KR100753003B1

KR100753003B1 - 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체

Info

Publication number: KR100753003B1
Application number: KR1020050069849A
Authority: KR
Inventors: 김하나; 변유량; 이상재; 홍영호; 이동우; 최은아; 김성보; 조은아; 조석철; 국무창; 최찬익; 김도윤
Original assignee: (주)바이오벤; 변유량
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2005-07-29
Publication date: 2007-08-31
Anticipated expiration: 2025-07-29
Also published as: KR20070014867A

Abstract

본 발명은 야생형 글루타메이트 디카르복실라아제의 아미노산 서열의 C-말단 부위가 결손된 아미노산 서열을 포함하며 pH 4.0-9.0의 범위에서 활성을 나타내는 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체에 관한 것으로서, 본 발명의 변이체의 활성은 산성-비의존성을 나타내며, pH 4.0-9.0의 범위에서 활성을 나타내기 때문에 특히 세포고정화를 통한 GABA 생산에 적합하다.

감마-아미노부티르산, GABA, 생물전환, 글루타메이트 디카르복실라아제, 글루타메이트. 세포 고정화

Description

절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체{Truncated Glutamate Decarboxylase Mutants}

도 1은 락토바실러스에서 글루타메이트 디카르복실라아제에 의한 산성 pH 내성 및 ATP 생성 기전을 보여주는 모식도이다.

도 2는 실란 시약 및 글루타르알데하이드를 이용하여 다공성 실리카겔에 본 발명의 재조합 글루타메이트 디카르복실라아제를 고정화시키는 과정을 나타낸다.

도 3은 GABA 제조를 위한 패킹-베드 반응기의 개략도이다.

도 4는 L. plantarum 야생형 글루타메이트 디카르복실라아제의 절단형 변이체 (LPTF 및 LPTD)의 디자인을 보여주는 뉴클레오타이드 서열이다.

도 5는 본 발명의 L. plantarum 야생형 글루타메이트 디카르복실라아제의 SDS-PAGE (패널 A) 및 네이티브-PAGE (패널 B) 결과 사진이다. 패널 A에서 레인 1은 분자량 마커이고, 레인 2는 세포 전체 단백질 패턴, 레인 3은 세포 추출물, 레인 4-5는 정제된 글루타메이트 디카르복실라아제, 레인 6은 투석 후의 정제된 글루타메이트 디카르복실라아제를 각각 나타낸다. 패널 B에서, 레인 1은 정제된 글루타메이트 디카르복실라아제, 레인 2는 분자량 마커이다.

도 6a은 L. plantarum 야생형 글루타메이트 디카르복실라아제의 최적 pH를 보여주는 그래프이다. 효소 활성을 100 mM 소듐-아세테이트 완충액 (pH 3.5-6.0)에서 결정하였다.

도 6b는 L. plantarum 야생형 글루타메이트 디카르복실라아제의 최적 온도를 보여주는 그래프이다. 효소 활성을 50 mM 소듐-아세테이트 완충액 pH 5.0에서 결정하였다.

도 7a는 L. plantarum 야생형 글루타메이트 디카르복실라아제의 pH 안정성을 보여주는 그래프이다. 효소 용액을 서로 다른 시간 (0-96 hr) 동안 실온에서 각각의 완충액에 프리-인큐베이션하였다.

도 7b는 L. plantarum 야생형 글루타메이트 디카르복실라아제의 열적 안정성 (thermostability)을 보여주는 그래프이다. 효소 용액을 서로 다른 시간 (0-9 hr) 동안 다양한 온도 (40-90℃)에서 200 mM 소듐 아세테이트 (pH 5.0)에서 인큐베이션하였다.

도 8은 정제된 L. plantarum 글루타메이트 디카르복실라아제의 온도 변화에 따른 구조 변화를 보여주는 그래프이다. 50 mM 소듐 아세테이트 완충액 (pH 5.0) 내의 정제된 효소 시료 (1 mg/㎖)를 30-110℃ 온도에서 222 nm로 스캐닝하였다 (스캔 속도, 1℃/분).

도 9a는 유리 및 고정화 글루타메이트 디카르복실라아제에 대한 pH 영향을 보여주는 그래프이다. 효소 활성을 pH 3.5-6.0의 범위의 100 mM 소듐-아세테이트 완충액에서 결정하였다.

도 9b는 유리 및 고정화 글루타메이트 디카르복실라아제에 대한 온도 영향을 보여주는 그래프이다. 효소 활성을 pH 5.0에서 50 mM 소듐-아세테이트 완충액에서 20분 동안 인큐베이션하여 결정하였다.

도 10a는 고정화 글루타메이트 디카르복실라아제의 pH 안정성을 보여주는 그래프이다. 각각의 완충액에서의 잔여 활성을 실온에서 7일 동안 프리-인큐베이션한 후에 결정하였다.

도 10b는 고정화 글루타메이트 디카르복실라아제의 열적 안정성을 보여주는 그래프이다. 효소 용액을 서로 다른 시간 (0-9 hr) 동안 다양한 온도 (40-90℃)에서 200 mM 소듐 아세테이트 (pH 5.0)에서 인큐베이션하였다.

도 11은 패킹-베드 반응기 (45℃)에 있는 실리카 비드에 고정화된 글루타메이트 디카르복실라아제에 의한 모노-소듐 글루타메이트의 GABA로의 생물전환을 보여주는 그래프이다.

도 12는 LPGAD 3D 모델을 만들기 위하여 주형 E. coli gadB (PDB: 1PMO) 및 L. plantarum GAD의 아미노산 서열을 얼라인먼트한 결과이다.

도 13은 L. plantarum GAD의 모델 구조를 나타낸다. α-나선 부분은 청색으로 β-쉬트 구조는 노란색으로 표시되어 있다.

도 14는 L. plantarum GAD의 중성 pH (패널 A) 및 산성 pH (패널 B)에서의 구조적 차이를 보여준다. 두 개의 인접한 도메인은 핑크색 및 노란색으로 나타나 있다. pH 변화에 따른 구조적 변화는 적색 및 청록색의 부위로 나타나 있다.

도 15는 L. plantarum GAD의 기질 결합 부위 상호작용에 대한 분자적 상세도이다. 정상 pH (패널 A) 및 산성 pH (패널 B) 조건은 상호작용 변화를 유도한다. 기질 결합 포킷을 이루는 C-말단 잔기들은 백색으로 표시되어 있다. 적색의 점선은 수고결합을 나타낸다.

도 16은 본 발명의 절단형 GAD 변이체의 발현 패턴을 보여주는 사진이다. 레인 1 분자량 마커, 레인 2 야생형 단백질, 레인 3 LPTF 및 레인 4 LPTD.

도 17은 본 발명의 절단형 GAD 변이체의 활성에 대한 pH 영향을 보여주는 사진이다. 효소 활성을 100 mM 소듐-아세테이트 완충액 (pH 3.5-9.0)에서 결정하였다. 패널 A 야생형, 패널 B LPTF 및 패널 C LPTD.

도 18은 락토바실러스 플랜타룸의 GAD 이외의 락토바실러스 브레비스와 대장균의 GAD의 경우에도 성공적으로 GABA 생물전환 반응을 하는 지 여부를 확인한 TLC 결과 사진이다. 레인 1-2는 락토바실러스 브레비스의 GAD, 레인 3-4는 락토바실러스 플랜타룸의 GAD, 그리고 레인 5-6은 대장균 GAD에 대한 것이다.

본 발명은 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용한 생물전환공정에 의한 GABA의 제조방법 및 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 약자는 다음과 같다: BCA (bicinchoninic acid), CD (circular dichroism), ATCC (American Type Culture Collection), EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), GRAS (generally recognized as safe), HPLC (high performance liquid chromatography), IPTG (isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside), LB (Luria-Bertani), LPGAD (Lactobacillus plantarum Glutamate Decarboxylase), PCR (polymerase chain reaction), SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), TLC (thin-layer chromatography), UV (ultraviolet) 및 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside).

글루타메이트 디카복실라아제 (GAD)는 피리독살 5-포스페이트 (PLP)-의존 세포내 효소로서, L-글루타메이트의 γ-아미노부티레이트로의 비가역적 탈카르복시화 반응을 촉매한다 (도 1, Aurozo et al., 2003). 동물과 식물에 널리 분포되어 있는 GABA는 포유동물 뇌 및 척추에서 억제성 신경전달물질의 역할을 한다. GABA는, 뇌졸중과 뇌종양 또는 대뇌동맥질환의 속발증으로서 두통, 이명, 의지박약의 치료 용도로서 상품명 Gammaron (Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.)으로 하여 의약으로 오랫동안 이용되고 있는 데, 이는 GABA가 뇌에서 혈류를 개선하고 뇌에 산소공급을 증진시키며 뇌 대사를 강화하기 때문이다. 또한, GABA는 연수의 혈관운동체 중심에 작용하여 혈압을 낮추는 데 유효하다 (표 1).

GAD는 GABA 생성에 관여함으로써 척추동물 중추신경계에서 중요한 역할을 한다. GAD는 신경전달물질 합성에 관여하는 효소 중에서 독특하다고 여겨지며, 이는 GAD의 기질과 생성물이 모두 신경절달물질이고 서로 반대되는 작용을 하기 때문이다. 신경계에서, L-글루타메이트는 흥분제 GABA는 억제제의 작용을 하며, 각각 은 글루타민생성 시냅스 및 GABA생성 시냅스에 관여한다 (Shepherd, 1998). 대부분의 척추동물에서, GAD는 두 종류의 동형제 (isoform), GAD65 및 GAD67를 갖으며, 이 둘은 중성 pH에서 활성을 나타낸다 (Martin and Soghomonian, 1998). GAD65는 당뇨병과 경직 질환 (stiff man syndrome: SMS)을 가지는 환자에서 생성되는 항체에 대하여 항원성을 나타내기 때문에 인간 췌장 GAD65는 특별히 주목을 받고 있다. GAD65의 구조 정보는 신규하고 진보된 진단 도구를 개발하는 데 중요하다.

GABA의 생화학적 특성 및 생리학적 작용

생화학적 특성	생리학적 작용
4개의 탄소 비-단백질 아미노산	저혈압 효과
높은 수용성	이뇨 효능
CNS에서의 주요한 억제 신경전달물질	정신안정제 효능
GAD에 의해 글루타메이트로부터 비가역적으로 생성	항-우울증 효능

식물 및 이스트 GAD의 독특한 특징은 C-말단 부분에 칼모듈린 (CaM)-결합 도메인의 존재이다. Saccharomyces cerevisiae에서, GAD 발현은 정상적 산화 스트레스 내성에 필수적이다 (Coleman et al., 2001). 식물에서, GAD는 Ca²⁺시그널을 감지하는 스트레스-어탭터 차페로닌으로 추측되고 있다. CaM-결합 도메인을 제거하면, 활성이 조절되지 않아 심각한 발생 문제가 야기된다 (Baum et al., 1996). GAD 식물 효소의 최적 pH는 5.8이지만 그의 활성은 Ca² ⁺/CaM 복합체의 존재 하에서 pH 7.3에서 크게 나타나며, 약 500 kDa의 크기를 나타낸다 (Baum et al., 1996).

박테리아 GADs는 산성 최적 pH (3.8-4.6)를 갖으며 (Darii et al., 1994), 환경 스트레스에 반응하여 발현된다 (Blankenhorn et al., 1991; Biase et al., 1999). GAD 동형체 (gadA and gadB)는 그람-음성 박테리아 Escherichia coli (Elliott et al., 1992)와 그람-양성 박테리아 Listeria monocytogenes (Cotter et al., 2001) 등 몇 종의 박테리아에서 발표된 바 있다. 두 가지의 동형체는 동일한 속도론적 특성 및 생리화학적 특성을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Biase et al., 1996). E. coli에서, gadA 및 gadB는 gad 시스템의 구성 요소로서 알려져 있다 (Biase et al., 1999; Cotter et al., 2001). E. coli에서 알려진 3가지 산내성 시스템 중에서 (Foster et al., 1995; Baik et al., 1996), gad 시스템은 가장 강력하며, 정상기에서 박테리아에게 산내성을 부여하며, 이는 위의 산도와 같은 강산 (pH < 2.5) 환경에서 최소 2시간 동안의 생존능을 부여한다 (Foster et al., 1995). gadA 및 gadB는 이화성 아미노산 탈카르복시화 효소 (아르기닌 (adiA), 라이신(cadA) 및 오르니틴 (speF) 탈 카르복시화 효소)에 속하며, E. coli에서 산에 의해 유도된다. 그러나, 단지 gad 및 adi 시스템만이 산 보호 효과를 제공하며 상기 산의 pH는 해당하는 디카르복시화 효소인 gad 및 adi의 최적 pH인 pH 5이다 (Foster and Slonczewski, 1996).

두 종의 Gad 동형체를 암호화하는 유전자, gadA 및 gadB는 E. coli 염색체에서 2100 kb 떨어져 있다 (Elliott et al., 1992; Blattner et al., 1997). gadB의 다운스트림에는 gadC로 불리는 다른 유전자 (글루타메이트/GABA 안티포터로 추정됨)가 있고, 이는 gadB와 같이 전사된다. 다른 미생물에서, 시스템의 완전성은 산 스트레스에 대항하기 위하여 필수적이다 (Biase et al., 1999; Cotter et al., 2001; Blankenhorn et al., 1996; Small et al., 1996). gad 시스템은, H⁺의 내입을 통한 산성 기질 (글루타메이트)의 중성 물질 (GABA)로의 탈카르복시화에 의해 세포액 환경의 산성화를 조절하는 것으로 예상된다 (도 1). GABA는 gadC 단백질을 통하여 세포외로 방출되며, 이는 세포외 환경의 국소적 알칼리화에 기여한다 (Bennette et al., 1992; Hayakawa et al., 1997).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 산성-비의존성을 나타내는 글루타메이트 디카르복실라아제의 변이체를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, C-말단 부위를 결손시키는 경우에는 야생형의 산성-의존성이 상실되고, 비교적 넓은 pH 범위 4.0-9.0의 범위에서 활성을 나타낸다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 암 호화하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 핵산분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 이용한 GABA의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 숙주세포를 이용한 GABA의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 미생물로부터 분리 및 정제된 (isolated and purified) 글루타메이트 디카르복실라아제 (glutamate decarboxylase)에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부티르산 (GABA)의 제조방법을 제공한다.

본 발명자들은 미생물로부터 분리 및 정제된 (isolated and purified) 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용하여 생물전환공정 (bioconversion)에 통하여 GABA를 대량으로 그리고 저비용으로 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 연구하였다. 그 결과, 미생물로부터 글루타메이트 디카르복실라아제 유전자의 성공적인 클로닝 및 발현을 통하여 수득한 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용하여 GABA의 생산 시스템을 구축하게 되었다.

상기한 바와 같이, 미생물로부터 분리 및 정제된 글루타메이트 디카르복실라아제 효소를 이용하여 인 비트로 시스템에서 GABA를 대량으로 생산한 것은 본 발명자들에 의해 최초로 이루어진 것이다.

본 명세서에서 표현 “미생물로부터 분리 및 정제된 글루타메이트 디카르복실라아제”는 상기 미생물이 원래부터 가지고 있는 글루타메이트 디카르복실라아제 단백질을 정제한 경우뿐만 아니라, 상기 미생물이 가지고 있는 글루타메이트 디카르복실라아제 유전자를 적합한 숙주세포에서 클로닝 및 발현시킨 다음 이 숙주세포로부터 글루타메이트 디카르복실라아제 단백질을 정제한 경우까지 포함하는 것이다.

본 명세서 표현 “분리 및 정제”는 목적의 단백질을 숙주세포로부터 분리한 어떠한 형태도 다 포함하는 의미를 갖는다. 예를 들어, 숙주세포의 추출물 (extract) 및 추출물의 정제물, 예컨대, 암모늄 설페이트에 의한 용해도 분획화 (solubility fractionation), 크기 분별 여과 (한외여과) 및/또는 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리물을 포함하는 의미를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 글루타메이트 디카르복실라아제는 유전자를 클로닝하여 적합한 숙주세포에서 발현된 것을 정제하여 얻은 것이다. 락토바실러스 플랜타룸 (Lactobacillus plantarum)-유래 글루타메이트 디카르복실라아제를 예를 들어 설명하면 다음과 같다.

락토바실러스 플랜타룸의 지놈 DNA에서 글루타메이트 디카르복실라아제의 유전자를 증폭한다 (예컨대, PCR 증폭). 증폭된 적합한 벡터에 클로닝한다. 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 벡터가 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레 이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET, pGEM-T Easy, pQE30 등), 파지 (예: λgt4?λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 글루타메이트 디카르복실라아제의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다. 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼을 이용하여 소망하는 글루타메이트 디카르복실라아제 단백질을 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

글루타메이트 디카르복실라아제 유전자를 포함하는 벡터가 제작되면, 벡터를 적합한 숙주세포에 형질전환시킨다. 이러한 숙주세포로는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, E. coli DH5α, E. coli M15, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 글루타메이트 디카르복실라아제 단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 글루타메이트 디카르복실라아제는 다양한 미생물에서 유래될 수 있다. 바람직하게는, 대장균, 락토바실러스 (예컨대, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis , Lactobacillus pentosus , Lactobacillus sakei), 리스테리아 (예컨대, Listeria monocytogenes), 이스트 (예컨대, Saccharomyces cerevisiae), 박테로이드 (예컨대, Bacteroides fragilis), 디바리오마이시스 (예컨대, Debaryomyces hansenii), 마이코박테리움 (예컨대, Mycobacterium bovis , Mycobacterium tuberculosis), 아스퍼질러스 (예컨대, Aspergillus nidulans), 락토코코스 (예컨대, Lactococcus lactis), 캔디다 (Candida glabrata)로부터 유래된 것이고, 보다 바람직하게는 락토바실러스로부터 유래된 것이며, 가장 바람직하게는 락토바실러스 플랜타룸 (Lactobacillus plantarum)으로부터 유래된 것으로서, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열 전부 또는 일부를 포함하는 글루타메이트 디카르복실라아제이다.

서열목록 제2서열의 아미노산 서열의 전부를 포함하는 야생형의 글루타메이트 디카르복실라아제는 최적 온도 40-45℃, 최적 pH 4.5-5.0의 호열성 및 호산성의 효소이며, 우수한 속도론적 (kinetic) 파라미터 (예컨대, 글루타메이트에 대한 효소반응 효율 k_cat/k_m이 1125 mM^-1)를 갖는 바, 종래에 규명된 어떤 다른 글루타메이트 디카르복실라아제보다 우수한 촉매반응성을 나타낸다.

한편, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열의 일부를 포함하는 글루타메이트 디카르복실라아제는 바람직하게는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열의 C-말단 부위가 중성 pH에서 루프 (loop)를 형성하는 것을 억제하도록 C-말단 부위의 일부 서열이 결손된 것이다. 이러한 루프 형성을 억제함으로써 글루타메이트 디카르복실라아제 활성의 산성-의존성이 극복된다. 보다 바람직하게는, 상기 서열목록 제2서열의 아미노산 서열 일부를 포함하는 글루타메이트 디카르복실라아제는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열에서 C-말단 부위로부터 아미노산 잔기 1-25개, 보다 더 바람직하게는 아미노산 잔기 2-18개가 결손된 것이다. 가장 바람직하게는, 상기 글루타메이트 디카르복실라아제의 절단 변이체 (truncated mutant)는 서열목록 제4서열 또는 제5서열의 아미노산 서열로 구성된 것이다.

상기 글루타메이트 디카르복실라아제의 절단 변이체는 야생형의 글루타메이트 디카르복실라아제의 C-말단이 절단된 형태로서, pH 4.0-9.0의 넓은 범위에서 활성을 나타낸다. 야생형 글루타메이트 디카르복실라아제는 pH 6.0 이상에서는 거의 활성을 나타내지 않는다. 따라서, 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 산성 조건이 적합하지 않은 반응 시스템에서 매우 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 반응은 35-60℃의 온도에서 실시되며, 보다 바람직하게는 40-45℃의 온도에서 실시된다. 이러한 고온에서의 GABA 생산 시스템은 아직까지 발표된 적이 없다. 이러한 고온 생산방법은 특히 산업적 스케일의 대량 생산 시스템에서 유리하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 반응은 pH 4.0-5.0, 보다 바람직하게는 pH 4.5-5.0에서 실시된다.

본 명세서의 방법에서 이용되는 글루타메이트 디카르복실라아제의 기질은 글루타메이트 또는 글루타메이트의 염 (바람직하게는, 무기염)이다. 본 발명의 방법에 있어서, 반응에 첨가되는 글루타메이트 디카르복실라아제의 글루타메이트 또는 글루타메이트의 소듐염이 이용될 수 있으며, 소듐염 중에서, MSG (monosodium glutamate)가 가장 바람직하다. 그 이유는 본 발명의 방법이 산업적인 스케일로 실시되는 경우에 MSG가 비용 측면에서 매우 유리하기 때문이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 글루타메이트 디카르복실라아제는 고체 지지체 (solid support)에 고정화 (immobilized)된 것이다.

단백질, 특히 효소를 고체 지지체에 고정화하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다 (Weetall, H. H., Preparation of immobilized proteins covalently coupled through silane coupling agents to inorganic supports. Appl . Biochem . Biotech. 41:157-188(1993); Weetall, H. H., Methods in Enzymology . 44:134-148(1976)).

본 발명의 글루타메이트 디카르복실라아제가 고정화 되는 고체 지지체는 실리카, 다공성 유리 비드, 조절-동공 유리 (controlled-pore glass), 다공성 세라믹, 다공성 알루미나 및 다공성 티타니아를 포함하며, 가장 바람직하게는 고정화 지지체로서 다공성 실리카가 이용된다.

구체적인 일 실시예에 따라 고정화 과정을 설명하면 다음과 같다: 실리카 비드를 3-아미노프로필트리메톡시실란 (3-aminopropyltrimethoxysilane)을 이용하여 실란화하여 활성화시킨다. 이어, 실란화된 실리카 비드에 글루타르알데하이드를 처리한다. 그런 다음, 글루타메이트 디카르복실라아제 효소액을 처리한 다음 일정 시간 동안 반응시켜 고정화를 완료한다.

이렇게 고정화된 글루타메이트 디카르복실라아제 효소는 유리 효소 (free enzyme)와 비교하여 생물전환공정에서 상당한 장점을 발휘한다. 고정화된 글루타 메이트 디카르복실라아제 효소의 최적 온도 프로파일은 유리 효소와 비교하여 약 5℃ 정도 높은 쪽으로 이동한다. 따라서, 고정화된 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용하는 경우에는, 바람직하게는, 40-50℃, 보다 바람직하게는 45-50℃의 온도에서 생물전환 공정이 실시된다. 이러한 고온에서의 GABA 생산 시스템은 아직까지 발표된 적이 없으며, 이러한 고온 생산방법은 특히 산업적 스케일의 대량 생산 시스템에서 유리하다.

또한, 고정화된 글루타메이트 디카르복실라아제는 유리 효소와 비교하여 상당히 넓은 pH 범위에서 높은 활성을 나타낸다. 고정화된 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용하는 경우에는, 바람직하게는, pH 3.5-6.0에서 실시된다.

이외에도, 고정화된 글루타메이트 디카르복실라아제는 열적 안정성 및 pH 안정성이 유리 효소와 비교하여 매우 높은 장점이 있다. 또한, 고정화된 글루타메이트 디카르복실라아제는 80 mM 기질 (MSG)에서도 최대 생성량을 나타내며, 기질의 농도가 150 mM인 경우에도 기질 저해 (substrate inhibition)를 거의 받지 않고, 기질의 농도가 80 mM 이하인 경우에는 100% 전환수율이 반응 12분만에 달성되기 때문에, GABA의 산업적 대량 생산에 매우 유리하다.

본 발명의 글루타메이트 디카르복실라아제가 고정화된 고체 지지체는 컬럼형 반응기 (예컨대, 유리 반응기)에 충진시켜 사용하는 것이 바람직하다. 적합한 유속으로 기질을 반응기에 공급시켜 GABA가 생성되도록 한다.

한편, 본 발명자들은 글루타메이트 디카르복실라아제 활성의 산성-의존성의 분자적 기전을 규명하고자 노력하였고, 그 결과 글루타메이트 디카르복실라아제의 C-말단 부위에서 3차원적으로 루프 구조를 형성하는 부위가 산성-의존성에 기여한다는 사실을 발견하였고, 이를 기초로 하여 C-말단 부위가 결손된 산성-비의존성 절단형 변이체 (truncated mutant)를 개발하였다.

따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열의 C-말단 부위가 결손된 아미노산 서열을 포함하며 pH 4.0-9.0의 범위에서 활성을 나타내는 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 제공한다.

이러한 넓은 범위의 pH에 대하여 활성을 나타내는 본 발명의 변이체는 야생형과 비교하여 응용성이 더욱 넓어지는 이점을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열의 C-말단 부위가 중성 pH에서 루프를 형성하는 것을 억제하도록 C-말단 부위의 일부 서열이 결손된 것이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열에서 C-말단 부위로부터 아미노산 잔기 1-25개, 보다 더 바람직하게는 2-20개, 가장 바람직하게는 3-18개가 결손된 것이다.

본 발명의 구체적인 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 서열목록 제4서열 또는 제6서열의 아미노산 서열로 구성된 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 절단형 글루타메이트 디 카르복실라아제 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 핵산분자를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 핵산분자를 운반하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록 제3서열 또는 제5서열의 뉴클레오타이드 서열로 구성되어 있다.

본 발명의 벡터 및 형질전환체은 상기의 벡터 및 형질전환체에 대한 설명이 참조되어 설명될 수 있다. 예를 들어, 상술한 벡터의 구성, 형질전환 방법 및 숙주세포의 종류 등은 본 발명에도 그대로 적용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 접촉시키는 단계 를 포함하는 감마-아미노부티르산 (GABA)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 상기한 본 발명의 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 이용하기 때문에, 변이체에 대한 내용은 반복기재 (redundancy)에 의한 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 생물전환 공정의 반응온도는 35-60℃가 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 반응은 pH 4.0-9.0에서 실시된다. 이와 같이 넓은 pH 범위에서 GABA를 생산할 수 있는 것이 본 발명의 가장 큰 특징이다. 야생형 글루타메이트 디카르복실라아제는 활성을 나타내기 위해서는 산성 조건을 요구하지만, 본 발명의 절단형 변이체는 산성-의존성이 없어 넓은 pH 범위에 걸쳐 활성을 나타낼 수 있는 이점을 갖게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 고체 지지체에 고정화 (immobilized)된 것이다. 이러한 고정화에 의해 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 열적 안정성 및 pH 안정성이 보다 개선된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부티르산 (GABA)의 제조방법을 제공한다.

이 제조방법은 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 세 포에 반응기질을 직접 접촉시켜 GABA를 생산한다는 측면에서 효소를 이용하는 상기한 방법과 차이가 있다.

이와 같이 세포를 직접 GABA 생산에 이용하는 방법은 크게 두 가지가 있다. 첫 번째 방법은 배양방법이고, 두 번재 방법은 고정화된 세포를 이용하는 방법이다.

배양방법에 따르면, GABA의 제조방법은 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 포함하는 배지에서 배양하여 실시한다.

배양에 이용되는 배지로는 숙주세포의 종류에 따라 당업계에 공지된 어떠한 배지도 선택할 수 있다. 예를 들어, LB (Luria-Bertani) 배지, MRS (deMan Rogosa Sharpe) 브로스 배지, APT (All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI (Brain Heart Infusion) 배지를 이용할 수 있다. 본 발명의 방법의 배지에 있어서, 이용되는 탄소원은 다양한 탄수화물이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 수크로스, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 아라비노스 및 락토스이다. 본 발명의 방법이 배지에 이용되는 질소원은 유기 질소원이 이용되며, 바람직하게는 이스트 추출물, 프로테오스 펩톤 No.3 및 펩톤이다.

상기 배지 내에서 그리고 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질의 존재 하에서 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 숙주세포를 배양하여 GABA를 생산한다.

세포고정화 방법에 따르면, 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 숙주세포는 세포고정화용 고체 지지체에 고정화된다. 바람직하게는, 세포고정화에 이용되는 고체 지지체는 알기네이트 (alginate), 폴리아크릴아마이드 , 아가로스 및 키토산을 포함하고, 가장 바람직하게는 알기네이트이다.

세포고정화는 당업계에 공지된 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다 (Fukui, S. and A. Tanaka, Immobilized microbial cells. Annu . Rev. Microbiol., 36:145-172(1982); Kierstan, M. and Bucke, C. The immobilization of microbial cells, subcellular organelles, and enzymes in calcium alginate gels, Biotechnol . Bioeng., 19:387-397(1977); Kierstan, M. and Coughlan, P., Immobilization of cells and enzymes by gel entrappment. In Immobilized cells and Enzymes, ed. J. Woodward, pp. 39-48. IRL Press, Oxford.(1985)).

한편, 본 발명의 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 이용하여 세포고정화를 통하여 GABA 생산이 가능한 것은, 변이체의 활성이 pH 4.0-9.0와 같이 넓은 범위에 걸쳐 나타나기 때문이다. 산성 pH 범위에서 활성을 나타내는 상기 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용하는 경우에는 세포고정화를 할 수 없다. 보다 상세하게는, 세포고정화에 이용되는 지지체, 예컨대, 알기네이트의 경우 산성범위에서는 알기네이트의 안정성이 확보되기가 어려우며 이에 세포의 고정화 담체에서 유출되는 현상이 야기될 수도 있으며 또한 불안정성으로 인해 고정화 세포의 재사용측면에서 경제성이 떨어지기 때문에 세포고정화를 시킬 수 없다. 그러나 본 발명의 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 중성 pH뿐만 아니라 알칼리 부위에서도 활성을 나타내기 때문에 고체 지지체에 세포고정화를 시킬 수 있 다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료

실시예에서 이용되는 실험재료는 다음과 같이 구입한 것이다: 제한효소, Ex-Taq, Taq DNA 중합효소, 디옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 PCR용 시약은 Takara Biomedicals (Takara Co.,Shiga, Japan); pGEM T Easy 벡터 및 T4 DNA 리가아제는 Promega (Madison, WI, U.S.A.); pQE30 발현벡터 및 His-결합 레진 키트는 Novagen (Madison, WI, USA); 지놈-팁, 젤 추출, PCR 정제 및 플라스미드 미니프렙 키트는 Qiagen (Hilden, Germany); 전기영동 시약은 Bio-Rad (Hercules, CA, USA); 효소 분석, 특성연구 및 고정화를 위한 모든 화학물질은 Sigma (St. Louis, MO, USA). 올리고뉴클레오타이드는 Cosmo Genetech (Seoul, Korea)에서 합성하였다.

박테리아 균주 및 배양 조건

Lactobacillus plantarum ATCC 14917는 ATCC (American Type Culture Collection)으로부터 구입하였다. L. plantarum를 MRS 배지에서 48-72시간 동안 30℃에서 배양하였다. E. coli strain DH5α [supE44 ΔlacU169 (Φ80 lacZ ΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1]는 클로닝/발현벡터의 구축을 위한 숙주세포로 이용하였다. E. coli M15 (pREP4)는 L. plantarum의 GAD의 발현 숙주로 이용하였다. 상기 두 균주를 암피실린 (100 ㎍/㎖)을 포함하는 Luria-Bertani (LB) 배지에서 회전 쉐이커에서 37℃로 배양하였다. E. coli M15의 경우, 카나마이신 (50 ㎍/㎖)을 LB 배지에 첨가하여 사용하였다. 플라스미드 pGEM-T Easy 벡터를 클로닝 및 시퀀싱 벡터로 이용하였고, pQE30는 발현을 위해 이용하였다.

L. plantarum GAD의 준비

컴피턴트 세포의 준비, 형질전환 및 플라스미드 DNA 미니- 프렙

E. coli 세포로의 형질전환은 화학적 형질전환법을 이용하여 실시하였다. 50 ㎖ Luria-Bertani (LB, Difco) 브로스에 E. coli 균주를 하룻밤 동안 배양하였다. E. coli 균주를 37℃에서 초기 대수기까지 (OD₆₀₀ 0.4-0.6) 성장시켰다. 이어, 세포를 멸균된 50 ㎖ 폴리프로필렌 튜브에 옮기고, 4,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 수확하였다. 세포 펠릿을 얼음-냉장 0.1 M CaCl₂ 용액 10 ㎖로 재현탁하고, 얼음 위에서 20분 동안 인큐베이션 하였다. 처리된 세포를 4,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 회수하고, 얼음-냉장 0.1 M CaCl₂ 용액 5 ㎖로 재현탁하 였다. 현탁물을 200 ㎕ 분획으로 나누었다.

형질전환을 위하여, 컴피턴트 세포 및 플라스미드 DNA를 혼합하고 (9:1, v:v), 얼음 상에서 30분 동안 반응시켰다. 혼합물에 42℃ 90초의 열충격을 가한 다음, 얼음통에 신속하게 옮긴 후, 1-2분 동안 냉장시켰다. 형질전환된 컴피턴트 세포를 0.01% X-Gal (Takara)과 암피실린 (50 ㎍/㎖, Sigma)을 포함하는 LB 아가 플레이트에 플레이팅한 다음, 37℃에서 12-16시간 동안 반응시켰다. 백색 콜로니를 선택하고 5 ㎖ LB-암피실린 배지에 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다.

플라스미드 DNA의 제조를 배양된 E. coli 세포를 수확한 다음, 플라스미드 DNA를 QIAprep Spin Miniprep 키트 (Qiagen)로 분리하였다.

L. plantarum GAD의 클로닝 및 과발현

GenBank에 있는 미생물 지놈 서열의 검색을 통하여, L. plantarum의 gadB 유전자 서열을 발견하였다. 지놈 DNA 추출 키트 (Qiagen)를 이용하여 L. plantarum의 지놈 DNA를 분리 및 정제하였다. 상기 분리된 지놈 DNA를 주형으로 하고, 다음의 전방향/역방향 프라이머를 이용하여 L. plantarum의 GAD 인코딩 유전자를 PCR 증폭하였다: 5'-GGATCCATGGCAATGTTATACGGTAAAC-3' 및 5'-CTGCAGTCAGTGTGTGAATCCGTAT-3'. BamHI 사이트를 전방향 프라이머로 삽입하였고, PstI 사이트를 역방향 프라이머에 삽입하여 pQE-30 벡터에 클로닝 되도록 하였다. 2 mM MgCl₂, 20 ng of DNA, 10 pmol 프라이머, 200 μM dNTP 혼합물 및 2.5 U Ex- Taq DNA 중합효소 (Takara Shuzo co, shiga, Japan)을 포함하는 10x Ex Taq 완충액을 이용하여 총 50 ㎕ 부피로 PCR을 실시하였다. 94℃에서 4분 동안 초기 변성을 시킨 다음, 총 30 사이클 (30초 94℃ 변성, 30초 57℃ 어닐링 및 1분 72℃ 연장반응)의 PCR을 실시한 다음, 5분 동안 72℃에서 최종 연장반응을 실시하였다. PCR 생성물을 pGEM-T Easy 벡터에 클로닝하고 E. coli DH5에 형질전환시켰다. L. plantarum GAD 유전자를 가지는 pGEM-T Easy 벡터를 포함하는 형질전환체를 0.01% X-Gal을 포함하는 LB-암피실린 플레이트에서 선별하였다. 삽입서열을 가지는 클론으로부터 유래된 세포로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 각각의 제한효소로 절단하였다. L. plantarum gadB 유전자를 pQE30 벡터 (pQE-LPGAD)의 BamHI 및 PstI 위치에 라이게이션시키고, E. coli M15에 형질전환시켰다. pQE-LPGAD 벡터는 N-말단 폴리히스티딘 (6xHis)을 코딩하는 서열을 갖고 있다. 재조합 효소의 발현을 위하여, pQE-LPGAD으로 형질전환된 E. coli M15 세포를 100 ㎍/㎖ 암피실린 및 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 포함하는 LB 배지 1 ℓ에서 37℃로 배양하고 IPTG 1 mM로 중간-대수기 (A₆₀₀ = 0.6)까지 유도한 다음, 추가적으로 4시간 동안 배양한 후, 원심분리 (10,000 x g, 20분, 4℃)하여 세포를 회수하였다. 박테리아 펠릿을 -70℃에서 보관하였다.

재조합 L. plantarum GAD의 정제

원심분리하여 얻은 세포를 1 x His-결합 완충액 (500 mM NaCl, 20 mM Tris, 5 mM 이미다졸; pH 7.9) 50 ℃에 현탁시킨 다음, 음파파쇄 하였다. 파쇄물을 14,000 x g로 20분 동안 원심분리하여 세포 조각을 제거하고, 상청액을 1 x His-결합 완충액으로 평형화된 His-결합 레진 컬럼 (10 ㎖)에 로딩하였다. 컬럼을 세척 완충액 (500 mM NaCl, 20 mM Tris, 60 mM 이미다졸, pH 7.9) 10 부피로 세척한 다음, 이미다졸 농도구배 (5 mM - 1 M)를 적용하여 재조합 단백질을 용출하였다. 효소활성을 포함하는 분획을 풀링하고, 소듐 아세테이트 완충액 (pH 5.0)에 대하여 투석한 다음, 투석된 효소를 4℃에서 보관하였다. 단백질 농도는 BCA 방법에 따라 결정하였다. 효소 분획을 12% SDS-PAGE로 분석하고 쿠마쉬 블루로 가시화하였다 (Laemmli, 1970).

L. plantarum GAD 특성 연구

효소 활성 분석

200 mM 소듐 아세테이트/아세트산 (pH 5.0) 내의 GAD 용액 (0.005-0.02 ㎍ GAD/㎕) 100 ㎕에, 500 mM 모노-소듐 글루타메이트 3 ㎕ 및 0.2 mM 피리독살 5'- 포스페이트 (PLP) 11 ㎕를 첨가하였다. 37℃에서 20분 동안 반응시킨 다음, 600 ml 무수 에탄올을 -20℃로 첨가하여 반응을 종결시켰다. 현탁액을 1500 x g (10 분, 0℃)에서 원심분리 하고, 0.22 ㎛ 동공크기 필터로 여과한 다음, HPLC 분석을 실시하였다. GAD 활성의 1 unit는 분석 조건 하에서 1분 당 1 μmol의 산물을 생성하는 데 요구되는 효소의 양으로 정의하였다.

GABA 분석

모노-소듐 글루타메이트 (MSG) 및 GABA의 박막 크로마토그래피 분석 (TLC)을 n-부탄올/아세트산/물 (5/3/2, v/v/v) 조건으로, 상향 농도구배 방식으로 0.2 mm 실리카겔-코팅 알루미늄 쉬트 (type 60; Merck, Deamstadt, Germany) 상에서 실시하였다. 플레이트에 60% 닌하이드린을 스프레이한 다음 가열하여 스팟을 가시화 하였다 (Chang and Lee et al., 1992).

HPLC는 XTerra 컬럼 (Waters; RP 185m, 4.6 mm x 150 mm)을 이용하여 실시하였다. OPA 용액 (pH 9.3)을 1.0 ㎖ 메탄올 OPA, 250 ㎕ 보레이트 완충액 (pH 9.9) 및 25 ㎕ 2-머캅토에탄올과 혼합하였다. 메탄올 OPA는 메탄올 50 ㎖에 2.56 g OPA를 포함하며, 보레이트 완충액은 0.2 M 보르산 (0.2 M 포타슘 클로라이드에 용해된 것)-0.2 M 소듐 하이드록사이드, pH 9.9가 50:50 부피비로 혼합된 것이다. 유도체화는 사용전 최소 90분 전에 준비한 시약을 이용하여 실시하였고, 9일 이상 보관 하지 않았다. 효소의 동일한 양 (120 ㎕)을 380 ㎕ OPA와 혼합하였고, 주입전에 8분 동안 반응하도록 하였다.

L. plantarum GAD의 생화학적 특성

효소 활성에 대한 온도의 영향을 결정하기 위하여, 효소를 15 mM 기질을 함유하는 200 mM 소듐-아세테이트 (pH 5.0)에서 20분 동안 반응시켰고, 이 때 온도는 30℃-60℃로 변화를 주었다. -20℃의 무수 알코올을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 열안정성 시험을 위하여, 200 mM 소듐-아세테이트 (pH 5.0)의 존재 하에서 효소를 다양한 온도 (40-90℃)에서 서로 다른 시간 (0-9 시간) 동안 반응시켰다. 잔여 활성을 측정하였다.

효소의 최적 pH는 37℃ 효소반응 온도에서 100 mM 소듐 아세테이트/아세트산 완충액 (pH 3.5-6.0)을 이용하여 결정하였다. pH 안정성을 결정하기 위하여, 효소용액을 실온에서 각각의 완충액과 서로 다른 시간 (0-96 시간) 동안 미리 반응시킨 다음 잔여 활성을 측정하였다.

효소 반응속도론 연구

GAD의 속도론적 파라미터를 200 mM 소듐 아세테이트/아세트산 완충액에서 다양한 기질 농도 (1-300 mM)로 40℃에서 3분 동안 반응시켜 결정하였다. 라인위버-버크 플랏 및 마이클리스-멘텐 (Michaelis-Menten) 공식을 이용하여 속도론적 파라미터를 얻었다.

원편광 이색성 (Circular dichroism )

CD (Circular dichroism) 측정을 Peltier 온도-조절 큐벳 홀더가 장착된 Jasco J-810 spectropolarimeter를 이용하여 실시하였다. 50 mM 소듐 아세테이트 완충액 내의 효소 시료 (1 mg/ml)의 CD 스펙트럼은, 30-110℃ 온도 범위 및 1℃/분의 가열 속도로 1.0 cm 광경로 석영 유리 큐벳에서 222 nm에서 측정하였다.

L. plantarum GAD의 고정화

효소의 고정화

실리카 비드를 3-아미노프로필트리메톡시실란 (3-aminopropyltrimethoxysilane: Sigma Chemical Co., USA)을 이용하여 실란화하여 활성화시켰다. 실리카 비드 1 g을 50 mM 포타슘 포스페이트 완충액 (pH 8.0) 내의 2.5% 글루타르알데하이드 (Sigma Chemical Co., USA) 50 ㎖로 1.5-2시간 동안 실온에서 마일드한 교반 하에서 처리하였다 (Weetall. 1976). 미반응 글루타르알데하이드를 제거하기 위하여 증류수로 활성화된 지지체를 세척한 다음, 효소액 10 ㎖을 첨가하였다. 실온에서 12시간 경과한 다음, 지지체를 침전으로 회수하고 증류수로 세척하였다 (도 2). 상등액 내의 비결한 효소를 풀링하여 단백질 양 및 활성을 측정하여 지지체에 결합된 단백질의 양을 간접적으로 결정하였다.

고정화된 GAD의 생화학적 특성 연구

효소 활성에 대한 온도의 영향을 결정하기 위하여, 효소를 15 mM 기질을 함유하는 200 mM 소듐-아세테이트 (pH 5.0)에서 20분 동안 반응시켰고, 이 때 온도는 30℃-60℃로 변화를 주었다. -20℃의 무수 알코올을 첨가하여 반응을 종결시켰다.

열안정성 시험을 위하여, 200 mM 소듐-아세테이트 (pH 5.0)의 존재 하에서 효소를 다양한 온도 (40-90℃)에서 서로 다른 시간 (0-9 시간) 동안 반응시켰다. 잔여 활성을 측정하였다.

효소의 최적 pH는 37℃ 효소반응 온도에서 100 mM 소듐 아세테이트/아세트산 완충액 (pH 3.5-6.0)을 이용하여 결정하였다. pH 안정성을 결정하기 위하여, 효소용액을 실온에서 각각의 완충액과 서로 다른 시간 (0-148 시간) 동안 미리 반응시킨 다음 잔여 활성을 측정하였다

GABA 생산 용 패킹- 베드 반응기의 작동

고정화된 효소를 유리 반응기 (1.0 x 12 cm)에 충진시켰다. 온도는 수조에 반응기를 넣어 유지하였다. 기질 (모노 소듐 글루타메이트)을 반응온도 (45℃)까지 도달하게 한 다음 페리스탈틱 펌프로 펌핑-다운시켰다. 유속은 페리스탈틱 펌프를 이용하여 0.2-2.0 ml/분으로 변화를 주었다. 고정화 효소 55 mg을 반응기에 넣었다. 50 mM 소듐 아세테이트 완충액 내의 모노 소듐 글루타메이트 용액 (1-300 mM)의 다양항 농도를 반응기에 공급하였다 (도 3).

반응기의 총 부피를 이요하여 공간속도를 계산하였다. 생성물 시료를 수집하여 GABA 함량을 측정하였다. 모노 소듐 글루타메이트 및 GABA의 양을 HPLC를 이용하여 결정하였다.

L. plantarum GAD의 변이유발

GAD의 서열 얼라이먼트 및 상동성 모델링

E. coli GAD와 L. plantarum GAD의 서열비교분석을 FASTA로 실시하였다. E. coli GAD의 구조 (PDB ID: 1PMO)를 이용하여 L. plantarum GAD 상동성 모델을 만들었다. the InsightⅡ 분자 모델링 시스템 내의 상동성 모듈 및 모델러를 이 용하여 모델들을 만들었다. 모든 모델링은 Silicon Graphics R10000 워크스테이션을 이용하여 실시하였다.

절단 (Truncation) 변이유발

주형으로서 pQE-LPGAD를 이용하여 절단 변이유발을 통해 LPGAD 변이체들을 생성시켰다. 변이체에 특이적인 프라이머를 이용하여 절단 변이체들을 PCR로 제조하였다. 변이체들 (LPTF, LPTD) (도 4)을 제조하기 위한 프라이머 세트는 다음과 같다: LPTF: F 5'-GGATCCATGGCAATGTTATACGGTAAAC-3' 및 R 5'CTGCAGTCATCCGTATTTCTTAGGTGC-3'; LPTD: F 5'-GGATCCATGGCAATGTTATACGGTAAAC-3' 및 R 5CTGCAGTCAATGATGATAGACAATGTG-3'. 2 mM MgCl₂, 20 ng of DNA, 10 pmol 프라이머, 200 μM dNTP 혼합물 및 2.5 U Ex-Taq DNA 중합효소 (Takara Shuzo co, shiga, Japan)을 포함하는 10x Ex Taq 완충액을 이용하여 총 50 ㎕ 부피로 PCR을 실시하였다. 94℃에서 4분 동안 초기 변성을 시킨 다음, 총 30 사이클 (30초 94℃ 변성, 30초 57℃ 어닐링 및 1분 72℃ 연장반응)의 PCR을 실시한 다음, 5분 동안 72℃에서 최종 연장반응을 실시하였다. 증폭된 플라스미드를 BamHI 및 PstI으로 절단하고 E. coli DH5α 세포에 형질전환시켰다. 클론들을 서열결정하여 변이유발 여부를 확인하였다. 변이체 동정에 이어, 변이유발된 플라스미드를 E. coli M15 세포에 재형질전환시킨 다음, 단백질을 발현시키고 특성을 연구하였다.

실험결과

L. plantarum GAD의 특성 연구

클로닝 , 발현 및 정제

GAD 코딩 유전자를 L . plantarum 지놈 DNA를 이용하여 PCR로 증폭한 다음, pGEM-T Easy 클로닝 벡터에 클로닝하였다. E. coli에서의 발현과 정제를 용이하게 하기 위하여, gadB 유전자를 pQE30 발현벡터에 서브클로닝하여 pQE-LPGAD를 얻었다. IPTG로 발현유도하여 pQE-LPGAD 내의 GAD 유전자를 N-말단 헥사히스티딘-태깅 융합 단백질 형태로 E. coli M15에서 성공적으로 발현시켰다.

Ni² ⁺ 킬레이트 친환성 크로마토그래피 한 단계를 통하여 정제도 95% 이상의 GAD를 얻었다. SDS-PAGE를 통하여 융합 단백질의 어패런트 M _r 이 53 kDa임을 규명하였고 이는 추정 아미노산 서열로부터 계산된 M _r (53000 Da)과 일치되는 것이다 (도 5 패널 A). 그러나, Native-PAGE의 결과에 따르면, 정제된 효소는 110 kDa으로 결정되었는 데, 이는 본 발명의 GAD가 호모다이머 구조를 갖는다는 것을 보여준다 (도 5 패널 B).

L. plantarum GAD의 생화학적 특성

재조합 GAD의 온도 및 pH 의존도를 다양한 온도 및 pH에서 20분 동안의 인큐베이션 후에 HPLC로 결정하였다. 재조합 GAD의 최적 온도는 40℃이었다 (도 6b). 정제된 GAD는 기대한 바와 같이 pH 4.5 to 5.0에서 최대의 활성을 나타내었다 (도 6a). 효소의 열적안정성을 40-90℃ 범위에서 측정하였다 (도 7b). 초기 활성의 95% 이상이 40-60℃ 범위에서 유지되었고, 70℃에서도 9시간 동안 약 70% 활성이 유지되었다. 반감기는 90℃에서 46분이었고, 100℃에서는 효소의 활성이 급격하게 감소하였다.

효소의 pH 안정성을 pH 3.0-6.0의 범위에서 측정하였다 (도 7a). 효소를 다양한 온도에서 96시간 동안 인큐베이션시킨 경우, 활성의 90% 이상이 pH 4.0-5.5 범위에서 유지되었다. 이러한 실험 결과는 Lactobacilli GAD가 호산성일 뿐만 아니라 극-호열성임을 처음으로 규명한 것이다.

L. plantarum GAD의 속도론적 파라미터

기질로서 글루타메이트를 이용하여 라인위버-버크 플랏을 통하여 속도론적 파라미터를 결정하였다. 글루타메이트에 대한 k _m 은 13 mM이고 V _max 는 277 U/mg이었다. 글루타메이트에 대한 효소 효율 (k _cat /K _m )은 1125 mM^-1min^- ¹ 이었다 (표 2).

L. plantarum GAD 및 다른 미생물 GAD의 속도론 파라미터 데이터

미생물	T_opt(℃)	pH_opt	k_m (mM)	V_max (U/mg)	k_cat (min^-1)	k_cat/k_m (mM^-1min^-1)	참조
L. plantarum	40	4.5-5.0	13	277	14681	1125	본 발명
L. brevis	30	4.2	9.3	-	390	42	Hayakawa et al.
L. lactis	30	4.7	0.51	-	-	-	Aso et al.
E. coli	-	3.8	1	-	-	-	Baik et al.

원편광 이색성 (Circular dichroism )

222 nm에서의 네가티브 타원율은 본 발명의 효소의 α-나선 구조가 98℃에서 언폴딩됨을 나타내는 데, 이는 98-110℃ 온도 범위에서 부분 언폴딩 값이 증가하지 않기 때문이며, 상기 온도 범위는 효소가 급격하게 비활성되는 범위이다. 본 발명의 T_m은 94℃로 조사되었다 (도 8).

L. plantarum GAD의 고정화

고정화된 효소의 생화학적 특성 연구

고정화 효소의 화성에 대한 pH 영향을 다양한 pH (3.5-6.0)에서 연구하였다. 고정화된 GAD의 pH-활성 프로파일은 유리 효소의 프로파일과 비교하여 더 넓었다 (도 9a). 도 9b는 유리 및 고정화 효소의 활성에 대한 온도의 영향을 보여준다. 고정화된 효소에 대한 온도 프로파일은 약 5℃ 정도 높은 온도로 이동하였고, 이는 고정화 후에 종종 발견되는 현상이다 (Ettlibi and Baratti. 2001). 이와 같이 최적 pH가 증가하는 것은 효소의 물리적/화학적 특성이 변화하기 때문이다. 고정화된 효소의 pH 안정성을 서로 다른 pH에서 7일 동안 인큐베이션한 후 조사하였고 37℃에 잔여 활성을 측정하였다. 도 10a에서 확인할 수 있듯이, 고정화된 효소는 실온에서 3.5-6.0의 범위에서 매우 안정하였다. 고정화 GAD의 아미노기를 통한 공유결합의 형성은 구조적 유연성 (conformational flexibility)을 감소시키는 것으로 판단된다. 효소를 고정화하는 이유 중 하나는 다양한 비활성 요소에 대한 안정성의 향상인데, 이는 고정화 이후 단백질의 제한된 구조적 이동성 (conformational mobility)에 의해 초래된다 (Arica et al., 1995, Tien and Chiang. 1999). 컨포메이션 효과뿐만 아니라 내부 확산 효과도 산성 부분에서 안정성이 증가하는 한 요인이다 (Rehm and Reed, 1987).

고정화 GAD의 열적안정성에 대한 온도의 효과를 서로 다른 온도 (40-90℃)에서 조사하였다. 초기 활성의 약 95% 이상이 40-90℃ 온도 범위에서 유지되었고, 70℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후 활성의 80%가 유지되었다 (도 10b). 반감기는 90℃에서 60분으로 규명되었다. 한편, 유리 효소는 70℃에서 9시간 동안 인큐베이션한 후 비교적 불안정하였고 초기 활성의 약 70%만이 유지되었다 (도 7b). 이러한 결과는 다공성 실리카 비드에 공유적으로 효소가 고정화되면서 고정화 효소의 열적안정성이 증가하기 때문인 것으로 판단된다. 고정화된 효소, 특히 공유결합으로 고정화된 효소의 활성은 유리 형태의 효소와 비교하여 열과 다른 변성 요소에 대하여 더 큰 내성을 나타낸다는 사실은 발표된 바 있다 (Weetall. 1993).

GABA 제조용 패킹 베드 반응기의 작동

GABA 제조에 있어서 기질 농도의 영향을 평가하기 위하여, 45℃, pH 5.0에서 실험을 실시하였다. 고정화된 효소에 의한 모노-소듐 글루타메이트로부터 GABA 제조에 대한 기질 농도 영향은 도 11에 나타나 있다. 고정화된 효소에 의한 GABA의 최대 생산은 45℃에서 80 mM 모노-소듐 글루타메이트에서 얻을 수 있었다. 고정화 효소의 패킹-베드 반응기의 결과가 도시된 도 11에서 볼 수 있듯이, 100% 전환수율이 12분 반응후에 얻을 수 있었다.

L. plantarum GAD의 변이유발

GAD의 상동성 모데링

E. coli GAD와 L. plantarum GAD의 서열비교분석을 FASTA로 실시하였다 (도 12). E. coli GAD와 L. plantarum GAD의 서열 상동성은 약 55%이었다. L. plantarum GAD에 대한 추가적인 연구를 위한 구조적 기초를 얻기 위하여, 상동성 구조 모델을 만들었다 (도 13). 서열 상동성 및 구조 상동성에 대한 L. plantarum GAD 모델을 위한 기초로서 E. coli GAD를 선택하였고, 이는 L. plantarum GAD 상동성 모델을 만들기 위한 적합한 참조를 제공한다.

절단 변이유발

E. coli GAD는 pH-의존성 구조 변화를 나타내고 낮은 pH에서 최대 활성을 가지는 것으로 발표된 바 있다 (Aurozo et al. 2003). 이 효소는 중성 pH에서는 세포질에 위치하지만, pH가 떨어지면 세포막쪽으로 이동하게 된다. 도 14 및 15는 L. plantarum GAD의 컨포메이션 변화에 대한 분자 수준의 상세도이다. L. plantarum GAD 모델링의 결과, C-말단 부위는 활성과 관련이 있음을 알 수 있었다. C-말단, 452-465 잔기는 중성 pH에서 루프를 형성하지만 이 루프는 낮은 pH에서 없어지며, 이는 pH-의존성 쉬프트 현상 때문인 것으로 판단된다. 따라서, 본 발명자들은 절단 변이유발을 실시하였다. LPTF 및 LPTD는 각각 12 및 36 뉴클레오타이 서열이 결손된 것이다. 절단 변이체를 클로닝하고 E. coli M15에서 과발현시켰는데, 발현양은 야생형 GAD보다 좋지 않았다 (도 16). 중성 pH에서의 활성을 결정하기 위하여, 효소 활성을 100 mM 소듐-아세테이트 완충액 (pH 3.5-9.0)에서 결정하였다. 절단 변이체의 활성에 대한 pH 영향을 pH 3.5-9.0의 다양한 pH에서 연구하였다. LPTF 및 LPTD의 최적 pH는 각각 pH 5.0-5.5으로 규명되었다. 야생형 GAD는 pH 6.0에서 활성을 나타내지 않았으나, LPTF 및 LPTD는 pH 6.0에서 활성을 나타내었다 (도 17).

다른 미생물의 GAD를 이용한 GABA 생물전환 반응

락토바실러스 브레비스와 대장균에서 클로닝한 GAD를 이용하여 GABA 생물전환 반응을 실시하였다. 기질로서 80 mM MSG를 이용하였고, 반응온도는 37℃로 하였으며, pH는 락토바실러스 브레비스의 겨우 pH 5로 하였고, 대장균은 pH 4로 하였다. 도 18에서 확인할 수 있듯이, 락토바실러스 플랜타룸의 GAD 이외에도 락토바실러스 브레비스와 대장균의 GAD의 경우에도 성공적으로 GABA 생물전환 반응을 한다는 것을 알 수 있다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 제공한다. 본 발명의 변이체의 활성은 산성-비의존성을 나 타내며, pH 4.0-9.0의 범위에서 활성을 나타내기 때문에 특히 세포고정화를 통한 GABA 생산에 적합하다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열목록 제2서열의 아미노산 서열에서 C-말단 부위로부터 아미노산 잔기 3-25개가 결손된 아미노산 서열로 구성되며 pH 4.0-9.0의 범위에서 활성을 나타내는 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체.
제 1 항에 있어서, 상기 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열의 C-말단 부위가 중성 pH에서 루프를 형성하는 것을 억제하도록 C-말단 부위로부터 아미노산 잔기 3-25개가 결손된 것을 특징으로 하는 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체.
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제 2 항에 있어서, 상기 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 서열목록 제4서열 또는 제6서열의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체.
상기 제 1 항, 제 2 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항의 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 핵산분자.
상기 제 7 항의 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터.
상기 제 8 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
상기 제 1 항의 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부티르산 (GABA)의 제조방법.
절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 상기 제 8 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부티르산 (GABA)의 제조방법.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열의 C-말단 부위가 중성 pH에서 루프를 형성하는 것을 억제하도록 C-말단 부위로부터 아미노산 잔기 3-25개가 결손된 것을 특징으로 하는 감마-아미노부티르산 (GABA)의 제조방법.
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제 12 항에 있어서, 상기 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 서열목록 제4서열 또는 제6서열의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 단계는 35-60℃의 온도에서 실시되 는 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 단계는 pH 4.0-9.0에서 실시되는 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
제 10 항에 있어서, 상기 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 고체 지지체에 고정화 (immobilized)된 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
제 11 항에 있어서, 상기 GABA의 제조방법은 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 상기 제 8 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 포함하는 배지에서 배양하여 실시하는 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
제 11 항에 있어서, 상기 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 상기 제 8 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포는 세포고정화용 고체 지지체에 고정화된 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.
제 21 항에 있어서, 상기 세포고정화용 고체 지지체는 알기네이트 (alginate), 폴리아크릴아마이드 , 아가로스 또는 키토산인 것을 특징으로 하는 GABA의 제조방법.