.Eggs obtained from the inoculated egg hens were collected and egg yolk proteins were separated by Kim et al. (1998, MS Thesis, Dankook University). First, only egg yolk was separated from the collected eggs and diluted 10-fold with distilled water. The diluted egg yolk solution was adjusted to pH 5.0 and frozen overnight at -20 ° C. The frozen egg yolk was thawed at room temperature and centrifuged at 10,000 x g at 4 ° C for 30 minutes to collect the supernatant. The supernatant was filtered to separate the aqueous fraction (WSF) and freeze-dried and stored. Ion-exchange chromatography using DEAE was carried out to purify egg yolk antibodies. That is, equilibrate with 0.025M phosphate buffer in a column containing DEAE, dispense 0.025M phosphate buffer solution containing egg yolk antibody in the column, wash the column, and elute with 0.25M phosphate buffer (pH 8.0). . At this time, the eluted protein was fractionated by 3 ml per tube and purified by measuring the absorbance at 280 nm using a spectrophotometer.
실시예 5 : 난황 항체를 이용한 임상시험Example 5 Clinical Trials Using Egg Yolk Antibodies
5-1 : 시험동물 및 시험설계5-1: Test animal and test design
난황 항체를 이용한 임상실험은 개시체중 3.38±0.7(SD)의 2개월령 미만의 교잡종 이유자견 24두 공시하여 14일간 사양시험을 실시하였다. 시험설계는 다음과 같이 하였다.Clinical trials using egg yolk antibody were performed for 24 days with 14 dogs of weaning and weaning age of 3.38 ± 0.7 (SD). The test design was as follows.
(1) 대조구 ; 일반 동결건조 난황 1g/일 투여군(1) control; Normal lyophilized yolk 1g / day administration group
(2) 저농도 처리구 (LAB) : CRV Vd에 대한 난황 항체를 함유한 난황 항체 1g/일 투여군(2) Low concentration treatment (LAB): 1g / day administration group of egg yolk antibody containing egg yolk antibody against CRV Vd
(3) 고농도 처리구 (HAB) : CRV Vd에 대한 난황 항체를 함유한 난황 항체 3g/일 투여군(3) High concentration treatment group (HAB): 3g / day egg yolk antibody containing yolk antibody against CRV Vd
5-2 : 사양관리 및 난황 항체, CRV의 투여5-2: Administration of specification control and yolk antibody, CRV
모든 자견은 각각의 대사 케이지에 1마리씩 분리 사육하였다. 시험기간 동안 일반 이유자견용 사료(2~5kg용)를 급여하였고 사료 급여량은 자견에 있어 일반적인 일일 급여 권장량인 체중의 3%를 오전, 오후로 나누어 두 차례 급여하였다. 시험 개시일부터 종료일까지 난황 항체 및 일반 난황 분말을 경구 투여하였고, 시험 개시 후 3일, 4일에 CRV (6×105 pfu/ml)를 경구 투여하여 육안으로 기력상실, 식욕부진, 설사정도, 눈과 코 분비물, 구토, 폐사율을 점검하였다.All dogs were bred separately in each metabolic cage. During the test period, the diet was given for the general weaning diet (for 2 ~ 5kg), and the feeding amount was provided twice in the morning and afternoon divided by 3% of the body's recommended daily daily salary. The yolk antibody and normal yolk powder were orally administered from the start of the test to the end of the test. CRV (6 × 10 5 pfu / ml) was orally administered on the 3rd and 4th days of the test, and the visual loss, loss of appetite, diarrhea, Eye and nasal discharge, vomiting and mortality were checked.
도 5a 및 표 2에 나타낸 바와 같이 14일간의 시험 기간동안 모든 처리구의 폐사율은 0 %였으며, 눈과 코의 분비물은 대조구가 71%로 LAB 43% 및 HAB 33%와 비교하여 높은 발생율을 나타내었으며, 식욕부진과 기력상실은 대조구가 각 처리구보다 높았다.As shown in Fig. 5a and Table 2, the mortality rate of all treatments was 0% during the 14-day test period, and the secretion of eyes and nose was 71% in the control group, which was higher in comparison with LAB 43% and HAB 33%. In contrast, control loss and loss of appetite were higher in the control than in the treatments.
5-3 : 분석항목5-3: Analysis Items
개 로타바이러스 항체의 진단을 위해 자견 정맥에서 시험 개시일, 3일, 5일, 7일, 10일, 14일에 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 시험 자견으로부터 얻은 혈청에서 IgG 역가를 분석하기 위해 ELISA를 실시하였다. CRV 바이러스 배양액을 3회 동결 융해시킨 후 2500rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 채취하였다. 채취한 상등액 100㎖당 7% 폴리에틸렌글리콜(PEG M. W.6000)과 2.3g의 NaCl을 첨가하여 4℃에서 16시간 교반한 후 1000g에서 30분 동안 원심분리한 후 침전물을 수확하였다. 침전물은 TEN(Tris 10mM, EDTA 1mM, NaCl 100mM, pH7.4) 완충액을 처음 양의 1/10농도로 산정하여 재 용해시켜 ELISA를 위한 항원으로 사용하였다. CRV 항원 220㎕를 11㎖의 카르보네이트-비카르보네이트 완충용액(pH 9.6)으로 희석하여 MicrotestⅢ flexible assay plate(Falcon 3911, BD Biosciences, USA)의 각 구에 100㎕씩 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 코팅이 완료된 플레이트를 세정 완충용액(PBST, 0.02M NaH2PO4, 0.13M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.2)로 3회 세정한 후 3% BSA(bovine serum albumin, pH 7.3, Sigma Co. USA)/PBS을 각 구에 175㎕씩 분주한 후 2시간 동안 37℃에서 배양하고, 이어서 PBST로 5번 세정하였다. 3% BSA/PBS와 세정 완충용액(PBST, phosphate buffered saline-Tween 20)을 동량으로 섞은 희석 완충용액을 이용하여 혈청을 10배 희석하여 3배씩 연속적으로 희석한 후, 상기 CRV 항원이 코팅된 구에 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 2차 항체로는 알칼리성 포스파타제 콘쥬게이티드 도그 IgG 항체(Kirkegaard and Perry Laboratories Inc. Gaithersburg, MD)를 2,500배로 희석하여 37℃에서 2시간 동안 상기 플레이트의 구에 분주하여 반응시켰다. 기질 완충용액으로는 포스페이트 기질 타블렛(ρ-nitrophenyl phosphate, PIERCE Co. USA)을 0.5mM MgCl2 가 포함된 10% 디에탄올아민(pH 9.8)에 용해시킨 용액을 사용하여 37℃에서 20분간 반응시켰다. 정지 용액으로 5M NaOH을 사용하여 반응을 블로킹시킨 후 마이크로플레이트 리더 (EL-800, BIO-TEK Instrument Inc. USA)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 반응을 조사하였다.Serum was isolated from blood from the veins of the dogs for the diagnosis of canine rotavirus antibody at the start of the test, 3, 5, 7, 10, and 14 days. ELISA was performed to analyze IgG titers in serum from test subjects. The supernatant was harvested by freezing and thawing CRV virus cultures three times and centrifuging at 2500 rpm for 10 minutes. 7% polyethylene glycol (PEG MW6000) and 2.3 g of NaCl were added per 100 ml of the collected supernatant, followed by stirring at 4 ° C. for 16 hours, followed by centrifugation at 1000 g for 30 minutes, to obtain a precipitate. The precipitate was re-dissolved by TEN (
도 5b에 나타낸 바와 같이 시험 자견에서 획득한 혈청에서 IgG 항체가를 측정한 결과 시험 종료일인 14일 째에 대조구는 시험 시작일 보다 IgG 항체가가 약 20배 높아졌으나, LAB는 IgG 항체가가 7일째에 약 2배 감소하였으며 실험 종료일에는 IgG 항체가가 시험 시작일과 유사하였다. 또한, HAB는 7일째까지 항체가가 일정수준 유지하였으며, 시험 종료일에는 IgG 항체가가 약 4배 증가하였다. 바이러스 투여하고 4일 후 대조구는 각 난황 항체 처리구(LAB, HAB)보다 IgG 항체가가 각각 7배, 4배 높았다. 대조구와 각 난황 항체 처리구는 유의적인 차이가 있었으며(P < 0.1), LAB와 HAB는 유의적인 차이가 없었다. 이는 실험 기간동안 대조구에서 콧물이 나오는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 분비물로 인하여 환축의 재감염이 일어나 IgG 항체가가 증가하였을 것이라고 사료된다.As shown in FIG. 5B, IgG antibody titers were measured in serum obtained from the test subjects. On the 14th day of the test end date, the control group had about 20 times higher IgG antibody titer than the test start date. At about the end of the experiment, IgG antibody titers were similar to the start of the test. In addition, HAB maintained a constant level of antibody titer until
본 발명에 따른 재조합된 개 로타바이러스 VP4 단백질과 이에 대한 항체는 개 로타바이러스에 대한 감염증을 보다 효율적으로 치료 또는 예방하는데 유용될 수 있다.The recombinant canine rotavirus VP4 protein and antibodies thereto according to the present invention can be useful for more effectively treating or preventing infection with canine rotavirus.
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