KR100787035B1 - 페디오코커스 펜토사세우스로부터 제조되는 항균 펩타이드 - Google Patents

페디오코커스 펜토사세우스로부터 제조되는 항균 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페디오코커스 펜토사세우스로부터 제조되는 항균 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 식중독을 일으키는 미생물인 시겔라 속(Genus) 시겔라 손네이(Shingella sonnei)과 살모넬라 속(Geuns) 살모넬라 티피므리움(Salmonella typhimurium) 등에 대하여 강한 항균 활성을 나타낸다.
항균 펩타이드

Description

페디오코커스 펜토사세우스로부터 제조되는 항균 펩타이드{Antibacterial peptide prepared from Pediococcus pentosaceus}
도 1은 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus)의 주사전자현미경 (Scanning Electron Microscope) 사진이다. 흰 막대의 길이는 9 마이크론(9 x 10-6m)을 표시한다.
도 2는 페디오코커스 펜토사세우스의 항균펩타이드 유전자 (pedA)와 그 생산에 필요한 유전자들(pedB-D)의 개열도이다.
도 3은 본 발명에 따른 항균펩타이드를 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori ATCC 43504)에 액체배양액 (1,600 Au/ml) 처리시(왼쪽)와 배양분발 (16,000 Au/g) 처리시(오른쪽)에 항균력이 있음을 보인다.
도 4는 항균 펩타이드 페디오신(Ped A)의 분리정제 과정을 보여준다.
도 5는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)에 대한 본 발명에 따른 항균펩타이드(PedA)의 항균력을 보여준다. 그래프는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)을 페디오신이 없는 완충액과 페디오신이 있는 완충액에서 배양한 후, 고체배지에 도말한 후 24시간 후의 각각의 박테리아수를 계수한 결과이다. 사진은 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)를 페디오신이 없는 완충액과 페디오신이 있는 완충액에서 4시간 배양한 후, 고체배지에 도말하여 24시간 배양한 결과이다
도 6는 시겔라 및 살모넬라균에 대한 본 발명에 따른 항균펩타이드(PedA)의 항균력를 보여준다. 그래프는 시겔라 손네이(Shigella sonnei) 및 살모넬라 티피므리움(Salmonella typhimurium)을 페디오신이 없는 완충액과 페디오신이 있는 완충액에서 배양한 후, 고체배지에 도말한 후 24시간 후의 각각의 박테리아수를 계수한 결과이다. 사진은 시겔라 손네이(Shigella sonnei) 및 살모넬라 티피므리움(Salmonella typhimurium)를 페디오신이 없는 완충액과 페디오신이 있는 완충액에서 4시간 배양한 후, 고체배지에 도말하여 24시간 배양한 결과이다
본 발명은 식중독을 일으키는 미생물인 시겔라 속(Genus) 시겔라 손네이(Shingella sonnei)과 살모넬라 속(Genus) 살모넬라 티피므리움(Salmonella typhimurium) 등에 대하여 강한 항균 활성을 나타내는 항균 펩타이드에 관한 것이다.
지구상의 모든 생물들은 세균이나 곰팡이 및 바이러스와 같은 미생물로부터 자신을 방어 또는 보호할 수 있는 생체 방어기구를 가지고 있는데, 그중 하나가 항균 펩타이드 등을 이용한 비선택적 면역체계(non-specific immunity)이다.
한국 등록 특허 번호 10-346072호에는 식물로부터 유래된 항균 펩타이드가 게시되어 있으며, 메기로부터 분리한 신규한 항균펩타이드가 10-19990005078호 출원되었고, 두꺼비로부터 분리된 신규한 항균펩타이드가 10-19950002164호 출원되었다.
이와 같이 항균 펩타이드는 외부 미생물의 공격으로부터 생물 자신을 보호하는데 중요한 역할을 하므로 이를 이용하면 신규의 의약품 개발이 가능하다. 따라서 신규한 항균 펩타이드의 개발이 필요하다.
본 발명은 서열번호 1의 항균 펩타이드를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명은 서열번호 2의 항균 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 3의 항균 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 상동성를 가지고 서열번호 2 또는 서열번호 3의 항균 펩타이드를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명은 항균 펩타이드를 코딩하는 서열번호 1을 함유하는 재조합 벡터를 를 제공한다.
본 발명은 항균 펩타이드를 코딩하는 서열번호 1을 함유하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명은 서열번호 1을 함유하는 형질전환체를 이용하여 항균 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 항균 펩타이드를 이용하여 세균의 생육을 저지 또는 살균하는 방법을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1의 항균 펩타이드를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
본 발명은 서열번호 2의 항균 펩타이드 및 서열번호 3의 항균 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 상동성를 가지고 서열번호 2 또는 서열번호 3의 항균 펩타이드를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
본 발명은 항균 펩타이드를 코딩하는 서열번호 1을 함유하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 항균 펩타이드를 코딩하는 서열번호 1을 함유하는 형질전환체에 관한 것이다.
본 발명은 서열번호 1을 함유하는 형질전환체를 이용하여 항균 펩타이드를 제조하는 방법 및, 상기 항균 펩타이드를 이용하여 세균의 생육을 저지 또는 살균하는 방법에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 사용될 수 있는 항균 펩타이드를 코딩하는 서열번호 1의 유전자는 인위적으로 디자인하거나 또는 자연계에 존재하는 유전자에서 분리되어져 사용되어질 수 있다.
본 발명에 따른 항균 펩타이드를 생산하는 유전자는, 세 번째 코돈의 퇴화에 의하여 같은 아미노산에 대하여 다른 코돈이 사용되어질 수 있으므로, 본 발명에 따른 서열번호 2 또는 서열번호 3과 같은 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 1과 상동성이 있는 서열도 사용되어질 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 항균 펩타이드는 인위적으로 디자인하거나 자연계에 존재하는 항균 펩타이드들 중에서 선택할 수 있으며, 그것을 암호화하는 유전자를 합성하거나, 자연계로부터 분리하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 페디오코커스 펜토사우스로부터 신규의 항균 펩타이드 유전자 분리.
본 발명에 따른 항균 펩타이드를 생산하는 미생물은 김치로부터 분리되어졌으며, 동정결과 페디오코거스 펜토사세우스로 밝혀졌다. 도 1은 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus)의 주사전자현미경 (Scanning Electron Microscope) 사진이다. 흰 막대의 길이는 9 마이크론(9 x 10-6m)을 표시한다. 페디오코커스 펜토사세우스의 유전자는 풀 게놈이 분석되어졌으며, 이 들중에 항균 펩타이드 및 이의 생합성에 관련된 유전자를 찾았다. 샷건 서열분석방법을 따랐으며, TOPO 샷건 클론닝 키트(인비트로젠),pGem-3Z 벡터를 이용하여 6.9 X 커버에 해당되는 18,157 서열을 읽었다. 콘티그를 얻은 후 콘티그 사이의 갭 필링은 포스미드 라이브러리(Fosmid library; 4x384fosmid x 40kb = 61.4Mb; 36 배 커버)를 이용하였다. 도 2는 페디오코커스 펜토사세우스의 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유전자 (pedA)와 그 생산에 필요한 유전자들(pedB-D)의 개열도이다. pedA 항균 펩타이드인 페디오신을 나타내고, pedB는 면역 단백질, pedC는 TRX-유사 도메인을 함유하는 단백질을 나타내며, pedD는 운반체를 나타낸다. 결정되어진 pedA 유전자 서열을 서열번호 1로 나타내었고, 본 유전자로부터 유추되어진 아미노산 서열을 서열번호 2로 나타내었고, 가공되어진 후의 서열을 서열번호 3으로 나타내었다.
항균 펩타이드의 분리는 유전자 재조합을 통하여 생산되어진 융합단백질을 이용하여 흡착크로마토그래피를 이용하여 분리되어졌다. 분리과정은 도 4에 나타내었다.
[실시예 2] 서열번호 3의 항균 펩타이드 페디오신의 항균력 검정
실시예 1에 의해 분리되어진 서열번호 3의 단백질을 이용하여 항균력 시험을 하였다. 도 3은 본 발명에 따른 항균 펩타이드를 Helicobacter pylori ATCC 43504에 액체배양액 (1,600 Au/ml) 처리시(왼쪽)와 배양분발 (16,000 Au/g) 처리시(오른쪽)에 항균력이 있음을 보인다. 위염의 원인이 되는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 및 리스테리아 (Listeria 속) 여러종, 살모넬라 티피므리움(Salmonella typhimurium), 프로피오니박테리움 종에 대한 항균력 시험 결과를 표 1에 나타내었다.
표 1.항균 펩타이드의 항균스펙트럼
Figure 112004059922106-pat00001
도 5는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)에 대한 본 발명에 따른 항균펩타이드(PedA)의 항균력을 보여준다. 그래프는 Bacillus subtilis을 페디오신이 없는 완충액과 페디오신이 있는 완충액에서 배양한 후, 고체배지에 도말한 후 24시간 후의 각각의 박테리아수를 계수한 결과이다. 사진은 Bacillus subtilis를 페디오신이 없는 완충액과 페디오신이 있는 완충액에서 4시간 배양한 후, 고체배지에 도말하여 24시간 배양한 결과이다. 도 5에서 알수 있듯이 본 발명에 따른 항균 펩타이드 페디오신은 그람 양성균인 바실러스에도 효과적인 것을 알 수 있다.
도 6는 시겔라 및 살모넬라균에 대한 본 발명에 따른 항균펩타이드(PedA)의 항균력를 보여준다. 그래프는 Shigella sonnei, 및 Salmonella typhimurium을 페디오신이 없는 완충액과 페디오신이 있는 완충액에서 배양한 후, 고체배지에 도말한 후 24시간 후의 각각의 박테리아수를 계수한 결과이다. 사진은 Shigella sonnei 및 Salmonella typhimurium를 페디오신이 없는 완충액과 페디오신이 있는 완충액에서 4시간 배양한 후, 고체배지에 도말하여 24시간 배양한 결과이다. 도 6에서 알 수 있듯이 본 발명에 따른 페디오신은 시겔라, 살모넬라에도 항균 효능이 있었다.
페디오신의 항균성의 안정도를 시험하기 위하여, 염 농도, 온도, pH를 달리하면서 항균 시험을 하였을 때 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2에서 알수 있듯이 페디오신은 염, 온도, pH의 변화에 매우 안정적이었다. 염농도는 10%까지는 항균력의 변화가 없었으며, 섭씨 100℃에서도 항균력이 유지되어져서 열에 매우 안정한 것을 알 수 있다. 특히 pH 3의 산도에서도 항균력의 변화가 거의 없어서, 펩디오신이 위산에 의하여 효능이 파괴되지 않는 것을 알 수 있다.
표 2. 페디오코커스 펜토사세우스 생산 서열번호 3의 항균펩타이드의 염도, 온도 및 산도에 대한 안정성
Figure 112004059922106-pat00002
여러종류의 가수분해를 처리하여 가수분해 효소에 의하여 분해되는지 여부와 위액에 대한 안정도를 시험하였고 그 결과를 표 3에 나타내었다. 페디오신은 여러종류의 가수분해 효소에 대한 내성이 컸으며, 위액에서도 안정적으로 그 기능이 유지되는 것을 알 수 있다.
표3. 페디오코커스 펜토사세우스 생산 서열번호 3의 항균 펩타이드의 가수분해 및 위액에 대한 안정성
Figure 112004059922106-pat00003
본 발명에 따른 항균 펩타이드는 항균력 시험 균주인 Bacillus subtilis에서 우수한 항균력을 나타내었을 뿐 아니라, 몸속의 헬리코박터 (Helicobacter pylori), 리스테리아 (Listeria 속) 등 유해 세균을 억제하고 물리치며, 식중독을 일으키는 미생물인 시겔라 속(Genus) 시겔라 손네이(Shingella sonnei)과 살모넬라 속(Geuns) 살모넬라 티피므리움(Salmonella typhimurium)에도 항균력을 나타낸다.
본 발명에 따른 항균 펩타이드는 김치유산균이 생산하는 무해 항균물질이다.
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  7. 페디오코커스 펜토사세우스로부터 아미노산 서열번호 3의 항균 펩타이드를 제조하는 방법.
  8. 서열번호 3의 항균펩타이드를 포함하는 페디오코커스 펜토사세우스의 배양물을 이용하여 헬리코박터 (Helicobacter pylori), 리스테리아 (Listeria) 속 유해 세균, 시겔라 손네이(Shingella sonnei)또는 살모넬라 티피므리움(Salmonella typhimurium)의 생육을 저지 또는 살균하는 방법.
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