KR100748914B1 - 나트륨 이온 구동형 클로라이드/비-카르보네이트 익스체인저 - Google Patents
나트륨 이온 구동형 클로라이드/비-카르보네이트 익스체인저 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저를 코딩하는 서열 번호 1 또는 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 서열 번호 2 또는 4에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 및 결실, 치환, 부가 또는 삽입 아미노산을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 세포에서 발현될 경우 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저로서 기능하는 그의 상동성 단백질, 및 상기 단백질이 외인성 발현되는 세포를 개시한다.
Description
도 1은 래트 조직 및 호르몬 분비 세포주에 있어서, NCBE mRNA의 RNA 블롯 분석 (a) 및 마우스 췌도 (pancreatic islets)로부터의 NCBE mRNA의 RT-PCR 검출 (b)의 결과를 나타낸다.
도 2는 22Na+ 흡수에 대한 세포외 Na+ 농도의 영향을 예시하는 그래프를 나타낸다.
도 3은 22Na+ 흡수에 대한 세포외 HCO3
- 농도의 영향을 예시하는 그래프를 나타낸다.
도 4는 36Cl- 유출에 대한 세포내 Cl-의 영향을 예시하는 그래프를 나타낸다.
도 5는 22Na+ 흡수에 대한 DIDS의 영향을 예시하는 그래프를 나타낸다.
도 6은 대조(비-트랜스펙션) 세포에서의 세포내 pH 변화와 함께, 300 μM 의 DIDS의 존재 또는 부재 하에서의 세포내 pH 변화를 예시하는 그래프를 나타낸다.
도 7은 HCO3
- 불함유 조건 하에서, 환경을 Na+ 불함유 용액으로부터 Na
+ 함유 용액으로 변경할 경우 관찰되는 세포내 pH 변화를 예시하는 그래프를 나타낸다.
도 8은 Cl- 불함유 조건 하에서, 환경을 Na+ 불함유 용액으로부터 Na+ 함유 용액으로 변경할 경우 관찰되는 세포내 pH 변화를 예시하는 그래프를 나타낸다.
본 발명은 사람 및 마우스 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저 (나트륨 이온-구동형 클로라이드/비카르보네이트 익스체인저) 단백질에 관한 것인데, 이들 단백질은 세포내 pH 제어에 관여하는 단백질류이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 나트륨 이온 구동형 클로라이드/비카르보네이트 익스체인저 단백질, 본 단백질 중 하나를 발현하도록 고안된 세포 (이 세포는 발현되는 단백질 중 하나의 기원과는 상이한 종으로부터의 것임), 본 단백질을 코딩하는 DNA, 본 단백질에 대한 항체, 및 나트륨 이온 구동형 클로라이드/비카르보네이트 익스체인저 단백질의 아고니스트/안타고니스트의 선별 방법에 관한 것이다.
다양한 자극에 대한 응답에 있어서의 세포내 pH (pHi)의 제어는 다수의 세포 기능 중에서 극히 중요한 것이다. 비카르보네이트 수송체 패밀리는 동물 세포에서의 생리적 조건 하에서 주요한 pHi 제어체이다. 비카르보네이트 (HCO3
-) 수송체는 그의 기능에 따라 Na+-비의존성 Cl-/HCO3
- 익스체인저 (이와는 달리, 음이온 익스체인저 (AE)라고도 칭해짐), Na+-HCO3
- 공동수송체 (NBC), K+-HCO
3
- 공동수송체, 및 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저의 4개의 군으로 나뉘어진다 [Boron, W.F. 등, J. Exp. Biol., 200:263-268(1997)]. 3종의 AE와 3종의 NBC가 클로닝되어 기능적으로 특성화되었으나, K+-HCO3
- 공동수송체 및 Na+ 구동형 Cl-/HCO
3
- 익스체인저의 분자적 구조는 알려져 있지 않다.
Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저는, 최초에 무척추 동물의 뉴런에서 발견되었으며, 그 후 척추 동물의 뇌, 혈관내피 세포, 정자, 신장 및 췌장 β-세포를 포함하여 뉴런 및 비뉴런 세포에서 발견되었다. Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저는 세포내 Cl-의 교환에 있어서 세포외 Na+ 및 HCO3
- 를 세포 내로 수송하는 세포내 pH 제어체로서, 세포의 알칼리화에 중요한 역할을 한다.
췌장 β-세포에 있어서, 글루코스는 인슐린 분비의 가장 중요한 생리학적 제어체이다. 글루코스 대사는 췌장 세포에 있어서 세포내 pH의 증가를 유도한다. 이러한 글루코스 유도성 pHi 상승은 주로 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저의 작용에 의해 유발되는 것으로 나타났다 [Pace, C.S. 등, J. Membrane Biol., 73:39- 43(1983)].
이와 같이, Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저는 여러 세포에 있어서 중요한 세포내 pH 제어체이지만, 그의 분자적 기초는 알려져 있지 않다. Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저의 분자 구조 및 기능의 분석은 췌장 β-세포에 의한 인슐린 분비의 기능적 분석, 및 당뇨병 치료약의 개발을 위한 스크리닝과 그의 분자 구조에 기초한 약물 설계에 유용하다.
상기 배경을 바탕으로, 본 발명은 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저를 클로닝함으로써 서열결정을 위한 그의 DNA를 수득하고, DNA를 발현하는 이종 세포를 제공하며, Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저의 구조 및 기능을 결정하는 것을 그 목적으로 한다.
이와 같이, 본 발명은 서열 목록의 서열 번호 2 또는 4에 나타내어져 있는 아미노산 서열을 포함하는 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열 목록의 서열 번호 2 또는 4에 나타내어져 있는 아미노산 서열과 관련하여, 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미 노산 서열을 포함하며, 세포에서 발현될 경우, Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저로서 기능하는 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은, Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저가, 세포외 비카르보네이트 및 세포내 클로라이드 이온 모두에 의존적으로 세포외 나트륨 이온을 세포내로 흡수하고 세포내 나트륨 이온을 세포 바깥으로 수송하는 상기 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 단백질 중 하나를 발현시키며, 단백질 중 하나의 기원 종과는 상이한 종의 세포를 제공한다. 이러한 이종 세포의 비제한적 예로는 제노푸스 래비스 (Xenopus laevis) 난모세포 및 HEK293 세포를 들 수 있다. 상기 이종 세포에서의 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저의 발현은 Na+
구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저를 코딩하는 DNA의 트랜스펙션 또는 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저에 상응하는 cRNA의 도입에 의해 성취될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 단백질에 대한 항체를 제공한다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다.
또한 본 발명은 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저의 아고니스트 및 안타고니스트의 선별 방법을 제공하는데, 상기 선별 방법은 본 단백질을 발현하는 이종 세포를 후보 화합물과 접촉시키고, Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저의 기능을 측정하 고, 이와 같이 얻어진 결과를 후보 화합물과 접촉시키지 않은 세포의 나트륨 이온 구동형 클로라이드/비카르보네이트 익스체인저의 기능 측정에 의해 얻어진 결과와 비교함으로써 후보 화합물이 상기 기능을 증강 또는 저해하는지의 여부를 판정하는 것을 포함한다.
또한 본 발명은 서열 목록의 서열 번호 1 또는 3에 나타내어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA를 제공하는데, DNA는 서열 목록의 서열 번호 1에 나타내어진 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오티드 67 내지 3330으로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하며, DNA는 서열 목록의 서열 번호 3에 나타내어진 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오티드 83 내지 3346으로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또한 본 발명은 서열 목록의 서열 번호 1에 나타내어진 뉴클레오티드 67 내지 3330으로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA와 관련하여 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 하기를 코딩하는 DNA를 제공한다:
(1) 서열 목록의 서열 번호 2에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는
(2) 서열 목록의 서열 번호 2에 나타내어진 아미노산 서열과 관련하여 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하며, 세포에서 발현될 경우 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저로서 기능하는 단백질.
추가로 본 발명은 서열 목록의 서열 번호 3에 나타내어진 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오티드 83 내지 3346으로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA와 관련하여 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 하기를 코딩하는 DNA를 제공한다:
(1) 서열 목록의 서열 번호 4에 나타내어진 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는
(2) 서열 목록의 서열 번호 4에 나타내어진 아미노산 서열과 관련하여 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하며, 세포에서 발현될 경우 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저로서 기능하는 단백질.
본 발명에 있어서, 본 발명의 단백질을 발현시키는 이종 세포는 예를 들어 제노푸스 래비스 난모세포 또는 HEK 293 세포일 수 있으며, 마우스 또는 사람 유래 이외의 기타 여러 세포로부터 주어진 목적에 따라 선택될 수 있다. 단백질의 기원의 종과는 상이한 종의 세포에서 본 발명의 단백질을 발현시키는 데 있어서 당 업계에 잘 알려진 통상의 방법이 사용될 수 있다.
본 명세서에 있어서, "하나 이상"이라는 용어는, "하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열"과 관련하여 사용될 경우, 통상 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 수개 (예를 들어 3 또는 4개)를 의미한다.
또한 본 명세서에 있어서, "하나 이상"이라는 용어는 "하나 이상의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA"와 관련하여 사용될 경우, 통상 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 수개 (예를 들어 3 또는 4개)를 의미한다.
이러한 여러 돌연변이 DNA, 및 상기 DNA에 의해 코딩되는 돌연변이 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 먼저, 임의의 상이한 화학적 또는 효소적 공정을 통하여 클로닝된 DNA 단편 내로 돌연변이를 도입시킬 수 있다. 이어서, 상기와 같이 얻어진 돌연변이 DNA를, 목적하는 장점을 가지는 특정 돌연변이체의 선별을 위하여 서열결정한다. 이러한 방법에 의해 그의 표현형과는 상관없이 상이한 돌연변이체의 체계적인 제조가 가능하다. 일반적인 돌연변이 클론 제조 방법은 하기와 같다:
1. 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 주어진 DNA 서열에 직접 도입시킬 수 있다. 이러한 방법에 의해 주어진 DNA의 작은 영역 내로의 다수의 돌연변이의 도입이 가능해진다.
2. 비교적 긴 올리고뉴클레오티드를 사용하여 목적 유전자를 합성할 수 있다.
3. 부위 특이적 변이체 작제법 (Region-specific Mutagenesis)에 의해 목적 돌연변이를 큰 (1 내지 3 kb) DNA 영역 내로 도입시킬 수 있다.
4. DNA의 링커-스캐닝 변이체 작제법 (Linker-scanning Mutagenesis)은 비교적 작은 (4 내지 10 bp) DNA 영역 내로 클러스터 점 돌연변이를 도입하는 데에 적합한 방법이다.
5. PCR도 돌연변이를 직접 도입하는 방법으로 이용될 수 있다.
[참고 문헌: Current protocols in molecular biology, 제3권, Ausubel F.M. 등 편집, John Wiley & Sons, Inc., Current Protocols., 제1권, 제8장: Mutagenesis of cloned DNA, 페이지 8.0.1 - 8.5.10]
또한, 상기 방법에 의해 얻어지는 상이한 돌연변이를 포함하여 목적 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드 또는 기타 벡터를 제조하는 방법이 당 업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 즉, 제한효소 및 리가제를 병용하여 발현 벡터 DNA 내로 목적 유전자를 포함하는 DNA를 삽입함으로써 목적 유전자를 보유하는 재조합 플라스미드를 용이하게 작제한다. 이어서, 상기와 같이 얻어진 재조합 플라스미드를 상이한 세포 내로 도입하여 트랜스펙션시킴으로써 형질전환 세포를 제조한다. 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 내지 효모, 곤충, 식물 및 동물 세포도 이용될 수 있다.
[참고 문헌: Vectors essential data. Gacesa P. 및 Ramji D.P. 166 페이지. BIOS Scientific Publishers Limited 1994., John Wiley & Sons in association with BIOS Scientific Publishers Ltd. Expression vectors, 9 내지 12페이지]
숙주 세포로의 재조합 플라스미드의 도입은 염화칼슘법 또는 전기천공법으로 실시할 수 있다. 염화칼슘법은 형질전환에 효율적인 방법이며, 그를 위해 특별히 고안된 장치가 필요하지 않다. 훨씬 큰 효율이 필요할 경우, 전기천공법이 권고된다.
[참고 문헌: Current Protocols in Molecular Biology, 제3권, Ausbel F.M. 등 편집, John Wiley & Sons, Inc., Current Protocols, 제1권, 유닛 1.8: Introduction of Plasmid DNA into Cells, 페이지 1.8.1 - 1.8.10]
동물 세포주에 대하여 통상 실시되는 두가지 형태의 트랜스펙션, 즉, 일과성 형태 및 안정하고 영구적인 형태가 공지되어 있다. 일과성 트랜스펙션에 있어서, 형질전환 세포는 도입 유전자의 전사 및 복제를 위하여 1 내지 4일 동안 배양하며, 이어서 세포를 수확하여 그의 DNA를 분석한다. 이와는 달리, 다수의 연구에 있어서, 도입 유전자가 염색체 내로 삽입된 안정한 형질전환 세포주가 제조된다. 트랜스펙션 방법의 예로는 인산칼슘법, 전기천공법, 및 리포좀 융합법이 있다.
[참고 문헌: Current protocols in molecular biology. 제3권, Ausubel F.M. 등 편집, John Wiley & Son, Inc., Current Protocols, 제1권, 제9장: Introduction of DNA into mammalian cells, 페이지 9.0.1 - 9.17.3.]
본 발명의 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저 단백질, 또는 그의 단편 또는 그의 유사체에 대한 폴리클로날 및 모노클로날 항체는 당 업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 용이하게 제조된다. 이와 같이 얻어진 항체는 예를 들어 이종의 세포에서 발현되는 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저의 면역조직화학에 사용되거나, 단백질을 차단하여 그의 기능을 저해하는 데에 사용될 수 있다. Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저의 기능이 저해된 이종 세포는 단백질의 아고니스트/안타고니스트의 선별에 있어서의 대조로 사용된다.
본 발명의 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저 단백질에 대한 mg-규모의 모노클로날 항체를 제조하는 일반적인 방법은 하기와 같다: 항원 단백질 중 하나를 마우스에 접종하여 면역화한다. 충분한 항체 역가를 나타내는 마우스로부터 비장을 꺼낸다. 비장 세포를 분리하고, B 세포를 선별하여 B 세포 기원의 골수종 세포와 융합시켜 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 형성시킨다. 하이브리도마 세포에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 친화 컬럼을 사용하거나, 이온-교환 또는 겔 여과법 등으로 배양 배지로부터 정제한다. 또한 본 발명의 폴리클로날 항체는, 토끼, 말, 마우스 또는 기니아 피그를 면역화 동물로 사용하여 항원 단백질을 당 업계에 공지된 스케쥴 중 하나에 따라 접종하여 동물을 면역화하고, 이어서 IgG와 같은 면역글로불린을 수집 혈청으로부터 단리하는 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
[참고 문헌: Current protocols in molecular biology, 제3권, Ausubel F.M. 등 편집, John Wiley & Sons, Inc., Current Protocols, 제2권, 제11장: Immunology, 페이지 11.0.1 - 11.16.13]
<실시예>
본 발명을 실시예를 참고로 더욱 상세하게 기술한다. 그러나, 본 발명은 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은, Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저의 구조 및 기능적 역할을 판정하기 위하여, 인슐린 분비 마우스 세포주인 MIN6로부터의 cDNA 라이브러리로부 터 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저 (NCBE로 명명)를 클로닝하였다. Na+ 구동형 클로라이드 (Cl-)/비카르보네이트 (HCO3
-) 익스체인저 (NCBE)의 1차 구조, 조직 분포 및 기능적 특성을 이하에 기술한다.
마우스 NCBE 단백질 (서열 번호 2)는 1,088개의 아미노산으로 이루어지며, 사람 근육, 망막 및 신장으로부터의 나트륨 비카르보네이트 공동수송체에 대한 아미노산 동일성이 각각 65%, 65% 및 41%임이 밝혀졌다. 마우스 NCBE는 음이온 익스체인저 및 나트륨 비카르보네이트 공동수송체에 특징적인 10개의 추정 막 관통 영역 및 보존 4,4'-디이소티오시아노스틸벤-2,2'-디술폰산 (DIDS)-결합 모티프를 가지는 것으로 밝혀졌다. NCBE mRNA는 뇌 및 마우스 인슐리노마 세포주 MIN6에서 고수준으로 발현되며, 비록 저수준이기는 하지만, 뇌하수체, 정소, 신장 및 회장에서도 발현되는 것으로 밝혀졌다. 제노푸스 래비스 난모세포 및 HEK293 세포에서 발현되는 NCBE 단백질의 기능적 분석을 통하여, 본 단백질은 세포내 Cl- 교환에 있어서 세포외 Na+ 및 HCO3
-를 세포 내로 수송함으로써 세포내 pH 상승을 야기하는 것으로 입증되었다. 본 발명자들은 이러한 발견을 기초로 클로닝된 NCBE가 천연 세포에 있어서 세포내 pH를 제어하는 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저라고 결론지었다.
이어서, 사람 NCBE도 동정하기 위하여 상기에서 얻어지는 마우스 Na+ 구동 형 Cl-/HCO3
- 익스체인저의 부분 서열 (2,746 bp)를 먼저 PCR로 증폭시켰다. 상기 증폭에 있어서, 서열 목록의 서열 번호 1에 나타내어진 서열의 뉴클레오티드 250 내지 270으로 이루어진 서열을 가지는 DNA 단편을 센스 프라이머로 사용하고, 안티센스 프라이머로는 서열 목록의 서열 번호 1에 나타내어진 서열의 뉴클레오티드 2976 내지 2995로 이루어진 서열에 상보적인 서열을 가지는 DNA 단편을 사용하였다. PCR 조건은 하기와 같았다:
초기 변성: 94℃, 2분
증폭 (20 사이클)
·변성: 94℃, 15초
·어닐링: 60℃, 30초
·연장: 72℃, 2분
최종 연장: 72℃, 7분
이와 같이 얻어진 PCR 생성물은 32P-dCTP를 사용하여 닉 (nick) 번역에 의해 표지하고, 이를 사용하여 사람 태아 뇌 cDNA 라이브러리 (Clontech사 제품)으로부터 약 100만개의 파지를 스크리닝하였다. 4개의 양성 파지 클론을 얻어 그의 DNA를 EcoRI으로 절단하였다. 아가로스 전기영동 후 상응하는 밴드를 잘라내고, 각각의 DNA를 추출하여 인서트를 얻었다. 개별적으로, pGEM7Z (Promega사 제품)을 EcoRI으로 절단하여 알칼린 포스파타제로 처리하였다. 서브클로닝을 위하여 양성 파지로부터 얻어진 인서트를 상기에 각각 라이게이션시켰다. 이어서 각각의 인서 트를 자동서열결정기 (ABI 310) 상에서 서열결정하고, 이와 같이 얻어진 서열을 기초로, 사람 NCBE 단백질에 상응하는 cDNA 뉴클레오티드 서열을 결정하였다 (서열 번호 3으로 나타냄). 이어서, 상기 결과에 따라 사람 NCBE 단백질의 서열을 결정하였다 (서열 목록의 서열 번호 4로 나타냄).
상기 실험의 방법 및 결과는 마우스 NCBE를 사용한 후속 과정 및 수득 결과를 중심으로 이하에 기술한다.
[재료 및 방법]
<cDNA 클로닝>
사람 신장 NBC cDNA의 부분 cDNA 단편 [Burnham, C.E. 등, J. Biol. Chem., 272: 19111 - 19114 (1997)]을, 사람 신장 cDNA를 주형으로 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 여기에 사용한 센스 및 안티센스 프라이머는 5'-TTTGGAGAAAACCCCTGGT-3' (nt 2232-2250) (서열 번호 5) 및 5'-TGACATCATCCAGGAAGCTG-3' (nt 2912-2931) (서열 번호 6)이었다. PCR은 하기의 조건 하에 40 사이클까지 수행하였다: 써멀 사이클러 GeneAmp PCR 시스템 9600 (PE Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 소재)에서 변성: 94℃, 15초; 어닐링: 60℃, 30 초; 및 연장: 72℃, 45초. 이전에 기술된 낮은 엄격한 조건 하에 [Fukumoto, H. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5434-5438 (1988)], 700 bp PCR 생성물을 프로브로 하여 MIN6 cDNA 라이브러리 [Inagaki, N. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2679-2683 (1994)]를 스크리닝하였다. 양성 클론을 pGEM-3Z 벡터 (Promega사 제품, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 서브클로닝하고, ABI PRISM (상표명) 377 DNA 서열결정기 (PE Applied Biosystems사 제품)을 사용하여 양 방향으로 서열결정하였다.
<RNA 블롯 분석>
다양한 조직 및 세포로부터의 전체 RNA 10 ㎍을 사용하여 RNA 블롯 분석을 수행하였다. RNA를 포름알데히드로 변성시키고, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동시키고, 나일론 막으로 옮겼다. 이전에 기술된 표준 조건 [Wang, C-Z. 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 220: 196-202 (1996)] 하에 블롯을 NCBE cDNA로 프로빙하였다. 오토라디오그래피 전에, 0.1 X SSC 및 0.1% SDS로 실온에서 1시간 동안, 이어서 50℃에서 추가로 1시간 동안 블롯을 세척하였다.
<역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)>
TRIZOL 시약 (Life Technologies, Inc., 사 제품, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 사용하여 단리 마우스 췌도로부터 전체 RNA를 제조하였다. 제1 가닥 cDNA (10 ng)은, Superscript (상표명) II 역전사효소 (Life Technologies 사 제품)를 사용하여 랜덤 프라이머에 의해 제조하였다. PCR은 표준 조건 하에 20 ㎕의 반응 부피 중 약 1 ng의 주형 DNA를 사용하여 Expand High Fidelity PCR System (Roch Diagnositics사 제품, 독일 만하임 소재)으로 수행하였다. 사용한 센스 및 안티센스 프라이머는 5'-GTCATGTTAGACCAACAGGT-3' (nt 4283-4302) (서열 번호 7) 및 5'-GTTGTAATAGCGACACTC-3' (nt 4911 - 4928) (서열 번호 8)이었다. PCR 생성물은 1% 아가로스 겔 상에서 분리시켜 DNA 서열결정으로 확인하였다.
<제노푸스 래비스 난모세포에 있어서의 NCBE의 기능적 분석>
pSD5 중 NCBE의 코딩 서열을 FspI으로 절단하여 선형화하고, 이미 기술된 바와 같이 SP6 RNA 폴리머라제로 시험관내 전사시켰다 [Wang, C-Z. 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 220:196-202(1996)]. 탈여포 난모세포에 NCBE cRNA (50 nl, 0.5 ㎍/㎕) 또는 물을 주입하고, 18℃에서 3 내지 5일 동안 1 X MBS 매질 (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.8 mM MgCl2, 0.4 mM CaCl2, 0.3 mM Ca(NO3)2, 2.4 mM NaHCO3 및 7.5 mM 트리스, pH 7.4)에서 인큐베이션한 후 연구를 행하였다. 난모세포를 18℃에서 1시간 동안 표준 용액 (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgC12, 1 mM CaCl2, 및 8 mM NaHCO3, pH 7.4)에서 예비인큐베이션시켰다.
이어서, 세포외 Na+ 농도에 대한 의존성 연구를 위하여, 0.074 MBq의 22Na+ (NEN (상표명) Life Science Products 사 제품, 미국 매사추세츠주 보스톤 소재)를 포함하며 1.5% CO2로 버블링된 pH 7.4의 1, 10, 30 또는 100 mM의 Na+ 용액 1.4 ml 중에서 난모세포를 인큐베이션시켰다. 각각의 용액에 있어서, 표준 용액 중 Na+를 동일 몰량의 콜린으로 치환하였다. 10 ㎕ 분량을 이후의 22N+-비활성 측정을 위하여 인큐베이션 용액으로부터 옮겨놓았다. 15분 후, 각각 1, 10, 30 또는 100 mM의 Na+를 포함하는 pH 7.4의 빙냉 용액으로 3회 세척함으로써 22Na+ 흡수를 종결시키고, 이어서 난모세포를 5% SDS 0.5 ml에서 용해시키고, 수성 계수 신틸런트 (Aqueous Counting Scintillant, Amersham Pharmacia Biotech사 제품) 4.5 ml을 첨가하였다. 22Na+ 흡수는 Cl- 불함유의 1, 10, 30 또는 100 mM Na+ 용액 (pH 7.4) 중에서 수행하였다. 세포외 Cl-를 동일 몰량의 글루콘산으로 치환하고, 세포외 Na+를 동일 몰량의 N-메틸-D-글루카민 (NMG)으로 치환하였다. 또한 15분 동안의 22Na+ 흡수를 표준 용액 중 음이온 수송체의 저해제인 300 μM의 4,4'-디이소티오시아노스틸벤-2,2'-디술폰산 (DIDS, Sigma사 제품)의 존재 또는 부재 하에 조사하였다.
세포외 HCO3
- 농도에 대한 의존성 연구를 위하여, 18℃에서, 0.074 MBq의 22Na+ 를 포함하며 1.5% CO2로 버블링된 pH 7.4의 1, 3, 10 또는 30 mM의 HCO3
- 용액 중에서 Na+ 흡수 실험을 수행하였다. 용액은 2 mM KCl, 1 mM MgCl2 및 1 mM CaCl2
를 포함하였으며 (pH 7.4), 추가로, 1 mM HCO3
- 용액의 경우 107 mM NaCl 및 1 mM NaHCO3, 3 mM HCO3
- 용액의 경우 105 mM NaCl 및 3 mM NaHCO3, 10 mM HCO3
- 용액의 경우 98 mM NaCl 및 10 mM NaHCO3, 및 30 mM HCO3
- 용액의 경우 78 mM NaCl 및 30 mM NaHCO3를 포함하였다.
36Cl- 유출 실험을 위하여, 세포내 Cl-의 고갈을 위한 Cl- 불함유 용액 중에서, 또는 Cl- 함유 표준 용액 중에서 1시간 동안 난모세포를 예비인큐베이션시켰다. 난모세포를, 18℃에서 1시간 동안 1.5% CO2로 버블링시키면서 0.074 MBq의 36Cl-
함유 용액 (NEN (상표명) Life Science Products사 제품) 중에서 인큐베이션시켰다. 난모세포를 상응하는 각각의 용액으로 3회 신속하게 세척하고, 이어서 1.5% CO2로 버블링한 pH 7.4의 각각의 Cl- 불함유 용액 1.5 ml로 옮겼다. 이후의 36Cl- 비활성 측정을 위하여 10 ㎕ 분량을 인큐베이션 용액으로부터 옮겼다. 용액 중 36Cl- 활성을 0, 5, 15, 25 및 35분에서 측정하였다. 잔류 세포내 36Cl-의 측정을 위하여 난모세포를 상기한 바와 같이 처리하였다. 각각의 시간 지점으로부터의 배지 일부를 카운팅하고, 값을 합하여 유출량을 결정하였다. 36Cl- 유출은 전체 세포 36Cl
- 방출에 대한 퍼센트로 표시하였다. 22Na+ 및 36Cl- 활성을 베타 신틸레이션 카운터 (Aloka사 제품, 일본)로 측정하였다.
<HEK293 세포내의 NCBE의 기능적 분석>
HEK293 세포를, 커버슬립을 포함하는 3.5 cm-직경의 디쉬 당 3 x 105개의 세포의 밀도로 도말하고, 10%의 소 태아 혈청, 스트렙토마이신 (60.5 ㎍/ml), 및 페니실린 (100 ㎍/ml)이 보충된 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM, 고 글루코스) 중에서, 95% 공기 및 5% CO2의 가습 조건 하, 37℃에서 배양하였다. 제조자의 지시에 따라 리포펙타민 (Lipofectamine), 리포펙 타민 플러스, 및 Opti-MEM I 시약 (Life Technologies 사 제품, 미국 매릴랜드주 게이터스버그 소재)를 사용하여 pcDNA3.1 벡터 (Invitrogen사 제품, 네델란드 그로닌겐 소재) 중 완전한 길이의 NCBE cDNA 1 ㎍으로 세포를 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션후 48 내지 72시간 동안 세포를 연구하였다. 2',7'-비스(2-카르복시에틸)-5-(6)-카르복시플루오레신, 아세톡시메틸 에스테르 (BCECF-AM, Molecular Probe사 제품, 미국 오레곤주 유진 소재)을 사용하여 세포내 pH 변화를 모니터링하였다 [Burnham, C.E. 등, J. Biol. Chem., 272:19111-19114(1997)]. HEK293 세포에 1시간 동안 1 μM의 BCECF-AM을 로딩하고, 컴퓨터화된 영상 처리 장치 (490 nm/450 nm; 520 nm ~ 560 nm 발광) (Argus-50; Hamamatsu Photonics사 제품, 일본 하마마쯔 소재)를 사용한 이중 여기 파장법에 의해 세포내 pH 변화를 모니터링하였다. 시험 용액으로 전환하기 전, 그리고 10분 후의 세포내 pH의 차로서 △pHi를 결정하였다. pHi의 교정 곡선은 KCl/니게리신 기술을 사용하여 생성하였다 (Thomas, J.A. 등, Biochemistry 18: 2210-2218 (1979)). 모든 실험에 있어서, 세포를 먼저 40 mM NH4Cl-함유 용액을 포함하는 NH4
+-프리펄스 (prepulse)로 5분 동안 산성화한 후 각각의 Na+ 함유 시험 용액으로 변경하였다 (Burnham, C.E. 등, J. Biol. Chem., 272:19111-19114(1997)).
세포내 산성화로부터의 세포내 pH 회복 (△pHi)의 Na+ 의존성을 평가하기 위 하여, Na+ 불함유 용액 (115 mM 테트라메틸암모늄 클로라이드 (TMA-Cl), 25 mM KHCO3, 0.8 mM K2HPO4, 0.2 mM KH2PO4, 1 mM CaCl
2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES) 및 Na+ 함유 용액 (Na+ 불함유 용액 중 TMA-Cl 및 KHCO3를 90 mM NaCl, 25 mM KCl, 및 25 mM NaHCO3로 대체함)을 사용하였다.
HCO3
- 의존성을 시험하기 위하여, HCO3
- 불함유, Na+ 불함유 용액 (115 mM TMA-Cl, 0.8 mM K2HP04, 0.2 mM KH2P04, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES) 및 HCO3
- 불함유, Na+ 함유 용액 (HCO3
- 불함유, Na
+ 불함유 용액 중 TMA-Cl을 90 mM NaCl 및 25 mM KCl로 대체함)을 사용하였다.
Cl- 의존성을 측정하기 위하여, Cl- 불함유, Na+ 불함유 용액 (25 mM KHCO
3, 0.8 mM K2HP04, 0.2 mM KH2P04, 10 mM HEPES, 115 mM NMG-글루코네이트) 및 Cl- 불함유, Na+ 함유 용액 (NMG-글루코네이트를 115 mM 소듐 글루코네이트로 대체함)을 사용하였으며, 결과를 서로 비교하였다.
모든 용액은 95% O2 및 5% CO2로 버블링하였으며, 그의 pH는 7.4로 조정하였다. 각각의 용액의 삼투성은 수크로스로 조정하였다. 분석은 37℃에서 실시하였 다.
<통계학적 분석>
결과는 평균 ±SE로 표현하였다. 실험간의 통계학적 유의성은 스튜던트 t 테스트 (Student's t test)에 의해 결정하였다.
[결과 및 고찰]
NCBE는 Na+-HCO3
- 수송체에 구조적으로 관련되어 있다.
상기한 바와 같이, 사람 신장 Na+-HCO3
- 공동수송체 (NBC) cDNA 일부를 프로브로 사용하여 MIN6 cDNA를 스크리닝함으로써 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저 (NCBE)를 코딩하는 cDNA를 MIN6 cDNA로부터 클로닝하였다. 상기와 같이 서열결정된 뉴클레오티드 서열 (NCBE)를 서열 목록의 서열 번호 1에 나타내었다. 5,385-bp의 복합 뉴클레오티드 서열은 "ATG"의 상류의 인-프레임 (in-frame) 종결 신호가 후속하는 개봉 판독 프레임을 포함하며, 추정 분자량이 122 kDa인 서열 번호 1에 나타내어진 1,088개의 아미노산의 단백질을 코딩한다. 소수성 분석에 의하면, 상기 아미노산 서열은 각각 하기의 위치에 추정 막 관통 영역 (TM1 - TM10)을 가지는 것으로 나타났다:
TM1: 아미노산 479 ~ 499
TM2: 아미노산 514 ~ 534
TM3: 아미노산 564 ~ 584
TM4: 아미노산 693 ~ 713
TM5: 아미노산 733 ~ 753
TM6: 아미노산 780 ~ 800
TM7: 아미노산 826 ~ 846
TM8: 아미노산 882 ~ 901
TM9: 아미노산 905 ~ 924
TM1O: 아미노산 972 ~ 992
아미노산 서열에 있어서, 3개의 잠재적 N-결합 글리코실화 부위가 제3 (TM3) 및 제4 (TM4) 관통 영역 사이의 세포외 루프에 존재한다 (Asn-647, Asn-657 및 Asn-667). 잠재적 DIDS-결합 모티프는 아미노산 815-818에 존재한다.
NCBE 및 기타 NBC 사이의 아미노산 서열 비교에 의하면, NCBE는 사람 근육 NBC [Pushkin, A. 등, J. Biol. Chem., 274:16569-16575(1999)], 사람 망막 NBC [Ishibashi, K. 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 24:535-538(1998)], 및 사람 신장 NBC [Burnham, C.E. 등, J. Biol. Chem., 272:19111-19114(1997)]에 대하여 각각 65%, 65% 및 41%의 아미노산 동일성을 가진다. 이는 NCBE가 신규한 비카르보네이트 수송체라는 것을 나타낸다. 잠재적 막 관통 영역 및 DIDS-결합 모티프 중 아미노산 서열 Lys Leu Lys Lys (잔기 815-818)은 NCBE에 있어서 잘 보존되어 있는 반면, 세포내 아미노- 및 카르복실-말단 영역, 및 제3 및 제4 막 관통 영역 사이의 큰 세포외 루프 중의 아미노산 서열은 다소 상이하다.
NCBE는 뇌 및 인슐린 분비 클로날 췌장 β-세포에서 고수준으로 발현된다.
RNA 블롯 분석에 의하면, 5.5 kb의 NCBE mRNA는 뇌 및 인슐린 분비 세포주 MIN6 세포에서 고수준으로 발현되며, 뇌하수체, 정소, 신장 및 회장에서는 저수준으로 발현되는 것으로 나타났다 (도 1, a). RT-PCR 분석에 의하면, NCBE는 췌도에서도 발현되는 것으로 나타났다 (도 1, b).
도면에 있어서, "a"는 래트 조직 및 호르몬 분비 세포주에 있어서의 NCBE mRNA의 RNA 블롯 분석 결과를 나타낸다. 혼성화 전사체의 크기가 표시되어 있다. "b"는 마우스 췌도에 있어서의 NCBE mRNA의 RT-PCR 검출 결과를 나타낸다. DNA 길이 마커 및 RT-PCR 생성물이 각각 레인 1 및 2에 나타내어져 있다.
NCBE는 세포내 pH (pHi)를 제어하는 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저이다.
본 발명자들은 제노푸스 래비스 난모세포 시스템을 사용하여 NCBE의 기능적 성질을 조사하였다. 22Na+ 흡수 및 36Cl- 유출은 cRNA 또는 물 (대조)의 주입 후 3 내지 5일 동안 측정하였다. 난모세포를 1.5% CO2를 사용한 버블링에 의해 산성화하여, 본 발명자들은 먼저 22Na+ 흡수에 대한 세포외 Na+ 농도의 영향을 조사하였다. 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 22Na+ 흡수 (nmol/난모세포/시)과 세포외 Na+ 농도 사이의 관계를 예시한다. 도면에 있어서, ■ 및 ●는 NCBE cRNA를 주입한 세포에서 얻어진 결과를 나타내고, □ 및 0 은 물을 주입한 세포에서 얻어진 결과를 나타낸다. ■ 및 □는 Cl- 함유 세포외 용액을 사용하여 얻어진 결과를 나타내고, ●및 0 은 Cl- 불함유 세포외 용액을 사용하여 얻어진 결과를 나타낸다. 각각의 데이터는 2회의 독립적인 실험으로부터의 7 내지 16개의 난모세포의 평균 ±SE (표준편차)를 나타낸다. * 및 (p<0.05)는 물을 주입한 세포와, Cl- 불함유의, 각각 10 mM, 30 mM 또는 100 mM Na+ 용액 중 인큐베이션과의 통계학적 유의차의 유무를 나타낸다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 22Na+ 흡수 증가는, NCBE cRNA 주입 난모세포에 있어서, 생리학적 Na+ 농도 범위에 걸쳐 관찰되는 직선형 패턴으로, 세포외 Na+ 농도에 의존적이었다. 물 주입 난모세포에서는 22Na+ 흡수 증가가 전혀 나타나지 않았다. Cl- 함유 및 Cl- 불함유 용액에서 얻어진 결과들 사이의 Na+ 흡수를 비교해 보면, 세포외 Cl-의 존재 하에서의 Na+ 흡수가 세포외 Cl-의 부재하에서의 Na+ 흡수보다 현저하게 더 높았다 (도 2). 이러한 결과는 NCBE가 세포외 Na+를 세포 내로 수송하며, 세포외 Cl-가 NCBE 활성의 촉진에 관여한다는 것을 나타낸다.
이어서, 본 발명자들은 22Na+ 흡수에 대한 세포외 비카르보네이트 이온의 영향을 조사하였다. 결과를 도 3에 나타내었다. 각각의 데이터는 2회의 독립적인 실험으로부터의 11 내지 16개의 난모세포의 평균 ±SE (표준편차)를 나타낸다. * (p<0.05)는 물 주입 세포와의 비교치를 나타낸다. 도면으로부터 명확하게 알 수 있듯이, 세포외 비카르보네이트 이온의 증가는 NCBE cRNA 주입 난모세포에 있어서 농도 의존적인 방식으로 Na+ 흡수를 유의하게 증대시키는 반면, 물 주입 난모세포는 이러한 Na+ 흡수에서의 변화를 전혀 나타내지 않았다. 상기 결과는 세포외 비카르보네이트 이온이 Na+를 세포 내로 수송하는 데 필요하다는 것을 나타낸다.
Cl-가 NCBE에 의해 세포 바깥으로, 또는 세포 내로 수송되는지의 여부를 판정하기 위하여, 본 발명자들은 제노푸스 래비스 난모세포로부터의 36Cl-유출을 조사하였다. 36Cl-유입은 물 주입 난모세포에서는 검출되지 않았기 때문에, NCBE cRNA-주입 난모세포로부터의 36Cl- 유출에 대해서만 분석하였다. NCBE cRNA-주입 난모세포로부터의 36Cl- 유출률 (%)은, Cl- 불함유 용액에서의 예비인큐베이션에 의해 세포내 Cl-를 고갈시킨 조건 하에서, 그리고 Cl- 함유 용액에서의 예비인큐베이션에 의해 세포내 Cl-가 고갈되지 않은 조건 하에서 0 내지 35분 동안 측정하였다. 결과를 도 4에 나타내었다. 도면에 있어서, ●는 세포내 Cl- 를 고갈시키지 않은 조건 (Cl- 함유 용액에서 예비인큐베이션) 하에서의 세포에서 얻어진 결과를 나타내며, ▲는 세포내 Cl-를 고갈시킨 조건 (Cl- 불함유 용액에서 예비인큐베이션) 하에서의 세포에서 얻어진 결과를 나타낸다. 데이터는 3회의 독립적인 실험으로부터의 16 내지 17개의 난모세포의 평균 ±SE (표준 편차)를 나타낸다. * (p<0.05)는 5, 15, 25 및 35분에 있어서 세포내 Cl- 고갈 세포와의 비교를 나타낸다.
상이한 조건 하에서의 36Cl- 유출 결과들 사이의 비교에 의하면, NCBE는 세포내 Cl-를 세포 바깥으로 수송하는 것으로 나타났다. 종합해 보면, 상기 결과는 NCBE가 세포외 Na+ 및 비카르보네이트 이온을 세포내 Cl-와 교환한다는 것을 입증한나타낸다.
또한, 본 발명자들은 음이온 수송체의 저해제인 DIDS의 22Na+ 흡수에 대한 영향을 조사하였다. 발현은 0.3 mM DIDS의 부재 또는 존재 하에서 평가하였다. 결과를 도 5에 나타내었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험으로부터의 21 내지 22개의 난모세포의 평균 ±SE (표준 편차)를 나타낸다. * (p<0.05)는 cRNA+DIDS와의 비교를 나타낸다.
NCBE cRNA 주입 난모세포에서의 22Na+ 흡수는, DIDS의 부재 하에서는 31.4 ±2.1 nmol/난모세포/시 (n=21)이고, 300 μM의 DIDS의 존재 하에서는 6.0 ±0.7 nmol/난모세포/시 (n=14)이었다. 물 주입 난모세포에 있어서는, DIDS의 부재 또는 존재 하에서 상기 흡수는 각각 1.6 ±0.3 (n=22) 및 2.1 ±0.4 (n=19) nmol/난모세포/시 이었다. 이와 같이, DIDS는 NCBE에 의한 22Na+ 흡수를 부분적으로 저해하는 것으로 밝혀졌다 (도 5).
세포내 pH의 제어에 있어서의 NCBE의 역할을 명확하게 하기 위하여, NCBE로 일과성으로 트랜스펙션시킨 HEK293 세포를 사용하여 여러 조건 하에서 세포내 pH 변화를 측정하였다. 모든 실험은 NH4 + 프리펄스 (prepulse) 로 세포내 pH를 산성화한 조건 하에서 수행하였다. 세포내 pH 변화가 세포외 Na+에 의존적인지의 여부를 판정하기 위하여, 세포의 환경을 Na+ 불함유 용액으로부터 Na+ 함유 용액으로 변경시켰다. 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 대조 (비-트랜스펙션) 세포, 및 300 μM의 DIDS의 유무 하에서의 NCBE 트랜스펙션 세포의 추적 결과를 예시하는 그래프를 나타낸다. 세포의 환경은 Na+ 불함유 용액으로부터 Na+ 함유 용액으로 변경시켰다.
도면으로부터 알 수 있듯이, 세포내 pH의 신속한 회복 (△pHi)은 Na+/H+ 익스체인저의 특이적 저해제인 1 mM의 5-(N-에틸-N-이소프로필)-아밀로라이드 (EIPA)의 존재 하에서 단지 NCBE-트랜스펙션 세포에서만 관찰되었다 (△pHi은 NCBE-트랜스펙션 세포에서는 0.239 ±0.028 (n=97)이고, 대조에서는 0.003 ±0.015 (n=70)임. p<0.05) (도 6). 상기 세포내 pH에 있어서의 회복은 300 μM DIDS에 의해 부분적으로 저해되었다 (△pHi은 0.023 ±0.042 (n=89)임. p<0.05).
이러한 세포내 pH에서의 변화가 비카르보네이트 이온 의존성인지의 여부를 판정하기 위하여, 1 mM의 EIPA의 존재 하에서, NCBE-트랜스펙션 세포의 환경을 HCO3
- 불함유, Na+ 불함유 용액으로부터 HCO3
- 는 함유하지 않지만 Na+는 함유하는 용액으로 변경시켰다. 그러나, 도 7에 나타낸 바와 같이, 세포내 pH의 회복은 전혀 검출되지 않았다 (△pHi은 0.002 ±0.014 (n=71)임).
마지막으로, 본 발명자들은 Cl- 의존성에 대한 조사도 행하였다. NCBE-트랜스펙션 세포를 실험 내내 Cl- 불함유 용액 (세포내 Cl- 고갈 조건 하)에서 유지하였다. 상기 조건 하에, 세포의 환경을 Na+ 불함유 용액으로부터 Na+ 함유 용액으로 변경시켰다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 1 mM EIPA의 존재 하에서 세포내 pH의 회복은 전혀 검출되지 않았다 (△pHi은 0.067 ±0.012 (n=95)임)].
상기 결과는, 세포내 산성화로부터의 세포내 pH의 회복이 세포외 Na+ 및 HCO3
-와, 세포내 Cl-가 존재하는 경우에만 검출된다는 것을 나타낸다.
제노푸스 래비스 난모세포 및 HEK293 세포에서 이종적으로 발현되는 NCBE의 기능 연구에 의하면, NCBE는 세포내 Cl-를 교환하여 세포외 Na+ 및 HCO3
-를 수송함으로써 세포내 pH를 급성 세포내 산성화로부터 회복시킨다는 것이 나타났다 (도 3 및 4). NCBE는 지금까지 보고된 음이온 익스체인저 및 Na+-HCO3
- 공동수송체와는 기능적으로 별개이다. 이는 1) 제노푸스 래비스에서 발현시킨 NCBE가 세포내 Cl- 의존 성 Na+ 흡수 증가를 나타내고, 2) NCBE가 세포 바깥으로 Cl-를 수송하는 능력을 나타내며, 또한, 3) HEK239 세포에서 발현시킨 NCBE가 세포외 Na+ 및 HCO3
-와, 세포내 Cl-에 의존적인 방식으로 세포내 pH를 상승시키기 때문이다. 이러한 성질은 천연 세포에서 기술된 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저의 성질과 유사하다. 따라서, 클로닝된 NCBE는 Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저인 것으로 결론지었다.
NCBE의 가능한 생리학적 관련성
NCBE mRNA가 인슐린 분비 세포주 MIN6 및 췌도에서 발현된다는 것은 그의 생리학적 관련성을 내포한다. 글루코스 유도 인슐린 분비는 췌장 β-세포에서의 세포내 pH 상승을 수반한다는 것이 밝혀져 있다. 여러 세포내 pH 제어체가 췌장 β-세포에 존재하는 것으로 제안되었지만, 그의 분자적 기초는 지금까지 공지되어 있지 않다. NCBE가 1차 구조 및 기능적 성질이 결정된 첫번재 세포내 pH 제어 익스체인저이다. NCBE는 글루코스 대사에 의해 산성화된 췌장 β-세포에서의 세포내 pH의 회복 공정에 기여하는 것으로 생각된다. NCBE mRNA는 또한 정소에서도 나타나지만, 그의 발현 수준은 낮다. 세포내 pH는 정자의 수정능 획득 (capacitation)을 포함하여 다수의 정자 기능을 제어하고 있는 것으로 밝혀져 있다. 정자의 수정능 획득은, 세포내 pH의 증가로 이어지고, 이는 기능적인 Na+, Cl- 및 HCO3-
-의존성 산-유출 경로를 필요로 하기 때문에, NCBE는 정자의 수정능 획득 공정에 관여할 수 있다. NCBE mRNA는 뇌에서도 고수준으로 발현된다. 비록 생리학적 연구에 의하면 NCBE는 해마의 뉴런 및 성상 세포에 존재하는 것으로 나타났지만, 이러한 세포에 있어서의 그의 생리학적 중요성은 현재로서는 알려져 있지 않다.
본 발명에 따르면, Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저를 클로닝함으로써 서열결정을 위한 그의 DNA가 수득되고, DNA를 발현하는 이종 세포가 제공되며, Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저의 구조 및 기능이 결정되었다. Na+ 구동형 Cl-/HCO3
- 익스체인저의 분자 구조 및 기능의 분석은 췌장 β-세포에 의한 인슐린 분비의 기능적 분석, 및 당뇨병 치료약의 개발을 위한 스크리닝과 그의 분자 구조에 기초한 약물 설계에 유용하다.
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<150> JP2000-342911
<151> 2000-11-10
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ggctgagtgg aagacactga agacactgca gagcaaggtg ctttttttcc agaggtgtta 60
cagaac atg gag att aaa gac cag gga gcc caa atg gag ccg ctg ctg 108
Met Glu Ile Lys Asp Gln Gly Ala Gln Met Glu Pro Leu Leu
1 5 10
cct acg aga aat gat gaa gaa gcc gtt gtg gat aga ggt gga aca cgc 156
Pro Thr Arg Asn Asp Glu Glu Ala Val Val Asp Arg Gly Gly Thr Arg
15 20 25 30
tct att ctc aaa aca cat ttt gag aaa gaa gat tta gaa ggt cat cgg 204
Ser Ile Leu Lys Thr His Phe Glu Lys Glu Asp Leu Glu Gly His Arg
35 40 45
aca tta ttt att gga gtt cat gtg ccc ctg ggt gga aga aaa agc cat 252
Thr Leu Phe Ile Gly Val His Val Pro Leu Gly Gly Arg Lys Ser His
50 55 60
cgt cgt cac agg cat cgt ggt cat aag cac aga aag agg gac aga gag 300
Arg Arg His Arg His Arg Gly His Lys His Arg Lys Arg Asp Arg Glu
65 70 75
aga gat tcg gga ctg gag gat gga aga gag tcc cct tct ttt gac acc 348
Arg Asp Ser Gly Leu Glu Asp Gly Arg Glu Ser Pro Ser Phe Asp Thr
80 85 90
cca tcg cag agg gtg cag ttt att ctt gga act gag gac gat gat gag 396
Pro Ser Gln Arg Val Gln Phe Ile Leu Gly Thr Glu Asp Asp Asp Glu
95 100 105 110
gag cac ctc cct cat gac ctt ttc aca gag ctg gat gag att tgc tgg 444
Glu His Leu Pro His Asp Leu Phe Thr Glu Leu Asp Glu Ile Cys Trp
115 120 125
cgt gaa ggg gaa gat gct gag tgg cga gag aca gcc agg tgg ttg aaa 492
Arg Glu Gly Glu Asp Ala Glu Trp Arg Glu Thr Ala Arg Trp Leu Lys
130 135 140
ttt gaa gag gat gtg gaa gat gga gga gaa aga tgg agt aag ccc tat 540
Phe Glu Glu Asp Val Glu Asp Gly Gly Glu Arg Trp Ser Lys Pro Tyr
145 150 155
gtg gcc acg ctt tca tta cac agc ttg ttt gag ttg aga agc tgc atc 588
Val Ala Thr Leu Ser Leu His Ser Leu Phe Glu Leu Arg Ser Cys Ile
160 165 170
ctg aat gga act gtg cta ctg gac atg cat gcc aac acg ata gaa gaa 636
Leu Asn Gly Thr Val Leu Leu Asp Met His Ala Asn Thr Ile Glu Glu
175 180 185 190
att gca gat atg gtc ctt gac cag cag gtc agc tca ggc cag ctg aat 684
Ile Ala Asp Met Val Leu Asp Gln Gln Val Ser Ser Gly Gln Leu Asn
195 200 205
gaa gat gtt cgc cac agg gtc cac gaa gca ttg atg aag cag cat cat 732
Glu Asp Val Arg His Arg Val His Glu Ala Leu Met Lys Gln His His
210 215 220
cac cag aat cag aaa aaa ctg gct aac agg att cct att gtc cga tct 780
His Gln Asn Gln Lys Lys Leu Ala Asn Arg Ile Pro Ile Val Arg Ser
225 230 235
ttg gct gat att ggc aag aaa caa tca gaa cca aat tcc atg gat aaa 828
Leu Ala Asp Ile Gly Lys Lys Gln Ser Glu Pro Asn Ser Met Asp Lys
240 245 250
aat gca ggt cag gtt gtt tct cct cag tct gct cca gcc tgt gct gag 876
Asn Ala Gly Gln Val Val Ser Pro Gln Ser Ala Pro Ala Cys Ala Glu
255 260 265 270
aat aaa aat gat gtc agc agg gaa aac agc act gta gac ttc agc aag 924
Asn Lys Asn Asp Val Ser Arg Glu Asn Ser Thr Val Asp Phe Ser Lys
275 280 285
gtt gat ctg cat ttt atg aaa aag att cct ccg ggt gct gaa gct tca 972
Val Asp Leu His Phe Met Lys Lys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Ser
290 295 300
aac atc ttg gta gga gaa ctg gag ttc cta gac aga gct gtg gtt gcc 1020
Asn Ile Leu Val Gly Glu Leu Glu Phe Leu Asp Arg Ala Val Val Ala
305 310 315
ttt gtc agg ttg tct cca gct gtc ttg ctc caa gga ctt gct gaa gtt 1068
Phe Val Arg Leu Ser Pro Ala Val Leu Leu Gln Gly Leu Ala Glu Val
320 325 330
cca atc cca agc aga ttt ctg ttc atc ctt ctg gga ccc ctg gga aag 1116
Pro Ile Pro Ser Arg Phe Leu Phe Ile Leu Leu Gly Pro Leu Gly Lys
335 340 345 350
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Gly Gln Gln Tyr His Glu Ile Gly Arg Ser Ile Ala Thr Leu Met Thr
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Asp Glu Val Phe His Asp Val Ala Tyr Lys Ala Lys Asp Arg Asn Asp
370 375 380
ttg gta tca gga att gat gag ttt ctg gat cag gtt acc gtt ctt cct 1260
Leu Val Ser Gly Ile Asp Glu Phe Leu Asp Gln Val Thr Val Leu Pro
385 390 395
cct gga gaa tgg gat cca agc ata cga ata gaa cct ccc aaa aat gtc 1308
Pro Gly Glu Trp Asp Pro Ser Ile Arg Ile Glu Pro Pro Lys Asn Val
400 405 410
cct tcc cag gag aag agg aag att cct gct gta cca aat gga aca gca 1356
Pro Ser Gln Glu Lys Arg Lys Ile Pro Ala Val Pro Asn Gly Thr Ala
415 420 425 430
gct cat ggc gaa gct gag cca cat gga gga cac agc gga cct gaa ctc 1404
Ala His Gly Glu Ala Glu Pro His Gly Gly His Ser Gly Pro Glu Leu
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cag cga act ggg agg att ttt ggg gga ctt atg tta gat atc aaa aga 1452
Gln Arg Thr Gly Arg Ile Phe Gly Gly Leu Met Leu Asp Ile Lys Arg
450 455 460
aag gct cca ttc ttc tgg agc gac ttc agg gat gct ttc agc ctg cag 1500
Lys Ala Pro Phe Phe Trp Ser Asp Phe Arg Asp Ala Phe Ser Leu Gln
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Cys Leu Ala Ser Phe Leu Phe Leu Tyr Cys Ala Cys Met Ser Pro Val
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Ile Thr Phe Gly Gly Leu Leu Gly Glu Ala Thr Glu Gly Arg Ile Ser
495 500 505 510
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Ala Ile Glu Ser Leu Phe Gly Ala Ser Met Thr Gly Ile Ala Tyr Ser
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ctt ttt ggt gga cag ccc ctg acc ata tta ggc agc aca gga cct gtt 1692
Leu Phe Gly Gly Gln Pro Leu Thr Ile Leu Gly Ser Thr Gly Pro Val
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ttg gtg ttt gaa aag atc ttg ttt aag ttt tgc aag gaa tac ggc ctg 1740
Leu Val Phe Glu Lys Ile Leu Phe Lys Phe Cys Lys Glu Tyr Gly Leu
545 550 555
tcg tac ttg tcc tta cgg gcc agc att ggg ctc tgg act gca aca ctg 1788
Ser Tyr Leu Ser Leu Arg Ala Ser Ile Gly Leu Trp Thr Ala Thr Leu
560 565 570
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Cys Ile Ile Leu Val Ala Thr Asp Ala Ser Ser Leu Val Cys Tyr Ile
575 580 585 590
acc cgg ttt acc gaa gag gct ttt gct tct ctc att tgc atc att ttt 1884
Thr Arg Phe Thr Glu Glu Ala Phe Ala Ser Leu Ile Cys Ile Ile Phe
595 600 605
atc tat gaa gcc ctg gag aag ttg ttt gag ctc agt gaa acc tat cca 1932
Ile Tyr Glu Ala Leu Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ser Glu Thr Tyr Pro
610 615 620
atc aat atg cac aat gat ttg gaa ctg ctg aca caa tac tca tgt aac 1980
Ile Asn Met His Asn Asp Leu Glu Leu Leu Thr Gln Tyr Ser Cys Asn
625 630 635
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Cys Met Glu Pro His Ser Pro Ser Asn Asp Thr Leu Lys Glu Trp Arg
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Glu Ser Asn Leu Ser Ala Ser Asp Ile Ile Trp Gly Asn Leu Thr Val
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tca gag tgc aga tca ctg cac ggg gag tat gtc ggg cga gcc tgt ggc 2124
Ser Glu Cys Arg Ser Leu His Gly Glu Tyr Val Gly Arg Ala Cys Gly
675 680 685
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His Gly His Pro Tyr Val Pro Asp Val Leu Phe Trp Ser Val Ile Leu
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Ser Arg Tyr Phe Pro Thr Lys Val Arg Ser Ile Val Ser Asp Phe Ala
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Val Phe Leu Thr Ile Leu Cys Met Val Leu Ile Asp Tyr Ala Ile Gly
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Tyr Asp Arg Gly Trp Phe Val Thr Pro Leu Gly Pro Asn Pro Trp Trp
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Thr Ile Ile Ala Ala Ile Ile Pro Ala Leu Leu Cys Thr Ile Leu Ile
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Phe Met Asp Gln Gln Ile Thr Ala Val Ile Ile Asn Arg Lys Glu His
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Lys Leu Lys Lys Gly Cys Gly Tyr His Leu Asp Leu Leu Met Val Ala
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Val Met Leu Gly Val Cys Ser Ile Met Gly Leu Pro Trp Phe Val Ala
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Ala Thr Val Leu Ser Ile Thr His Val Asn Ser Leu Lys Leu Glu Ser
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Phe Met Thr Ser Ile Leu Lys Phe Ile Pro Met Pro Val Leu Tyr Gly
895 900 905 910
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Val Phe Leu Tyr Met Gly Ala Ser Ser Leu Lys Gly Ile Gln Leu Phe
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Asp Arg Ile Lys Leu Phe Trp Met Pro Ala Lys His Gln Pro Asp Phe
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Ile Tyr Leu Arg His Val Pro Leu Arg Lys Val His Leu Phe Thr Val
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gaaagctgac tcagggaaag gcgttgacag ggagacttgt ctatgacttg atcttcaatt 3440
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Met Glu Ile Lys Asp Gln Gly Ala Gln Met Glu Pro Leu Leu Pro Thr
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Arg Asn Asp Glu Glu Ala Val Val Asp Arg Gly Gly Thr Arg Ser Ile
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Leu Lys Thr His Phe Glu Lys Glu Asp Leu Glu Gly His Arg Thr Leu
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Phe Ile Gly Val His Val Pro Leu Gly Gly Arg Lys Ser His Arg Arg
50 55 60
His Arg His Arg Gly His Lys His Arg Lys Arg Asp Arg Glu Arg Asp
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Ser Gly Leu Glu Asp Gly Arg Glu Ser Pro Ser Phe Asp Thr Pro Ser
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Gln Arg Val Gln Phe Ile Leu Gly Thr Glu Asp Asp Asp Glu Glu His
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Leu Pro His Asp Leu Phe Thr Glu Leu Asp Glu Ile Cys Trp Arg Glu
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Gly Glu Asp Ala Glu Trp Arg Glu Thr Ala Arg Trp Leu Lys Phe Glu
130 135 140
Glu Asp Val Glu Asp Gly Gly Glu Arg Trp Ser Lys Pro Tyr Val Ala
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Thr Leu Ser Leu His Ser Leu Phe Glu Leu Arg Ser Cys Ile Leu Asn
165 170 175
Gly Thr Val Leu Leu Asp Met His Ala Asn Thr Ile Glu Glu Ile Ala
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Val Arg His Arg Val His Glu Ala Leu Met Lys Gln His His His Gln
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Asn Gln Lys Lys Leu Ala Asn Arg Ile Pro Ile Val Arg Ser Leu Ala
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Asn Asp Val Ser Arg Glu Asn Ser Thr Val Asp Phe Ser Lys Val Asp
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Leu His Phe Met Lys Lys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Ser Asn Ile
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Leu Val Gly Glu Leu Glu Phe Leu Asp Arg Ala Val Val Ala Phe Val
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Met Glu Ile Lys Asp Gln Gly Ala
1 5
caa atg gag ccg ctg ctg cct acg aga aat gat gaa gaa gca gtt gtg 154
Gln Met Glu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Asp Glu Glu Ala Val Val
10 15 20
gat aga ggt gga act cgt tct att ctc aaa aca cac ttt gag aaa gaa 202
Asp Arg Gly Gly Thr Arg Ser Ile Leu Lys Thr His Phe Glu Lys Glu
25 30 35 40
gat tta gaa ggt cat cga aca cta ttt att gga gta cat gtg ccc ttg 250
Asp Leu Glu Gly His Arg Thr Leu Phe Ile Gly Val His Val Pro Leu
45 50 55
gga gga aga aaa agc cat cga cgt cac agg cat cgt ggt cat aaa cac 298
Gly Gly Arg Lys Ser His Arg Arg His Arg His Arg Gly His Lys His
60 65 70
aga aag aga gac aga gaa aga gat tca gga tta gag gat gga agg gag 346
Arg Lys Arg Asp Arg Glu Arg Asp Ser Gly Leu Glu Asp Gly Arg Glu
75 80 85
tca cct tct ttt gac acc cca tca cag agg gta cag ttt att ctt gga 394
Ser Pro Ser Phe Asp Thr Pro Ser Gln Arg Val Gln Phe Ile Leu Gly
90 95 100
acc gag gat gat gac gag gaa cac att cct cat gac ctt ttc aca gaa 442
Thr Glu Asp Asp Asp Glu Glu His Ile Pro His Asp Leu Phe Thr Glu
105 110 115 120
ctg gat gag att tgt tgg cgt gaa ggt gag gac gct gag tgg cga gaa 490
Leu Asp Glu Ile Cys Trp Arg Glu Gly Glu Asp Ala Glu Trp Arg Glu
125 130 135
aca gcc agg tgg ttg aag ttt gaa gaa gat gtg gaa gat gga gga gaa 538
Thr Ala Arg Trp Leu Lys Phe Glu Glu Asp Val Glu Asp Gly Gly Glu
140 145 150
agg tgg agc aag cct tat gtg gct act ctt tca ttg cac agc ttg ttt 586
Arg Trp Ser Lys Pro Tyr Val Ala Thr Leu Ser Leu His Ser Leu Phe
155 160 165
gaa ttg aga agt tgt att ctg aat gga act gtg ttg ctg gac atg cat 634
Glu Leu Arg Ser Cys Ile Leu Asn Gly Thr Val Leu Leu Asp Met His
170 175 180
gcc aac act tta gaa gaa att gca gat atg gtt ctt gac caa caa gtg 682
Ala Asn Thr Leu Glu Glu Ile Ala Asp Met Val Leu Asp Gln Gln Val
185 190 195 200
agc tca ggt cag ctg aat gaa gat gta cgc cat agg gtc cat gag gca 730
Ser Ser Gly Gln Leu Asn Glu Asp Val Arg His Arg Val His Glu Ala
205 210 215
ttg atg aaa cag cat cat cat cag aat cag aaa aaa ctc acc aac agg 778
Leu Met Lys Gln His His His Gln Asn Gln Lys Lys Leu Thr Asn Arg
220 225 230
att ccc att gtt cgt tcc ttt gct gat att ggc aag aaa cag tca gaa 826
Ile Pro Ile Val Arg Ser Phe Ala Asp Ile Gly Lys Lys Gln Ser Glu
235 240 245
cca aat tcc atg gac aaa aat gca ggt cag gtt gtt tct cct cag tct 874
Pro Asn Ser Met Asp Lys Asn Ala Gly Gln Val Val Ser Pro Gln Ser
250 255 260
gct cca gcc tgt gtt gaa aat aaa aat gat gtt agc aga gaa aac agc 922
Ala Pro Ala Cys Val Glu Asn Lys Asn Asp Val Ser Arg Glu Asn Ser
265 270 275 280
act gtt gac ttt agc aag gtt gat ctg cat ttt atg aaa aag att cct 970
Thr Val Asp Phe Ser Lys Val Asp Leu His Phe Met Lys Lys Ile Pro
285 290 295
cca ggt gct gaa gca tcg aac atc tta ctg gga gaa ctg gag ttc ttg 1018
Pro Gly Ala Glu Ala Ser Asn Ile Leu Leu Gly Glu Leu Glu Phe Leu
300 305 310
gat cga aca gta gtt gcg ttt gtc agg ttg tct cca gct gta ttg ctt 1066
Asp Arg Thr Val Val Ala Phe Val Arg Leu Ser Pro Ala Val Leu Leu
315 320 325
caa gga ctg gct gaa gtc cca atc cca acc aga ttt ttg ttc att ctt 1114
Gln Gly Leu Ala Glu Val Pro Ile Pro Thr Arg Phe Leu Phe Ile Leu
330 335 340
ctg gga ccc ctg gga aag ggt caa cag tac cat gag att ggc aga tca 1162
Leu Gly Pro Leu Gly Lys Gly Gln Gln Tyr His Glu Ile Gly Arg Ser
345 350 355 360
att gca acc cta atg aca gat gag gta ttt cat gat gtt gcc tat aaa 1210
Ile Ala Thr Leu Met Thr Asp Glu Val Phe His Asp Val Ala Tyr Lys
365 370 375
gct aaa gat cgt aat gac ttg gta tca gga att gat gag ttt ctg gat 1258
Ala Lys Asp Arg Asn Asp Leu Val Ser Gly Ile Asp Glu Phe Leu Asp
380 385 390
cag gtt act gtt ctc cct cct gga gaa tgg gat cca agc att cga ata 1306
Gln Val Thr Val Leu Pro Pro Gly Glu Trp Asp Pro Ser Ile Arg Ile
395 400 405
gag cct ccc aaa aat gtt cct tcc cag gag aag agg aag att cct gct 1354
Glu Pro Pro Lys Asn Val Pro Ser Gln Glu Lys Arg Lys Ile Pro Ala
410 415 420
gta cca aat gga aca gca gct cat ggg gaa gca gag ccc cac gga gga 1402
Val Pro Asn Gly Thr Ala Ala His Gly Glu Ala Glu Pro His Gly Gly
425 430 435 440
cat agt gga cct gaa ctc cag cga act gga agg att ttt ggg gga ctt 1450
His Ser Gly Pro Glu Leu Gln Arg Thr Gly Arg Ile Phe Gly Gly Leu
445 450 455
att tta gat atc aaa aga aaa gct cca tac ttc tgg agt gac ttc aga 1498
Ile Leu Asp Ile Lys Arg Lys Ala Pro Tyr Phe Trp Ser Asp Phe Arg
460 465 470
gat gct ttc agc ctg cag tgc tta gca tct ttt cta ttt ctc tac tgc 1546
Asp Ala Phe Ser Leu Gln Cys Leu Ala Ser Phe Leu Phe Leu Tyr Cys
475 480 485
gcg tgt atg tct cct gtc atc acg ttt gga gga ctg ctg gga gaa gca 1594
Ala Cys Met Ser Pro Val Ile Thr Phe Gly Gly Leu Leu Gly Glu Ala
490 495 500
act gaa ggg cgt ata agt gca att gaa tct ctc ttt gga gca tcc atg 1642
Thr Glu Gly Arg Ile Ser Ala Ile Glu Ser Leu Phe Gly Ala Ser Met
505 510 515 520
acc ggg ata gcc tat tct ctc ttt ggt gga cag cct ctt acc ata tta 1690
Thr Gly Ile Ala Tyr Ser Leu Phe Gly Gly Gln Pro Leu Thr Ile Leu
525 530 535
ggc agt aca gga cca gtt ttg gtg ttt gaa aag att ttg ttt aaa ttt 1738
Gly Ser Thr Gly Pro Val Leu Val Phe Glu Lys Ile Leu Phe Lys Phe
540 545 550
tgc aaa gaa tat ggg ctg tca tac cta tct tta aga gct agc att gga 1786
Cys Lys Glu Tyr Gly Leu Ser Tyr Leu Ser Leu Arg Ala Ser Ile Gly
555 560 565
ctt tgg act gca act cta tgt atc ata ctt gtg gcc aca gat gct agt 1834
Leu Trp Thr Ala Thr Leu Cys Ile Ile Leu Val Ala Thr Asp Ala Ser
570 575 580
tcc ctt gtc tgc tac atc act cgg ttt act gaa gaa gct ttt gct tcc 1882
Ser Leu Val Cys Tyr Ile Thr Arg Phe Thr Glu Glu Ala Phe Ala Ser
585 590 595 600
ctg att tgc atc att ttc att tat gag gcc ctg gag aag ttg ttt gaa 1930
Leu Ile Cys Ile Ile Phe Ile Tyr Glu Ala Leu Glu Lys Leu Phe Glu
605 610 615
ctc agt gaa gca tat cca atc aac atg cat aat gat ctg gaa ctg ctg 1978
Leu Ser Glu Ala Tyr Pro Ile Asn Met His Asn Asp Leu Glu Leu Leu
620 625 630
aca caa tac tcg tgt aac tgt gtg gaa ccg cat aat ccc agc aat ggc 2026
Thr Gln Tyr Ser Cys Asn Cys Val Glu Pro His Asn Pro Ser Asn Gly
635 640 645
aca ttg aag gaa tgg agg gaa tcc aat att tct gcc tct gac ata att 2074
Thr Leu Lys Glu Trp Arg Glu Ser Asn Ile Ser Ala Ser Asp Ile Ile
650 655 660
tgg gag aac cta act gtg tca gaa tgc aaa tca ttg cat gga gag tat 2122
Trp Glu Asn Leu Thr Val Ser Glu Cys Lys Ser Leu His Gly Glu Tyr
665 670 675 680
gtt gga cgg gcc tgt ggc cat gat cac cca tat gtt cca gat gtt cta 2170
Val Gly Arg Ala Cys Gly His Asp His Pro Tyr Val Pro Asp Val Leu
685 690 695
ttt tgg tct gtg atc ctg ttc ttt tcc aca gtt act ctg tca gcc acc 2218
Phe Trp Ser Val Ile Leu Phe Phe Ser Thr Val Thr Leu Ser Ala Thr
700 705 710
ctg aag cag ttc aag act agc aga tat ttt cca acc aag gtt cga tcc 2266
Leu Lys Gln Phe Lys Thr Ser Arg Tyr Phe Pro Thr Lys Val Arg Ser
715 720 725
ata gtg agt gac ttt gct gtc ttt ctt aca att ctg tgt atg gtt tta 2314
Ile Val Ser Asp Phe Ala Val Phe Leu Thr Ile Leu Cys Met Val Leu
730 735 740
att gac tat gcc att ggg atc cca tct cca aaa cta caa gta cca agt 2362
Ile Asp Tyr Ala Ile Gly Ile Pro Ser Pro Lys Leu Gln Val Pro Ser
745 750 755 760
gtt ttc aag ccc act aga gat gat cgt ggc tgg ttt gtt acg cct tta 2410
Val Phe Lys Pro Thr Arg Asp Asp Arg Gly Trp Phe Val Thr Pro Leu
765 770 775
ggt cca aac cca tgg tgg aca gta ata gct gct ata att cca gct ctg 2458
Gly Pro Asn Pro Trp Trp Thr Val Ile Ala Ala Ile Ile Pro Ala Leu
780 785 790
ctt tgt act att cta att ttc atg gac caa cag att aca gct gtc atc 2506
Leu Cys Thr Ile Leu Ile Phe Met Asp Gln Gln Ile Thr Ala Val Ile
795 800 805
atc aac agg aaa gag cat aag cta aag aaa ggt tgt ggg tac cat ctg 2554
Ile Asn Arg Lys Glu His Lys Leu Lys Lys Gly Cys Gly Tyr His Leu
810 815 820
gac cta tta atg gtg gct gtc atg ctc ggt gta tgc tcc atc atg ggc 2602
Asp Leu Leu Met Val Ala Val Met Leu Gly Val Cys Ser Ile Met Gly
825 830 835 840
ctg cca tgg ttt gtg gct gcc aca gtc ctc tcc atc act cat gtc aat 2650
Leu Pro Trp Phe Val Ala Ala Thr Val Leu Ser Ile Thr His Val Asn
845 850 855
agc cta aaa ctg gaa tca gaa tgc tca gct cca gga gaa caa ccc aaa 2698
Ser Leu Lys Leu Glu Ser Glu Cys Ser Ala Pro Gly Glu Gln Pro Lys
860 865 870
ttt ctc ggc att cgg gag caa agg gtt act ggg ctt atg att ttt att 2746
Phe Leu Gly Ile Arg Glu Gln Arg Val Thr Gly Leu Met Ile Phe Ile
875 880 885
ctt atg ggt tca tca gtc ttt atg acc agt att ctg aag ttt att ccc 2794
Leu Met Gly Ser Ser Val Phe Met Thr Ser Ile Leu Lys Phe Ile Pro
890 895 900
atg cca gtg cta tat gga gtg ttt ctt tat atg ggt gct tca tct cta 2842
Met Pro Val Leu Tyr Gly Val Phe Leu Tyr Met Gly Ala Ser Ser Leu
905 910 915 920
aag gga att cag ttc ttt gat agg ata aag ctc ttc tgg atg ccg gca 2890
Lys Gly Ile Gln Phe Phe Asp Arg Ile Lys Leu Phe Trp Met Pro Ala
925 930 935
aaa cat caa cca gat ttt ata tac cta agg cac gta ccg ctt cga aaa 2938
Lys His Gln Pro Asp Phe Ile Tyr Leu Arg His Val Pro Leu Arg Lys
940 945 950
gtg cat ctc ttc aca att att cag atg agt tgc ctt ggc ctt ttg tgg 2986
Val His Leu Phe Thr Ile Ile Gln Met Ser Cys Leu Gly Leu Leu Trp
955 960 965
ata ata aaa gtt tca aga gct gct att gtc tct ccc atg atg gtg tta 3034
Ile Ile Lys Val Ser Arg Ala Ala Ile Val Ser Pro Met Met Val Leu
970 975 980
tcc ctg gtt ttt gta aga aag ttg atg gac ttg ttg ttc acg aaa cgg 3082
Ser Leu Val Phe Val Arg Lys Leu Met Asp Leu Leu Phe Thr Lys Arg
985 990 995 1000
gaa ctc tgc tgg ttg gat gat ttg atg cct gag agt aag aaa aag aaa 3130
Glu Leu Cys Trp Leu Asp Asp Leu Met Pro Glu Ser Lys Lys Lys Lys
1005 1010 1015
ctg gaa tat gct gaa aaa gaa gaa gaa caa tgt gtg cta cct atg gaa 3178
Leu Glu Tyr Ala Glu Lys Glu Glu Glu Gln Cys Val Leu Pro Met Glu
1020 1025 1030
gat gag ggc aca gta caa ctc cca ttg gaa ggg cac tat aga gat gat 3226
Asp Glu Gly Thr Val Gln Leu Pro Leu Glu Gly His Tyr Arg Asp Asp
1035 1040 1045
cca tct gtg atc aat ata tct gat gaa atg tca aag act gcc ttg tgg 3274
Pro Ser Val Ile Asn Ile Ser Asp Glu Met Ser Lys Thr Ala Leu Trp
1050 1055 1060
agg aac ctt ctg att act gcc gat aac tca aaa gat aag gag tca agc 3322
Arg Asn Leu Leu Ile Thr Ala Asp Asn Ser Lys Asp Lys Glu Ser Ser
1065 1070 1075 1080
ttt cct tcc aaa agc tcc cct tcc taat cactctagaa gctgattccc 3370
Phe Pro Ser Lys Ser Ser Pro Ser
1085
caaagcattg aaagccgaaa agagaagaaa gctgactcag ggatagttgt tgacagggag 3430
acttgtctat gactcgatct tcaatttatt ttttacatat atatgagaag agtgtcacaa 3490
ttattaataa aactgcttgg atcatgtatg gtaaattctg tccctcaacc caaatccact 3550
ttcatacggt aagtagggca aaacttgttt catttcggtg ttaaaatttc ggagcaggag 3610
acatccctgt gagcagaaac aatagccaat gcagaatctg tgtgttcctt gctgaacgta 3670
agacatttgt aaactggatt ctgattgtca gttttatgag agcaatagct tccttaaaga 3730
gataagtcat atacacctag tttgtattct catactttag agacctgaag acgcctgata 3790
atttcattca ggagaatttt tgaaaggtag tcaaacttct ttttagtttt tatagcttag 3850
cattagtgac ttatttcaaa agacccaaat caaaaagtta gtttgaaagc attttttaat 3910
aattgtattt atgcatttgg ctactgtaag ttttgctcca tggaataatg atgtgatagc 3970
aaaaatgaat aagactatga ataagttcct acatgaaggt taatgtcagt ggtgaaaaat 4030
cttattatgc tccaatatac tgccagcatg ctgagtatac ttggatcata aaaaactgtt 4090
tcatttttct tatttatttt atgcatagga atattcattc cggaattc 4138
<210> 4
<211> 1088
<212> PRT
<213> Homo sapience
<400> 4
Met Glu Ile Lys Asp Gln Gly Ala Gln Met Glu Pro Leu Leu Pro Thr
1 5 10 15
Arg Asn Asp Glu Glu Ala Val Val Asp Arg Gly Gly Thr Arg Ser Ile
20 25 30
Leu Lys Thr His Phe Glu Lys Glu Asp Leu Glu Gly His Arg Thr Leu
35 40 45
Phe Ile Gly Val His Val Pro Leu Gly Gly Arg Lys Ser His Arg Arg
50 55 60
His Arg His Arg Gly His Lys His Arg Lys Arg Asp Arg Glu Arg Asp
65 70 75 80
Ser Gly Leu Glu Asp Gly Arg Glu Ser Pro Ser Phe Asp Thr Pro Ser
85 90 95
Gln Arg Val Gln Phe Ile Leu Gly Thr Glu Asp Asp Asp Glu Glu His
100 105 110
Ile Pro His Asp Leu Phe Thr Glu Leu Asp Glu Ile Cys Trp Arg Glu
115 120 125
Gly Glu Asp Ala Glu Trp Arg Glu Thr Ala Arg Trp Leu Lys Phe Glu
130 135 140
Glu Asp Val Glu Asp Gly Gly Glu Arg Trp Ser Lys Pro Tyr Val Ala
145 150 155 160
Thr Leu Ser Leu His Ser Leu Phe Glu Leu Arg Ser Cys Ile Leu Asn
165 170 175
Gly Thr Val Leu Leu Asp Met His Ala Asn Thr Leu Glu Glu Ile Ala
180 185 190
Asp Met Val Leu Asp Gln Gln Val Ser Ser Gly Gln Leu Asn Glu Asp
195 200 205
Val Arg His Arg Val His Glu Ala Leu Met Lys Gln His His His Gln
210 215 220
Asn Gln Lys Lys Leu Thr Asn Arg Ile Pro Ile Val Arg Ser Phe Ala
225 230 235 240
Asp Ile Gly Lys Lys Gln Ser Glu Pro Asn Ser Met Asp Lys Asn Ala
245 250 255
Gly Gln Val Val Ser Pro Gln Ser Ala Pro Ala Cys Val Glu Asn Lys
260 265 270
Asn Asp Val Ser Arg Glu Asn Ser Thr Val Asp Phe Ser Lys Val Asp
275 280 285
Leu His Phe Met Lys Lys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Ser Asn Ile
290 295 300
Leu Leu Gly Glu Leu Glu Phe Leu Asp Arg Thr Val Val Ala Phe Val
305 310 315 320
Arg Leu Ser Pro Ala Val Leu Leu Gln Gly Leu Ala Glu Val Pro Ile
325 330 335
Pro Thr Arg Phe Leu Phe Ile Leu Leu Gly Pro Leu Gly Lys Gly Gln
340 345 350
Gln Tyr His Glu Ile Gly Arg Ser Ile Ala Thr Leu Met Thr Asp Glu
355 360 365
Val Phe His Asp Val Ala Tyr Lys Ala Lys Asp Arg Asn Asp Leu Val
370 375 380
Ser Gly Ile Asp Glu Phe Leu Asp Gln Val Thr Val Leu Pro Pro Gly
385 390 395 400
Glu Trp Asp Pro Ser Ile Arg Ile Glu Pro Pro Lys Asn Val Pro Ser
405 410 415
Gln Glu Lys Arg Lys Ile Pro Ala Val Pro Asn Gly Thr Ala Ala His
420 425 430
Gly Glu Ala Glu Pro His Gly Gly His Ser Gly Pro Glu Leu Gln Arg
435 440 445
Thr Gly Arg Ile Phe Gly Gly Leu Ile Leu Asp Ile Lys Arg Lys Ala
450 455 460
Pro Tyr Phe Trp Ser Asp Phe Arg Asp Ala Phe Ser Leu Gln Cys Leu
465 470 475 480
Ala Ser Phe Leu Phe Leu Tyr Cys Ala Cys Met Ser Pro Val Ile Thr
485 490 495
Phe Gly Gly Leu Leu Gly Glu Ala Thr Glu Gly Arg Ile Ser Ala Ile
500 505 510
Glu Ser Leu Phe Gly Ala Ser Met Thr Gly Ile Ala Tyr Ser Leu Phe
515 520 525
Gly Gly Gln Pro Leu Thr Ile Leu Gly Ser Thr Gly Pro Val Leu Val
530 535 540
Phe Glu Lys Ile Leu Phe Lys Phe Cys Lys Glu Tyr Gly Leu Ser Tyr
545 550 555 560
Leu Ser Leu Arg Ala Ser Ile Gly Leu Trp Thr Ala Thr Leu Cys Ile
565 570 575
Ile Leu Val Ala Thr Asp Ala Ser Ser Leu Val Cys Tyr Ile Thr Arg
580 585 590
Phe Thr Glu Glu Ala Phe Ala Ser Leu Ile Cys Ile Ile Phe Ile Tyr
595 600 605
Glu Ala Leu Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ser Glu Ala Tyr Pro Ile Asn
610 615 620
Met His Asn Asp Leu Glu Leu Leu Thr Gln Tyr Ser Cys Asn Cys Val
625 630 635 640
Glu Pro His Asn Pro Ser Asn Gly Thr Leu Lys Glu Trp Arg Glu Ser
645 650 655
Asn Ile Ser Ala Ser Asp Ile Ile Trp Glu Asn Leu Thr Val Ser Glu
660 665 670
Cys Lys Ser Leu His Gly Glu Tyr Val Gly Arg Ala Cys Gly His Asp
675 680 685
His Pro Tyr Val Pro Asp Val Leu Phe Trp Ser Val Ile Leu Phe Phe
690 695 700
Ser Thr Val Thr Leu Ser Ala Thr Leu Lys Gln Phe Lys Thr Ser Arg
705 710 715 720
Tyr Phe Pro Thr Lys Val Arg Ser Ile Val Ser Asp Phe Ala Val Phe
725 730 735
Leu Thr Ile Leu Cys Met Val Leu Ile Asp Tyr Ala Ile Gly Ile Pro
740 745 750
Ser Pro Lys Leu Gln Val Pro Ser Val Phe Lys Pro Thr Arg Asp Asp
755 760 765
Arg Gly Trp Phe Val Thr Pro Leu Gly Pro Asn Pro Trp Trp Thr Val
770 775 780
Ile Ala Ala Ile Ile Pro Ala Leu Leu Cys Thr Ile Leu Ile Phe Met
785 790 795 800
Asp Gln Gln Ile Thr Ala Val Ile Ile Asn Arg Lys Glu His Lys Leu
805 810 815
Lys Lys Gly Cys Gly Tyr His Leu Asp Leu Leu Met Val Ala Val Met
820 825 830
Leu Gly Val Cys Ser Ile Met Gly Leu Pro Trp Phe Val Ala Ala Thr
835 840 845
Val Leu Ser Ile Thr His Val Asn Ser Leu Lys Leu Glu Ser Glu Cys
850 855 860
Ser Ala Pro Gly Glu Gln Pro Lys Phe Leu Gly Ile Arg Glu Gln Arg
865 870 875 880
Val Thr Gly Leu Met Ile Phe Ile Leu Met Gly Ser Ser Val Phe Met
885 890 895
Thr Ser Ile Leu Lys Phe Ile Pro Met Pro Val Leu Tyr Gly Val Phe
900 905 910
Leu Tyr Met Gly Ala Ser Ser Leu Lys Gly Ile Gln Phe Phe Asp Arg
915 920 925
Ile Lys Leu Phe Trp Met Pro Ala Lys His Gln Pro Asp Phe Ile Tyr
930 935 940
Leu Arg His Val Pro Leu Arg Lys Val His Leu Phe Thr Ile Ile Gln
945 950 955 960
Met Ser Cys Leu Gly Leu Leu Trp Ile Ile Lys Val Ser Arg Ala Ala
965 970 975
Ile Val Ser Pro Met Met Val Leu Ser Leu Val Phe Val Arg Lys Leu
980 985 990
Met Asp Leu Leu Phe Thr Lys Arg Glu Leu Cys Trp Leu Asp Asp Leu
995 1000 1005
Met Pro Glu Ser Lys Lys Lys Lys Leu Glu Tyr Ala Glu Lys Glu Glu
1010 1015 1020
Glu Gln Cys Val Leu Pro Met Glu Asp Glu Gly Thr Val Gln Leu Pro
1025 1030 1035 1040
Leu Glu Gly His Tyr Arg Asp Asp Pro Ser Val Ile Asn Ile Ser Asp
1045 1050 1055
Glu Met Ser Lys Thr Ala Leu Trp Arg Asn Leu Leu Ile Thr Ala Asp
1060 1065 1070
Asn Ser Lys Asp Lys Glu Ser Ser Phe Pro Ser Lys Ser Ser Pro Ser
1075 1080 1085
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapience
<400> 5
tttggagaaa acccctggt 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapience
<400> 6
tgacatcatc caggaagctg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapience
<400> 7
gtcatgttag accaacaggt 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapience
<400> 8
gttgtaatag cgacactc 18
Claims (11)
- 서열 목록의 서열 번호 2 또는 4에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 단백질.
- 제1항에 있어서, 단백질이 세포에서 발현될 경우, 나트륨 이온 구동형 클로라이드/비카르보네이트 익스체인저로서 기능하는 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제2항에 있어서, 나트륨 이온 구동형 클로라이드/비카르보네이트 익스체인저가 세포외 비카르보네이트 및 세포내 클로라이드 이온 모두에 의존적으로 세포외 나트륨 이온을 세포내로 흡수하고, 세포내 나트륨 이온을 세포 바깥으로 수송하는 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단백질 중 하나를 발현하며, 상기 단백질 중 하나의 기원의 종과는 상이한 종의 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단백질 중 하나에 대한 항체.
- 제4항의 세포를 후보 화합물과 접촉시키고, 나트륨 이온 구동형 클로라이드/비카르보네이트 익스체인저의 기능을 측정하고, 이와 같이 얻어진 결과를 후보 화합물과 접촉시키지 않은 제4항의 세포의 나트륨 이온 구동형 클로라이드/비카르보네이트 익스체인저의 기능 측정에 의해 얻어진 결과와 비교함으로써 후보 화합물이 상기 기능을 증강 또는 저해하는지의 여부를 측정하는 것을 포함하는 나트륨 이온 구동형 클로라이드/비카르보네이트 익스체인저의 아고니스트 및 안타고니스트의 선별 방법.
- 서열 목록의 서열 번호 1 또는 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 DNA.
- 서열 목록의 서열 번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오티드 67 내지 3330으로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA.
- 서열 목록의 서열 번호 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오티드 83 내지 3346으로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA.
- 삭제
- 삭제
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