KR100753148B1 - 줄기세포 분화용 세포 자극 및 검출 바이오칩 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포 및 조직공학적인 연구와 실용화 분야에 적용 가능한 초소형 세포 자극 및 검출 바이오칩에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 다양한 세기와 주기를 갖는 기계적 압축자극을 세포에 전달할 수 있는 세포 자극기와 자극을 가한 후 세포의 분화 정도와 상태 등을 검출해 낼 수 있는 세포 검출기가 내장된 바이오칩과 이를 제작하는 방법에 관한 것이다.

이를 위하여 본 발명은, 실리콘, 유리 또는 폴리머 재질의 하부 기판에 마이크로머시닝 공정을 적용하여 미세 유로와 자극 챔버, 검출 챔버를 형성하는 단계, 상부 기판에 전기화학방전가공을 이용하여 유체의 입구, 출구를 제작하는 단계, 제작된 상부 기판과 하부 기판을 접합하는 단계, 상기 단계 후 기계적 자극을 위한 구동기를 부착하는 단계로 이루어진다.

상기 단계들로 제작된 세포 자극 및 검출 바이오칩은 세포와 함께 배양액이 유입하는 단계, 착상 단계 및 기계적 자극을 일정 시간 동안 주기적으로 가하는 단계, 세포를 탈착시켜 항원항체 반응을 이용한 특정 세포를 분리하는 단계, 분리된 세포의 비율과 형광 검출 또는 염색을 통하여 세포의 상태 및 분화정도를 알아내는 단계로 작동된다.

세포에 대한 기계적 압축자극과 검출 및 관찰을 단일 칩 상태에서 처리 가능하다는 점에서 줄기세포, 조직공학 분야에서의 응용 및 일반 세포와 의학, 약학 분야에도 응용 가능하며 인력, 시간, 비용을 획기적으로 감소시키는 특징이 있다.

줄기세포, 바이오칩, 세포 자극기, 세포 검출기, 마이크로머시닝

Description

줄기세포 분화용 세포 자극 및 검출 바이오칩{Biochip of cell stimulation and detection for stem cell differentiation}

도 1은 본 발명에 따른 세포 자극 및 검출 바이오칩의 평면도.

도 2는 본 발명에 따른 세포 자극 및 검출 바이오칩의 단면도.

도 3은 본 발명에 따른 세포 자극 및 검출 바이오칩의 제작 공정도.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

1 : 세포와 배양의 주입구 2 : 자극 챔버

3-1, 2 : 자기 미세 알갱이 주입구 및 출구 4 : 미세 유로

5 : 1차 세포 검출 챔버 6 : 2차 세포 검출 챔버

7-1, 2 : 형광 및 염색 주입구 및 출구 8 : 폐기구

9 : 상부 기판 10 : 하부 기판

11 : 압전디스크 12 : 도금용 금속 기판

13 : 두꺼운 감광제 14 : 도금된 구조물

본 발명은 줄기세포 및 조직공학적인 연구와 실용화 분야에 적용 가능한 초소형 세포 자극 및 검출 바이오칩에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 다양한 세기와 주기를 갖는 기계적 압축자극을 세포에 전달할 수 있는 세포 자극기와 자극을 가한 후 세포의 분화 정도와 상태 등을 검출해 낼 수 있는 세포 검출기가 내장된 바이오칩과 이를 제작하는 방법에 관한 것이다.

줄기 세포는 아직 분화하지 않은 미성숙 상태의 세포로 체외 배양에서도 미분화 상태를 유지하면서 분열, 복제할 수 있는 능력을 갖고 있다. 또 개체의 발달 시기와 위치하는 장소 등에 따라 생물체를 이루는 많은 종류의 서로 다른 세포로 분화 가능한 특징을 갖고 있다. 최근 의료분야에서 줄기세포를 증식 후 특정세포로 분화시켜 환자의 조직 또는 기관의 재생 및 치환을 위해 다양한 시도와 초기 임상 실험이 진행 중에 있다(강길선 등, 고분자과학과 기술, 제13권, 1호 (2002); 강계원, 사람의 배아줄기세포 기술정책, KISTI 기술동향분석보고서 (2003)).

대부분의 연구 그룹에서는 현재까지 해왔던 고전적 방법인 배양접시(petridish) 단위의 세포 배양 및 분화 연구를 수행하고 있다. 이러한 고전적 연구 방법은 세포의 변화를 검출하기 위해 다량의 배양 세포를 필요로 하며, 매 실험시 반복적인 세포 배양을 해야 하는 단점이 있다(Daniel R. Marshak 등, stem cell biology, cold spring harbor laboratory press (2001). 이는 동일 실험에 대해 결과가 달라져 신뢰성, 반복 재현성이 떨어지는 결과를 낳았다. 또 매 실험 단계마다 실험자의 조작과 노동력이 필요하며, 넓은 공간, 많은 시간과 비용을 필요로 한다.

실험 수행과는 별도로 그 동안의 줄기세포의 분화 연구는 분화를 촉진하기 위한 배양액의 조성과 분화 유도 물질을 통한 연구에 국한되어 있으며, 최근 생화학적 요인 외에 중력, 체액에 의한 전단 응력 등과 같은 기계적 요인들이 줄기세포 분화에 중요한 요인으로 생각되어 이에 대한 연구가 시작되고 있다.
기계적 자극이 줄기세포로부터 연골세포 분화를 어떠한 경로를 갖고 촉진시키는 지에 대한 가설을물질대사 개념으로 제시한 것이 개념도 1이다.

개념도 1. 기계적 자극이 연골세포 분화를 촉진하는 물질대사 과정
(T Ichiro, 등, J. Cell Sci., 111, 2067 (1998)).
개념도 1에 나타낸 것과 같이 줄기세포에 정압축력 자극을 준 결과 연골세포 분화의 표식인자인 Sox9, 제 2형 교원질과 aggrecan의 발현이 증가되고, 연골세포 분화에 부정적인 조절인자인 IL-1의 발현을 억제하는 것을 관찰하였다. 특히, 연골조직과 골조직(뼈)의 경우 항상 물리적, 기계적 자극 상태에 놓여 있어 이러한 조직으로 분화되는 줄기세포의 경우 기계적 자극이 분화를 촉진 시킬 것이라는 가정 하에 다양한 자극(압력, 세포변형/긴장, 유압과 유동, 동전기력, 대류에 의한 양분이동 등) 실험이 수행되고 있다(T Ichiro, 등, J. Cell Sci., 111, 2067 (1998); 박소라 등, 조직공학과 재생의학지, Vol. 2, No. 2, 77-85 (2005)). 다양한 연구그룹에서 기계적 자극이 줄기세포의 연골 및 골세포로의 분화를 촉진시킨다는 결과들을 보고하고 있으며 이를 바탕으로 분화 유도를 위한 기계적 자극의 이용이 활발해지고 있다(C. Perka, 등, J. Biomedical Material Research A, 52, 543-552 (2000); J. D. Kisiday, 등, J. Biomechanics, 37, 595-604 (2004)). 그러나 이러한 기계적 연구 또한 고전적인 실험방법인 배양접시 단위로 실험이 개별 진행되어 앞서 기술된 공간, 시간, 노동력, 비용 등이 많이 필요한 단점을 갖고 있다.

본 발명은 목적은 상기와 같은 문제점들(공간, 시간, 노동력, 비용)을 최소로 줄이고 효율을 극대화하기 위해 마이크로머시닝 기술을 적용하여 다양한 세기와 주기를 갖는 기계적 압축자극을 세포에 전달할 수 있는 세포 자극기와 세포의 분화 정도와 상태 등을 검출해 낼 수 있는 세포 검출 챔버가 한 칩에 통합 내장된 바이오칩을 제작하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포자극 실험 및 분화유도를 위해 진행되는 실험공정을 단일칩 상에서 진행하여 기존 실험방법에서 반복적으로 필요로 하는 세포의 양, 노동력, 비용, 시간을 최소화하고 실험의 신뢰도를 향상시키는 것이다.

이와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서 제시한 바이오칩은 압전방식으로 구동되는 세포 자극기와 자극을 가한 후 세포의 분화 정도와 변화 상태를 형광방식을 이용하여 분리, 검출할 수 있는 세포 검출 챔버가 하나의 칩에 통합 내장되어 있다.
압전디스크는 전압이 인가되면 일정한 방향으로 팽창되거나 수축되며, 이때 가장자리가 고정되어 있을 경우 디스크 중앙부분이 위로 변형된다. 세포가 이러한 압전디스크 표면에 위치하고 챔버의 다른 부분이 밀폐되어 있을 경우 압전디스크의 변형에 의해 기계적 압축자극을 받게 된다.
압전구동방식 세포 자극기는 이러한 압전디스크를 사용하여 전기적 신호의 주기와 전압 조절을 통하여 세포에 원하는 주기와 세기를 갖는 기계적 압축자극을 인가할 수 있다. 세포 검출 챔버는 2단계의 세포 검출 챔버를 갖는다. 각각의 검출 챔버(5, 6)는 세포 표면의 특정 단백질에 결합하는 특이적 항원항체 반응을 이용한 다양한 염색물질과 형광물질을 결합시킨 표지인자(surface marker)를 이용하여 세포를 분리 또는 결합 상태 그대로를 관찰한다. 항원항체 반응을 이용할 경우 특정한 세포만을 특이적 결합을 이용하여 분리할 수 있으며 전체 세포에 대하여 분리된 특정세포의 비율을 통하여 세포의 변화정도를 알아낼 수 있다. 형광물질이 붙어있는 경우는 특정세포 표면에 붙은 형광물질의 개수 또는 광량을 측정하여 변화된 세포의 개체수와 분화 정도를 알아낼 수 있다.
세포 자극기와 검출 챔버는 실리콘, 유리 또는 폴리머 재질의 하부 기판에 마이크로머시닝 공정을 적용하여 미세 유로와 자극 챔버, 검출 챔버를 형성하는 단계, 상부 기판에 전기화학방전가공을 이용하여 유체의 입구, 출구를 제작하는 단계, 제작된 상부 기판과 하부 기판을 접합하는 단계, 상기 단계 후 기계적 압축자극을 위한 압전디스크를 부착하는 단계로 이루어진다.
세포에 대한 기계적 자극과 검출 및 관찰을 단일 칩 상태에서 처리 가능하다는 점에서 줄기세포, 조직공학 분야에서의 응용 및 일반 세포와 의학, 약학 분야에도 응용 가능하며 인력, 시간, 비용을 획기적으로 감소시키는 특징이 있다.

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이하 첨부된 도면에 의해 상세히 설명하면 다음과 같다.

도 1과 2는 각각 본 발명의 줄기 세포 분화를 위한 세포 자극 및 검출 바이오칩의 평면도와 단면도이다. 세포 자극 및 검출 바이오칩은 한개의 자극 챔버(2)와 두개의 검출 챔버(5, 6)로 구성되어 있다. 하부 기판(10)은 챔버 형성을 위한 공동(2, 5, 6)과 유체가 흘러갈 수 있는 미세 채널(4)을 갖고 있으며, 상부 기판(9)은 각각의 챔버에 검출을 위한 물질 주입을 위한 입구(3-1, 7-1)와 출구(3-2, 7-2)를 갖고 있다. 미세 채널은 검출 챔버에 균일한 속도를 갖는 유량을 만들기 위해 벌집모양으로 채널을 분리시켜 균등한 유체 흐름을 유도한다. 최종적으로 세포 자극 및 검출 바이오칩은 상부 기판(9)과 하부 기판(10)이 접합된 구조로 되어있다.

도 3은 세포 자극 및 검출 바이오칩의 제작 공정도이다. 하부 기판(10)을 제작하기 전에 도금용 금속 기판에 도금 틀을 형성하기 위해 두꺼운 감광제(13)를 회전 도포 후 정밀 노광 장치를 이용하여 도 3(가)와 같이 패턴닝 한다. 패턴된 도금틀 위에 전기 도금 공정을 이용하여 도 3(다)와 같이 핫프레싱 몰드용 도금된 구조물(14)을 제작한다. 제작된 구조물에 폴리머 기판을 핫프레싱 하여 하부 기판의 각각의 챔버(2, 5, 6)와 미세 채널(4)을 도 3(마)와 같이 형성한다. 제작된 하부 기판(10)을 자극 구동기(11) 장착을 위해 정밀가공기를 사용하여 구멍을 도 3(바)와 같이 관통시킨다. 상부 기판(9)을 전기화학방전가공을 이용하여 검출용 유체 주입을 위한 입구, 출구를 도 3(사)와 같이 제작한다. 제작된 상부 기판(9)과 하부 기판(10)을 접합한 후 도 3(자)와 같이 자극 구동기를 부착하여 세포 자극 및 검출 바이오칩을 완성한다.
도 4는 상기 단계들로 제작된 세포 자극 및 검출 단일 바이오칩을 이용하여 줄기세포의 분화를 촉진하는 과정을 나타내는 작동 순서도이다. 세포와 함께 배양액이 유입하는 단계, 착상 단계 및 기계적 자극을 일정 시간 동안 주기적으로 가하는 단계, 세포를 분리시켜 항원항체 반응을 이용한 특정 세포를 분리하는 단계, 분리된 세포의 비율과 형광 검출 또는 염색을 통하여 세포의 상태 및 분화정도를 알아내는 단계로 작동된다. 사용된 표지인자는 CD 29, CD 90, Actin이며, 골조직으로의 분화를 측정하기 위해 칼슘 생성물에 붉은 색으로 염색되는 ALP(alkaline phosphatase)를 사용한다. 표지인자의 경우 형광물질 또는 자성물질을 2차적으로 연결시켜 관찰이 용이하도록 한다.
단계 1: 세포주입 및 세포정착 단계
배양액 또는 3차원 고분자 지지체와 섞인 세포를 전단 입구를 통하여 자극챔버 내로 주입하는 단계 (도 4(가))
단계 2: 기계적 자극 인가 단계
모든 입출구를 막고 압전디스크에 전기신호를 인가하여 챔버내 기계적 압축자극을 인가하는 단계 (도 4(나))
압전디스크에 인가되는 전압에 따라 압축자극의 세기를 조절할 수 있으며, 주파수에 따라 자극의 주기 조절이 가능하다.
단계 3: 검출 염색액 또는 표지인자를 이용한 형광물질 주입 단계
검출 챔버 위쪽 상판에 영구자석을 장착시키고 특정 세포에 반응하는 항체를 붙인 염색액 또는 특이적 결합을 하는 표지인자를 결합한 형광물질을 주입하는 단계 (도 4(다))
단계 4: 검출 단계 (1차 검출 챔버, 2차 검출 챔버 동일한 과정이며, 서로 다른 염색 방법을 적용한다.)
버퍼용액을 주입하여 자극 챔버안의 세포를 검출 챔버쪽으로 흘려보낸 후 고정된 특정 세포만 부착하도록 하는 단계 (도 4(라))
최종적으로 버퍼용액을 계속 흘려주어 필요세포 이외에는 모두 배출시킨 후 고정된 특정세포만을 관찰하거나, 별도로 수집하여 RT-PCR 또는 현미경을 통하여 염색정도와 형광량을 측정하여 세포의 변화를 검출한다. 형광염색법의 경우 별도의 수집과정 없이 칩상에서의 관찰도 가능하다.

이상에서 상술한 바와 같이 본 발명을 이용할 경우 특정 유형의 세포로 분화시킬 수 있는 분화기술이 개발이 용이하며, 이에 따라 다음과 같은 효과를 기대할 수 있다.

우선 1차적인 줄기 세포 및 생물학적 연구에 대한 기대효과로 세포에 대한 기계적 자극과 검출 및 관찰을 단일 칩 상태에서 처리 가능하다는 점에서 줄기세포, 조직공학 분야에서의 응용 및 일반 세포와 의학, 약학 분야에도 응용 가능하며 인력, 시간, 비용을 획기적으로 감소시키는 효과특징이 있다.

2차적인 효과로 다양한 종류의 난치병 치료에 응용이 가능하며, 세포 치료기술 및 조직 공학과의 연계를 통하여 장기 이식을 포함한 생체 재생의학에도 다양하게 응용될 수 있다. 또 신약 후보물질에 대한 전 임상 실험으로서 줄기세포로부터 분화 유도된 특정 세포를 이용하여 신약개발 및 약물 조사에도 응용될 수 있다.

마이크로머시닝을 이용한 바이오칩의 대량 생산을 통한 생산 단가 절감으로 바이오칩의 대중화 및 보급에도 크게 기여함으로서 기초과학과 산업의 발전 및 국민의 복지에도 직접 혹은 간접적으로 이바지할 것으로 기대된다.

Claims (3)

1. 압전디스크를 사용하여 전기적 신호의 주기와 전압 조절을 통하여 세포에 원하는 주기와 세기를

   갖는 기계적 압축자극을 인가할 수 있는 압전구동방식 세포 자극기,

   세포자극기와 세포 주입을 위한 입구를 갖는 자극 챔버,

   세포 표면의 특정 단백질에 결합하는 특이적 항원항체 반응을 이용한 다양한 염색

   물질, 형광물질을 결합시킨 표지인자를 이용한 형광방법을 사용하여 세포를

   분리하거나 세포의 상태 및 연골 또는 골분화정도를 현미경으로 관찰 가능한 세포 검출 챔버,

   압전방식으로 구동되는 세포 자극기와 자극을 가한 후 세포의 분화 정도와 변화 상태를 형광방식

   으로 검출할 수 있는 세포 검출 챔버가 벌집모양 미세유로로 연결되어 하나의 칩에 통합된

   바이오칩.
2. 실리콘, 유리 또는 폴리머 재질의 하부 기판에 마이크로머시닝 공정을 적용하여 균일한 유체

   흐름을 만들기 위한 벌집 모양의 분할된 미세 유로를 제작하는 단계,

   줄기세포를 자극하기 위해 압전디스크가 부착된 자극 챔버를 형성하는 단계,

   항원항체 반응을 이용한 특이적 결합이 일어날 수 있도록 하는 검출 챔버를 형성하는 단계,

   상부 기판에 전기화학방전가공을 이용하여 유체의 입구, 출구를 제작하는 단계,

   제작된 상부 기판과 하부 기판을 접합하는 단계,

   상기 단계 후 기계적 자극을 위한 구동기를 부착하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포

   자극 및 검출 바이오칩 제작 방법.
3. 제2항에 기재된 단계들로 제작된 세포 자극 및 검출 바이오칩의 작동 방법에 있어서,

   세포와 함께 배양액이 유입되는 단계,

   착상 단계 및 기계적 압축자극을 일정 시간 동안 주기적으로 가하는 단계,

   특정 항체를 붙인 후 항원항체 반응을 이용하여 특정 세포를 검출하는 단계,

   형광 검출 또는 염색을 통하여 세포의 상태 및 연골 또는 골분화 정도를 검출하는 단계,

   상기 순서로 세포를 자극 및 검출하도록 작동되는 방식.

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