KR100806696B1 - 합성 고분자 및 천연고분자를 포함하는 세포 배양용 혼합지지체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 상기 소수성 합성고분자에 초산을 첨가한 다음 친수성 천연고분자를 첨가하거나 또는 상기 소수성 합성고분자와 친수성 천연고분자의 혼합물에 초산을 첨가하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 물을 첨가하여 소수성 합성고분자와 친수성 천연고분자의 혼합용액을 제조하는 단계를 포함하는 생분해성 소수성 합성고분자와 생체적합성 친수성 천연고분자의 혼합 지지체의 제조방법, 그리고 혼합 지지체에 관한 것이다.

세포, 지지체, 스캐폴드, 합성고분자, 천연고분자, 초산

Description

합성 고분자 및 천연고분자를 포함하는 세포 배양용 혼합 지지체{Composite Scaffolds for Cell Culture Comprising Synthetic and Naturally Occurring Polymeric Materials}

도 1은 본 발명의 방법에 의해 제조된 PLCL[poly(lactide-co-caprolactone)]과 콜라겐-FITC(10:1 질량비)의 혼합 지지체를 절개하고 이를 형광 현미경으로 촬영한 사진이다. 좌측 패널은 40배율, 우측 패널은 100배율.

도 2는 본 발명의 혼합 지지체에 대한 세포 증식능 분석 결과를 보여주는 그래프이다. "Col"은 콜라겐을 나타낸다.

도 3a-도 3e는 각각 클로로포름을 용매로 하여 제조된 PLCL 지지체, 초산을 용매로 하여 제조된 PLCL 지지체, 초산을 공용매로 하여 제조된 PCLC과 콜라겐의 혼합 지지체, 초산을 공용매로 하여 제조된 PCLC과 히알루론산의 혼합 지지체, 초산을 공용매로 하여 제조된 PCLC과 키토산의 혼합 지지체의 단면에 대한 전자현미경 사진이다.

본 발명은 합성 고분자 및 천연고분자를 포함하는 세포 배양용 혼합 지지체에 관한 것이다.

세포 배양용 지지체, 스캐폴드로써 생분해성 합성고분자의 용도가 넓어지고 있다. 특히, PGA(Polyglicolide)와 같은 지방성 폴리에스테르와 PLA(polylactide), PCL(Poly-ε-caprolactone) 또는 그의 공중합체에 관한 연구가 활발히 진행 중이다[1-4].

적합한 스케폴드가 되기 위해서는, 적당한 생분해성과 물리적 안정성, 생분해 속도와 주변조직과의 융화성이 우수해야 한다. 최근의 보고에 따르면, 스캐폴드의 물리적인 자극에 의해 SMCs(Smooth muscle cells)의 표현형질을 조절한다[5-10]. 이러한 논문들에 개시된 바와 같이, 스캐폴드는 물리적인 자극에 의해서 고유의 물성을 유지해야 하고 세포와의 접착력이 우수하여 물리적인 자극이 세포에 직접적으로 전달되어야 하는 이유로 스캐폴드는 탄성과 복원력이 우수하여야 한다.

이러한 재료에 관하여 최근 PGA와 PCL의 공중합체인 PLCL[poly(lactide-co-caprolactone)]에 대한 합성법 개발과 평가가 이루어지고 있다 [11]. 그러나 PLCL은 콜라겐과 같은 수용성 천연고분자와 비교해서 세포친화력은 상대적으로 낮은 수준이다. 특히, 인간유래 섬유아세포(Human dermal fibroblast)에 대해서는 세포접합력과 세포성장에 있어 열악한 환경을 제공한다.

따라서 인장강도, 탄성 및 복원력 등의 물리적 특성을 유지함과 동시에 세포 친화력을 높이는 재료의 필요성이 요구되고 있다.

한편, 콜라겐, 히알루론산 및 키토산 같은 천연고분자는 세포친화력과 생리적 안전성이 우수하여 조직공학의 분야에서 많이 활발히 사용되고 있지만 그 가격이 고가이고 물성이 약하여 높은 인장강도가 요구되는 곳에는 사용될 수 없는 단점이 있다.

따라서 이 두 가지 재료, 즉 상기의 합성고분자와 천연고분자의 장점을 적절히 혼합하면 세포친화력이 우수하며 물성이 우수한 세포지지체를 제조할 수 있을 것이다. 하지만, 합성고분자인 PLCL과 천연고분자인 콜라겐을 혼합하는 시도에는 다음과 같은 기술적 과제가 있다.

일반적으로 클로로포름 등의 무극성 유기용매에 용해되는 PLCL은 약산이나 물에 용해되는 수용성 천연고분자와는 균일한 혼합이 불가능하다는 문제가 있다. 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoroisopropanol)과 같은 몇 몇 용매에서는 PLCL과 콜라겐, 키토산 또는 히알루론산의 용해가 가능하기는 하지만 용해성이 좋지 못하고 용매의 가격이 아주 고가인 단점이 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 PLCL과 같은 합성고분자와 콜라겐과 같은 천연고분자를 동시에 용해시켜 합성고분자와 천연고분자의 특성 및 장점을 모두 가지는 혼합 지지체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 초산과 물을 이용하면 간단하면서도 효과적으로 이러한 혼합 지지체를 제조할 수 있음을 발견하였고, 결과적으로 제조된 혼합 지지체가 물리적 특성이 우수하고 세포 증식률이 우수하다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 생분해성 소수성 합성고분자와 생체적합성 친수성 천연고분자의 혼합 지지체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생분해성 소수성 합성고분자와 생체적합성 친수성 천연고분자로 이루어진 혼합 지지체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생분해성 소수성 합성고분자와 생체적합성 친수성 천연고분자의 혼합 지지체의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 소수성 합성고분자에 초산을 첨가한 다음 친수성 천연고분자를 첨가하거나 또는 상기 소수성 합성고분자와 친수성 천연고분자의 혼합물에 초산을 첨가하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 물을 첨가하여 소수성 합성고분자와 친수성 천연고분자의 혼합용액을 제조하는 단계.

본 발명자들은 PLCL과 같은 합성고분자와 콜라겐과 같은 천연고분자를 동시에 용해시켜 합성고분자와 천연고분자의 특성 및 장점을 모두 가지는 혼합 지지체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 초산과 물을 이용하면 간단하면서도 효과적으로 이러한 혼합 지지체를 제조할 수 있음을 발견하였고, 결과적으로 제조된 혼합 지지체가 물리적 특성이 우수하고 세포 증식률이 우수하다는 것을 확인하였다.

본 발명은 생분해성 소수성 합성고분자와 생체적합성 친수성 천연고분자의 혼합 지지체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 생분해성(biodegradable) 소수성 합성고분자를 이용한다. 본 명세서에서 용어 "생분해성 고분자"는 pH 6-8인 생리적 용액(physiological solution)에 노출되었을 때 분해되는 고분자를 의미하며, 바람직하게는 생체 내에서 체액 또는 미생물 등에 의해서 분해될 수 있는 고분자를 의미한다.

본 발명에서 사용가능한 생분해성 고분자는, 상술한 분해성 및 소수성을 가지는 고분자이면 어떠한 것도 가능하며, 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(이하, "PLGA"라 한다), 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시부틸레이트), 폴리(하이드록시발러레이트) 및 이들의 공중합체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 폴리락트산과 폴리(카프로락톤)의 공중합체인 PLCL[poly(lactide-co-caprolactone)]이다.

PLCL을 생분해성 고분자로 이용되는 경우, 중량 평균 분자량이 10,000 이상이 바람직하다. 또한, PLCL을 형성하는 락타이드:ε-카프로락톤의 몰비가 80:20 - 20:80인 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 생체적합성(biocompatible) 친수성 천연고분자를 이용한다. 본 명세서에서 용어 "생체적합성 고분자"는 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성(tissue compatibility) 및 항응혈성(blood compatibility)을 가지며, 세포에 대한 친화력을 가지는 고분자를 의미한다.

본 발명에서 사용가능한 생체적합성 친수성 천연고분자는 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 피브린, 히알루론산 및 알지네이트를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 생체적합성 친수성 천연고분자는 콜라겐, 키토산 또는 히알루론산이며, 가장 바람직하게는 콜라겐이다.

본 발명의 방법의 기본 전략은 소수성 합성고분자와 친수성 천연고분자를 동시에 용해시켜 혼합용액을 제조하는 데 있어서 초산과 물을 이용하는 것이다. 청구항에 기재된 본 발명의 과정은 초산 처리 과정이 앞서고, 이어서 물을 처리하는 데, 초산과 물의 혼합용매를 사용하여도 거의 동일한 결과가 나올 수 있다. 예를 들어, 소수성 합성고분자와 친수성 천연고분자의 혼합물에 적합한 농도의 초산과 물의 혼합용매를 처리하여 용해시켜 혼합용액을 제조할 수 있다. 이러한 측면에서, 초산과 물의 혼합용매를 소수성 합성고분자와 친수성 천연고분자의 공용제라 할 수 있다.

또한, 청구항에 기재된 본 발명의 과정은 초산 처리에 의해 소수성 합성고분자를 용해한 다음, 물을 처리하여 천연고분자를 용해하는 단계로 이루어져 있는 데, 반대로 물을 처리하여 천연고분자를 용해한 다음, 초산 처리에 의해 소수성 합성고분자를 용해하는 것도 본 발명의 범위에 속한다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

본 발명의 방법에서 단계 (a)에 따르면, 소수성 합성고분자에 초산을 첨가한 다음 친수성 천연고분자를 첨가하거나 또는 상기 소수성 합성고분자와 친수성 천연고분자의 혼합물에 초산을 첨가하여 소수성 합성고분자를 용해함으로써, 소수성 합성고분자 용액을 제조한다.

단계 (a)에서의 바람직한 초산 농도는 90-100 v/v%이며, 보다 바람직하게는 92-100 v/v%이며, 보다 더 바람직하게는 95-100 v/v%이며, 가장 바람직하게는 98-100 v/v%이다. 이러한 초산 농도에서 소수성 합성고분자는 거의 완전하게 용해된 상태를 나타낸다. 만일, 초산 농도가 90 v/v% 미만이면, 소수성 합성고분자의 용해가 극히 미약하게 되는 문제점이 있다.

단계 (b)에서의 적합한 초산의 최종 농도, 물의 첨가에 의해 결정되는 초산의 최종 농도는 바람직하게는 80-99 v/v%, 보다 바람직하게는 87-99 v/v%, 보다 더 바람직하게는 90-97 v/v%, 가장 바람직하게는 93-96 v/v%이다. 이러한 초산 농도에서 친수성 천연고분자는 거의 완전하게 용해된 상태를 나타내며, 소수성 합성고분자도 거의 완전하게 용해된 상태를 유지한다.

이렇게 하여 제조된 소수성 합성고분자와 친수성 천연고분자의 혼합용액은 거의 완전한 용액 상태이기 때문에, 서로 균질하게 혼합되어 있는 상태이다. 따라서 이 혼합용액을 이용하여 제조된 지지체도 균질한 지지체가 될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 생분해성 소수성 합성고분자 및 생체적합성 친수성 천연고분자의 함량은 특별히 제한되지는 않지만, 유리하게는, 생분해성 소수성 합성고분자를 천연고분자보다 더 많은 양을 사용한다.

바람직하게는, 사용되는 생분해성 소수성 합성고분자:생체적합성 친수성 천연고분자의 질량비는 1.5:1 - 50:1, 보다 바람직하게는 1.5:1 - 30:1, 보다 더 바람직하게는 4:1 - 20:1, 가장 바람직하게는 8:1 - 12:1 이다. 만일, 합성고분자의 함량이 상기 질량비보다 작은 경우에는, 최종적으로 제조되는 혼합지지체의 물리적 특성(인장강도, 연신율)이 너무 작은 문제점이 있다. 만일, 천연고분자의 함량이 상기 질량비보다 작은 경우에는, 최종적으로 제조되는 혼합지지체의 세포친화력(세포접합력)이 너무 작은 문제점이 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (b) 이후에 동공(pore)을 형성시키는 단계 (c)를 추가적으로 포함한다. 고분자 지지체에 동공을 형성시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 염화나트륨 또는 소듐 시트레이트 등과 같은 염을 이용하는 염 리칭(salt leaching)법, 당(예컨대, 설탕)을 이용하는 당 리칭(sugar leaching) 등이 있으며 고분자가 용해되어 있는 용액을 급속으로 냉동시켜 동결건조하는 과정에서 발생하는 상분리를 이용한 상분리(phase separation) 방법 등이 널리 이용되고 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 동공을 형성시키는 단계는 염 리칭 방법이고, 보 다 바람직하게는 염화나트륨을 이용하는 염 리칭 방법이다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따라, 염화나트륨을 이용하는 염 리칭 방법을 소개하면 다음과 같다: 상기 과정에서 형성된 소수성 합성고분자와 친수성 천연고분자의 혼합용액에 소금 단결정(NaCl salt)을 첨가하여 균일하게 혼합하고, 몰드에 혼합액을 부은 다음 건조시킨다. 이용되는 소금 단결정의 크기를 조절하여 공극률 및 동공 크기를 조절할 수 있다. 이어, 용매를 증발시킨 후, 소금 단결정이 함유된 시편을 물로 세척하여 소금 단결정을 제거한다. 그런 다음, 초순수가 함유된 상태에서 동결 건조하여 최종적으로 본 발명의 지지체를 얻는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 동공을 형성시키기 위한 단계 (c) 이후에 지지체를 동결건조하는 단계 (d)를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 방법에 따르면, 초기에 사용된 친수성 천연고분자가 소수성 합성고분자와 완벽하게 혼화되어 혼합지지체를 형성한다. 따라서, 초기에 사용된 친수성 천연고분자는 최종적으로 제조되는 혼합지지체에 거의 완벽하게 보존된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최종적으로 형성된 혼합 지지체는 단계 (a)에서 사용된 친수성 천연고분자의 최초 질량의 80-100%, 보다 바람직하게는 85-100%, 가장 바람직하게는 90-100%을 포함한다.

본 발명의 방법에 따르면, 합성고분자의 장점인 우수한 물성(예컨대, 인장강도, 연신율, 탄성, 복원력 등)을 유지하면서도, 천연고분자의 장점인 우수한 세포친화성을 가지는 세포 지지체를 제조할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조되는 세포 지지체는 사용하는 합성고분자 및 천 연고분자의 종류 및 양을 조절함으로써, 다양한 물성 및 특성을 가질 수 있으며, 여러 형태의 조직공학 제품에 이용될 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 간단한 공정을 통하여 생분해성 소수성 합성고분자의 표면 및 내면에 생체적합성 친수성 천연고분자가 물리적으로 균일하게 결합된 세포 배양용 지지체를 얻을 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 생분해성 소수성 합성고분자와 생체적합성 친수성 천연고분자의 혼합 지지체에 있어서, 상기 생분해성 소수성 합성고분자의 표면 및 내면에 상기 생체적합성 친수성 천연고분자가 물리적으로 균일하게 결합되어 있고, 상기 혼합 지지체는 상기 생분해성 소수성 합성고분자보다 크고 상기 생체적합성 친수성 천연고분자보다 작은 세포 증식률을 가지며, 상기 혼합 지지체의 인장강도(단위: MPa)는 [생분해성 소수성 합성고분자의 인장강도 - (0 ~ 0.8) MPa]이며, 상기 혼합 지지체의 연신율(단위: %)은 [생분해성 소수성 합성고분자의 연신율 - (0 ~ 50)]인 것을 특징으로 하는 혼합 지지체를 제공한다.

본 발명의 혼합 지지체의 특징 중 하나는, 생체적합성 친수성 천연고분자가 생분해성 소수성 합성고분자의 표면뿐만 아니라, 내면에 균일하게 물리적으로 결합되어 있다는 것이다. 본 명세서에서 용어 "물리적 결합"은 흡착(adsorption), 응집(cohesion) 및 사슬엉킴(entanglement)과 같은 비화학적 결합에 의해 결합되어 있는 양상을 나타낸다. 본 발명의 혼합 지지체에서, 생체적합성 친수성 천연고분자는 소수성 합성고분자의 표면에 결합되어 있을 뿐만 아니라, 안쪽에도 결합되어 있다. 이러한 친수성 천연고분자의 광범위한 분포는 혼합 지지체를 제조함에 있어서, 천연고분자와 합성고분자 분자들이 고르게 분포되는 혼합용액을 이용하기 때문이다. 이러한 광범위한 분포 양상은 보다 많은 세포들이 지지체에 결합하여 증식 및 분화 되도록 한다.

본 발명의 혼합 지지체의 인장강도(단위: MPa)는 [생분해성 소수성 합성고분자의 인장강도 - (0 ~ 0.8) MPa]이다. 본 발명의 혼합 지지체의 인장강도는 사용되는 생분해성 소수성 합성고분자 및 생체적합성 친수성 천연고분자의 종류 및 함량, 또는 사용되는 유기용매의 종류에 따라 다양하지만, 대체적으로 출발물질로 이용되는 생분해성 소수성 합성고분자의 인장강도를 거의 그대로 유지한다.

바람직하게는 본 발명의 혼합 지지체의 인장강도(단위: MPa)는 [생분해성 소수성 합성고분자의 인장강도 - (0 ~ 0.5) MPa], 보다 바람직하게는 [생분해성 소수성 합성고분자의 인장강도 - (0 ~ 0.4) MPa], 가장 바람직하게는 [생분해성 소수성 합성고분자의 인장강도 - (0 ~ 0.3) MPa]이다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 혼합 지지체는 생분해성 소수성 합성고분자의 인장강도를 거의 그대로 유지하기 때문에, 세포 배양용 지지체에서 요구되는 기계적 강도를 만족할 수 있다.

본 발명의 혼합 지지체의 연신율(단위: %)은 [생분해성 소수성 합성고분자의 연신율 - (0 ~ 50)]이다. 본 발명의 혼합 지지체의 연신율은 사용되는 생분해성 소수성 합성고분자 및 생체적합성 친수성 천연고분자의 종류 및 함량, 또는 사용되는 유기용매의 종류에 따라 다양하지만, 대체적으로 출발물질로 이용되는 생분해성 소수성 합성고분자의 연신율을 거의 그대로 유지한다.

바람직하게는, 본 발명의 지지체의 연신율(단위: %)은 [생분해성 소수성 합성고분자의 연신율 - (0 ~ 40)], 보다 바람직하게는 [생분해성 소수성 합성고분자의 연신율 - (0 ~ 30)], 가장 바람직하게는 [생분해성 소수성 합성고분자의 연신율 - (0 ~ 20)]이다.

세포 배양용 지지체는, 물리적인 자극이 세포에 직접적으로 전달되어야 하기 때문에, 탄성 또는 복원력이 좋아야 한다. 본 발명의 혼합 지지체는 생분해성 소수성 합성고분자의 연신율을 거의 그대로 유지하기 때문에, 세포 배양용 지지체에서 요구되는 탄성 또는 복원력을 만족할 수 있다.

본 발명의 혼합지지체에서 생분해성 소수성 합성고분자:생체적합성 친수성 천연고분자의 질량비는 1.5:1 - 50:1, 보다 바람직하게는 1.5:1 - 30:1, 보다 더 바람직하게는 4:1 - 20:1, 가장 바람직하게는 8:1 - 12:1 이다. 만일, 합성고분자의 함량이 상기 질량비보다 작은 경우에는, 최종적으로 제조되는 혼합지지체의 물리적 특성(인장강도, 연신율)이 너무 작은 문제점이 있다. 만일, 천연고분자의 함량이 상기 질량비보다 작은 경우에는, 최종적으로 제조되는 혼합지지체의 세포친화력(세포접합력)이 너무 작은 문제점이 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 혼합지지체의 공극 크기는 10-500 ㎛이며, 보다 바람직하게는 50-400 ㎛, 가장 바람직하게는 100-300 ㎛이다. 만일, 공극 크기가 10 ㎛ 미만인 경우에는 강도가 너무 크고, 지지체에 있는 세포들이 영양분을 원활하게 공급받지 못하여 증식하는 데 매우 불리하며, 공극 크기가 500 ㎛ 를 초과하는 경우에는 강도가 너무 작아지는 문제점이 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 혼합지지체의 공극률은 50-99%이다. 공극률이 50% 미만인 경우에는 생체내에서 지지체가 분해될 때 분해산물이 너무 많이 생성되는 문제점이 있고, 99%를 초과하는 경우에는 강도가 너무 작아지는 문제점이 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 혼합 지지체는 상술한 본 발명의 방법에 의해 제조된 것이다.

본 발명의 혼합 지지체는 생체적합성 친수성 천연고분자와 유사한 세포 증식률을 나타낸다.

본 발명의 혼합 지지체는 원료로 이용된 생분해성 소수성 합성고분자의 물리적 특성과 생체적합성 친수성 천연고분자의 세포친화력(세포접합력)을 거의 그대로 가지고 있기 때문에, 혼합 지지체에 세포를 접종하여 이식물(implant)로 이용하면 우수한 세포치료 효능을 발휘할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: PLCL의 합성

PLCL의 합성은 기존에 보고된 논문에서 제시한 방법을 참조하여 진행하였다.[12]

건조시킨 용적 250 ㎖의 유리 앰플에 락타이드((주)바이오텍) 14.4 g 및 ε-카프로락톤(Sigma) 11.4 g과 촉매로서 옥토산주석(Sigma) 0.01 g을 톨루엔 0.04 g으로 희석하여 사용하였다. 반응물이 담긴 앰플에 테플론 코팅된 마그네틱 바를 넣고, 앰플을 0.01 ㎜Hg에 서 약 2시간 동안 진공 상태를 유지시켜, 톨루엔과 수분을 제거하였다. 이어서, 건조 질소 주입과 진공 상태 유지를 3회 반복하고, 앰플을 가열 봉합하였다. 봉합된 앰플을 150℃에서 20시간 동안 교반하며 고상 중합을 진행시켰다. 반응이 완결될 즈음에는 점도가 높아 교반이 불가능하게 되었으며 초기에는 투명한 겔 상태였으나 반응이 진행함에 따라 갈색 고체로 변하였다. 반응이 종결된 후, 앰플을 충분히 냉각시킨 후, 앰플을 파괴하여 공중합체를 회수하였다. 회수된 시료를 클로로포름 중에 용해시킨 후 메탄올 중에서 침전시켜 미반응 단량체를 제거하여, 중합체를 회수하였다(수율: 94％).

실시예 2: PLCL 지지체 제조 I

상기 과정에서 수득한 PLCL 5 g에 클로로포름을 가하여 전체 부피가 50 ml이 되도록 한 후 자석 교반기를 사용하여 균일하게 용해시켜 10 %(w/v) PLCL 용액을 제조하였다. 제조된 고분자 용액을 바이알에 넣고, 여기에 공극률이 약 90％가 되도록 φ100~150 ㎛ 크기의 소금 단결정(NaCl salt) 45 g을 첨가한 후, 소형 혼합 기를 사용하여 균일하게 혼합하였다. 그런 다음, 준비된 몰드에 혼합 용액을 붓고 24시간 동안 상온에서 건조시켰다. 용매가 모두 증발된 후, 소금 단결정이 함유된 디스크형 시편을 초순수로 수회 세척하여 소금 단결정을 제거하였다. 이 때, 초순수는 2일 동안 6시간마다 교체함으로써 내부에 존재하는 소금 단결정을 완전히 제거하였으며, 이 후 초순수가 함유된 상태에서 -70℃로 6시간 이상 동결한 후 동결건조하였다. 최종적으로 제조된 지지체의 단면에 대한 전자현미경 사진은 도 3a에 나타나 있다.

실시예 3: PLCL 지지체 제조 Ⅱ

PLCL 5 g에 무수 초산(absolute acetic acid)을 가하여 전체 부피가 50 ml이 되도록 한 후 자석 교반기를 사용하여 균일하게 용해시켜 10 %(w/v) PLCL 용액을 제조하였다. 제조된 고분자 용액을 바이알에 넣고, 여기에 공극률이 약 90％가 되도록 φ100~150 ㎛ 크기의 소금 단결정(NaCl salt) 45 g을 첨가한 후, 소형 혼합기를 사용하여 균일하게 혼합하였다. 그런 다음, 준비된 몰드에 혼합 용액을 붓고 24시간 동안 상온에서 건조시켰다. 용매가 모두 증발된 후, 소금 단결정이 함유된 디스크형 시편을 초순수로 수회 세척하여 소금 단결정을 제거하였다. 이 때, 초순수는 2일 동안 6시간마다 교체함으로써 내부에 존재하는 소금 단결정을 완전히 제거하였으며, 이 후 초순수가 함유된 상태에서 -70℃로 6시간 이상 동결한 후 동결건조 하였다. 최종적으로 제조된 지지체의 단면에 대한 전자현미경 사진은 도 3b에 나타나 있다.

실시예 4: 콜라겐과 PLCL의 혼합 지지체 제조

PLCL 5 g 및 형광콜라겐(Sigma) 0.5 g에 무수 초산(absolute acetic acid)을 첨가하여 전체 부피가 47.5 ml이 되도록 한 후 자석 교반기를 사용하여 균일하게 용해시킨 후 초 순수를 2.5 ml 가한 후 다시 교반하여 10 %(w/v) PLCL과 1 %(w/v) 콜라겐의 혼합용액을 제조하였다. 제조된 고분자 용액을 바이알에 넣고, 여기에 공극률이 약 90％가 되도록 φ100~150 ㎛ 크기의 소금 단결정(NaCl salt) 45 g을 첨가한 후, 소형 혼합기를 사용하여 균일하게 혼합하였다. 그 다음, 준비된 몰드에 혼합 용액을 붓고 24시간 동안 상온에서 건조시켰다. 용매가 모두 증발된 후, 소금 단결정이 함유된 디스크형 시편을 초순수로 수회 세척하여 소금 단결정을 제거하였다. 이 때, 초순수는 2일 동안 6시간마다 교체함으로써 내부에 존재하는 소금 단결정을 완전히 제거하였으며, 이 후 초순수가 함유된 상태에서 -70℃로 6시간 이상 동결한 후 동결건조하여, 콜라겐과 PLCL의 혼합 지지체를 제조하였다. 최종적으로 제조된 지지체의 단면에 대한 전자현미경 사진은 도 3c에 나타나 있다.

실시예 5: 히알루론산과 PLCL의 혼합 지지체 제조

PLCL 5 g과 히알루론산(Sigma) 0.5 g에 무수 초산을 가하여 전체 부피가 47.5 ml이 되도록 한 후 자석 교반기를 사용하여 균일하게 용해시킨 후 초순수를 2.5 ml 가한 후 다시 교반하여 10 %(w/v) PLCL과 1 %(w/v) 히알루로산 용액을 제조하였다. 제조된 고분자 용액을 바이알에 넣고, 여기에 공극률이 약 90％가 되도 록 φ100~150 ㎛ 크기의 소금 단결정(NaCl salt) 45 g을 첨가한 후, 소형 혼합기를 사용하여 균일하게 혼합하였다. 그 다음, 준비된 몰드에 혼합 용액을 붓고 24시간 동안 상온에서 건조시켰다. 용매가 모두 증발된 후, 소금 단결정이 함유된 디스크형 시편을 초순수로 수회 세척하여 소금 단결정을 제거하였다. 이 때, 초순수는 2일 동안 6시간마다 교체함으로써 내부에 존재하는 소금 단결정을 완전히 제거하였으며, 이 후 초순수가 함유된 상태에서 -70도로 6시간 이상 동결한 후 동결건조하여, 최종적으로 히알루론산과 PLCL의 혼합 지지체를 제조하였다. 최종적으로 제조된 지지체의 단면에 대한 전자현미경 사진은 도 3d에 나타나 있다.

실시예 6: 키토산과 PLCL의 혼합 지지체 제조

PLCL 5 g과 키토산((주)고려키토산) 0.5 g에 무수초산을 가하여 전체 부피가 47.5 ml이 되도록 한 후 자석 교반기를 사용하여 균일하게 용해시킨 후 초순수를 2. 5ml 가한 후 다시 교반하여 10 %(w/v) PLCL과 1 %(w/v) 키토산의 혼합용액을 제조하였다. 제조된 고분자 용액을 바이알에 넣고, 여기에 공극률이 약 90％가 되도록 φ100~150 ㎛ 크기의 소금 단결정(NaCl salt) 45 g을 첨가한 후, 소형 혼합기를 사용하여 균일하게 혼합하였다. 그 다음, 준비된 몰드에 혼합 용액을 붓고 24시간 동안 상온에서 건조시켰다. 용매가 모두 증발된 후, 소금 단결정이 함유된 디스크형 시편을 초순수로 수회 세척하여 소금 단결정을 제거하였다. 이 때, 초순수는 2일 동안 6시간마다 교체함으로써 내부에 존재하는 소금 단결정을 완전히 제거하였으며, 이 후 초순수가 함유된 상태에서 -70℃로 6시간 이상 동결한 후 동 결건조하여, 최종적으로 키토산과 PLCL의 혼합 지지체 제조 하였다. 최종적으로 제조된 지지체의 단면에 대한 전자현미경 사진은 도 3e에 나타나 있다.

실시예 7: 구조 및 혼합도 분석

상기 실시예에서 제조된 스케폴드의 표면과 절개면의 구조를 전자현미경(Hitachi, Japan)을 이용하여 분석하였다. 분석 결과, PLCL 지지체의 기공 형성에 있어서 클로로포름과 초산을 이용했을 때 큰 변화는 없는 것으로 관찰되었다. 또한, 95% 초산 수용액에서 PLCL과 콜라겐, 키토산 또는 히알루론산 등의 천연고분자가 완전히 용해되는 것을 관찰하였다.

한편, PLCL과 천연고분자의 균일한 혼합을 확인하기 위하여, 콜라겐-FITC와 PLCL의 혼합 지지체를 Cryosection(Leica, japan)을 이용하여 5 ㎛ 두께의 얇은 슬라이드로 만든 후 고정하여 형광현미경을 이용하여 분석하였다. PLCL-콜라겐-FITC 지지체의 형광현미경 사진인 도 1에서 볼 수 있듯이, 콜라겐이 지지체 전반에 걸쳐 균일하게 분포하고 있음을 알 수 있다.

실시예 8: 지지체 인장강도 분석

각각 제조된 지지체의 인장강도는 만능시험기(Instron, Model 5567, MA)을 이용하여 측정하였다. 3 mm 두께의 지지체를 10 x 20 mm 크기로 절단하고 상하 바이트에 5 mm씩 물린 후 10 x 10 mm에 해당하는 면적의 인장강도를 3회씩 측정하였다. 실험 결과는 표 1에 정리되어 있다.

구 분	공극률(%)a	공극크기b(㎛)	연신율(%)	인장강도(MPa)
PLCL(아세트산)*	90	200-300	350	0.83
PLCL(CHCl3)**	90	200-300	302	0.87
PLCL-콜라겐	90	200-300	337	0.82
PLCL-히알루론산	90	200-300	285	0.79
PLCL-키토산	90	200-300	317	0.84

^*PLCL(아세트산): PLCL에 대한 용매로 초산을 사용하여 제조한 지지체

^**PLCL(CHCl₃): PLCL에 대한 용매로 클로로포름을 사용하여 제조한 지지체

a: 혼합된 콜라겐 등의 질량으로부터 계산

b: 소금 단결정의 질량으로부터 계산

인장강도와 연신율은 지지체의 물리적인 특성을 나타내는 중요한 요소로서 지지체를 일정한 속도로 잡아당길 때 지지체에 걸리는 장력과 늘어난 비율의 관계를 측정하여 알 수 있다. 일반적으로 지지체가 파괴가 되기 직전에 장력은 최대치를 나타내는데 이 때의 장력을 인장강도라 하고 늘어난 길이와 초기 길이의 비율을 계산하여 연신율을 측정한다.

표 1에서 파악할 수 있듯이, 본 발명의 PLCL-콜라겐(히알루론산 또는 키토산) 지지체는 PLCL과 거의 동일한 물리적 특성, 특히 인장강도를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 PLCL-콜라겐(히알루론산 또는 키토산) 지지체는 PLCL의 우수한 물리적 특성(예컨대, 인장강도, 탄성 및 복원력)을 유지한다는 것을 알 수 있다.

실시예 9: 세포배양 및 증식률 평가

PLCL 및 PLCL-콜라겐 지지체를 각각 두께 3 mm 직경 8 mm의 크기로 펀칭하여 70% 알코올을 이용하여 6시간 동안 멸균하였다. 0.3% 콜라겐 수용액(Invitrogen)을 동결건조하여 제조한 콜라겐 지지체를 대조군으로 이용하였다. 멸균 PBS를 이용하여 상기 지지체들을 세척하여 알코올을 충분히 제거한 후 FGM-2 배지(Cambrex)로 1회 세척하였다. 배양된 HDF 섬유아세포(HDF: Human Dermal Fibroblast, p=4, MCTT)에 트립신-EDTA를 처리하여 단일세포로 분리한 후 10⁶ cell/ml의 농도의 세포현탁액을 준비하였다. 이어, 멸균된 거즈를 이용하여 지지체에 함유된 배지를 일정양 흡수시킨 후 배양 디쉬에 옮기고 HDF 세포 현탁액을 각각 지지체에 100 ㎕ 씩 주입하였다. 세포안착을 위해 4시간 동안 37℃ 배양기에서 방치한 후 FGM-2 배지를 10 ㎖ 첨가하여 이틀 동안 배양하였다.

그리고 나서, 세포 계수(cell counting)를 하였다. 세포 계수에는 WST-8(Dojindo, Japan) 키트를 이용하였다. 스케폴드를 24-웰 플레이트에 한 개씩 옮긴 후 배지를 2 ㎖씩 분주하고 WST-8 100 ㎕를 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 배양한 배지를 1/2로 희석하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 실험 결과는 도 2에 나타나 있다.

도 2에서 볼 수 있듯이, PLCL은 대조군인 콜라겐과 비교할 때 증식률이 현저히 낮지만 콜라겐을 혼합한 PLCL-콜라겐에서는 상당한 세포증식률의 향상이 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 PLCL-콜라겐 지지체는 천연고분자인 콜라겐의 세포 친화성 및 세포 증식률을 어느 정도 유지하는 것으로 평가된다.

실시예 8 및 9의 결과를 종합하면, PLCL과 콜라겐, 키토산 또는 히알루론산등의 천연고분자가 혼합된 본 발명의 지지체는 PLCL의 물성을 그대로 유지하며 세포의 친화성과 세포증식률을 증대시킬 수 있는 생분해성 고분자 지지체로 조직공학 분야에서 그 활용도가 매우 높다.

실시예 10: 콜라겐과 PLCL의 혼합지지체에 포함된 콜라겐의 정량분석

상기 실시예에서 제조된 PLCL과 형광콜라겐이 10:1(9.09% 질량비)로 혼합된 PLCL 혼합지지체를 공용제인 초산 95%에 각각 2 %(w/v)가 되도록 용해한 후 450 nm의 파장에서 각기 용액의 흡광도를 측정하여 지지체 내에 있는 콜라겐의 양을 정량분석 하였다. 또한 형광콜라겐을 초산에 2 %(w/v)로 용해시킨 용액을 대조군으로 사용하였다. 96-웰 플레이트에 2 %(w/v) PLCL, 2 %(w/v) PLCL+Col-FITC 용액 및 2 %(w/v) Col-FITC 용액을 각각 100 ㎕씩 분주하여 흡광도리더기(Versamax)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과는 표 2에 나타나 있다.

구분	PLCL	PLCL+Col	Col-F
n=1	0.047	0.102	0.987
n=2	0.044	0.093	1.123
n=3	0.045	0.086	1.02
n=4	0.045	0.09	0.919
평균	0.045	0.093	1.012

상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, 2 %(w/v) 형광콜라겐 용액의 흡광도를 기준으로 혼합지지체 용액의 흡광도를 비교할 때 0.093/1.012 = 9.12 %(w/w)의 콜라겐이 PLCL에 혼합되어 있음을 알 수 있다. 이는 초기에 혼합된 9.09% 양이 그대로 유지되어 지지체에 혼합되어 있는 것을 나타낸다. 소량의 차이는 실험 오차에서 발생한 것이다.

결과적으로, 본 발명의 방법에 따르면, 초기에 사용된 친수성 천연고분자(예컨대, 콜라겐)가 소수성 합성고분자와 완벽하게 혼화되어 혼합지지체를 형성한다는 것을 알 수 있다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따르면 간단한 공정을 통하여 생분해성 소수성 합성고분자의 표면 및 내면에 생체적합성 친수성 천연고분자가 물리적으로 균일하게 결합된 세포 배양용 지지체를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 혼합 지지체는 원료로 이용된 생분해성 소수성 합성고분자의 물리적 특성과 생체적합성 친수성 천연고분자의 세포친화력(세포접합력)을 거의 그대로 가지고 있기 때문에, 혼합 지지체에 세포를 접종하여 이식물(implant)로 이용하면 우수한 세포치료 효능을 발휘할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조문헌

[1] Patrick JC, Mikos AG, Mclntire VL. Frontiers in tissue engineering. New York: Pergamon; 1998.

[2] Freed LE, Vunjak-Novakovic G, Biron RJ, Eagles DB, Lesnoy DC, Barlow SK, Langer R. Biodegradable polymer scaffolds for tissue engineering. Biotechnology 1994;12:68993.

[3] Masaki H, Toshikazu Y, Minoru U, Koji K. Cartilage formation by cultured chondrocytes in a new scaffold made of poly(l-lactide-e-caprolactone) sponge. J Oral Maxillofac Surg 2000;58:76775.

[4] S.I. Jeong et al. Biomaterials 25 (2004) 59395946 5945 poly(l-lactide-e-caprolactone) scaffolds. Biomaterials 2003; 24:35119.

[5] Birukov KG, Shirinsky VP, Stepanova OV, Tkachuk VA, Hahn AWA, Resink TJ, Smirnov VN. Stretch affects phenotype and proliferation of vascular smooth muscle cells. Mol Cell Biochem 1995;144:1319.

[6] Kanda K, Matsuda T. Behavior of arterial wall cells cultured on periodically stretched substrates. Cell Transplant 1993;2:47584.

[7] Reusch P, Wagdy H, Reusch R, Wilson E, Ives HE. Mechanical strain increases smooth muscle and decreases nonmuscle myosin expression in rat vascular smooth muscle cells. Circ Res 1996;79:104653.

[8] Sumpio BE, Banes AJ, Link WG, Johnson Jr. G. Enhanced collagen production by smooth muscle cells during repetitive mechanical stretching. Arch Surg 1988;123:12336.

[9] Nimni ME, Cheung D, Strates B, Kodama M, Skeikh K. Chemically modified collagen: a natural biomaterial for tissue replacement. J Biomed Mater Res 1987;21:74151.

[10] Olde Damink LHH, Dijkstra PJ, van Luyn MJA, van Wachem PB, Nieuwenhuis P, Feijen J. Cross-linking of dermal sheep collagen using a water-soluble carbodiimide. Biomaterials 1996;17:76573.

[11] Lee SH, Kim BS, Kim SH, Choi SW, Jeong SI, Kwon IK, Kang SW, Nikolovski J, Mooney DJ, Han YK, Kim YH. Elastic poly(glycolide-co-caprolactone) scaffold for tissue engineering. J Biomed Mater Res 2003;66A:2937.

[12] Jeong SI, Kim SH, Kim YH, Kwon JH, Kim BS, Lee YM. Manufacture of elastic biodegradable PLCL scaffolds for mechano-active vascular tissue-engineering. J Biomater Sci Polym Ed 2003, accepted for publication.

Claims (13)

1. 다음의 단계를 포함하는 생분해성 소수성 합성고분자와 생체적합성 친수성 천연고분자의 혼합 지지체의 제조방법:

   (a) 상기 소수성 합성고분자에 초산을 첨가한 다음 친수성 천연고분자를 첨가하거나 또는 상기 소수성 합성고분자와 친수성 천연고분자의 혼합물에 초산을 첨가하는 단계; 및

   (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 물을 첨가하여 소수성 합성고분자와 친수성 천연고분자의 혼합용액을 제조하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 생분해성 소수성 합성고분자는 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산), 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시부틸레이트), 폴리(하이드록시발러레이트) 및 이의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 생체적합성 친수성 천연고분자는 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 피브린, 히알루론산 및 알지네이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 초산 농도는 90-100 v/v%인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 상기 생분해성 소수성 합성고분자:생체적합성 친수성 천연고분자의 질량비는 1.5:1 - 50:1인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 초산의 최종 농도는 80-99 v/v%인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 최종적으로 형성된 혼합 지지체는 단계 (a)에서 사용된 친수성 천연고분자의 최초 질량의 90-100%을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (b) 이후에 염화나트륨을 이용하여 동 공을 형성시키는 단계 (c)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 (c) 이후에 동결건조하는 단계 (d)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 생분해성 소수성 합성고분자와 생체적합성 친수성 천연고분자의 혼합 지지체에 있어서,

    상기 혼합 지지체는 상기 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 것이고,

    상기 생분해성 소수성 합성고분자의 표면 및 내면에 상기 생체적합성 친수성 천연고분자가 물리적으로 균일하게 결합되어 있고, 상기 혼합 지지체는 상기 생분해성 소수성 합성고분자보다 크고 상기 생체적합성 친수성 천연고분자보다 작은 세포 증식률을 가지며, 상기 혼합 지지체의 인장강도(단위: MPa)는 [생분해성 소수성 합성고분자의 인장강도 - (0 ~ 0.8) MPa]이며, 상기 혼합 지지체의 연신율(단위: %)은 [생분해성 소수성 합성고분자의 연신율 - (0 ~ 50)]인 것을 특징으로 하는 스폰지형 혼합 지지체.
11. 삭제
12. 제 10 항에 있어서, 상기 생분해성 소수성 합성고분자는 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산), 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시부틸레이트), 폴리(하이드록시발러레이트) 및 이의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 스폰지형 혼합 지지체.
13. 제 10 항에 있어서, 상기 생체적합성 친수성 천연고분자는 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 피브린, 히알루론산 및 알지네이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 스폰지형 혼합 지지체.

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