KR100752573B1

KR100752573B1 - 소화촉진용 솔잎 발효액

Info

Publication number: KR100752573B1
Application number: KR1020060072808A
Authority: KR
Inventors: 정현숙; 황인덕; 윤정훈; 딜리 프라삳 파우디알; 박가영; 전제열; 유진철; 함경수
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2006-08-02
Filing date: 2006-08-02
Publication date: 2007-08-29

Abstract

본 발명은 소화촉진용 솔잎 발효액에 관한 것으로써, 본 발명의 솔잎 발효액은 저장기간 7년이 지남에 따라 솔잎 발효액 구성물질들간의 역동적인 내부 전환에 의하여 안정적인 물질로 변하면서도 그 주요 성분은 잘 보존되어 있기 때문에 항산화, 항세균 효과가 증가하는 효과를 나타낼 뿐만 아니라 위장관 운동성 조절 효과가 뛰어나 저장 기간이 오래될수록 솔잎 발효액은 소화를 촉진시키고 건강을 증진시키기 위해 유용한 건강보조 식품으로 사용될 수 있다.

솔잎 발효액, 저장기간, 위장관 운동성, 항산화, 항세균

Description

소화촉진용 솔잎 발효액{Fermentation solution of pine tree leaves for promotion of digestion}

도1의 A는 저장기간에 따라 솔잎 발효액 구성물질들간의 역동적인 내부 전환에 의한 탄수화물의 변화량을 나타내는 그림이고, B는 솔잎 발효액의 비타민C 함량의 변화를 나타내는 그림이고,

도2는 본 발명의 방법에 의해 제조된 솔잎 발효액을 마우스 소장관에 처리하였을 때의 위장관 운동성을 나타낸 전기적 활동도 변화 그래프이다.

본 발명은 소화촉진용 솔잎 발효액에 관한 것으로써, 본 발명의 솔잎 발효액은 저장기간 7년이 지남에 따라 솔잎 발효액 구성물질들간의 역동적인 내부 전환에 의하여 안정적인 물질로 변하면서도 솔잎의 주요 성분은 잘 보존되어 있기 때문에 항산화, 항세균 효과가 증가하는 효과를 나타낼 뿐만 아니라 위장관 운동성 조절 효과가 뛰어나 저장 기간이 오래될수록 솔잎 발효액은 소화를 촉진시키고 건강을 증진시키기 위해 유용한 건강보조 식품으로 사용될 수 있다.

소나무(pinus densiflora Siebold et Zuccarini)는 소나무과(pinaceae)에 속하는 사록 침엽성 교목으로 우리나라 전국의 산에 야생하고 있다(김일혁, 약품식물학각론, 진명출판사, 1981, 71). 솔잎은 예로부터 건위, 보혈작용이 있고 중풍, 동맥경과, 고혈압, 당뇨병 등을 예방하는 효능이 있는 것으로 알려져 왔으며(김완희, 최신동의보감, 태평양 출판공사, 1983,960) 선식이나 차로도 이용되고 있다.

솔잎의 활성 성분이며 휘발성 항생물질인 테르펜은 솔잎에 약 7-12%가량 들어 있고 다량의 이소프렌으로 구성되어 모노테르펜(monoterpene), 세퀴테르펜(sequiterpene), 디테르펜(diterpene)이라고 불리며, 항생, 항암, 혈압강하, 호르몬 분비촉진, 항산화 등과 같은 독특한 약리작용 효과가 있어 아로마테라피(aromatheraphy)에 사용되기도 한다.

동의보감과 본초강목에서도 솔잎은 뇌졸중과 고혈압 등에 좋은 장수약으로 전하고 있다. 솔잎이 이런 칭송을 받게 된 데에는 그럴만한 이유가 있다. 테르펜의 자극과 신체활성에 의한 혈액순환과 혈관벽 강화작용도 하나의 이유가 되겠지만, 솔잎에 들어 있는 독특한 지방산도 큰 기여를 한다. 솔잎에 들어 있는 지방산은 동물성 지방산과도, 같은 식물성 지방과도 또 다르다. 솔잎에는 리놀렌산이 약 20%로서 가장 많이 들어 있고, 그 다음이 팔미트산으로 10%를 차지한다. 이외에도 쉽게 산화되지 않는 5-올레핀산을 비롯해 고도불포화지방산이 많이 들어 있다. 산화가 되지 않으므로 과산화지질 같은 유해물질을 만들지도 않고 노화도 방지되는 것이다.

상기 언급된 솔잎의 다양한 효능으로 인하여 건강 보조 식품으로서 솔잎 착즙 상징액의 발효액과 비수리 추출물의 혼합액을 함유하는 건강 보조 식품, 솔잎 엑기스 및 보리싹 엑기스 혼합물을 함유하는 건강 보조 식품 등 많은 연구개발이 활발히 이루어지고 있다(대한민국 특허등록 제0536083, 대한민국 특허등록 제0536086호, 특허등록 제0546250호).

본 발명에서는 일정 저장 기간 동안 솔잎 발효액의 탄수화물, 비타민, 지방산과 지질, 페놀 화합물의 종류 및 함량 변화를 조사하고, 일정 저장 기간이 지난 솔잎 발효액의 항산화성, 항균성을 조사한 결과 발효 숙성기간을 거치면서 구성물질들간의 역동적인 내부 전환으로 인하여 그 효과가 증대된 솔잎 발효액을 제공하는 것이다. 또한 위장관 운동성 조절 효과가 뛰어나기 때문에 소화를 촉진하고 건강을 증진시키기 위해 유용하게 사용될 수 있는 솔잎 발효액을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 소화촉진용 솔잎 발효액에 관한 것으로써, 솔잎추출 후 7년동안 저장 발효시켜 만든 본 발명의 솔잎 발효액은 솔잎 발효액 구성물질들 간의 역동적인 내부 전환에 의하여 안정적인 물질로 변하면서, 그 주요 성분이 잘 보존되어 있고, 위장관 운동성 조절 효과가 증가할 뿐만 아니라 저장 기간이 오래될수록 솔잎 발효액은 항산화, 항세균 효과가 증가하는 효과를 나타내므로 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 솔잎 추출액을 7년동안 저장 발효시켜 1,8-cineole/eucalyptol과 camphor 함량이 각각 증가되는 것을 특징으로 하는 항산화 및 항세균용 솔잎 발효액을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 솔잎 추출액을 7년동안 저장 발효시켜 1,8-cineole/eucalyptol과 camphor 함량이 각각 증가되는 것을 특징으로 하는 위장관 운동성 조절용 솔잎 발효액을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 솔잎 발효액을 유효성분으로 함유하는 건강식품을 제공하는 것이다.

삭제

본 발명의 또 다른 목적은 상기 건강식품으로 차, 생식, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 면류, 껌류, 낙농제품, 스프, 음료수, 드링크제, 알콜음료, 비타민 복합제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강식품을 제공하는 것이다.

본 발명은 솔잎의 주요 성분이 잘 보존되어 있고, 위장관 운동성 조절 효과가 뛰어날 뿐만 아니라 저장 기간이 오래될수록 항산화, 항세균 효과가 증가하는 솔잎 발효액에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 솔잎 발효액을 제공한다.
본 발명은 솔잎 추출액을 7년동안 저장 발효시켜 1,8-cineole/eucalyptol과 camphor 함량이 각각 증가되는 것을 특징으로 하는 항산화 및 항세균용 솔잎 발효액을 포함한다.
본 발명은 솔잎 추출액을 7년동안 저장 발효시켜 1,8-cineole/eucalyptol과 camphor 함량이 각각 증가되는 것을 특징으로 하는 위장관 운동성 조절용 솔잎 발효액을 포함한다.

본 발명은 상기의 솔잎 발효액을 유효성분으로 함유하는 건강식품을 포함한다.

삭제

본 발명은 상기 건강식품으로 차, 생식, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥 류, 과자류, 피자, 라면, 면류, 껌류, 낙농제품, 스프, 음료수, 드링크제, 알콜음료, 비타민 복합제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강식품을 포함한다.

본 발명의 솔잎 발효액은 항산화, 항세균 효과 뿐만 아니라 위장관 운동성 조절 효과가 뛰어나다.

본 발명의 솔잎 발효액이 함유하는 주요성분 및 효과를 분석한 결과, 솔잎추출 후 7년 동안 저장 발효시켜 만든 솔잎 발효액은 솔잎 발효액 구성 물질들 간의 역동적인 내부 전환에 의하여 안정적인 물질로 변한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

솔잎 발효액은 각기 다른 성분을 포함하고 있는 액체 발효물이다. 본 발명에서는 탄수화물, 지질, 비타민C와 페놀 화합물을 저장기간에 따라 각각 분석하였다. 추출하자마자(0년) 위와 같은 성분을 분석하였고, 추출 후 3년, 7년이 지난 후 구성성분의 변화를 분석하였다.

1. 솔잎 발효액의 성분 조사

1.1 탄수화물과 비타민 C

탄수화물은 식물체에서 중요한 성분인데, 글루코스, 프락토즈와 슈크로즈의 함량 변화를 분석하였다. 솔잎 발효액을 제조한 해(0년)와 저장 후 7년이 지난 후 변화량을 조사한 결과, 탄수화물의 농도는 7253.63 (±158.13) ppm에서 2853.363 (±138.112)로, 비타민 C는 1440.00 (±25.40)에서 80.12 (±2.99) ppm로 변화하였다(표1, 도 1).

1.2 지방산/지질

솔잎 발효액의 저장 기간을 달리하여 몇몇의 지방산을 분석하였다. 페놀 화합물과 마찬가지로 지방산 또한 저장기간이 길어질수록 다른 지방산 형태로 내부 전환하는 것으로 분석되었다. 솔잎 발효액에서 가장 일반적인 지질은 팔미토레산(Palmitoleic acid)과 라우릭산(Lauric acid)과 미리스트산(Myristic acid)으로 분석되었다. 솔잎 발효액에 존재하는 지방산은 저장기간에 따라 다른 비율로 존재하였다. 막단백질의 구성성분이고, 낙농업 제품의 희귀한 구성성분인 미리스트산(Myristic acid)은 저장기간이 길어질수록 증가되었고, 항암물질로 추측되는 리놀레산(Linoleic acid)이 초기에(0년) 소량 나타났다.

표1. 발효가 진행됨에 따른 솔잎발효액의 vitamin C, 당, 지방산조성 비교

시료 항목		솔잎발효액 (0년)	솔잎발효액 (3년)	솔잎발효액 (7년)	비고
VitaminC		1,440±25.4	92.81±3.85	80.12±2.99	ppm
당	Glucose	2,855±56.72	395.2±15.47	2,765±55.30	ppm
	Fructose	4,328±74.48	6,975±83.23	7,803±93.36	ppm
	Sucrose	70.63±6.912	370.91±16.87	80.56±9.47	ppm
지방산조성	C6:0 Caproic	4.12±0.02	1.47±0.02	1.15±0.05	%
	C8:0 Caprlic acid	2.05±0.13	2.14±0.02	0.70±0.10	%
	C10:0 Capric acid	0.97±0.03	1.37±0.15	0.90±0.01	%
	C12:0 Lauric acid	31.8±3.37	6.07±0.13	3.82±0.15	%
	C14:0 Myristic acid	4.50±0.35	25.9±1.41	22.9±2.54	%
	C16:0 Palmitic acid	not detected	not detected	not detected	%
	C18:0 Stearic acid	not detected	1.35±0.52	not detected	%
	C16:1 Palmicoleic acid	6.00±0.20	6.81±0.11	6.75±0.15	%
	C18:1 Oleic acid	not detected	not detected	1.10±0.05	%
	C18:2 Linoleic acid	1.38±0.19	not detected	not detected	%
	Unknown	40.9±2.45	51.2±3.91	54.8±4.78	%
	Total Fatty acids	50.8±4.56	45.1±2.77	37.3±3.60	%
	Total Fat(%)	0.24±0.01	0.11±0.01	0.16±0.00	%

1.3 페놀 화합물

페놀 화합물은 퍼지(purge)와 트랩 방법을 사용하여 분석하였다. 내부 전환률이 매우 높다는 것을 페놀산의 역동설이 보여준다. 심각하게 유독한 발암성 물질인 스티렌(Styrene)은 저장 3년 후 완전히 분해된다. 페놀 화합물의 대부분은 톨루엔(Toluene)과 유칼립톨(Eucalyptol)이라고 예상되는데, 이 물질들은 특히 불안정하고, 새로운 물질로의 내부 변환 비율이 높은 것으로 보인다. 페놀산의 몇몇은 또한 필수 오일로 간주된다. 필수 오일은 너무 자라는 것(over growth)과 어떤 질병에 대해 내성을 갖는데 매우 유용하다. 필수 오일로 분류되는 것은 a -pinene, camphene, phellandrene, eucalyptols 이다. 초기의 솔잎 발효액에서 5-isopyrenyl-2-2 methyl-2vinyltetrahydrofuran은 분석되지 않고 추출 후 3내지 7년이 지나야 증가하는 것을 알수 있다. 유사하게도, 식물에 있어 필수적인 Camphore는 발효 초기(0년)의 솔잎 발효액에서는 보이지 않다가 저장 7년이 지나면 6.888 % 에서 24.195%으로 증가한다(표2). Camphor의 경우 적정농도의 사용 시 세포의 생성이나 재생에 효과가 있고, 가래를 없애는데 매우 유용하다.이런 결과는 초기 발효액(0년)의 몇몇의 화합물은 매우 불안정하며 이것은 저장 기간이 길어질수록 안정한 상태로 변화한다는 것을 보여준다. 이런 결과로 볼 때, 솔잎 발효액의 저장은 대표적으로 발암물질로 간주되는 유독한 물질 스티렌(Styrene)을 제거하기 위해 유용한 방법이다.

표2. 솔잎추출액(flash), 솔잎추출액을 3년 발효시킨 것(3 year), 7년 발효시킨 것(7 year)의 특정 성분 비교.

2.항산화효능

솔잎 발효액의 항산화성을 조사하기 위하여 NBT(nitro blue tertazolium) 분석을 수행하였다. 이 분석법은 Xanthine/xanthine oxidase system에 의해 발생되는 활성 유해 산소(superoxide anion radical, O₂ ^-)를 항산화제가 제거시키는 정도를 확인하는 실험이다. 즉, 활성 유해 산소(superoxide anion radical)에 의해 NBT가 환원되면 블루 포마즌(blue formazan)을 형성하는데 이 블루 포마즌(blue formazan)의 형성을 억제하는 능력으로 항산화능(%)을 측정할 수 있다. 솔잎추출 후 7년 저장 발 효시킨 솔잎 발효액은 0.5, 1, 2, 3, 4㎕ 농도별로 항산화효능이 점차 증가하였으며 5㎕ 이상에서는 85% 항산화능을 나타내며 최대 항산화효능을 확인할 수 있었다(도2).

3. 솔잎 발효액의 항세균 효과

솔잎 발효액의 항균성과 항진균성을 조사하였는데 항균성을 나타내었다. 페이퍼 디스크(paper disc) 방법을 사용한 결과 박테리아 생장의 저해를 나타내었다. 배양후 페이퍼 디스크 주위에 형성된 투명환(발육저지환)의 지름을 측정하여 표3에 나타내었다. 7년 저장 발효 솔잎액의 경우 10㎜이상의 투명환이 형성되어 높은 항세균 효과가 있음을 알 수 있었다. Bacillus subtilis은 솔잎 발효액에 대한 민감성을 보였는데 이런 효과는 투여량에 따라 달라진다. 그러나 Salmonella typhimurium , Staphylococcus aureus , Escherichia coli 는 덜 민감하다(표3). 솔잎 발효액의 항진균성 테스트에서 Candida 와 Saccharomyces는 성장의 저해가 없었다.

표3. 항균성 테스트

Species	Diameter in Centimeter
	Fresh	4 Years	7 Years
Salmonella typhimurium KCTC1925	-	0.8	1.2
Micrococcus luteus ATCC9341	-	-	1.4
Staphylococcus aureus ATCC6538P	-	0.9	1.0
Escherichia coli KTCC1923	-	-	1.0
Pseudomonas aeruginosa ATCC15692	-	-	0.8
Bacillus subtilis ATCC6633	-	1.0	1.2
Saccharomyces cerevisiae	-	-	-
Candida albicans ATCC10231	-	-	-

4. 솔잎 발효액의 위장관 운동성 조절 효과

4.1 자발적 내향성 전류 (향도잡이 전류)

세포막 전압을 ―70 mV로 고정한 상태에서 interstitial cells of Cajal (ICC)는 자발적 내향성 전류인 향도잡이 전류를 발생시켰다. 솔잎추출 후 7년 저장 발효시킨 솔잎 발효액(200ug/ml)은 향도잡이 전류의 발생빈도와 전류의 크기를 감소시켰다(도3A, 도3B). ICC에 200ug/ml농도로 처리하였을 때 전류 clamp mode에서는 전류양이 증가하였었고, 전압 clamp mode에서는 향도잡이 전류 빈도수와 증폭율이 급격히 감소함을 확인하였다. 이는 솔잎발효액이 위장관 막의 전기적 활동도를 변화시켜 위장관 운동성을 조절할 수 있음을 시사한다.

ATP-sensitive K+ channel 차단제인 Glibenclamide 10uM를 전처리하였을 때에는 솔잎발효액의 향도잡이 세포에 대한 영향이 나타나지 않았다.(도3C) 이는 솔잎추출 후 7년 저장 발효시킨 솔잎 발효액이 ATP-sensitive K+ channel에 관여하여 위장관운동성을 조절한다는 것을 시사한다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다.

다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

<실시예 1> 솔잎 발효액의 제조

아황산가스의 오염을 최소화하기 위해 해발 350 m 이상에서 자란 청정지역의 건강한 소나무를 선택하여 영양상태가 좋은 가지부분을 채취한 후 싱싱하고 푸른 잎만 선별하였다. 상기 선별된 솔잎의 불순물이 녹아 나오도록 자외선살균기로 살균된 맑은 물에 담근 후 맑은 물이 나올때까지 3-4회 세척하였다. 상기 세척된 솔잎은 다시 숯을 우려낸 물로 1회 세척하였다.

탈수된 솔잎을 녹즙기(인화정밀, 삼광무력공사, 명신상사)로 분쇄하여 착즙하였다. 본 발명에서 사용한 녹즙기는 재래식 녹즙기에 비해 성능이 향상된 것으로 분쇄기와 압축기를 따로 사용하고, 착즙시 전력 소모가 적으며, 착즙 부위가 FDA 승인 제품인 폴리카보네이트이고, 감속기어를 사용하기 때문에 소음과 진동이 적으며, 작업 과정이 단조로와 영양소의 손실이 적고, 부품이 세분화되어 있어 수리비용이 적게 들며, 착즙액의 비율이 재래식보다 약 3배 이상 높은 장점이 있다. 상기 솔잎의 분쇄 과정 중에는 열이 발생하지 않게하여 압착점이 정밀하도록 하였다. 상기 분쇄 로 착즙된 솔즙을 4℃에서 3시간 동안 방치하여 섬유소층과 상징액이 분리되도록 하였다. 상기 분리된 상징액을 수득하여 이를 "솔잎 발효액"이라 명명한 후 결정이 생기지 않도록 -70℃ 이하의 냉동고에서 저장하였다. 또한, 상기 솔골드를 37℃ 진탕 배양기에서 270 rpm으로 7년동안 배양하여 발효시킨 후 "솔잎 발효액"이라 명명하였다.

<실시예2: 솔잎 발효액의 탄수화물, 비타민, 페놀 및 지질 성분 조사>

1. 탄수화물, 비타민, 지질

1) 지방산 분석

각 사료 35 mL를 정확히 취해 10 mL이하로 감압농축하고 전량을 전용 추출장치(Extraction Unit, B-815, Buchi, Switzerland)로 30분간 추출 및 검화하였다. 내부표준물질(C13, tridecanoic acid), KOH(검화), Ascorbic acid(산화방지)를 첨가하고 n-BtOH를 추출용매하였다. 추출 및 검화가 완료되면 산성용액을 가해 지방층과 수층으로 분리하였다. 분리된 상층부의 지방층을 취해 전용분석장치인 Fat determination System(B-820, Buchi, Switzerland)로 분석하였다. 분석조건은 carrier gas 는 Hydrogen, Injector의 온도는 220℃, 검출기(FID)의 온도는 260℃로 설정하고, oven의 온도는 초기 130℃→6.5℃/min→260℃(4min), 이때 수소가스의 압력은 225 kPa, 혼합기체의 압력은 48kPa로 하였다.

2) 비타민C

시료 10 mL를 5% H₃PO₄ 용액으로 추출 50 mL로 적용하고, 0.45 um로 여과한 여액을 HPLC(SCL 10Avp Series, Shimadzu,, Japna)로 분석하였다. (이동상은 acetonitrile 40%, 0.05M KH₂PO₄ 60% isocratic으로 유속은 1 mL/min, column은 NH₂ column, 254nm UV detector로 검출)

3) 당(soluble sugars)

시료를 바로 0.45 um로 여과한 여액을 HPLC(SCL 10Avp Series, Shimadzu,, Japna)로 분석하였다. (이동상은 acetonitrile 75%, water 25% isocratic으로 유속은 1 mL/min, column은 NH₂ column, RI detector로 검출)

2. 페놀화합물(GC-MS)

시료를 증류수로 10배 희석 하여 purge & trap방법을 사용하였다. purge & trap concentrator로 Tekmar 3000을 사용하였고, 퍼지시간은 11분, 드라이 퍼지 시간 2분, 탈착예열온도 175℃, 탈착온도 180℃, 탈착시간 4분, 트랩 굽는 온도 180℃, 트랩 굽는 시간 7분의 조건으로 분석하였다. purge & trap후 가스크로마토그래프/질량분석계 (Gas Chromatography/ Mass spectroscopy) (GC-MS)를 사용하여 페놀화합물을 분석하였다. GC는 Hewlett Packard사제품을 사용하였으며, 컬럼은 HP-5 용융 실리카 캐피러리 컬럼(안지름 0.25mm, 길이 30m, 막두께 0.25㎛)을 사용하였다. 액상은 5% 페닐메틸실리콘, 컬럼 온도는 35℃(3min) - 10℃/min - 280℃를 유지하 였고, 캐리어가스로 헬륨(1ml/분, 평균선속도 : 36cm/초)를 사용하였다. MS는 Hewlett Packard사 HP-6890 GC를 사용하였다. EI 이온화법, 70V 이온화전압, 이온원온도는 230℃를 유지하여 스캔(m/z 35-700)하여 분석하였다.

<실시예3: 솔잎 발효액의 항세균 효과 분석>

상기 실시예 1에서 제조한 솔잎 발효액을 4000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 뒤 상등액을 수득하였다. 상기 수득한 시료를 페이퍼 디스크(paper disk)에 각각 40 ㎕ 또는 120 ㎕로 적신 후 스타필로코커스 아우레우스(staphyllococcus aureus) 또는 대장균(E. coli)를 도말한 영양배지아가(nutrient agar) 위에 올려놓아 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후 페이퍼 디스크 주위에 형성된 투명환(발육저지환)의 지름을 측정하였다.

그 결과, 솔골드 40 ㎕ 및 120 ㎕로 적신 페이퍼 디스크에서는 농도 의존적으로 스타필로코커스 아우레우스 및 대장균의 발육이 저지되어 높은 항세균 효과가 있음을 알 수 있었다(표3).

<실시예4: 솔잎 발효액의 위장관 운동성 조절 효과 분석>

1. 세포분리

8 ~ 13일 된 Balb/C mice를 암수 구별 없이 실험동물로 사용하였다. 에테르로 마취 시킨 다음 경추부위를 탈구시켜 희생 시켰다. 개복하여 유문관(pyloric ring)에서 부터 회장에 해당하는 소장 부위를 적출하였다. 실온에서 Krebs-Ringer bicarbonate용액으로 채워진 준비용기 속에서 장간연(mesenteric border)을 따라 절개하여 내용물을 제거하였다. 핀으로 조직을 고정한 후 현미경 하에서 미세가위를 이용하여 점막층을 제거하고 윤상근을 노출시켰다. 분리된 소장근 조직을 collagenase 1.3 mg/ml, (Worthington Biochemical Co., Lakewood, USA), bovine serum albumin 2mg/ml, (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), trypsin inhibitor 2 mg/ml, (Sigma), ATP 0.27 mg/mL을 포함하고 있는 Ca² ⁺이 들어있지 않는 Hank’s 용액에 옮긴 다음 37C에서 20분간 항온 소화시켰다. 소화 시킨 후 다시 Ca² ⁺이 들어있지 않는 Hank’s 용액으로 교체하고 끝이 무딘 유리피펫을 사용하여 조심스럽게 진탕시켜 단일세포를 분리하였다.

분리된 세포들을 35 mm 배양 용기내 murine collagen (2.5 g/ml, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA)으로 표면처리 된, 멸균된 커버글래스 위에 분주하였다. 10분 후에 stem cell factor (SCF, 5 ng/ml, Sigma)와 2% antibiotic/antimycotic (Gibco-BRL)가 들어있는 SmGm (smooth muscle growth medium, Clonetics Corp., San Diego, CA, USA) 용액을 분주한 후 37C, 95% O₂, 5% CO₂ 배양기에서 배양시켰다. 배양된 다음날 전날 배양된 용액에서 2% antibiotic/antimycotic만 제외시켜 영양액을 바꾸어 주었다. 실험은 배양 2일 후부터 시행하였다. 배양된 ICC의 확인은 키트 단백에 대한 항체(ACK2, Gibco-BRL)를 사용하였으며, Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)로 면역형광염색을 실시하였다.염색이 끝난 후 공초점레이저주사현미경(confocal laser scanning microscopy; FV300, Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하였다.

2. 세포막 전압 및 전류의 기록

배양된 용기를 도립현미경위에 설치되어 있는 항온 조절계에 옮긴 후 분당 2 ~ 3 ml 속도로 세포외 용액을 관류시켰다. Whole-cell patch clamp를 사용하여 배양된 ICC에서 세포막 전류(voltage clamp)와 세포막 전압(current clamp)을 기록하였다. Patch clamp 증폭기(Axopatch 1-D, Axon Instruments, Foster, CA, USA)를 통하여 나오는 신호는 디지털 오실로스코프, 생리적 기록기를 통해서 관찰하였고 고정전압과 자극전압의 조정 및 전류의 기록은 pClamp (version, 6.0, Axon Instruments)와 IBM-compatible computer를 사용하였다. 세포막 전류는 ―80 mV의 유지전압에 고정하여 기록하였다. 모든 실험은 29℃에서 시행하였다.

3. 실험용액

세포외 관류용액의 조성은 다음과 같다(각 수치는 mM단위임): KCl 5, NaCl, 135, CaCl₂2, MgCl₂ 1.2, glucose 10, HEPES (N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethansulfonic acid]) 10이며 Tris를 첨가하여 pH가 7.4가 되도록 적정하였다. 전극내 용액의 조성은 다음과 같다 (각 수치는 mM단위임): K-aspartate 20, KCl 120, MgCl₂ 5, K₂ATP 2.7, Na₂GTP 0.1, creatine phosphate disodium 2.5, HEPES 5, EGTA 0.1이며 Tris를 첨가하여 pH가 7.2가 되도록 적정하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 솔잎추출 후 7년동안 저장 발효시켜 만든 본 발명의 솔잎 발효액은 솔잎 발효액 구성물질들 간의 역동적인 내부 전환에 의하여 안정적인 물질로 변하면서 솔잎의 주요 성분은 잘 보존되어 있고, 위장관 운동성 조절 효과가 증가할 뿐만 아니라 저장 기간이 오래될수록 솔잎 발효액은 항산화, 항세균 효과가 증가하는 효과를 나타내므로, 본 발명의 솔잎 추출 후 7년동안 저장 발효시킨 솔잎 발효액은 소화를 촉진시키고 건강을 증진시키기 위해 유용한 건강보조 식품으로 사용될 수 있다.

Claims

솔잎 추출액을 7년동안 저장 발효시켜 1,8-cineole/eucalyptol과 camphor 함량이 각각 증가되는 것을 특징으로 하는 항산화 및 항세균용 솔잎 발효액.
솔잎 추출액을 7년동안 저장 발효시켜 1,8-cineole/eucalyptol과 camphor 함량이 각각 증가되는 것을 특징으로 하는 위장관 운동성 조절용 솔잎 발효액.
제1항 또는 제 2항에 있어서, 솔잎 발효액을 유효성분으로 함유하는 건강식품.
제 3항에 있어서, 상기 건강식품은 차, 생식, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 면류, 껌류, 낙농제품, 스프, 음료수, 드링크제, 알콜음료, 비타민 복합제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강식품.