KR100780548B1

KR100780548B1 - Ｓ-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 ｍＲＮＡ에특이적인 작은 간섭 ＲＮＡ 및 그를 유효성분으로포함하는 악성종양 치료제

Info

Publication number: KR100780548B1
Application number: KR1020040102859A
Authority: KR
Inventors: 김진식; 조은위; 문명숙; 김국찬; 김인규
Original assignee: 한국원자력연구원; 한국수력원자력 주식회사
Priority date: 2004-12-08
Filing date: 2004-12-08
Publication date: 2007-11-29
Also published as: KR20060064156A

Abstract

본 발명은 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 mRNA에 특이적인 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 그를 유효성분으로 포함하는 악성종양 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 siRNA는 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제(S-adenosylmethionine decarboxylase) mRNA의 염기서열중 선택되는 17 내지 29머의 센스서열, 4 내지 8머의 루프서열 및 상기 센스서열에 상보적으로 결합하는 안티센스서열로 구성된다. 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 mRNA에 특이적인 siRNA 및 상기 siRNA를 유효성분으로 포함하는 악성종양 치료제는 악성종양 세포 특히 전골수성 백혈병 세포에 형질도입시, DNA 손상시 수선에 필요한 여러 유전자의 발현에 관계하는 폴리아민의 합성에 관여하는 유전자인 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제의 발현을 억제하여 전골수성 백혈병 세포의 성장을 억제하고, 세포사를 증가시키며, 감마 방사선 및 DNA 손상인자에 의한 손상시 수선효소의 발현을 억제시킴으로써 세포사멸(apoptosis)을 극대화함으로써, 화학요법 또는 방사선요법과 병행하여 사용될 경우, 악성종양 치료에 있어서 매우 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

siRNA, S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제, SAMDC, 악성종양, 치료제

Description

Ｓ-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 ｍＲＮＡ에 특이적인 작은 간섭 ＲＮＡ 및 그를 유효성분으로 포함하는 악성종양 치료제{Small Interfering RNA Specific for S-adenosylmethionine Decarboxylase mRNA and Therapeutic Agent for Malignancy Comprising the Same}

도 1은 본 발명의 Ｓ-아데노실메티오닌 디카르복실라제 (S-adenosyl methionine decarboxylase) mRNA에 특이적인 siRNA(small interfering RNA)를 발현시키기 위한 발현벡터를 나타낸 개열지도이다.

도 2는 역전사 중합효소 연쇄 반응을 이용한 각종 유전자들의 발현정도를 비교한 사진이다.

도 3은 각 세포의 세포성장률을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4a는 각 세포의 방사선에 대한 민감도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 4b는 세포의 H₂O₂에 대한 민감도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 각 세포에 대하여 저선량의 방사선을 조사하여 소핵분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6a는 세포 내의 활성산소종의 농도를 유동세포 분석기로 측정한 그래프이 고, 도 6b는 상기 세포들을 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

도 7은 세포내 활성산소종 수준의 조절에 관여하는 물질인 전체 글루타티온(GSH)의 농도를 나타낸 그래프이다.

도 8a는 단세포 전기영동법을 통해 세포내 활성산소종에 의한 DNA의 손상정도를 나타내는 그래프이고, 도 8b는 단세포 전기영동 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.

암세포에 이온화 방사선 조사 시 DNA에 단일가닥 절단(single strand breakage) 또는 양가닥 절단(double strand breakage)를 일으키게 되고 ?O₂ ^-을 비롯한 활성산소종(reactive oxygen species 혹은 oxygen free radicals )을 생성해 암세포에 손상을 주게 되어 암세포의 사멸을 유도한다(Symonds R. P., Current Obsterics & Gynaecology, 13:102-109, 2003). 이러한 방사선 조사에 의해 생성된 물리적 또는 화학적 DNA의 단일 가닥 또는 양 가닥 절단을 수선(repair)하기 위해 여러 수선효소들이 관여하게 된다. DNA의 수선기전에는 상동성 재조합 수선(homologous recombination repair, HRR), 비상동성 말단-결합(non-homologous end-joining, NHEJ), 염기 절제 수선(base excision repair, BER), 핵산 절제 수선 (nucleotide excision repair, NER), 불일치 수선(mismatch repair, MMR)과 같은 5가지 기작이 작동하여 DNA의 수선이 이루어진다(Ronen A. et al., Environ. Mol. Mutagen., 37:241-283, 2001; Zhe Y. et al., Environ. Mol. Mutagen., 31:3-20, 1999). 이러한 DNA의 수선기작에는 70개 정도의 유전자가 참여하게 되는데(Park J.Y. et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 11: 23-27, 2002), 주요 유전자로는 HRR 기전에는 ATM(ataxia telangiectasia mutated), ATR(ATM related protein, BRCA1(breast cancer attributable 1), p53 등이, NHEJ 기전에는 DNA-PK 아그룹등이, NER 기전에는 XPB(xeroderma pigmentosum B), XPD(xeroderma pigmentosum P), p53 등이, BER 기전에는 poly(ADP-ribose) polymerase-1(PARP-1), p53 등이, MMR 기전에는 MLH1(mutL homolog 1), MSH2(mutS homolog 2), MSH6(mutS homolog 6)등이 관련되어 있는 것으로 보고 되고 있다(Ronen A. et al., Environ. Mol. Mutagen., 37: 241-283, 2001; Zhe Y. et al., Environ. Mol. Mutagen., 31:3-20, 1999; Carol B. et al., Mutation Research, 511:145-178, 2002). 최근 대장균 연구에 있어서 폴리아민이 산화적 스트레스에 의해 유도된 DNA 손상을 수선하는데 관련된 위와 같은 여러 종류의 유전자 발현에 중요한 역할을 수행한다고 제안하고 있다(Kim and Oh, Toxicol. Lett., 116:143-149, 2000; Jung and Kim, Biochem. Biophys. Res. Commun., 301:915-922, 2003). 이러한 폴리아민(퓨트리신, 스퍼민, 스퍼미딘)은 모든 생물에서 자연적으로 존재하며 분자량이 작은 양이온 화합물이며(Igarashi et al., Eur. J. Biochem., 48:495-502, 1974; Fredlund and Oredsson, Cell Prolif., 29:457-466, 1996; Thomas and Thomas, Cell Mol. Life Sci., 58:244-258, 2001), 유전자의 발현 조절(Celano P. et al., J. Biol. Chem., 264:8922-8927, 1989), DNA의 구조적 안정화, RNA와 단백질의 합성, 세포막의 안정화, 이온채널의 조절, 활성산소종에 대한 방어와 같은 중요한 역할을 수행하며, 세포의 항상성 유지, 세포의 성장과 분화에 필수적이다(Schipper et al., Prostate, 44:313-321, 2000). 이들 폴리아민합성에 많은 유전자가 관련되고 있는데 퓨트리신합성에 관여하는 오르니틴 디카르복시라아제(ornithine decarboxylase, ODC)가 가장 많이 알려져 있다. S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제(S-adenosylmethionine decarboxylase, SAMDC)는 스퍼민 혹은 스퍼미딘 합성에 필요한 전구물질의 생성에 관여한다고 알려져 있다(Russell D.H., Phamacology, 20:117-129, 1980; Pegg A.E. and McCann P.P., Am. J. Physiol., 243:212-221, 1982; Tabor C.W. and Tabor H., Annu. Rev. Biochem., 53:749-790, 1984). 이러한 폴리아민은 정상세포내에서 농도가 엄격히 제어되지만, 비정상적인 세포에 있어서는 일반적으로 높은 농도를 보이고 있다. 그러므로 암세포 내의 폴리아민을 결핍시킴으로써 암세포의 성장을 억제시키고, DNA 손상인자들에 대한 감수성을 증가시킬 수 있기 때문에 암치료 연구에 있어서 주목을 받고 있다. 이에, 폴리아민을 결핍시킴으로써 암을 치료하는 노력이 지속되고 있으나, 아직까지 큰 성과가 없는 실정이다.

따라서, 종양세포 내에서 폴리아민을 결핍시킴으로써, DNA 손상인자들에 대한 감수성을 증가시킴으로써, 암치료의 효율을 증대시킬 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 크게 대두되었다.

본 발명의 목적은 종양세포 내에서 폴리아민을 결핍시킴으로써, DNA 손상인자들에 대한 감수성을 증가시킴으로써, 암치료의 효율을 증대시킬 수 있는 신규한 물질 또는 방법을 찾아내는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제(S-adenosylmethionine decarboxylase) 유전자의 mRNA에 특이적으로 상보결합하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 siRNA를 발현하는 발현벡터를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 siRNA 또는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 악성종양 치료제를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제(S-adenosylmethionine decarboxylase) 유전자의 mRNA에 특이적으로 상보결합하는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)를 제공한다.

이때, 상기 siRNA는 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제(S-adenosylmethionine decarboxylase) mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 17 내지 29머의 센스서열, 4 내지 8머의 루프서열 및 상기 센스서열에 상보적으로 결합하는 안티센스서열로 구성되며, 이때, 상기 센스서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 19 내기 21개의 염기로 구성되는 것이 바람직하고, 서열번호 2 내지 5로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열이 더욱 바람직하고, 서열번호 4인 것이 가장 바람직하다. 상기 루프서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, UUCG의 서열을 갖는 것이 바람직하며, 상기 siRNA의 3' 말단에는 전사종료신호인 2 내지 4개의 U가 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다. 한편, 본 발명의 siRNA는 통상의 올리고뉴클레오티드 합성기(예: ABI model 394 oligonucleotide synthesizer, USA)를 이용하여 합성할 수 있다.

본 발명의 siRNA의 또 다른 실시태양에 의하면, 상기 센스서열 및 안티센스서열을 독립적인 올리고뉴클레오티드로 합성하여 이를 혼화(hybrization)하여 사용할 수 있다.

이 때, 상기 발현벡터는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 통상적인 siRNA 발현용 벡터인 psiRNA(Invitrogen, USA), pRNA(GenScript, USA), psiLentGene(Promega, USA), pSIREN(Clontech, USA), pSilencer(Ambion, USA) 또는 pU6shX(VectorCoreA, 대한민국)에 상기 siRNA에 대응하는 DNA 염기서열이 삽입된 것이 바람직하며, pU6shX을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 발현벡터로 백혈병 세포주인 HL 60 세포를 형질전환시킨 결과, 상기 백혈병 세포주의 세포 성장이 억제되고, 세포의 산화적 손상의 정도가 증가하는 등, 악성종양의 치료에 효과적임을 확인할 수 있었다.

아울러, 본 발명은 상기 siRNA 또는 siRNA 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 악성종양 치료용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 악성종양은 이에 특별히 제한되는 것은 아니나, 위암, 간암, 대장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 피부암, 신장암, 뇌종양, 방광암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 치료용 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 치료용 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하 게 제제화할 수 있다.

본 발명의 치료용 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제하되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하며, 정맥내 주사에 의한 투여가 더욱 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 siRNA 또는 siRNA 발현벡터를 마우스에 정맥내 주사에 의하여 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단된다.

본 발명의 치료용 조성물은 악성종양의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

일반적으로 암세포는 정상세포에 비해 성장속도가 빠르며, 방사선이나 DNA 손상인자를 이용하여 암세포의 세포사 유도시 암세포는 DNA 손상을 수선하기 위해 수선에 관련된 여러 유전자들의 발현이 이루어지게 되고, 또한 방사선에 대한 저항력이 증가하게 된다. 그러나 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 유전자 특이적 siRNA 및 상기 siRNA의 발현벡터는 악성종양 세포 특히 전골수성 백혈병 세포에 형질도입시, DNA 손상시 수선에 필요한 여러 유전자의 발현에 관계하는 폴리아민의 합성에 관여하는 유전자인 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제의 발현을 억제하여 전골수성 백혈병 세포의 성장을 억제하고, 세포사를 증가시키며, 감마 방사선 및 DNA 손상인자에 의한 손상시 수선효소의 발현을 억제시킴으로써 세포사멸(apoptosis)을 극대화함으로써, 화학요법 또는 방사선요법과 병행하여 사용될 경우, 악성종양 치료에 있어서 매우 효과적일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> siRNA의 고안 및 siRNA 발현 벡터의 제조

<실시예 1-1> siRNA의 고안 및 제조

S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 mRNA에 특이적인 siRNA를 발현벡터를 통하여 발현될 수 있도록, 먼저 발현될 siRNA를 고안하였다. 상기 siRNA는 인간 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 유전자(서열번호 1)의 mRNA의 개시코돈의 첫 번째 염기로부터 각각 36 내지 54번째 염기에 해당되는 센스방향의 19머(서열번호 2: 5'-gctgctggaggtttggttc-3'), 77 내지 95번째 염기에 해단되는 센스방향의 19머(서열번호 3: 5'-accaaggatctggggatct-3'), 82 내지 100번째 염기에 해당되는 센스 방향의 19머(서열번호 4: 5'-ggatctggggatcttcgca-3') 및 918 내지 936번째 염기서열에 해당되는 센스방향의 19머(서열번호 5: 5'-gcgtcttgattgccagagt-3')를 선택하였으며, 3' 말단에 UU가 부가하여 최종 21머의 올리고뉴클레오티드를 고안하였다. 한편, 상기 19머의 센스방향 19머 올리고뉴클레오티드에 상보적인 안티센스방향 19머 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에도 UU를 부가하였다. 상기 21머의 센스방향 올리고뉴클레오티드 및 21머의 안티센스방향 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 합성기(ABI model 394 oligonucleotide synthesizer, USA)를 이용하여 합성하였으며, 상기 합성된 올리고뉴클레오티드를 5X 서냉 완충용액(annealing buffer, 30mM HEPES, pH 7.4, 100mM Potassium Acetate, 2 mM Magnesium Acetate) 및 RNase-free 2차증류수에 혼합하여, 최종적으로 1X 어닐링 완충용액 및 siRNA 농도가 100nM이 되도록 현탁시킨 다음, 90℃에서 1분간 가열 후, 37℃에서 1시간 동안 서냉시켜 최종적으로 21머의 이중가닥 siRNA를 제조하였다. 이어, 상기 서냉된 siRNA는 -20℃로 냉동시켜 보관하였다.

<실시예 1-2> siRNA 발현벡터의 제조

상기 실시예 1-1에서 제조한 siRNA를 세포에 직접 형질도입시킬 수 있지만, 보다 안정적인 발현 및 형질전환효율의 제고를 위하여, siRNA를 발현시킬 수 있는 발현벡터에 상기 siRNA에 대응하는 DNA 단편을 클로닝하여 siRNA 발현벡터를 제조하였다. 먼저, 상기 실시예 1-1에서 고안한 siRNA의 서열에 대응하는 RNA가 세포내에서 형성되도록 하기 위하여 DNA 단편을 하기와 같은 과정을 통하여 제조하였 다. pU6shX 벡터(VectorCoreA, 대한민국)의 발현으로 siRNA 이중가닥이 형성되게 하기 위하여 필요한 삽입용 DNA 단편을 하기와 같이 제조하였다. siRNA를 형성하는 부위로 선택한 상시 실시예 1-1에서 고안한 19머의 센스서열 중 서열번호 2 및 이에 상보적인 안티센스서열을 각각 5' 로부터 3' 방향으로 나란히 배열하고, 이들 중간에 UUCG서열의 테트라 루프(tetra loop)를 삽입하였다. 그리고, 안티센스 서열의 3' 말단에는 전사종료(transcription termination)을 위한 UUUU서열을 부가하였다. 아울러, 이러한 서열부위를 벡터에 삽입하기 위해서 이들의 5' 말단 및 3' 말단에 각각 EcoR I 및 Xba I의 인식부위를 부가하여 구성하였다. 이렇게 구성된 삽입용 DNA 단편은 67개의 폴리뉴클레오티드로서 합성하여 이용하거나 또는 중간에 15개의 염기구간이 상보적인 서열을 갖도록 40머의 포워드 프라이머(forward primer, 서열번호 6) 및 42머의 리버스 프라이머(reverse primer, 서열번호 7)를 합성하여, 상기 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 부분적으로 이중가닥화한 다음, 나머지 부분을 중합반응으로 채워가는 방법으로 제조하였다. 상기 합성한 포워드(forward) 및 리버스 프라이머(reverse primer)들의 서열은 하기 표 1에 기재된 바와 같다. 하기 표 1에서 밑줄부분은 우측열에 표시된 제한효소의 인식부위를 의미한다. 이들 각각의 프라이머(100 pmol/㎕)를 2 ㎕씩 취하여 PCR 프리믹스(Bioneer Co. 대한민국)에 2차 증류수 16 ㎕와 혼합하여 중합반응용액을 제조하였다. 삽입부위를 완성시키기 위한 중합효소의 반응조건은 95℃에서 5분간 변성(denature)시킨 후, 30℃에서 10분간 서냉(annealing)시키고, 72℃로 온도를 높여 60분동안 반응을 수행하였다. 삽입될 DNA가 제대로 형성되었는지는 20% 폴리아크 릴아마이드 겔 상에서 전기영동하여 확인하였다.

siRNA 삽입부위 제조에 사용된 프라이머

	염기서열	제한효소
정방향 프라이머	5'-CGGAATTCCGGATCTGGGGATCTTCGCATTCGTGCGAAGA-3'(서열번호 6)	EcoRⅠ
역방향 프라이머	5'-CGCTCTAGAGCAAAAAGGATCTGGGGATCTTCGCACGAATGC-3'(서열번호 7)	XbaⅠ

상기의 반응으로 제조한 삽위부위와 pU6shX 벡터((VectorCoreA, 대한민국)를 EcoR I과 Xba Ⅰ으로 37℃에서 밤새 절단시켜 젤 용리(gel elution)방법으로 정제하고, 상기 절단된 pU6shX 벡터 1 ㎕, 상기 절단된 삽입부위 7 ㎕, T4 리가아제 1㎕, 10X 결찰 완충용액(ligation buffer) 1 ㎕를 섞어 결찰반응액을 제조하고, 이를 16℃에서 밤새 반응시켰다. 상기 결찰반응시킨 DNA는 E. coli DH5α에 CaCl₂법으로 형질전환을 하였다. 상기 형질전환된 E. coli를 LB 배지에 옮겨 담은 후 37℃에서 2시간 동안 흔들어 배양한 후 암피실린을 포함하는 LB 배지 플레이트에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 삽입부위의 삽입유무를 확인하기 위하여 LB 배지 플레이트상의 콜로니를 5 ㎖의 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 배양한 후 플라스미드를 분리하였고, 이를 pU6shX-SAMDC로 명명하였다(도 1). 분리한 플라스미드는 제한효소 EcoR I과 XbaⅠ을 가하여 37℃에서 밤새 절단한 후 20% 폴리아크릴아마이드 겔상에서 70bp 크기의 DNA 존재유무를 확인하였다. 삽위부위의 DNA는 다시 염기서열분석법을 이용하여 재차 확인하였다. 도 1은 본발명의 Ｓ-아데노실 메티오닌 디카르복시라아제 mRNA에 특이적인 siRNA를 발현시키기 위한 발현벡터를 나타낸 개열지도이다.

<실시예 2> siRNA 발현벡터의 형질도입

상기 실시예 1-2에서 클로닝된 siRNA 발현벡터는 형질도입을 위하여 플라스미드 분리키트(Qiagene, USA)를 이용하여 고순도로 정제하여, 하기의 방법으로 백혈병 세포주인 HL-60(ATCC Number: CCL-240)에 형질도입시켰다. 우선 형질도입에 앞서 HL-60 세포를 100 units/ml 페니실린(Sigma, USA), 65℃에서 불활성화 시킨 10% 우태아 혈청(JRH Bioscience Inc., USA)을 포함한 pH 7.3의 RPMI 1640(Gibco, USA)배지에 1×10⁵cells/ml으로 하여 전체부피가 5ml이 되도록 T-25 배양용 플라크에 분주한 다음, 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였으며, 공벡터(pU6shX) 또는 상기 실시예 1-2에서 제조한 siRNA 발현벡터를 각각 형질도입시킨 HL-60 세포에는 G418(Duchefa, Netherlands) 100 ㎎/㎖을 첨가하여 배양하였다. 이때, 상기 siRNA 발현벡터는 선별자(selection marker)를 갖고 있지 않기 때문에 안정하게 형질도입 된 것을 선별하기 위해 네오마이신 저항성 선별자를 발현하는 pcDNA3.1(Neo^r)(Invitrogen, USA)를 함께 형질도입시켰다. 형질도입 할 세포들은 하루 전에 2X10⁵개 정도씩 도포하였다. 형질도입은 리포좀 제제(Exgen500 Cationic polymer transfection reagent, Fermentas, USA)를 이용하여 제조사의 권고방법에 따라 수행하였고 발현벡터와 pcDNA3.1(Neo^r)는 20:1의 비율로 혼합하여 형질도입시켰다. 안정하게 형질도입이 이루어진 것을 선별하기 위해 형질도입한 후 이틀 후부터 G418(Duchefa, Netherlands) 100 ㎎/㎖을 0.5 ㎎/㎖ 농도로 RPMI 1640배지에 첨가하여 4주 동안 선별하였다. 한편, 음성대조군으로는 siRNA에 대응하는 삽입부위가 삽입되지 않은 pU6shX 벡터를 사용하였다.

<실시예 3> 형질도입된 세포의 분석

<실시예 3-1> 역전사 중합효소 연쇄 반응 분석

상기 실시예 2에서 siRNA 발현벡터 또는 공벡터가 각각 형질도입된 HL-60 세포 및 대조군인 정상 HL-60 세포를 수거하여 PBS(phosphate buffered saline)로 세척 후 TRIzol 시약(Gibco-BRL, USA)을 이용하여 1X10⁶개 정도 용해시켰고, 용해액 총 부피의 1/5에 해당하는 클로로포름을 첨가하여 4℃에서 12,000 rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 상기에서 얻어진 상등액을 새로운 튜브로 옮기고 동량의 이소프로필 알콜을 첨가하고 상온에서 10분 동안 방치시킨 다음, 4℃에서 원심분리 하여 RNA를 침전시켰다. 침전된 RNA를 75% 에탄올 1 ㎖을 첨가하여 염을 제거한 다음, 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 건조시킨 다음, DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리 2차증류수 20 ㎕로 용해시켰다. 정제한 RNA는 260nm의 흡광도로 정량하였다.

상기에서 준비된 각각의 RNA 0.1 ㎍, 하기 표 2에 기재된 바와 같이 제작된 프라이머 각각 10 pM, 역전사 중합연쇄반응 키트 용액(RT-PCR ONE-STEP kit, iNtRON Biotechnology Inc., 대한민국) 및 이차증류수를 혼합하여 전체 부피를 각각 20 ㎕로 맞춘 다음, 95℃ 5분간 변성을 1 회전, 94℃ 30초 동안 변성, 54℃ 30초 동안 서냉, 72℃ 1분간 신장과정을 30 회전 시행한 다음, 72℃ 10분 동안 최후 신장을 1 회전 수행하였다. 하기 표에서 F는 정방향 프라이머를, R은 역방향 프라이머를 의미한다. 상기의 반응결과의 PCR 산물은 1% 아가로오스 겔에 전기영동한 다음 에티디움 브로마이드(EtBr)용액으로 염색하여 확인하였다(도 2).

RT-PCT에 사용된 프라이머 목록

유전자	서열
β-액틴	F : 5'-ATGTGCAAGGCCGGCTTCG-3' (서열번호 8) R : 5'-TTAATGTCACGCACGATTTCC-3' (서열번호 9)
ODC	F : 5'-CCCAGCGTTGGACAAATACT-3' (서열번호 10) R : 5'-CATTGAACGTAGAGGCAGCA-5' (서열번호 11)
SAMDC	F : 5'-ACCCAGCAGTTATGGACCAG-3' (서열번호 12) R : 5'-TGGTGTTGTTGCTGCTCCTT-3' (서열번호 13)
ATM	F : 5'-AAATTCTTGGATCCAGCTATT-3' (서열번호 14) R : 5'-CTGTATGAGCAAATTCACTTG-3' (서열번호 15)
PARP	F : 5'-ATGTCAACTATGAGAAGCTCA-3' (서열번호 16) R : 5'-GTTATATAGTAGAGAGGTGT-3' (서열번호 17)
MSH2	F : 5'-AACCCATTTTCATGAACTTACT-3' (서열번호 18) R : 5'-ATCTTATTAAGTTGATAGCCCA-3' (서열번호 19)
RAD51	F : 5'-AGATTGTATCTGAGGAAAGGAA-3' (서열번호 20) R : 5'-TAGATCAGTTTGTGACTACTGA-3' (서열번호 21)
GSH synthetase	F : 5'-TAACAACCTATATTGGGAA-3' (서열번호 22) R : 5'-ACCAGTATTTACCCTTCCATA-3' (서열번호 23)
γ-GCS 중쇄 소단위	F : 5'-AGAGAAGGGGGAAAGGACAA-3' (서열번호 24) R : 5'-GTGAACCCAGGACAGCCTAA-3' (서열번호 25)
γ-GCS 경쇄 소단위	F : 5'-TCAGTCCTTGGAGTTGCACA-3' (서열번호 26) R : 5'-AAATCTGGTGGCATCACACA-3' (서열번호 27)

도 2는 역전사 중합효소 연쇄 반응을 이용한 각종 유전자들의 발현정도를 비교한 사진이다. 이때, WT는 대조군으로 사용한 HL-60 세포를 의미하고, I-C는 공벡터를 형질도입한 HL-60 세포를 의미하며, T는 본 발명의 siRNA 발현벡터를 형질도입한 HL-60 세포를 의미한다. 아울러, SAMDC는 S-아데노실메티오닌 디카르복실라제(S-adenosylmethionine decarboxylase)를 의미하고, ODC는 오르니틴 디카르복실라제(ornithine decarboxylase)를 의미하며, ATM은 아탁시아 텔랑지엑타시아 뮤테이티드(ataxia telangiectasia mutated)를 의미하고, PARP는 폴리 에이디피-리보스 폴리머라제[Poly (ADP-ribose) polymerase]를 의미하며, MSH2는 mutS 상동체 2(mutS homolog 2)를 의미하고, RAD51은 recA 상동체의 일종이며, GSH synthetase는 글루타티온 합성효소를 의미하고, γ-GCS는 γ-글루타밀시스테인 합성효소(γ-glutamylcysteine synthetase)를 의미한다. 한편, RT-PCR에 대한 대조군으로는 β-액틴을 사용하였다.

도 2에서 보듯이, 정상적인 HL-60 세포 및 공벡터를 각각 삽입한 HL-60세포에서는 SAMDC, ODC, ATM, PARP, MSH2, RAD51, GSH synthetase, γ-GCS 중쇄, γ-GCS 경쇄 유전자에 있어서 발현양상이 거의 비슷하였으나, SAMDC 안티센스를 형질 도입시킨 HL-60 세포는 ODC 유전자에서는 정상 HL-60 세포와 공벡터를 삽입한 HL-60 세포보다 발현이 높았으나, 나머지 유전자에 있어서는 이들보다 유전자의 발현이 낮음을 알 수 있었다.

<실시예 3-2> 세포성장률 분석

본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA가 세포의 성장과 생존에 미치는 영향을 알아보기 위해 대조군 HL-60 세포, 공벡터를 삽입한 HL-60 세포 및 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포를 각각 5×10⁴cells/ml로 하여 전체부피가 2 ml이 되도록 6-웰 플레이트에 분주한 다음, 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하여, 5일 동안 24시간 마다 트립판 블루 염색법을 사용하여 세포성장률을 조사하였다(도 3).

도 3은 각 세포의 세포성장률을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, 상기 도에서, WT는 대조군 HL-60 세포를 의미하고, i-ctl은 공벡터를 삽입한 HL-60 세포를 의미하며, i-SAMDC는 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포를 의미하고, i-SAMDC+SPD는 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 다음, 스퍼미딘 10 μM을 첨가한 HL-60 세포를 의미한다.

도 3에서 보듯이, 각각의 세포를 5×10⁴ cell/ml로 각각 분주하여 5일간 배양해 24시간 마다 세포의 수를 측정해 세포 성장률을 비교한 결과 대조군 HL-60 세포와 공벡터를 삽입한 HL-60 세포에 비해 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포의 성장은 잘 이루어지지 않았으며, 특히 배양 5일째는 배양된 세포의 수가 5배까지 차이를 보여, 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도 입시킨 HL-60 세포의 성장이 잘 이루어지지 않는다는 것을 알 수 있었다. 한편, HL-60 세포를 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 다음, 스퍼미딘을 첨가한 경우(iSAMDC+SPD)에는 HL-60 세포의 성장이 어느 정도 회복됨을 알 수 있었다. 이는 스퍼미딘의 생성이 종양세포의 성장에 중요한 역할을 수행하고 있음을 보여주는 증거이다.

<실시예 3-3> 유동 세포 분석

<실시예 3-3-1> 감마 방사선 처리에 따른 유동 세포 분석

정상 HL-60 세포, 공벡터 형질도입 HL-60세포 및 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포를 각각 대조군 및 감마방사선 처리군으로 나누어 배양하여, 감마방사선 처리군은 방사선 조사 후 24시간, 48시간, 72시간 경과후 세포를 수거하고, 대조군은 방사선 조사 없이 동일 시간 경과후 세포를 수거하여 10분간 1000 rpm으로 원심분리한 다음 상등액을 제거하고, 세포를 부유시켜 70% 에탄올 1 ml을 첨가하여 30분간 -20℃에 방치하여 세포를 고정시켰다. 그런 다음, 1000rpm으로 10분간 원심분리한 후 에탄올을 완전히 제거하고 PBS로 씻어준 후 PI(propidium iodide) 염색시약(PBS, pH 7.4, 0.1% Triton X-100, 0.1 mM EDTA, pH 7.4, 0.05 mg/ml RNase A(50 units/mg), 5㎍/ml PI) 500 ㎕를 넣고 4℃에서 1시간동안 염색 후 염색된 세포를 유동세포분석기(flowcytometry, Epix, Coulter, USA)로 저이수배수체(hypodiploid)를 분석하였 다(도 4a).

도 4a는 각 세포의 방사선에 대한 민감도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, 상기 도에서, WT는 대조군인 HL-60 세포를 의미하고, i-control은 공벡터를 형질도입한 HL-60 세포를 의미하며, i-SAMDC는 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포를 의미한다. 도 4에서 보듯이, 2 Gy의 감마 방사선을 조사한 다음, 72시간 후에는 저이수 이배체의 수가 대조군 HL-60 세포와 공벡터를 삽입한 HL-60 세포에 비해 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포의 수가 4 내지 5배 높아 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 유전자를 억제시킨 HL-60 세포가 방사선에 민감하다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 3-3-2> H₂O₂ 처리에 따른 유동 세포 분석

한편, S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 유전자를 억제시킬 경우, 종양 세포의 산화적 스트레스에 대한 민감도의 변화양상을 조사하기 위하여, HL-60 세포, 공벡터 형질도입 HL-60세포 및 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포를 각각 대조군 및 H₂O₂ 처리군으로 나누어, H₂O₂ 처리군은 H₂O₂ 처리 후 3시간, 6시간 및 12시간 경과 후 세포를 수거하고, 대조군은 H₂O₂ 처리 없이 동일 시간 경과 후 세포를 수거하여 10분간 1000 rpm으로 원심분리한 후 상등액을 제거하고, 세포를 부유시켜 70% 에탄올 1 ml 을 첨가해 30분간 -20℃에 방치하여 세포를 고정시켰다. 그런 다음, 1000rpm으로 10분간 원심분리하여 에탄올을 완전히 제거하고, PBS로 씻어준 후 상기 실시예 3-3-1에서 사용한 PI 염색시약 500 ㎕를 첨가하고 4℃에서 1시간동안 염색하여, 염색된 세포를 유동세포분석기로 분석하였다(도 4b).

도 4b는 각 세포의 H₂O₂에 대한 민감도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, WT는 대조군인 HL-60 세포를 의미하고, i-control은 공벡터를 형질도입한 HL-60 세포를 의미하며, i-SAMDC는 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포를 의미한다. 도 4b에서 보듯이, 각각의 세포에 H₂O₂150 μM를 처리한 다음, 24시간 후에 저이수이배체의 수가 대조군 HL-60 세포와 공벡터를 삽입한 HL-60 세포에 비해 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포에서 매우높음을 보여주고 있어, S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 유전자를 억제시킬 경우, 종양세포가 DNA 손상인자인 H₂O₂에 민감해진 다는 것을 알 수 있었다.

<실시예3-3> 소핵 분석

S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 유전자를 억제로 인해 발생하게 되는 DNA 손상정도의 차이를 알아보기 위하여 소핵분석을 수행하였다. 2×10⁵cells/ml 농도의 정상 HL-60 세포, 공벡터 형질도입 HL-60 세포 및 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포◎각각 5ml씩 대조군 및 감마방사선 처리군으로 나누어 배양하여, 감마 방사선을 0.5 Gy(조사속도: 0.05 Gy/min)을 조사한 다음, 사이토칼라신(Cytochalasin-B, Sigma, USA) 3 ㎍/㎖를 처리하여 28시간 배양하고, 세포를 수확하여 0.075 M KCl 저장액에 3분간 노출시킨 다음, 메탄올:아세트산을 3:1(v/v)로 혼합한 고정액에 2회 고정시켰다. 이어, 상기 고정된 세포를 깨끗한 슬라이드 글라스에 떨어뜨리고 공기 중에 건조시킨 다음, 5% 김자용액(Giemsa solution)에 염색하여 현미경(1000X)을 이용하여 1000개의 이핵세포(binuclei)를 갖는 세포를 관찰하여 이들이 갖는 소핵의 수를 계측하였다(도 5).

도 5는 각 세포에 대하여 저선량의 방사선을 조사하여 소핵분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, 상기 도에서, WT는 대조군 HL-60 세포를 의미하고, i-control은 공벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포를 의미하며, SAMDC는 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포를 의미한다.

도 5에서 보듯이, 소핵 형성에 있어서 방사선을 조사하지 않은 상태에서는 각각의 세포가 유의한 차이를 보이지 않았으나, 저선량 방사선(0.5 Gy) 처리 후 소핵을 분석한 결과, 대조군 HL-60 세포와 공벡터를 삽입한 HL-60 세포에 비해 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 유전자를 억제시킨 HL-60세포의 경우 3배정도 높게 소핵이 형성됨을 확인할 수 있었다. 소핵은 방사선 등에 의하여 DNA 손상되었 을 때 형성되므로, 상기 결과를 통해, 본 발명의 siRNA에 의하여 방사선에 의한 종양세포 치료효과가 증가됨을 확인할 수 있었다.

<실시예 3-4> 형광을 이용한 세포내 활성 산소종 분석

세포의 성장과 세포사멸에 영향을 미치는 활성 산소종의 세포내 농도를 알아보기 위하여, 2×10⁵cells/ml의 농도의 정상 HL-60세포, 공벡터 형질도입 HL-60세포, 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포 및 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 다음 스퍼미딘 10 μM을 첨가한 HL-60 세포를 각각 5 ml로 T-25 플라스크에 분주하여 37℃에서 48시간동안 배양한 다음, 세포를 수확하여 PBS로 세척하고, 5×10⁵개의 세포를 300 ㎕의 PBS로 부유시켰다. 상기 세포에 10 μM의 클로로메틸-2',7'-디클로로플루오르신 디아세테이트(chloromethyl-2',7'-dichloro fluorescin diacetate, DCFH-DA, Sigma, USA)를 첨가하여 20분간 암실에 방치한 다음, 488 nm 파장을 갖는 형광현미경(Leica, Germany)과 유동세포분석기(Epix, Coulter, USA)를 이용하여 세포내 활성산소종의 양을 분석하였다(도 6a 및 6b).

도 6a는 각 세포 내의 활성산소종의 농도를 유동세포분석기로 측정한 그래프이고, 도 6b는 상기 세포들을 형광현미경으로 관찰한 사진이다. 이때, 상기 도에서 WT는 대조군 HL-60 세포를 의미하고, i-ctl은 공벡터를 형질도입시킨 HL-60 세 포를 의미하며, i-SAMDC는 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포를 의미하고, i-SAMDC+SPD는 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 다음 스퍼미딘 10 μM을 첨가한 HL-60 세포를 의미한다.

도 6a 및 6b에서 보듯이, 대조군 HL-60세포와 공벡터를 삽입한 HL-60세포에 비해 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포가 세포 내 활성산소종의 농도가 높은 것으로 관찰 및 측정 되었고, S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포에 스퍼미딘 10 μM을 첨가한 경우(i-SAMDC+SPD)에는 활성산소종의 농도가 감소했음을 확인할 수 있었다.

<실시예 3-5> 글루타티온(glutathion, GSH)의 농도분석

세포 성장과 생존에 영향을 미치는 활성산소종의 세포내 수준을 결정짓는데 중요한 역할을 하는 글루타티온의 농도를 각각의 세포마다 알아보기 위하여, 각각 2×10⁵cells/ml 농도의 정상 HL-60 세포, 공벡터 형질도입 HL-60 세포, 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포 및 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 후 10 μM의 스퍼미딘을 처리한 HL-60 세포 30ml을 T-75 플라스크에 분주하여 37℃에서 48시간동안 배양한 다음, 상기 세포를 수확하여 PBS 로 세척하고, 각각 2×10⁷개 정도의 세포를 취하여 용해 완충액[lysis buffer, 40 mM Tris, 35 ㎍/ml PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), 300 ㎍/ ml EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid), 0.7 ㎍/ml pepstatin, 0.5 ㎍/ml leupeptin, pH 7.4] 50 ㎕를 첨가하여, 세포를 파쇄시킨 다음 4℃ 12000 rpm으로 50분간 원심분리하고 상등액을 취해 단백질을 정량하였다. 정량된 단백질은 글루타티온 측정 키트(Calbiochem, USA)를 이용하여 세포내 글루타치온의 수준을 측정하였으며, 이때 제조사의 권고방법으로 표준곡선을 작성하여 측정값을 정량화 하였다(도 7).

도 7은 세포내 활성산소종 수준의 조절에 관여하는 물질인 전체 글루타티온(GSH)의 농도를 나타낸 그래프이다. 이때, 상기 도에서, WT는 대조군 HL-60 세포를 의미하고, i-ctl은 공벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포를 의미하며, i-SAMDC는 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포를 의미하고, i-SAMDC+SPD는 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 다음 스퍼미딘 10 μM을 첨가한 HL-60 세포를 의미한다.

도 7에서 보듯이, 대조군 HL-60 세포, 공벡터를 삽입한 HL-60 세포에 비해 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포의 글루타티온의 농도가 낮음을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시 킨 HL-60세포에 스퍼미딘 10μM를 첨가한 경우(i-SAMDC+SPD)에는 글루타티온의 농도가 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 3-6> 단세포 전기영동 분석

본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킴으로써, S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 유전자를 억제시킬 때, 유발되는 세포내 생리적(활성산소종 증가), 유전적(DNA 수선관련 유전자, 글루타치온 합성 관련 유전자의 발현저해) 이상으로 발생하게 되는 DNA 손상정도를 알아보기 위해 단세포 전기영동 분석을 수행하였다. 먼저 0.6%의 정상 용해 아가로즈겔(normal melting agarose gel)을 슬라이드 글라스에 떨어뜨려 제1층을 만든 다음, 1×10⁴cells/㎕ 농도의 세포 85 ㎕를 0.5% 저온 용해 아가로즈겔(low melting agarose gel)과 혼합하여 재빨리 제1층 위에 도포한 다음, 마지막으로 85 ㎕의 0.5% 저온 용해 아가로즈겔을 슬라이드 글라스 위에 떨어뜨려 슬라이드를 준비하였다. 상기 준비된 슬라이드는 알카라인 용해 완충용액(alkaline lysis buffer, 2.5 M NaCl, 100 mM Na₂-EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1% Triton X-100, 10% DMSO, pH 10.0)에 침지하여 4℃에서 1시간동안 방치하였다. 그런 다음 슬라이드를 10분동안 증류수로 세척하고 알카라인 완충용액(alkaline buffer, 1 mM Na₂-EDTA, 300 mM NaOH, pH 13.0)에서 0.78 V/cm로 25분간 전기영동을 수행하였다. 전기영동을 완효한 다음, 중성화 완충용액(neutralization buffer, 0.4 M Tris-HCl, pH 7.5)을 이용하여 세 척하고, 100% 에탄올에 1분간 방치한 다음, 슬라이드를 꺼내 100 ㎕ 에티디움 브로마이드 용액(10 ㎍/ml)를 슬라이드 위에 떨어뜨려 염색을 하였다. 이어, 형광현미경(Leica, Germany)과 이미지 프로그램(Kinetic imaging, UK)을 이용하여 계측하였다(도 8a 및 8b).

도 8a는 단세포 전기영동법을 통해 세포내 활성산소종에 의한 DNA의 손상정도를 나타내는 그래프이고, 도 8b는 단세포 전기영동 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다. 이때, 상기 도에서, WT는 대조군 HL-60 세포를 의미하고, i-ctl은 공벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포를 의미하며, i-SAMDC는 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포를 의미하고, i-SAMDC+SPD는 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 다음 스퍼미딘 10 μM을 첨가한 HL-60 세포를 의미한다.

도 8a 및 8b에서 보듯이, 대조군 HL-60 세포, 공벡터를 삽입한 HL-60 세포, 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포에 대하여 단세포 전기영동을 수행한 결과, 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 발현벡터를 형질도입시킨 HL-60 세포의 경우, 대조군 HL-60 세포 와 공백터를 삽입한 HL-60 세포에 비해 4 내지 5배 더 긴 DNA 꼬리를 나타내었다. 반면, 여기에 스퍼미딘을 첨가하면 DNA의 손상이 부분적으로 회복됨을 확인할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 및 상기 siRNA의 발현벡터는 종양세포에 형질도입시킬 경우, 활성산소종 증가, DNA 수선관련 유전자 및 글루타치온 합성 관련 유전자의 발현저해 등을 통하여, 종양세포의 성장을 억제시키고, 산화적 스트레스 및 방사선 조사에 대한 민감도를 증가시켜, 이들 종양세포의 세포사멸을 촉진시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제에 특이적인 siRNA 및 상기 siRNA의 발현벡터는 화학요법 또는 방사선 요법과 병행하여 사용될 경우 종양치료에 있어서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이상에서 주장하고 입증하였듯이, 본 발명은 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 mRNA에 특이적인 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 그를 유효성분으로 포함하는 악성종양 치료제를 제공한다. 본 발명의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제 mRNA에 특이적인 siRNA 및 상기 siRNA를 유효성분으로 포함하는 악성종양 치료제는 악성종양 세포 특히 전골수성 백혈병 세포에 형질도입시, DNA 손상시 수선에 필요한 여러 유전자의 발현에 관계하는 폴리아민의 합성에 관여하는 유전자인 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제의 발현을 억제하여 전골수성 백혈병 세포의 성장을 억제하고, 세포사를 증가시키며, 감마 방사선 및 DNA 손상인자에 의한 손상시 수선효소의 발현을 억제시킴으로써 세포사멸(apoptosis)을 극대화함으로써, 화학요법 또는 방사선요법과 병행하여 사용될 경우, 악성종양 치료에 있어서 매우 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오타이드 염기서열을 갖는 센스서열, 4 내지 8 염기 길이의 루프서열 및 상기 센스서열에 상보적으로 결합하는 안티센스서열로 이루어진, 서열번호 1의 S-아데노실 메티오닌 디카르복실라제(S-adenosylmethionine decarboxylase) 유전자의 mRNA에 특이적으로 상보결합하는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA).
삭제
제 1항에 있어서,

3' 말단에 2 내지 4개의 U가 추가적으로 부가되는 것을 특징으로 하는 작은 간섭 RNA.
제 3항에 있어서, 3' 말단에 2개의 U가 부가되는 것을 특징으로 하는 작은 간섭 RNA.
삭제
제 1항에 있어서,

루프서열은 UUCG인 것을 특징으로 하는 작은 간섭 RNA.
삭제
삭제
제 1항의 작은 간섭 RNA를 발현하는 재조합 발현벡터.
제 9항에 있어서,

도 1의 pU6shX-SAMDC로 기재되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 1항, 제 3항, 제 4항 및 제 6항 중 어느 한 항의 작은 간섭 RNA를 유효성분으로 포함하는 악성종양 치료제.
제 11항에 있어서,

약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 치료제.
제 11항에 있어서,

악성종양은 위암, 간암, 대장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 피부암, 신장암, 뇌종양, 방광암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료제.
제 9항 또는 제 10항의 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 악성종양 치료제.
제 14항에 있어서,

악성종양은 위암, 간암, 대장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 피부암, 신장암, 뇌종양, 방광암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료제.
제 14항에 있어서,

약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 치료제.